DE2236599B2 - Fungizides Antibiotikum, sowie Herstellung und Verwendung desselben - Google Patents

Description

entspricht.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-1293 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen das Antibiotikum SF-1293 erzeugenden Stamm von Streptomyces hygroscopicus, identifiziert als ATCC Nr. 21705, unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium züchtet, welches assimilierbaren Stickstoff und assimilierbaren Kohlenstoff enthält.

3. Die Verwendung des Antibiotikums SF-1293 gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von durch Fungi hervorgerufenen Infektionen bei Pflanzen.

4. Die Verwendung des Antibiotikums SF-1293 gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von Schalenrost und Reisbrand bei Reispflanzen.

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die meisten Pestizide, die bisher in der Landwirtschaft verwendet worden sind, sind synthetische Verbindungen, die mit Hilfe von chemischen Prozessen hergestellt worden sind. Es handelt sich dabei um große Mengen synthetischer chlorhaltiger Verbindungen, synthetischer quecksilberhaltiger Verbindungen und synthetischer arsenhaltiger Verbindungen usw., die als Pestizide auf verschiedene Pflanzen und Böden aufgebracht wurden. In der Regel lassen sich diese synthetischen Pestizide aber, nachdem sie auf die Pflanzen oder Böden aufgebracht worden sind, gar nicht oder nur schwierig abbauen bzw. zersetzen, so daß sie an oder in den Pflanzenkörpern und auch im Boden weiter vorhanden sind. Dieses andauernde Vorhandensein der einmal aufgebrachten Pestizide kann zu einem Verschmutzungs- bzw. Vergiftungsproblem der natürlichen Umgebung und gegebenenfalls zu einer Zerstörung derselben führen. Es ist daher in den vergangenen Jahren in zunehmendem Maße die Forderung erhoben worden, Pestizide zu entwickeln, die, nachdem sie nach dem Aufbringen ihre gewünschte Wirkung entfaltet haben, rasch abbaubar bzw. zersetzbar sind. Da Pestizide vom Typ der Antibiotika im allgemeinen leichter zersetzbar sind als synthetische Pestizide, erscheint es ratsam, antibiotische Substanzen als Pestizide zu verwenden, wenn das Problem einer Verschmutzung bzw. Vergiftung der natürlichen Umgebung ausgeschaltet werden soll.

Zweck der Erfindung ist infolgedessen das Zurverfügungstellen eines neuen Antibiotikums, welches als Pestizid brauchbar ist und zur Bedämpfung verschiedener Arten von phyto-pathogenen Mikroorganismen, insbesondere phyto-pathogenen Fungi eingesetzt werden kann.

Von der Anmelderin ist eine intensive Erforschung der Stoffwechselprodukte vieler Stämme der Gattung Streptomyces durchgeführt worden, und zwar mit dem Ziel, eine neue antibiotische Substanz zu finden, die in wirksamer Weise das Wachstum von pathogenen Mikroorganismen, die verschiedene Pflanzenkrankheiten hervorrufen, zu inhibieren vermag. Es konnte gefunden werden, daß eine antibiotische Substanz, die eine hohe Wirksamkeit hinsichtlich der Inhibierung des Wachstums verschiedener pathogener Fungi einschließlich der pathogenen, Reisschalenrost (rice sheath blight) und Reisbrand (rice blast) erzeugenden Fungi besitzt, in den Kulturen eines Stammes der Gattung Streptomyces erzeugt und angereichert wird und sich aus diesen Kulturen isolieren läßt. Es ist gelungen, diese aktive Substanz in reiner Form zu isolieren. Diese aktive Substanz ist mit der Bezeichnung »Substanz SF-1293« belegt worden.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum SF-1293 ist eine phosphorhaltige Verbindung, die in ihrer Molekülstruktur die charakteristische C — P — C-Bindung aufweist. Durch diese C — P — C-Bindung unterscheidet sich das erfindungsgemäße Antibiotikum SF-1293 von bereits bekannten phosphorhaltigen Verbindungen, bei denen es sich um Phosphorsäureesterderivate handelt. Verbindungen der letztgenannten Art sind beispielsweise die unter den Handelsbezeichnungen »Kitazin«, »Conen«, »Hinosan« und »Inezin« bekannten Produkte. Aus Berichten, die von offiziellen Instituten bezüglich der fungiziden Wirkung von »Kitazin«, »Conen«, »Hinosan« und »Inezin« gegen Reisbrand und Schalenrost veröffentlicht wurden, geht hervor, daß das beanspruchte Antibiotikum SF-1293 bereits in einer Dosierung von nur V20 °der Vi₀ der Menge, die bei »Kitazin«, »Conen«, »Hinosan« und »Inezin« erforderlich ist, dieselbe Wirkung bei der Bekämpfung von Reispflanzenkrankheiten zeigt wie die genannten vier handelsüblichen Fungizide. Es ist letzteren infolgedessen deutlich überlegen.

Das erfindungsgemäße neue Antibiotikum SF-1293 bildet ein weißes amorphes Pulver mit einem Schmelzpunkt bei 159 bis 161°C. Die Substanz ist in Wasser und Methanol löslich, in Äthanol, Butanol, Aceton, Äthylacetat, Chloroform, Benzol, Hexan und Äthyläther jedoch nur mäßig löslich. Die Substanz besitzt amphoteren Charakter und zeigt positive Reaktionen mit Ninhydrin-Reagenz, Biuret-Reagenz und Lemieux-Reagenz sowie negative Reaktionen mit Ferrichlorid, Fehling-Reagenz.Molisch-ReagenzundFolin-Reagenz. Zu den weiterenCharakteristikadeserfindungsgemäßen

neuen Antibiotikum gehören eine optische Drehung von [x]^!o^! = minus 34° in 1 %iger wäßriger Lösung, Elementaranalysenwerte von C = 40,28 %, H = 6,82%, N = 11,89%, P = 8,90% und O (Restmenge) = 32,11%, ein Molekulargewicht
Titrationskurve) von 355, die

CH,

(bestimmt aus der empirische Formel

NH₂

C₁₁H₂₂O₆N₃P sowie charakteristische Absorptionsbanden im Infrarotbereich des Spektrums (in Kaliumbromidtabletten) bei 1650 cm-¹ und 1540 cm-¹, die den Amidbindungen zuzuordnen sind.

Die Substanz SF-1293 konnte als eine Verbindung identifiziert werden, die der Formel

CH_a

CH,

HO — P — CH₂ — CH₂ — C — CONH — C — CONH — C — COOH

Ψ ',¹I

O HHH

entspricht.

Die weiteren Eigenschaften der Substanz SF-1293 werden im folgenden beschrieben.

Bei der Filterpapier-Elektrophorese wandert die Substanz SF-1293 bei einem pH-Wert von 1,9 und einer Spannung von 3500 Volt in 20 Minuten über eine Distanz von 4 cm in Richtung auf die Kathode, bei einem pH-Wert von 9,5 und einer Spannung von 250 Volt dagegen in 2 Stunden über eine Distanz von 5,5 cm in Richtung auf die Anode. Diese Tatsache beweist eindeutig, daß die Substanz SF-1293 einen amphoteren Charakter besitzt.

In der Papierchromatographie zeigt die Substanz SF-1293 folgende Rf-Werte in verschiedenen Lösungsmittelsystemen, und zwar: 0,02 in wassergesättigtem n-Butanol, 0,98 in 3%igem wäßrigem Ammoniumchlorid, 0,50 in 75%igem wäßrigem Phenol, 0,92 in 50%igem wäßrigen Aceton, 0,11 in n-Butanol-Methanol-Wasser (4:1: 2), 0,01 in Benzol-Methanol (3 :1) und 0,93 in destilliertem Wasser.

Bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel und Cellulose zeigt die Substanz SF-1293 verschiedene Rf-Werte in verschiedenen Lösungsmittelsystemen, was aus der folgenden Tabelle hervorgeht. Mit verschiedenen Lösungsmittelsystemen ergibt die Substanz SF-1293 einen einzigen Fleck mit verschiedenen Rf-Werten, was anzeigt, daß die Substanz SF-1293 rein und homogen ist.

hydrin-Reagenz reagierten; einer dieser beiden Flecke wies einen Rf-Wert auf, der dem von Alanin entsprach. Die Substanz SF-1293 zeigt nur eine Endabsorption im Ultraviolettbereich des Spektrums.
In den Zeichnungen bedeutet

ao F i g. 1 den Verlauf des Infrarot-Absorptions-Spektrums der Substanz SF-1293 in einer Kaliumbromidtablette,

F i g. 2 eine Kurve des kernmagnetischen Resonanz-Spektrums der Substanz SF-1293, gelöst in Deutero-Wasser.

Die Kurve des Infrarot-Absorptions-Spektrums der Substanz SF-1293 zeigt, daß eine Absorptions-Bande des Amids I bei 1650 cm-¹ und eine Absorptions-Bande des Amids II bei 1540 cm"¹ existiert. Aus dieser Tatsache ergibt sich eindeutig, daß die Substanz SF-1293 zu den Antibiotika vom Peptid-Typ gehört.

Die Substanz SF-1293 zeigt eine Wirkung vor allem bei der Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen vom Fungi-Typ. Die inhibierend wirkenden Mindestkonzentrationen der Substanz SF-1293 gegen verschiedene Fungi-Arten wurden mit Hilfe der bekannten Brühen-Verdünnungsmethode bestimmt; die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Tabelle	I	Rf-Werte	Cellulose
		Dunnschichtchromato-
Zur Entwicklung benutzte	grapnie an	0,65
Lösungsmittelsysteme	Kieselsaure gel
		0,41
n-Butanol-Essigsäure-	0,42
Wasser (2:1:1)		0,43
n-Butanol-Methanol-	0,21	0,66
Wasser (4:1:2)
Äthanol-Ammoniak-	0,65
Wasser (8:1:1)	0,25	0,40
Äthanol-Wasser (4:1) ...
n-Propanol-Pyridin-
Essigsäure-Wasser	0,45
(15 : 10: 3 : 10)

Test-Mikroarganismus	Inhibierend wirkende Mindestkonzentrationen (mcg/ml)
45 Alternaria kikuchiana Alternaria mali Botrytis cinerae Glomerella cingulata 5° Pellicularia sasakii Muccor angulispörus Leptosphaeria salvinii Sclerotinia screlotiorum Trichophyton asternoides ... 55 Piricularia oryzae	3,1 3,1 3,1 6,2 0,09 100 0,75 0,37 0,18 25

Die Substanz SF-1293 konnte durch Behandlung mit 6n-Chlorwasserstoffsäure bei 110⁰C in 20 Stunden hydrolysiert werden. Bei der Prüfung des nach der Hydrolyse vorliegenden Reaktionsgemisches mit Hilfe der Papierchromatographie konnte festgestellt werden, daß 2 Flecke vorhanden waren, die positiv gegen Nin-Das Kulturmedium, das für die Bestimmung der inhibierend wirkenden Mindestkonzentrationen verwendet wurde, war Czapek's Agarmedium.

Aus den Ergebnissen in Tabelle II erkennt man, daß die Substanz SF-1293 eine starke antimikrobielle Wirkung bei der Verhinderung des Wachstums einer großen Zahl von phyto-pathogenen Mikroorganismen aufweist. Es konnte ferner nachgewiesen werden, daß die Substanz SF-1293 eine hervorragende Wirkung gegen Reisschalenrost (Pelliculariasasakii)aufweist; die Wirkung wurde bei Reihenversuchen in Gewächshäusern und auf Reisfeldern festgestellt.

Polyoxine [vgl. »Agricultural biological chemistry«, Bd. 29, S. 848 bis 854 (1965), und Bd. 31, S. 190 bis 199 (1967)] und Validamycine A und B [vgl. »Journal of Antibiotics«, Bd. 24, S. 119 bis 123 (1971)] sind Antibiotika, von denen bekannt ist, daß sie das Wachstum verschiedener phyto-pathogener Mikroorganismen und insbesondere auch von Pellicularia sasakii zu verhindern vermögen. Die Substanz SF-1293 läßt sich von den Polyoxinen eindeutig durch die Absorptions-Bande im Ultraviolettbereich des Spektrums unterscheiden; von den Validamycinen unterscheidet sie sich dadurch, daß die Validamycine Antibiotika vom Glycosid-Typ sind.

Soll die erfindungsgemäße Substanz SF-1293 zur Bekämpfung von Fungi-Infektionen bei Pflanzen verwendet werden, so kann sie auf die Pflanzen entweder direkt oder in Mischung mit einem inerten Träger- oder Streckmittel, welches fest oder flüssig sein kann, aufgebracht werden. Die Substanz SF-1293 kann nach Wunsch zu Präparaten in Form von Stäuben, netzbaren ao Pulvern, Granulaten, Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen verarbeitet werden. Bei der Herstellung von Stäuben, netzbaren Pulvern und Granulaten kann ein festes Trägermaterial oder Vehikel wie Diatomeenerde, Talkum, Kaolin, Ton, Kieselsäurfc, Calciumcarbonat u. ä. verwendet werden. Bei der Herstellung von Lösungen, Suspensionen und Emulsionen verwendet man dagegen flüssige Trägermaterialien oder Vehikel wie Wasser oder organische Lösungsmittel, z. B. Xylol, Toluol, Benzol, Methanol, Äthanol, Aceton, Cyclohexanon, Dimethylformamid u. ä. In die Präparate können gegebenenfalls beliebige oberflächenaktive Mittel als Ausbreitungshilfsmittel, Dispergiermittel, Netzmittel und/oder Emulgiermittel eingearbeitet werden.

Die erfindungsgemäße Substanz SF-1293 weist auch eine kräftige Wirkung gegen Trichophyton asteroides auf, welches Trichophytose hervorruft. Die erfindungsgemäße Substanz SF-1293 eignet sich infolgedessen auch zur therapeutischen Behandlung der Trichophytose. Zur Behandlung der Trichophytose kann die Substanz SF-1293 zu einer Lösung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Äthanol oder zu einer Salbe verarbeitet werden; diese Präparate können äußerlich auf die Haut aufgebracht werden, an denen eine Trichophytose entstanden ist. Die Substanz SF-1293 weist eine geringe Toxizität auf. Die akute Toxizität der Substanz SF-1293 wurde geprüft, indem man Gruppen von Mäusen mit je 5 Tieren die Substanz SF-1293 in wäßriger Lösung intravenös injizierte. Keine der Mäuse in den Gruppen starb, wenn Dosen in Höhe von 25 mg pro kg und 50 mg pro kg verabreicht wurden. Alle Mäuse einer Gruppe waren jedoch tot, wenn die Dosis an Substanz SF-1293 auf 100 mg pro kg gesteigert wurde.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1293 besteht in der Züchtung eines die Substanz SF-1293 produzierenden Stammes von Streptomyces hygroscopicus, identifiziert als ATCC Nr. 21 705 unter aeroben Bedingungen in einem KuI-turmedium, welches assimilierbaren Stickstoff und assimilierbaren Kohlenstoff enthält, Die Substanz SF-1293 wird bei dem Verfahren in dem Kulturmedium erzeugt und angereichert und kann anschließend aus diesem isoliert werden.

Der Stamm SF-1293, der von der Anmelderin zuerst aus einer Bodenprobe isoliert worden ist, wurde bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C, USA, unter der ATCC-Nummer 21 705 (eine Kultur dieses Stammes wurde bei ATCC am 16. Juli 1971 empfangen) sowie bei der japanischen öffentlichen Hinterlegungsstelle »Fermentation Research Institute«, Chiba, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 996 hinterlegt.

Streptomyces hygroscopicus SF-1293 weist folgende mikrobiologischen Kenndaten auf:

(I) Morphologische Kenndaten

Das Luftmycel ist gut ausgebildet, und Sporen bilden sich in reichlicher Menge auf Stärke-Agar, Hafermehl-Agar, Hefe-Malz-Agar und Tyrosin-Agar. Das Luftmycel ist einfach verzweigt, verzweigt sich jedoch nicht in Form von Wirbeln. An der Spitze des Luftmycels bilden sich geschlossene kompakte oder offene kurze Spiralen. Die Bildung einer Lederhaut (Sklerotium) konnte nicht beobachtet werden. Bei der Beobachtung unter dem Elektronenmikroskop zeigte sich, daß die Oberflächenstruktur der Sporen glatt ist. Die Sporen haben eine elliptische bis ovale Form, wobei 10 oder mehr Sporen üblicherweise miteinander verknüpft sind. Die Größe der Sporen beträgt 0,6 bis 0,8 mal 0,8 bis 1,1 Mikron.

(N)

Die Charakteristika auf verschiedenen Kulturmedien sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperaturbereich: gutes Wachstum erfolgte bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 4O⁰C auf Hefe-Malz-Agar-Schrägboden als Medium.

(2) Verflüssigung von Gelatine: während einer 30tägigen Inkubation bei 20⁰C konnte keine Verflüssigung beobachtet werden.

(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (stark).

(4) Koagulation von Magermilch: negativ (sowohl bei 28⁰C als auch bei 37⁰C).

(5) Peptonisierung von Magermilch: positiv (sowohl bei 28⁰CaIs auch bei 37°C).

(6) Bildung eines melaninähnlichen Pigmentes: negativ:

(IV) Verwertung des angebotenen assimilierbaren Kohlenstoffes

(geschätzt in einem Pridham-Gottliebs-Agar-Medium)

(1) Verwertung: D-Glucose, D-Fructose, D-Mannitol, Sucrose und Raffinose.

(2) Zweifelhaft: D-Xylose und L-Arabinose.

(3) Nicht verwertet: L-Inositol und Rhamnose.

Die vorstehend aufgeführten mikrobiologischen Kenndaten von Streptomyces hygroscopicus SF-1293 (im folgenden einfach als Stamm SF-1293 bezeichnet) können wie folgt zusammengefaßt werden: Das Luftmycel bildet Spiralen, und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt. Die Farbe des Wachstums liegt zwischen cremefarbig bis hellgelb zu gelbbraun. Das Luftmycel ist graubraun gefärbt und wird allmählich hygroskopisch. Die Bildung eines löslichen Pigmentes konnte weder auf synthetischen noch auf organischen Kulturmedien beobachtet werden; der Stamm SF-1293 ist infolgedessen als nichtchromogen zu bezeichnen.

Die vorstehend aufgeführten Eigenschaften des Stammes SF-1293 stimmen gut mit denen der bekannten Art Streptomyces hygroscopicus überein. Der Stamm SF-1293 zeichnet sich durch folgende drei Eigenschaften aus:

(a) das Luftmycel bildet Spiralen,

(b) das gebildete Luftmycel weist eine graubraune Farbe auf, und

(c) das Luftmycel wird hygroskopisch.

Diese Eigenschaften sind charakteristisch für die bekannte Art Streptomyces hygroscopicus.

Tabelle III

Kulturmedium	Wachstum	Luftmycel	Lösliches Pigment
Sucrose-Nitrat-Agar	farblos bis schwachbraun mit schwachgrünlichem Stick	schwach, weiß bis weißgraue Farbe	keins
Glukose-Asparagin- Agar	cremefarbig bis Schwachgrün	weiß, später in ein leicht grün liches Braun umschlagend	keins
Glycerin-Asparagin- Agar	cremefarbig bis hellgelb	schwach entwickelt, weiß	keins
Stärke-Agar	gutes Wachstum, cremefarbig mit schwachgrünlichem Stich, allmählich umschlagend in hellbraun	reichlich, graubraun, allmählich hygroskopisch werdend	keins
Tyrosin-Agar	gutes Wachstum, gelblichcreme- farbig bis hellgelblichbraun	reichlich, graubraun, allmählich hygroskopisch werdend	keins
Nähr-Agar	schwaches Wachstum, hellgelb	dürftig ausgebildet, weiß	keins
Hefe-Malz-Agar	gutes Wachstum, gelblichbraun	reichliches Wachstum, braungrau, allmählich hygroskopisch wer dend	keins
Hafennehl-Agar	gutes Wachstum, hellgraugrün	reichlich ausgebildet, graubraun, allmählich hygroskopisch wer dend	keins
Hefe-Stärke-Agar	gutes Wachstum, gelblichbraun	reichlich ausgebildet, braungrau, allmählich hygroskopisch wer dend	keins
Kartoffelstücke	erhabenes Wachstum, stark schrumplig, hellbraun	nicht beobachtet	keins

Bemerkungen: die Inkubationstemperatur betrug bei allen Kulturmedien 28°C.

Ein Vergleich des Stammes SF-1293 mit dem bekannten Stamm Streptomyces hygroscopicus wurde gemäß der Waksman's Beschreibung [Waksman's »The Actinomycetes«, Bd. 2, S. 230 und 231 (1961)] durchgeführt. Es konnte festgestellt werden, daß der Stamm SF-1293 sich von der bekannten Art Streptomyces hygroscopicus hinsichtlich der Farbe, das Wachstums auf Sucrose-Nitrat-Agar und Glukose-Asparagin-Agar sowie hinsichtlich der Bildung eines löslichen Pigmentes unterscheidet; hinsichtlich der übrigen Bedingungen des Wachstums und der physiologischen Eigenschaften stimmt der Stamm SF-1293 mit der bekannten Art Streptomyces hygroscopicus überein.

Der Stamm SF-1293 stimmt also mit dem bekannten Stamm Streptomyces hygroscopicus, der in Waksman's Beschreibung erwähnt ist, hinsichtlich der vorstehend erwähnten grundlegenden drei Eigenschaften überein, unterscheidet sich jedoch von diesem hinsichtlich einiger unwesentlicherer Eigenschaften. Die Feststellung, daß der Stamm SF-1293 zur Gattung Streptomyces. hygroscopicus gehört, dürfte demnach gerechtfertigt sein. Die Anmelderin hat infolgedessen den Stamm SF-1293 als Streptomyces hygroscopicus SF-1293 bezeichnet, damit dieser von dem bekannten Stamm Streptomyces hygroscopicus unterscheidbar ist.

Als Nährstoffquellen kommen alle Nährsubstanzen in Frage, die auch üblicherweise bei der Züchtung von bekannten Streptomyces -Stämmen eingesetzt werden. Beispielsweise kann man Glukose, Stärke, Glycerin, Sukrose, Stärkesirup, Melasse u. ä. als Kohlenstoffquelle verwenden. Sojabohnenmehl, Weizen-Embryo, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe, Maisweichwasser, lösliches Pflanzenprotein, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat u. ä. können als Stickstoffqueilen verwendet werden. Gegebenenfalls können, wenn erforderlich, auch anorganische Salze wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Eisensulfat, Nickelchlorid, Phosphate u. ä. dem Kulturmedium zugesetzt werden. Weiterhin kann das Kulturmedium mit organischen und anorganischen Materialien versetzt werden, die das Wachstum des Stammes SF-1293 unterstützen und die Bildung der Substanz SF-1293 fördern.

Als Züchtungsmethode für den Stamm SF-1293 hat sich die flüssige Kultivierung und insbesondere die

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flüssige Kultivierung unter submersen aeroben Bedingungen bewährt; die angewandten Methoden entsprechen praktisch genau denen, die auch bei der Züchtung bekannter Antibiotika angewandt werden. Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen und bei einer Inkubationstemperatur zwischen 25 und 35⁰C durchgeführt. Bei der Produktion im technischen Maßstab oder auch im Laboratorium wählt man als Züchtungstemperatur häufig 28°C. Unter diesen Bedingungen erreicht die Konzentration an Substanz SF-1293 in der Kulturbrühe am Ende von 3 bis 5 Tagen sowohl bei der Schüttel-Kultivierungsmethode als auch bei der Tank-Kultivierungsmethode ein Maximum.

Zur Prüfung der Substanz SF-1293 kann beispielsweise folgende Methode dienen: Das bei der Prüfung verwendete Kulturmedium kann aus 2,5% Glukose, 0,2% Natriumnitrat, 0,1% Monokaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Kaliumphosphat, 0,01% Ferrosulfat, 1,5% Agar zusammengesetzt sein und einen pH-Wert von 6,0 aufweisen. Als Mikroorganismus kann bei der Prüfung Pellicularia sasakii benutzt werden. Bei dieser Prüfmethode kann bei einer Konzentration von 1 Mikrogramm meg pro ml bis 32 Mikrogramm pro ml Substanz SF-1293 die Relation zwischen dem Logarithmus der Konzentration und dem Durchmesser der Inhibierungszone linear aufgetragen werden, derart, daß sich eine Inhibierungszone mit einem Durchmesser von 24 bis 50 mm ergibt (bestimmt nach der Schalen-Platten-Methode).

Zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, die durch Fungi hervorgerufen worden sind, kann die die Substanz SF-1293 enthaltende Kulturbrühe, die bei der Kultivierung des Stammes SF-1293 erhalten worden ist, direkt ohne Isolierung der Substanz SF-1293 auf die Pflanzen aufgebracht werden. Andererseits ist es aber auch möglich, die Substanz SF-1293 aus der Kulturbrühe zu isolieren und zu reinigen, wobei man nach üblichen und bekannten Methoden, die für die Abtrennung und Reinigung von Antibiotika allgemein angewandt werden, verfahren kann.

Die Substanz SF-1293, die bei der Kultivierung des Stammes SF-1293 entsteht, ist im wesentlichen in der flüssigen Phase der Kulturbrühe gelöst. Da die Substanz SF-1293, wie weiter vorn bereits erwähnt, eine wasserlösliche und amphotere Substanz ist, kann sie aus der Kulturbrühe isoliert werden, indem man sie zunächst entweder an einem Kationenaustauscherharz oder einem Anionenaustauscherharz adsorbiert und danach aus dem Harz mit einer wäßrigen Lösung einer geeigneten Säure, einer geeigneten Lauge oder einem geeigneten Salz eluiert. Als Kationenaustauscherharz kommt beispielsweise ein sulfoniertes Polystyrolharz oder ein sulfoniertes Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol in Frage. Als Anionen-Austauscherharz eignet sich beispielsweise ein quaternäres Ammoniumhydroxid-derivat von Polystyrol, welches — N — (CH₃)₃OH-Gruppen als funktionell Gruppen enthält, ein polyaminiertes Polystyrol oder ein polyaminiertes Phenol-Formaldehyd-Copolymer.

Zur Isolierung der Substanz SF-1293 aus der mit dem Stamm SF-1293 gewonnenen Kulturbrühe filtriert man zunächst die Kulturbrühe, trennt den Filterkuchen (das ist die feste Phase der Brühe, die den Mycelkuchen enthält) von dem Filtrat (das ist die flüssige Phase der Kulturbrühe), leitet das Filtrat durch eine stark saure Kationen-Austauscherharzkolonne, z. B. eine Kolonne mit einem sulfonierten Copolymer aus Styrol und Divinylbenzol, und eluiert schließlich die Harzkolonne mit einem wäßrigen Ammoniakstrom. Das Eluat kann im Vakuum eingedampft werden, wodurch man die Substanz SF-1293 als Rohrprodukt in Pulverform gewinnt.

S Zur Reinigung des so gewonnenen pulverförmigen Rohproduktes der Substanz SF-1293 kann man dasselbe an Cellulose, Kieselsäuregel, Kieselsäure oder Dextrangel, welches mit Epichlorhydrin vernetzt worden ist, chromatographieren. Auf diese Weise kann ίο man die Substanz SF-1293 in Form eines reinen, weißen, amorphen Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 159 bis 161°C gewinnen.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung wird nunmehr auf die folgenden Beispiele verwiesen.

Beispiel 1

Eine Vorratskultur von Streptomyces hygroscopicus SF-1293 (identifiziert als ATCC Nr. 21 705) wurde als Impfgut in 151 eines flüssigen Kulturmediums aus 2,0% Stärke, 1,0% Pepton, 0,3% Fleischextrakt und 0,05% Dikaliumphosphat, welches einen pH-Wert von 7,0 aufwies, gegeben und bei 28⁰C 24 Stunden unter Belüftung und Rühren weitergezüchtet, so daß man auf diese Weise eine Impfkultur erhielt.

Die so gewonnene Impfkultur wurde auf 2001 eines flüssigen Kulturmediums aus 3,0% Glukose, 1,0% Stärkesirup, 2,5% Weizen-Embryo, 0,5% löslichem Pflanzenprotein, 0,1% Sojabohnenöl, 0,1% Hefeextrakt, 0,001% Ferrosulfat, 0,0001% Nickelchlorid und 0,0001 % Kobaltchlorid, welches einen pH-Wert von 7,0 aufwies, übertragen und bei 28⁰C 96 Stunden lang unter Belüftung und Rühren weitergezüchtet. Die schließlich vorliegende Kulturbrühe wurde durch Zugabe von 6n-Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und anschließend filtriert, so daß man 1501 eines Brühenfiltrates gewann (Aktivität: 110 Mikrogramm pro ml).

Das Brühenfiltrat wurde durch eine Kolonne mit Aktivkohle (Volumen: 7,51) geleitet; anschließend wurden 301 Wasser zum Waschen durch die Kolonne gegeben. Die die Kolonne verlassende Lösung und die Waschwässer wurden vereinigt (zu einem Gesamtvolumen von 1801), und die vereinigten Lösungen wurden durch eine Kolonne mit 9 1 eines Kationen-Austauscherharzes geleitet; letzteres bestand aus einem polysulfonierten Styrol-Divinylbenzol-Copolymer vom Η-Zyklus (Handelsprodukt »Dowex 5OW-X2«) in Form von Kügelchen mit einer Größe, die einem Prüfsieb mit 50 bis 100 Maschen entspricht. Die aktive Substanz wurde an dem Kationen-Austauscherharz adsorbiert. Die Harzkolonne wurde mit Wasser gewaschen und dann unter Verwendung von 0,05 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereinigt (zu einer Gesamtvolumenmenge von 451), und die Lösung wurde unter vermindertem Druck eingedampft, so daß man 50 g eines pulverförmigen Rohproduktes von hellgelbbrauner Farbe (Aktivität: 200 Mikrogramm pro mg) erhielt.

20 g des so gewonnenen pulverförmigen Rohproduktes wurden in 2 1 destilliertem Wasser gelöst, Die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne mit 1,7 1 des bereits beschriebenen Kationen-Austauscherharzes (Dowex 50W-X2), welches jetzt jedoch in Form von

«5 Kügelchen mit einer Größe entsprechend einem Prüfsieb mit 200 bis 400 Maschen vorlag, geleitet, so daß die aktive Substanz an dem Kationen-Austauscherharz adsorbiert wurde. Die Harzkolonne wurde mit Wasser

gewaschen und anschließend mit 0,01η wäßrigem Ammoniak eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von je 2,5 I aufgefangen wurde. Die Fraktionen 37 bis 42, die eine fungizide Wirkung aufwiesen, wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt. Man erhielt so 3,1 g eines weißen Pulvers, welches die Substanz SF-1293 enthielt (Aktivität: 680 Mikrogramm pro mg). 500 mg dieses Pulvers wurden in 4 ml destilliertem Wasser gelöst; die entstandene Lösung wurde an einer Kolonne mit 800 ml eines Dextrangels, welches mit Epichlorhydrin vernetzt war (das unter der Handelsbezeichnung »Sephadex G-10« erhältliche Produkt). Chromatographien. Die adsorbierte aktive Substanz wurde chromatographisch entwickelt, indem man destilliertes Wasser durch die Dextrangel-Kolonne leitete und das Eluat in Fraktionen von je 6 ml auffing. Die Fraktionen 55 bis 58, die einen Einzelfleck der Substanz SF-1293 bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose (unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol-Essigsäure-Wasser (2:1:1) bei der Entwicklung) ergaben, wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt; man erhielt so 210 mg der Substanz SF-1293 als reines weißes Pulver (Aktivität: 1000 Mikrogramm pro mg).

Beispiel 2

5 g des hellbraunen pulverförmigen Rohproduktes, welches in Beispiel 1 erhalten worden war, wurden in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst; die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne mit 300 ml des Anionen-Austauscherharzes »Amberlite IRA-400« geleitet. Die aktive Substanz wurde an dem Anionen-Austauscherharz adsorbiert. Die Harzkolonne wurde dann mit Wasser gewaschen und mit 0,2 n-Schwefelsäure eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden zu einer Gesamtmenge von 800 ml vereinigt, und die eluierte Lösung wurde mit Bariumcarbonat versetzt. Das gebildete Bariumsulfat wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde sofort unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft; man erhielt auf diese Weise 2,1 g eines Pulvers mit einer hellgelben Farbe.

Dieses Pulver wurde in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, welche ] 00 ml eines Anionen-Austauscher-Dextrangels mit Diäthylaminoäthyl als funktioneilen Gruppen, welches in Form des Chlorides vorlag (Handelsprodukt mit der Bezeichnung »DEAE-Sephadex A-25«), enthielt. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und chromatographisch unter Verwendung von 0,02m wäßriger Natriumchloridlösung entwickelt. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden zu einem Gesamtvolumen von 450 ml vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Methanol extrahiert, und die methanolische Lösung wurde von dem ungelöst zurückbleibenden Natriumchlorid abfiltriert. Der methanolische Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingedampft und ergab 520 mg eines weißen Pulvers (Aktivität: 650 Mikrogramm pro mg).

Dieses Pulver wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde mit einer kleinen Menge Cellulosepulver vermischt. Die Mischung wurde getrocknet und auf das obere Ende einer Cellulosekolonne (400 g) gegeben. Die Kolonne wurde mit Hilfe eines Lösungsmittelgemisches entwickelt, welches aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (2:1:1) s bestand.

Das Eluat wurde in Fraktionen von je 15 ml aufgefangen. Die aktiven Fraktionen 71 bis 80 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in lOmldestilliertem Wasser getrocknet. Die wäßrige Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen. Auf diese Weise erhielt man 240 mg der Substanz SF-1293 in Form eines reinen weißen Pulvers (Aktivität: 1000 Mikrogramm pro ml).

B e i s ρ i e 1 3

Eine Vorratskultur von Streptomyces hygroscopicus SF-1293 (identifiziert als ATCC Nr. 21 705) wurde in 800 ml eines flüssigen Kulturmediums aus 2,0% Glukose und 2;0% getrockneter Bouillon, welches einen pH-Wert van 7 aufwies, geimpft und bei 28⁰C unter Belüftung und Rühren 30 Stunden weiter gezüchtet, so daß man eine Impfkultur erhielt.

Diese Impfkultur wurde auf 351 eines flüssigen Kulturmediums übertragen, ewlches aus 2,5% Melasse, 1,0% Glukose, 2,5% entfettetem Baumwollsamenmehl, 0,1% Hefeextrakt und 0,5% Weizen-Embryo bestand und einen pH-Wert von 7 aufwies; anschließend wurde bei 28⁰C unter Belüftung und Rühren 72 Stunden inkubiert. Die gewonnene Kulturbrühe wurde durch Zugabe von 6 n-Chlorwasserstoff-

säure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und dann

filtriert; man erhielt so 301 eines Brühenfiltrates

(Aktivität: 180 Mikrogramm pro ml).

Dieses Brühenfiltrat wurde zur Isolierung und Reinigung der Substanz SF-1293 in derselben Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Man erhielt 820 mg der Substanz SF-1293 in Form eines reinen weißen Pulvers (Aktivität: 1000 Mikrogramm pro ml).

B e i s ρ i e 1 4

Dieses Beispiel dient zur Erläuterung der starken Wirkung der Substanz SF-1293 bei der Bekämpfung des Schalenroates bei Reispflanzen.

Ein InokulUm des Reisschalenrost hervorrufenden Mikroorganismus (Pellicularia sasakii) wurde auf im Wasser stehende Reispflanzen in einem Reisfeld übertragen. In der Anfangsphase der Infektion, in der alle Reispflanzen gleichmäßig infiziert erschienen, wurde eine Testlösung, die die aktive Substanz in der in der folgenden Tabelle IV angegebenen Konzentration enthielt, auf die infizierten Reispflanzen aufgesprüht. 5 Tage nach dem ersten Aufbringen der Testlösung wurde dieselbe gegebenenfalls noch ein zweites Mal aufgebracht. Die Testlösung wurde in einer Menge von 150 1 pro 10 Ar aufgebracht. 14 Tage nach der ersten Anwendung der Testlösung wurde die Länge der größten Läsion, die sich unter einer großen Zahl von Läsionen, die an allen Reispflanzen entstanden waren, bei 40 Reispflanzen pro Feldstück, entweder behandelt oder unbehandelt, gemessen. Das Maß der Bekämpfung wurde nach folgender Gleichung berechnet:

Ausmaß der Bekämpfung in % = ( 1 —

Durchschnittliche Länge der am stärksten entwickelten Läsion
in dem Feldstück der behandelten Reispflanzen

Durchschnittliche Länge der am stärksten entwickelten Läsion
in dem Feldstück der unbehandelten Reispflanzen

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV enthalten.

Tabelle IV

Geprüfte aktive Substanz (Konzentration)	Häufigkeit der Anwendung	Durchschnittl. Länge der am stärksten entwickelten Läsion	Ausmaß der Bekämpfung
Substanz SF-1293 (40 ppm) Substanz SF-1293 (20 ppm) Polyoxine (40 ppm) (als Vergleichs substanz) Unbehandelt	1 2 2	12,1 mm 10,7 mm 20,7 mm 41,1 mm	70,6% 74,0% 49,4% 0

Aus den Daten in der vorstehenden Tabelle geht deutlich hervor, daß die Substanz SF-1293 eine wesentlich höhere Wirkung bei der Bekämpfung des Schalenrostes bei Reispflanzen im Reisfeld aufweist als die bekannten Polyoxine, die zu den Antibiotika gehören, die man schon gegen Schaltenrost eingesetzt hat.

Bei weiteren Versuchen wurde eine wäßrige Lösung mit einer Konzentration an Substanz SF-1293 von 30 ppm über Reispflanzen, die in Töpfe gepflanzt waren, gesprüht. Nachdem die aufgesprühte Lösung getrocknet war, wurde ein Inokulum von Pellicularia sasakii über die behandelten Reispflanzen gesprüht. Die geimpften Reispflanzen wurden dann 5 Tage bei 30⁰C in einem Gewächshaus bei hoher Luftfeuchtigkeit inkubiert. Anschließend wurden die Reispflanzen visuell geprüft, wobei festgestellt werden konnte, daß die Pflanzen vollständig gegen eine Infektion durch Schalenrost geschützt worden waren.

Beispiel 5

Eine Testlösung, die eine aktive Substanz in der in der folgenden Tabelle V angegebenen Konzentration

ao enthielt, wurde mit einer Spritzpistole gleichmäßig auf im Wasser wachsende Reispflanzen aufgesprüht, die sich im echten 4-Blätter-Wachstums-Stadium befanden und in Töpfe von 9 cm gepflanzt waren. Die Testlösung wurde in einer Menge von 35 ml auf je 2 Töpfe aufgesprüht. Nachdem die aufgesprühte Lösung an der Luft getrocknet war, wurden die behandelten Reispflanzen bei 25⁰C und hoher Feuchtigkeit in einem Gewächshaus abgestellt. In dem Gewächshaus wurde eine wäßrige Suspension von Sporen des Reisbrand hervorrufenden Mikroorganismus (Piricularia oryzae) auf die behandelten Pflanzen aufgesprüht, um diese zu infizieren. 5 Tage nach der Infizierung wurde die Zahl der Läsionen pro Blatt an den infizierten Reispflanzen gezählt. Das Ausmaß der Bekämpfung wurde nach folgender Gleichung berechnet:

Ausmaß der Bekämpfung in % = II — Durchschnittliche Zahl der Läsionen pro Blatt in der Menge der behandelten Reispflanzen

Durchschnittliche Zahl der Läsionen pro Blatt in der Menge der unbehandelten Reispflanzen

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V enthalten.

Tabelle V

Geprüfte aktive Substanz Konzentration
(ppm) der aktiven
Substanz in der aufgesprühten Testlösung

Durchschnittl. Zahl
der Läsionen pro Blatt

Ausmaß der Bekämpfung

(X)

Substanz SF-1293

Kasugamycin (Vergleichssubstanz) ...

Phenylquecksilberacetat (Vergleichssubstanz)

Unbehandelt

24

50

100

25

50

100 (als Hg)

0,5
0,1
0

1,9
1,1
0,5

1,1
11,8

96

99

100

84 91 96

91 0

Aus den Ergebnissen in der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß die Substanz SF-1293 bei der Bekämpfung von Reisbrand eine bessere Wirkung entfaltet als Kasugamycin und Phenylquecksilberacetat, die häufig für diesen Zweck verwendet werden.

Beispiel 6

Die Substanz SF-1293 wurde zu einer hydrophilen Salbe verarbeitet, und zwar so, daß diese 3% der Substanz SF-1293 in inniger Mischung mit einer Mix-

tür aus Cetanol-Polyäthylenglykol (Handelsprodukt schriebene Salbe auf die Hautstellen aufgebracht, und

»Emuigen 408«) — weiße Vaseline — Wasser zwar in einer Menge von 0,2 g pro Stelle. Die Anwen-

(18 : 5: 38: 39) als Salbengrundlage enthielt. dung der Salbe wurde 10 Tage lange einmal täglich

Gruppen von männlichen weißen Meerschweinchen fortgesetzt. Eine der vier Stellen wurde als Kontroll-

(10 Meerschweinchen pro Gruppe) mit einem durch- 5 stelle (unbehandelt) benutzt und nach der Infektion

schnittlichen Körpergewicht von 240 g wurden als Ver- nicht mit Salbe behandelt. 12 Tage nach der Infektion

suchstiere verwendet. wurden die Meerschweinchen getötet und jeweils

An vier verschiedenen Stellen auf dem Rücken der 3 Hautstückchen mit einer Größe von 3 · 3 mm aus Meerschweinchen wurden die Haare entfernt, so daß jeder der vier für den Test benutzten Hautstellen geFlecke von etwa 4 · 4 cm freilagen. Die Haut wurde an io schnitten. Alle Hautstückchen wurden bei 27°C 7 Tage diesen Stellen leicht mit Bimsstein abgerieben. Die so auf Sabourand's Agarmedium inkubiert, um so die vorbereiteten Stellen wurden mit einer Suspension von Anwesenheit des eingeimpften Mikroorganismus zu Trichophyton asteroides — das ist einer der Tricho- prüfen. Das Ausmaß der Inhibierung der Infektion phytose hervorrufenden Mikroorganismen — infiziert. durch Trichophyton asteroides wurde nach folgender 2 Tage nach der Infektion wurde die vorstehend be- 15 Gleichung ausgedrückt:

(Zahl der inkubierten Hautstückchen, auf denen die Anwesen- \
heit des Fungus festgestellt wurde I ,

1 2 2 I · 100 Gesamtzahl der inkubierten Hautstücken /

Es konnte festgestellt werden, daß das Ausmaß der stanz SF-1293 eine wirksame therapeutische Behand-

Inhibierung bei den mit SF-1293 behandelten Haut- lung von Infektionen durch Trichophyton asteroides

stellen bei 73,3%, dagegen bei 0% auf den Kontroll- 25 erlaubt,
stellen (unbehandelt) lag. Das beweist, daß die Sub-

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche: 1. Antibiotikum SF-1293 mit fungizider Wirkung, welches der Formel

   CH_a NH₂ CH₃ CH

   ! I I I "

   HO — P — CH₂ — CH₂ — C — CONH — C — CONH — C — COOH O HHH