DE1039198B - Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Antibiotika - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Antibiotika Die Erfindung bezieht sich auf die Antibiotika Distamycin und seiner Komponenten sowie auf Distacin und hat zum Gegenstand deren Herstellung durch Züchten der neuen Streptomyces-Art »Streptomyces distallicus«.
• Die genannten Antibiotika sind bisher nicht beschrieben worden. Präparate, welche diese neuen Antibiotika enthalten, sind hochwirksam gegenüber mehreren pathogenen Pilzen und Sch.izomyceten.
• Diese neuen Antibiotika werden durch eine neue Streptomyces-Art hervorgebracht, deren Stamm aus einer Bodenprobe aus Campania (Provinz Neapel) isoliert werden konnte. Die Erzeugung erfolgt in verschiedenen Züchtungsmedien, welche für die Entwicklung der erzeugenden Mikroorganismen und für die Erzeugung der Antibiotika durch dieselben. günstig sind.
• Aus der folgenden Beschreibung geht hervor, daß der hier isolierte Stamm keiner der Arten entspricht, welche in Bergey's-Handbuch oder durch W a s k s m a n -Lechev elier in »Actinomycetes and their Antihiotics« (1953) klassifiziert worden sind. Diese neue Art wird als »Streptomyces distallicus« bezeichnet. Eine Kultur wurde im Commonwealth Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, Surrey, und im National Mycological Institute. Teddington, Mi.ddlesex. hinterlegt.
• Der erzeugende Mikroorganismus zeigt folgende Eigenschaften: Unter dem optischen Mikroskop zeigen sich ziemlich gerade, kaum verzweigte, lange Hyphen. Auf Hefeagar erscheinen lange und gestreckteHyphen mit Wirbeln aus kurzen gestreckten sympodischen Hy-phen. Auf Kartoffelagar. Rübenagar und Asparaginagar bildet sieh ein vegetatives llycel, dessen Farbe auf der einen Seite beim Altern von Honiggelb auf Braun, auf der entgegengesetzten Seite von Bla.ßbraun auf Kastanienbraun wechselt. Das Luftmycel ist bei den genannten Zuchtmedien nur schwach ausgebildet und hat ein staubiges, satinartiges Aussehen und in den ersten Tagen des Wachstums eine grauweiße und später eine schwach cremegraue Farbe; auf Asparaginagar zeigt es eine schwach violettbraune Tönung.
• Auf Stärkeagar und Czapekagar ändert sich die Farbe des vegetativen Mvcels von farblos zu Honiggelb, während die Rückseite gelb ist. Auf Czapek ist das Luftmycel gräulichweiß und auf Stärkeagar schwach wein- bis rosarot, stets staubig und satinartig.
• In Fleischbrühe und Pepton-Glukose-Brühe wird ein reichliches vegetatives Mycel erzeugt, das in Form von Flocken meistens vollständig untergetaucht ist. Bei Fleischbrühe wächst es auch an der Oberfläche in Ringform, wobei eine Seite honiggelb, die entgegengesetzte Seite gelb ist. Ein Luftmycel fehlt. Auch auf Gelatine erfolgt ein reichliches Wachstum; das vegetative Mycel ist braun bis honiggelb mit gelbbrauner Rückseite: das Luftmycel ändert sich von Gräulichweiß zu Grau; es zeigt sich ein diffuses braunschwarzes Pigment, während auf anderen Substraten keine Pigmentierung auftritt. Es verflüssigt die Gelatine nach 25 Tagen ziemlich stark und hydrolysiart Stärke beträchtlich. Das geeignetste Zuchtmedium zur Erzielung eines guten Wachstums an Mycel und einer entsprechend höheren antibiotischen Wirkung besteht aus Kohlehydraten, stickstoffhaltigen Substanzen sowie Salzen.
• Als Kohlehydratquelle können Glukose, Saccharose, Maltose, Stärke und auch die in der Getreideweiche enthaltenen Kohlehydrate benutzt werden. Als Stickstoffquelle können dienen: Getreideweiche, Sojabohnenmehl sowie Ammoniumsalze. Außerdem werden N a C1, Ca C 03, K2 H P 04, Mg S 04, Fe S O4 usw. zugesetzt. Der pH-Wert der Nährlösung beträgt etwa 6,6. Die Fermentierung kann in einem 300-cem-Erlenmayer-Kolben unter guter Belüftung und bei 28° C erfolgen. Die höchste Aktivität ergibt sich nach 100 bis 120 Stunden bei einem pH von etwa 7,6.
• Die Züchtung des Mikroorganismus kann auch durch submerse Fermentierung unter Rühren und Belüftung erfolgen, wie dies dem Fachmann geläufig ist. Um ein gutes Wachstum der Kulturen zu erzielen, kann man ein Nährmedium verwenden, welches eine oder mehrere Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff sowie Salze der beschriebenen Art enthält.
• Gegenstand der Erfindung bildet auch die Isolierung der Antibiotika, welche durch den unter den vorerwähnten Bedingungen gezüchteten Mikroorganismus erzeugt werden.
• Aus den Beispielen gehen einige experimentelle Einzelheiten dieses Teils der Erfindung hervor. Im allgemeinen erfolgt die Isolierung der aktiven Produkte aus den Kulturen dadurch, daß man das von der Zuchtflüssigkeit abgetrennte Mycel mit verschiedenen Flüssigkeiten, insbesondere Methyl-, Äthyl- und n-Butylalkohol, extrahiert. Am besten bewährt hat sich die Verwendung von Butylalkohol. Die Extraktion wird im allgemeinen so ausgeführt, daß man das Mycel nacheinander mit kleinen Mengen des Lösungsmittels schüttelt. Die Auszüge werden durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum eingedampft. Aus dein so erhaltenen öligen Konzentrat wird durch Behandeln mit Äther ein gelber oder gelbbrauner Niederschlag gewonnen, welcher getrocknet wird. Dieses Produkt (Distainycin) zeigt ein Ultravioleitabsorptioilsspektrum, wie es für ein konjugiertes Polyen charakteristisch ist. Die Maxima im Ultraviolettspektrum finden sich bei 235, 290, 305, 318, 333, 350, 380 und 405 mg. Die Maxima bei 318, 333 und 350 inlt sind typisch für ein Chromophor vom Pentaentypus. Mit konzentrierter Schwefelsäure ergibt das Produkt eine tiefviolette Färbung. Es enthält Stickstoff.
• Das Produkt ist in niedrigen Alkoholen, Äthvlcellosolve, Pyridin und anderen aliphatischen oder aromatischen Basen sowie auch in Eisessig löslich. Teilweise löst es sich in Chloroform, verdünnten Säuren und Basen, während es in Äther unlöslich ist. Es ist thermolal>il, insbesondere bei saurem und basischem PH, in methanolischer Lösung hingegen stabil.
• Chromatographische Rf-Werte: Wässeriges Butanol 0.15; finit Butanol gesättigtes Wasser 0,3; Butanol-Pyridin-Wasser (1:0,6:1) 0,6; Butanol-Essigsäure-Wasser (2:1:1) 0,73; 3o/oige Ammoniumehloridlösung 0,04; 60o/oiges Aceton 0,8; Benzol-Essigsäure-Wasser (2:1: 1) 0,00 (bioautographisch entwickelt auf Candida albicans).
• Das Infrarotabsorptionsspektrum zeigt ein Maximum bei 2,9411 mit Wendepunkten bei 3,00 und 3,05 g, zwei scharfe Maxima bei 6,04 und 6,33 h mit Wendepunkten bei 6.10, 6.24, 6,52, 6,58 g, eine weniger ausgeprägte Bande bei 5,82 l und eine hohe Absorptionsbande zwischen 6,8 und 7,3 [x.
• Die aus den Kulturen von Streptomyces distallicus auf Grund des beschriebenen Verfahrens oder eines anderen äquivalenten Verfahrens, gegebenenfalls auch unter Verwendung eines anderen Lösungsmittels als Butanol, z. B. eines anderen Alkohols, von Chloroform, Aceton, Lösungen von aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Basen usw., erhaltenen Produkte zeigen alle eine bemerkenswerte Hemmwirkung gegenüber verschiedenen pathogenen Pilzen und Bakterien. Insbesondere ist das durch Extraktion mit Butanol erhaltene Produkt (Distamycin) mit den obenerwähnten Eigenschaften aktiv gegenüber S. lutea, B. subtilis, Mycobacterium tuberculosis Stamm 607, Actin. boströmi, O. albieans, Tric. mentagrophites, Sab. gypseus, Epid. floccosum und Deb. Hudeloi (s. unten). Aus dein Distamycin lassen sich auf verschiedenen Wegen andersartige Produkte mit bemerkenswerter antibiotischer Wirkung erhalten. Diese neuen Verbindungen können im Rohprodukt bereits vorhanden sein oder durch Umwandlung desselben gebildet werden. Eine sehr aktive Verbindung läßt sich erhalten, wenn man eine methanolische Distamycinlösung durch eine Tonerdesäule filtriert. Dieses neue Produkt wurde als »Distamycin A« bezeichnet. Sein U ltraviolettspektruni zeigt Maxima bei 304 und 240 mg. Das Produkt ergibt beim Behandeln mit konzentrierter Schwefelsäure eine weinrote Färbung. Es ist unlöslich in Chloroform, Äthylacetat, Aceton, Äther und verdünnt-n Basen; kaum löslich ist es in einem 1Methanol-Äther-Gemisch 1:3.
• Distainvcin A ist wirksamer als das 1=)istamvcin, aus welchem es erhalten wird. Es zeigt eine besondere Hemmwirkung gegenüber gewissen Schizomyceten sowie gegenüber Actin. boströmi, O. all)icans, Trie. mentagrophites, Sab. gypseus, G1. graphii, Epid. Floccosum und Deb. Hudeloi (s. unten).
• Durch Fraktionierung mit geeigneten Lösungsmitteln (Chloroform, Alkohole. Alkoliol-Äther-Gemische) kann man weitere aktive Produkte erhalten. Wird beispielsweise eine methanolische Lösung eine Distamycin-Produktes mit einer geeigneten Äthermenge ausgefällt, so -erhält man zwei neue Produkte. nämlich Di.staniycin B, welches in Methanol-Äther unlöslich ist, dessen 1lltraviolettspektrum Maxima bei 230, 318, 333, 350, 380 und 405 mg zeigt, und das finit konzentrierter Schwefelsäure eine violette Färbung ergibt, sowie Distamycin C, das im Methanol-Äther-Gemisch löslich ist und dessen Ultraviolettabsorptionsspektrum durch ein bedeutendes '.Maximum bei 236 mg und durch eine im Vergleich zu den anderen Produkten geringere Absorption bei 300 bis 350 nig gekennzeichnet ist. Dieses Produkt ergibt mit konzentrierter Schwefelsäure eine weinrote Färbung. Es ist in Chloroform und verdünnten Basen mit gelber Farbe fast vollkommen löslich.
• Alle Verbindungen, welche durch diese oder eine andere Fraktionierung auf Grund einer Extraktion mit Lösungsmitteln (.Alkoholen, Chloroform, Aceton usw.), gegebenenfalls unter nachfolgender Ausfällung erhalten werden, zeigen eine antibakterielle und fungizide Wirkung, welche derjenigen von Distamycin gleichkommt oder sie übertrifft.
• Distamycin und die Distamycine A, B und C erweisen sich auf Grund ihrer Eigenschaften als verschieden von allen andern beim Stoffwechsel von Acti.nomyeeten entstehenden fungiziden Produktelf, welche bisher isoliert oder genügend charakterisiert worden sind. Insbesondere sind sie verschieden von Fungichromin und Philipin, d. h. Substanzen, welche ein pentaenisches Chromophor enthalten.
• Aus der ätherischen Mutterlösung der Distamycinausfällung läßt sich ein weiteres Produkt mit fungizider Wirkung erhalten, welches als »Distacin« bezeichnet wird. Dieses Produkt kann durch Kristallisation aus wäßrigem Aceton gereinigt werden. Es handelt sich um eine gelbe kristalline Substanz, die in Wasser unlöslich, jedoch in vielen organischen Lösungsmitteln löslich ist, Schmelzpunkt 154 bis 156° C, [al D = -17 (in Methanol). Das Ultraviolettspektrum von Distacin zeigt Maxima bei 255 mg (Eia,. = 640) und 340 mg (Eta.@= 470) ; seine Analsenwerte entsprechen einer Verbindung mit der' Bruttoformel C-22 H25 (),N.
• Die TV-Al)sorptioiissltelctra der hier beschriebenen und beanspruchten Antibiotika sind im Diagramm der Zeichnung angegeben; darin bedeutet A die Kurve für Distamycin und B diejenige für Distacin, während A', .4" und A' die Kurven für die Fraktionen A. B und C von Distamycin bezeichnen.
• Zur weiteren Kennzeichnung des erfindungsgemäßen Verfahrens sei ferner erwähnt, daß auch das Filtrat der Kulturen von Streptomyces distallicus eine Hemmwirkung gegenüber Schizomyceten und Pilzen besitzt. Die antibiotische - Wirksamkeit des Filtrats ist proportional der Produktion von Distamycin durch den 1-Iikroorganismus.
• Nachfolgend sei das antibiotische Spektrum von Distamycin und seinen Derivaten wiedergegeben zur Darstellung von deren Aktivität gegenüber verschiedenen Bakterien.

  Antibiotisches Spektrum von Distamycin und den daraus gewonnenen Fraktionen A, B und C

  Minimale Hemmungsdosis in @ug%ccm; Verdünnung in Hefesuspension

  Stämme I Distamycin Fraktion A I Fraktion B Fraktion C

  Staph.114 ................ > 50 50 > 50 50

  S.lutea .................. 50 < 10 50 ± 10

  B. subtilis . . . . . . . .. .. . . . . . 50 < 10 50 50

  Mvcob. 607 . . . . . . . . . . . . .. . > 50 ± 50 > 50 ± 50

  E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . > 50 > 50 > 50 > 50

  Ps.aeruginosa ............ < 50 > 50 > 50 > 50

  Actin. boströmi A . . . . . . . , ± 10 < 10 ± 10 ± 10

  O. albicans . .. . . . . . .. . . . . . < 10 ± 10 < 10 ± 10

  Tr. mentagrophytes ....... ± 10 ± 10 ± 10 ± 10

  Sab.gypseus .............. < 10 < 10 < 10 < 10

  G1. graphii . . . . . . . . . . . . . . . . 50 -!- 10 50 50

  Epid. floccosum . .. . . . . . .. . < 10 < 10 < 10 < 10

  Deb. hudeloi . . . . . . . . . . . . . . ± 10 -!- 10 ± 10 ± 10

  Distacin hat in einer Dosis von 100 1tg/ccm in Agar-Sabouraud-Kultur eine Hemmwirkung gegenüber Epidermophyton floccosum, Tricophyton mentagrophytes, Glenospora graphii und Sabouraudites gypseus sowie eine subinhibitorischeWirkung gegenüber Pseudomonas aeruginosa und Sarcina lutea. Beispiel 1 Zu 3000 ccm eines sterilen Mediums, enthaltend 2% Dextrose, 2% Maisquellwasser, 1% CaC03. 0,3°/o (N H4)2 S 04 und 0,3% Na C1, gibt inan eine Sporensuspension, entsprechend der Waschung einer Kultur auf festem Nährboden, wie sie in einer Flasche vom Typus Roux (»Kolle«) enthalten ist.
• Die Fermentierung wird während 40 Stunden fortgesetzt, wobei mit 150 bis 250 Umdr./Min. gerührt und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 bis 2 I/Minute und pro Liter Kulturmedium belüftet wird.
• Zur Impfung von 6000 ccm eines gleichartigen sterilen Kulturmediums für die Produktionsphase verwendet man 300 ccm vegetatives Mycel. Diese Produktionsphase dauert 85 bis 100 Stunden, wobei mit einer Geschwindigkeit von 350 bis 400 Umdr./Min. gerührt und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 1/Minute und proLiterKulturmedium belüftet wird. Beispiel 2 Zu 171 einer wie im Beispiel 1 durch Tauchfermentierung erhaltenen Kultur gibt man eine Hilfssubstanz und filtriert das Ganze. Das Gemisch aus Mycel und Hilfssubstanz wird 1 Stunde lang mit 2500 ccm Butanol geschüttelt. Diese Behandlung wird zweimal wiederholt.
• Die butanolischen Auszüge werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, zu öliger Konsistenz konzentriert und mit Äther behandelt. Man erhält 8,9 g eines gelbbraunen Produktes (Distainyci.n). Die ätherische Mutterlösung wird 5 bis 6 Tage lang stehengelas.sen. Der kristalline Niederschlag wird gesammelt und aus 75%igem Aceton kristallisiert, Schmelzpunkt 154 bis 156° C (Distacin). Beispiel 3 Man löst 1,0 g Distainycin in 70 ccm Methanol und trennt Trübungen durch Filtrieren ab. Die gelborange Lösung wird auf einer Säule filtriert, welche 100 g angesäuerte Tonerde enthält (nach Wieland), und mit Methanol gewaschen. Die Eluierung erfolgt mit dem gleichen Lösungsmittel. Die ersten 100 ccm des nach dem Erscheinen der gelben Farbe im Ausfluß gesammelten Eluates ergeben nach dem Trocknen durch Eindampfen 0.2g Distamycin A.
• Beispiel 4 1,0 g Distamycin werden 30 Minuten lang mit zwei Portionen von je 50 ccm Methanol gerührt. Es tritt eine praktisch vollständige Auflösung ein (Rest 50 mg). Die Auszige werden auf 25 ccm konzentriert, von einem geringfügigen Niederschlag (20 mg) abgetrennt und mit dem dreifachen Volumen Äther behandelt. Der Niederschlag (Distamycin B) wird getrocknet. Die Ausbeute beträgt 0,4 g. Die ätherische Mutterlösung wird vollständig eingedampft und wiederum mit Äther aufgenommen. Das verbleibende Produkt wird gesammelt und getrocknet; Ausbeute 0.33 g (Distamycin C).

Claims (4)

1. PATENTANSPRI'C1IE: 1. Verfahren zur Herstellung und Gewinnung der Antibiotika Distamycin sowie dessen Komponenten und Distacin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces distallicus oder einen ihm ähnlichen Streptomyces-Stamm oder deren Mutanten in üblichen Nährmedien, zweckmäßig in bekannter Weise submers, züchtet, das Distamycin aus dem Mycel und die Komponenten A, B und C des Distamycins sowie das Distacin aus den Mutterlaugen isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mycel mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, insbesondere eines aliphatischen Alkohols mit weniger als 5 C-Atomen, extrahiert, den Extrakt im Vakuum konzentriert und durch Ausfällung mit Äther das Distamycin isoliert wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß aus der nach der Ausfällung von Distamycin erhaltenen ätherischen Mutterlösung das Distacin, Schmelzpunkt 154 bis 156° C [a] ö = -1? in Methanol, gewonnen wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zum Extrahieren von Distamycin aus Kulturen oder Mycel oder zum Fraktionieren desselben als Lösungsmittel halogenierte Derivate von niedrigen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Aceton, heterocyclische Basen oder Lösungen von aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Basen in einem geeigneten Lösungsmittel verwendet werden.