DE2152548B2

DE2152548B2 - Verfahren zur herstellung von l-hydroxyphenylalanien

Info

Publication number: DE2152548B2
Application number: DE19712152548
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Zushi; Nakazawa Enei
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1970-10-21
Filing date: 1971-10-21
Publication date: 1977-11-10
Also published as: DE2152548A1; FR2113090A5; DE2152548C3; GB1321201A

Description

Ri

in der Ri und R₂ die vorstehende Bedeutung ι-, haben,

(b) 0,1 bis 20% GewVVol. Ammoniumionen und

(c) einer oder mehreren der Säuren: Pyruvinsäure, Oxalessigsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure und Milchsäure oder deren Salze

bei Temperaturen von 10 bis 50° C und bei einem pH-Wert von 4 bis 11 in Gegenwart einer jS-Tyrosinase umsetzt, die mit Hilfe der Mikroorganismen j-,

Escherichia coli ATCC 3655,

Aerobacter aerogenes ATCC 7256,

Citrobacter freundii ATCC 6750,

Citrobacter freundii ATCC 8090,

Erwinia herbicola ATCC 21433, Erwinia herbicola ATCC 21434,

Pseudomonas perlurida ATCC 490,

Xanthomonas campestris ATCC 7381,

Proteus mirabilis ATCC 15290,

Salmonella gallinarum ATCC 9148, .r,

Paracolobactrum coliforme ATCC 11605 und

Alcaligenes f aecalis ATCC 8315
hergestellt worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Phenolverbindung teilweise -,o während der Reaktion zur Lösung zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung ein Reduktionsmittel und/oder ein Komplex- oder Chelatbildungsmittel in einer Konzentration von 0,01 bis 1 % Gew./Vol. -,-> enthält.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ι L-Hydroxyphenylalaninen.

_-3,4-DihydroxyphenyIalanin (nachstehend als )PA bezeichnet) wird zur Behandlung der Parkinsonien Krankheit verwendet, L-Tyrosin ist eine der sentlichen Aminosäuren und L-2,4-DihydroxyphenyI-nin ist als Nährmittel und Lebensmittelzusatz iiirhhar

DOPA Kann aus Zwischenprodukten, wie Piperonylaldehyd, Vanillin, Tyrosin und Brenzcatechin synthetisch hergestellt werden, oder es kann durch" Extraktion natürlicher Saaten erhalten werden. DOPA kann biochemisch aus Brenzcatechin und L-Tyrosin mittels /J-Tyrosinase, die aus einem Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört, hergestellt werden. L-Tyrosin wird in technischem Umfang nur durch Extraktion von natürlichen Substanzen erzeugt. Es ist neu, daß L-2,4-Dihydroxyphenyl alanin biochemisch synthetisiert werden kann.

Es ist bekannt, daß das Enzym 0-Tyrosinase die Zersetzung von L-Tyrosin zu Phenol, Brenztraubensäure und Ammoniak katalysiert. Wie angegeben, erzeugt j3-Tyrosinase auch DOPA aus Brenzcatechin und L-Tyrosin.

Aufgabe der Erfindung ist die Erzeugung von L-Hydroxyphenylalaninen nach einem biochemischen Verfahren bei niedrigen Kosten aus leicht zur Verfügung stehenden Rohmaterialien und durch einfachere und bequemere Behandlungen, als dies bei bekannten Verfahren der Fall ist.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung von L-Hydroxyphenylalaninen der allgemeinen Formel

in der R₁ und R₂ Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe bedeuten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige Lösung aus:

(a) 0,1 bis 20% Gew/Vol. eine Phenolverbindung der allgemeinen Formel

in der Ri und R2 die vorstehende Bedeutung haben,

(b) 0,1 bis 20% Gew./Vol. Ammoniumionen und

(c) einer oder mehreren der Säuren: Pyruvinsäure, Oxalessigsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure und Milchsäure oder deren Salze

bei Temperaturen von 10 bis 50⁰C und bei einem pH-Wert von 4 bis 11 in Gegenwart einer /J-Tyrosinase umsetzt, die mit Hilfe der Mirkoorganismen Escherichia coli ATCC 3655,

Aerobacter aerogenes ATCC 7256, Citrobacter freundii ATCC 6750, Citrobacter freundii ATCC 8090, Erwinia herbicola ATCC 21433, Erwinia herbicola ATCC 21434, Pseudomonas perlurida ATCC 490, Xanthomonas campestris ATCC 7381, Proteus mirabilis ATCC 15290, Salmonella gallinarum ATCC 9148, Paracolobactrum coüforme ATCC 11605 und

Alcaligenes f aecaliü ATCC 8315, hergestellt worden ist.

Die Quelle von jS-Tyrosinase kann aus einer Brühe bestehen, in der ein Mikroorganismus gezüchtet ist,

,der einem zellfreien Filtrat davon, einer wäßrigen • sDension von gemahlenen Zellen, einem Filtrat davon 'der einer reinen Enzymbereitung bestehen. ' Die zum Züchten der Mikroorganismen angewende-Medien können aus üblichen Medien bestehen, ^e 1 he Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Sackstoff und die üblichen geringeren Menge Nährstoffen enthalten und auch eine geeignete tv .,ge η Tyrosin einschließen. Die Mikroorganismen sind '°it Erfolg auf Medien gezüchtet worden, die Kohlenhy- ι Hrate wie Glukose, Fructose, Sucrose, Mannose, Maltose, Mannit, Xylose, Galaktose, Stärkehydrolysat _nd Melassen, enthalten. Organische Säuren, wie Essigsäure, Citronensäure, Milchsäure, Fumarsäure, Anfelsäure, «-Ketoglutarsäure, Gluconsäure und Pyru- ι vinsäure (Brenztraubensäure), Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol, Fettsäuren und Kohlenwasserstoffe sind auch als Hauptkohlenstoffauellen oder ergänzende Kohlenstoffquellen für ausgewählte Mikroorganismen geeignet. Die Konzentration der Kohlenstoffquellen in dem Medium liegt gewöhnlich zwischen 0,1 und 10% Gew./Vol., bezogen auf Glukoseäquivalente. Stickstoff kann durch Ammoniumsalze von anorganischen oder organischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure Essigsäure und Kohlensäure, durch Harnstoff und durch Ammoniak in wäßriger Lösung oder im gasförmigen Zustand geliefert werden. Andere organische Substanzen, die Stickstoff enthalten, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt und NZ-Amin werden als zusätzliche oder ergänzende Stickstoffquellen angewendet.

Das Medium soll auch anorganische Salze und geringere Mengen an organischen Nährstoffen enthalfen welche das Wachstum der Mikroorganismen fördern. Die anorganischen Salze können Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(il)-sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat und Calciumcarbonat einschließen Bekannte organische wachstumsfördernde Substanzen umfassen Aminosäuren allgemein, Biotin, Vitamine, organische Säuren, Fettsäuren und Protein und Eiweiß enthaltende Substanzen. Sie können durch Substanzen zugeführt werden, welche das aktive Mittel unter den Züchtungsbedingungen ergeben, wie z.B. Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Magermilch, Chlorellaextrakt und Sojabohnenpro-

teinhydrolysat. ,...,, ,

Tyrosin soll zu dem Medium in einer Menge von mehr als 0,01% und vorzugsweise von 0,05 bis 0,5% in Teilen/Vol. zugegeben werden. Das Tyrosin kann sich in der Form von organischen Nährstoffen, wie einer Aminosäuremischung, Polypepton oder Sojabohnenextrakt befinden. .

Aminosäuren, wie Methionin, Uycin und Alanin, Vitamine, wie Pyridoxin, Pyridoxal und Pyridoxalphosphat werden auch dem Züchtungsmedium zugegeben, um die Enzymaktivität zu verbessern. Die Konzentration der zugesetzten Aminosäuren liegt gewöhnlich zwischen 0,01 und 5% Gew./Vol. als freie Aminosäuren, und die Vitamine sind in einer Menge von mehr als 0,5 mg/dl wirksam.

Die Gärung oder Fermentierung wird unter aeroben Bedingungen bei 25 bis 40°C ausgeführt. Vorzugsweise wird der pH-Wert des Züchtungsmediums auf 5,5 bis 8,5 während der Züchtung eingestellt. Die /.üchtung wird allgemein während 10 bis 72 Stunden ausgeführt. Die Brühe kann als Rnzymquelle, wie sie ist, ohne Entfernung der bakteriellen Zellen benutzt werden. Ein zellfreies Filtrat der Züchtungsbrühe und eine Suspension von zerkleinerten bakteriellen Zellen, die durch Zerreiben, Autolyse oder Ultraschallschwingungen bereitet ist, werden aus als Enzymquelle gemäß der Erfindung verwendet. Rohes Enzym und reines Enzym, das durch Zentrifugieren, Aussalzen und Lösungsmittelfällung gewonnen ist, können auch zur Anwendung gelangen.

Die L-Hydroxyphenylalanine können dadurch hergestellt werden, daß man Phenoiverbindungen, Ammoniumionen und Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Oxalessigsäure, Apfelsäure, Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure, Milchsäure, Salz der Säuren oder Derivate davon . dem Medium während der Züchtung zusetzt.

Die Phenolverbindungen, welche als Ausgangsmaterial bei dem Verfahren gemäß der Erfindung angewendet werden können, schließen Brenzcatechin, Resorcin und Phenol ein.

Die Säuren, die als Quelle des Alaninanteils der L-Hydroxyphenylalanine dienen, sind Pyruvinsäure (Brenztraubensäure), Oxalessigsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure oder Milchsäure. Die Ammoniumionen können in einer Menge von r> 0,1 bis 10 Gewichtsteilen zugegeben werden. Die Brenztraubensäure, Oxalessigsäure, Apfelsäure, Fumarsäure, Maleinsäureoxim, Glyoxylsäure und Milchsäure können in form der freien Säure, des Ammonium-, Natrium-, Kalium- oder Calciumsalzes vorliegen, es in können jedoch auch die Ester, wie der Methylester oder Äthylester, und andere Derivate zur Anwendung gelangen. Das Ammoniumsalz der betreffenden Säure wird bevorzugt. Die Menge der Säure, die in dem Reaktionssystem vorhanden ist, beträgt 0,1 bis 20% i--i GewVVol., bezogen auf die freie Säure.

Die Reaktion wird bei einem pH-Wert von 4 bis 11 und einer Temperatur von 10 bis 50⁰C ausgeführt. Der pH-Wert des Reaktionssystems wird durch Zusatz von Calciumcarbonat, Ammoniak, Ätzalkali oder Phosphatpufferlösung aufrechterhalten.

Wenn Brenzcatechin und Resorcin als Phenolverbindung zur Erzeugung von DOPA und L-2,4-Dihydroxyphenylalanin angewendet werden, kann die Menge an Endprodukt stark erhöht werden, wenn man ein 4) Reduktionsmittel und/oder ein komplex- oder chelatbildendes Mittel dem Reaktionssystem zusetzt. Beispiele von geeigneten Reduktionsmitteln sind schwefelige Säure, Natriumsulfit, Kaliumsulfit, Ammoniumsulfit, Thioschwefelsäure, Kaliumthiosulfat, Natriumthiosulfat, in Ammoniumthiosulfat, Cystein, j3-Mercaptoäthanol und Ascorbinsäure.

Beispiele von brauchbaren Komplexbildungsmitteln sind Äthylendiamintetraessigsäure bzw. deren Natriumsalz (EDTA), Äthylendiamin, N-Oxyäthylendiamin, > Asparginsäure, N-Dioxyäthylglycin, Nitrilotriacetat, Citronensäure und Thioglycolsäure. Das Reduktionsmittel und die Komplex- oder Chelatbildungsmittel werden im allgemeinen in einer Menge von 0,01 bis 1% GewVVol. angewendet.

wi Wenn Brenzcatechin als Phenolverbindung zur Herstellung von DOPA angewendet wird, kann die Ausbeute von DOPA stark erhöht werden, indem man Borsäure dem Reaktionssystem zusetzt. Die Borsäure kann sich in der Form des Alkalisalzes oder Erdalkalisal-(V) zes befinden und kann in äquimolarer Menge bis zu einem kleinen molaren Überschuß je Mol Brenzcatechin angewendet werden. Das Reduktionsmittel und/ oder das Komplex- oder Chelatbildungsmittel kann

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zusammen mit der Borsäure in dem Reaktionssystem vorhanden sein.

Die in der Reaktionsmischung hergestellten L-Hydroxyphenylalanine können nach üblichen Verfahren gewonnen werden, z. B. kann DOPA nach dem in Journal of Biological Chemistry, Bd. 239, 1964, Seite 2910, beschriebenen Verfahren gewonnen werden.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium, das 0,2 g/dl L-Tyrosin, 0,1 g/dl Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 g/dl Magnesiumsulfat, 0,7 g/dl Fumarsäure, 0,2 g/dl Glucose, 1,0 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Fleischextrakt und 0,01 g/dl Pyridoxin enthielt, wurde hergestellt, der pH-Wert des Mediums mit einer KOH-Lösung auf 8,0 eingestellt und 5 Minuten bei einer Temperatur von 110° C sterilisiert.

60 ml Ansätze des Mediums wurden mit Erwinia herbicola ATCC 21433, die vorher während einer Zeitdauer von 20 Stunden bei 28°C auf einer Peptonagar-Schräge gezüchtet worden war, geimpft und 24 Stunden unter Schütteln bei 31° C gezüchtet.

Zwei Liter der Züchtungsbrühe wurden zur Sammlung der Bakterienzellen zentrifugiert, die Zellen wurden zu einer 2-1-Lösung, die 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat, 10 g/dl Phenol und 1,0 g/dl Ammoniumacetat enthielt, zugegeben und das Gemisch bei einem pH-Wert von 8,0 bei 37°C 20 Stunden stehengelassen. Es wurde festgestellt, daß das Reaktionsgemisch 0,8 g/dl L-Tyrosin enthielt.

10Oy des festen Reaktionsproduktes wurden auf ein Filterpapier gestreut, mit einem Lösungssystem aus Butanol/Essigsäure/Wasser in einem Verhältnis von 4:2:1 entwickelt, und der erhaltene einzelne Fleck wurde mittels der Ninhydrinreaktion und der Millonschen Reaktion als Tyrosin identifiziert. Durch Messen der optischen Drehung wurde bestätigt, daß das Tyrosin zu 100% in der L-Form vorlag.

Es wurde unter Verwendung von 2,0 g/dl Oxalessigsäure und 2,0 g/dl Ammoniumacetat anstelle von 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Ammoniumacetat eine ähnliche Reaktion, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt, und es wurde festgestellt, daß das Reaktionsgemisch 0,7 g/dl L-Tyrosin enthielt.

Beispiel 2

Erwinia herbicola ATCC 21433 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, Bakterienzellen, erhalten aus 4 Liter der Brühe, wurden

2 Liter einer Lösung, die 1,0 g/dl Brenztraubensäure, 1,0 g/dl Brenzcatechin, 1,0 g/dl Ammoniumacetat und 0,2 g/dl Kaliumsulfit enthielt und einen pH-Wert von 8,0 hatte, zugegeben, und das Gemisch während 24 Stunden bei 22° C umgesetzt. Es wurde festgestellt, daß das Reaktionsgemisch 0,7 g/dl L-Tyrosin enthielt.

Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde mit

3 n-HCl auf einen Wert von 3,5 eingestellt, das Gemisch 5 Minuten auf 110⁰C erhitzt und die Zellen wurden durch Zentrifugierung entfernt. Der überstehende Teil wurde auf 300 ml eingeengt, der pH-Wert der konzentrierten Lösung wurde auf 1,0 eingestellt, und die Lösung wurde durch eine mit aktiver Holzkohle gefüllte Säule geleitet. 0,1 η-Salzsäure wurde in die Säule eingeführt, um Aminosäurenebenprodukte zu eluieren; DOPA wurde mit verdünntem, 0,2% Natriumsulfit enthaltendem Ammoniakwasser eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, der DQPA-Niederschlag, der sich bildete, wurde durch Zugabe von Salzsäure aufgelöst und konzentriert. Der erhaltene DOPA-Niederschlag wurde dreimal mit Wasser gewaschen, und es wurden 6 g DOPA erhalten. Es wurde festgestellt, daß sich das DOPA gänzlich in der L-Form befand.

Eine ähnliche Reaktion wurde unter Verwendung von 20 g/dl Oxalessigsäure und 2,0 g/dl Ammoniumacetat statt 1 0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Animo· niumac'etat wiederholt; das Reaktionsgemisch enthielt in diesem Fall 0,6 g/dl DOPA.

Beispiel 3

Bakterienzellen von Erwinia herbicola ATCC 21433, erhalten aus 4 Liter der Züchtungsbrühe, wurden 2 Liter einer Lösung zugegeben, die 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat 1,0 g/dl Resorcin, 1,0 g/dl Ammoniumacetat und 0 2 g/dl Natriumsulfit enthielt und einen pH-Wert von 80 hatte Das Gemisch wurde bei 22⁰C 24 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch enthielt 0,4 g/dl L-2,4-Dihydroxyphenylalanin.

Durch Zugabe von Trichloressigsäure wurde Protein aus der Reaktionsmischung entfernt, die sich ergebende Lösung wurde mit einem Anionenaustauschharz und dann mit aktiver Holzkohle behandelt; es wurde rohes, kristallines 2,4-Dihydroxyphenylalanin erhalten. Die rohen Kristalle wurden mit wäßrigem Äthanol gewaschen und ergaben 5,3 g reines Produkt von 2,4-Dihydroxyphenylalanin. Durch optische Drehung wurde bestätigt, daß es sich in der L-Form befand.

Eine ähnliche Reaktion wurde durchgeführt, wobei an Stelle von 1,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Ammoniumacetat 2,0 g/dl Oxalessigsäure und 2,0 g/dl Ammoniumacetat verwendet wurden; es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 0,4 g/dl L-2,4-Dihydroxyphenylalanin enthielt.

Beispiel 4

Aus 100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433 erhaltene Bakterienzellen, die wie in Beispiel 1 gezüchtet worden war, wurden zu den folgenden Lösungen (1), (II), (III) und (IV) hinzugefügt und bei einer Temperatur von 37°C 24 Stunden umgesetzt.

Lösung(I)	1,0 g/dl
Brenztraubensäure	1,5 g/dl
(NH₄J₂SO₄	1,0 g/dl
Phenol	0,5 g/dl
Ammoniumacetat
pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)
Lösung (II)	1,0 g/dl
Brenztraubensäure	1,0 g/dl
Phenol
pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)
Lösung (III)	1,0 g/dl
Kaliumpyruvat	1,0 g/dl
Phenol	2,0 g/dl
Ammoniumacetat
pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)
Lösung (IV)	1,0 g/dl
Kaliumpyruvat	1,0 g/dl
Phenol
pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels KOH)

Es wurde festgestellt, daß L-Tyrosin in einer Menge von 0,7 g/dl in der Lösung (I), in einer Menge von

0,9 g/dl in der Lösung (II) und in einer Menge von 0,9 g/dl in der Lösung (III) produziert worden war; in der Lösung (IV) jedoch wurde auf Grund des Fehlens von Ammoniumionen kein Tyrosin festgestellt.

Beispiel 5

Die in Tabelle 1 angegebenen Bakterien wurden in 60 ml Ansätzen eines Kulturmediums gezüchtet, das 0,2 g/dl Tyrosin, 0,1 g/dl Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 g/dl Magnesiumsulfat, 0,6 g/dl Glycerin, 0,5 g/dl Bernsteinsäure, 2,0 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl Fleischextrakt und 0,01 g/dl Pyridoxin enthielt; die Züchtung wurde während 24 Stunden bei 31⁰C und einem pH-Wert von 7,5 unter Schütteln ausgeführt.

Jeweils 100 ml Züchtungsbrühe wurden zur Isolierung der Bakterienzellen zentrifugiert; die erhaltenen Zellen wurden zu den nachstehend angegebenen 50 ml Lösungen (I), (II) und (III) zugegeben, und das Reaktionssystem der Lösung (I) wurde 20 Stunden bei 37⁰C gehalten. Die Lösungen (II) und (III) wurden 20 Stunden bei einer Temperatur von 20⁰C gehalten. Die Mengen an produzierten phenolischen Aminosäuren sind in Tabelle I aufgeführt.

Lösung (I)

Kaliumpyruvat 2,0 g/dl

Phenol 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

Lösung (II)

Kaliumpyruvat 2,0 g/dl

Brenzcatechin 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

Na₂SO₃ 0,2 g/dl pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

Lösung (III)

Kaliumpyruvat 2,0 g/dl

Resorcin 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

Na₂SO₃ 0,2 g/dl pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

Tabelle I

Verwendete Bakterien

Menge an produzierter phenolischer Aminosäure

L-Tyrosin DOPA 2,4-Dihydroxyplicnyl-

Erwinia hcrbicola
ATCC 21433
Cilrobactcr freuntlii
ATCC 6750
Eschcrichiu coli
ATCC 3655
Citrohnclcr l'rcundii
ATCC 8090
Proteus morganii
IFO 3848
Proteus mirabilis
ATCC 15 290

(g/dl)

1,2
0,9
0,8
0,5
0,5
0,4

(BAU)

alanin (B/dl)

0,8 0,6 0,5 0,3 0,3 0,3

0,7 0,5 0,4 0,4 0,4 0,3

Verwendete Bakterien

Menge an produzierter phenolischer Aminosäure

L-Tyrosin DOPA

2,4-Dihydroxyphenylalanin

(g/dl)

(g/dl) (g/dl)

Pseudomonas perlurida 0,3 0,2 0,2

ATCC 490

Aerobacter aerogenes 0,3 0,2 0,2

ATCC 7256

Salmonella gallinarum 0,5 0,4 0,2

ATCC 9148

Paracolobactrum 0,4 0,3 0,2

coliforme

ATCC 11605

Xanthomonas 0,4 0,2 0,1

campestris

ATCC 7381

Alcaligenes faecalis 0,3 0,1 0,1

ATCC 8315

Ähnliche Reaktionen wurden wiederholt, wobei statt Kaliumpyruvat in den Lösungen (I) bis (III) 2,0 g/dl Oxalessigsäure verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Verwendete Bakterien

Menge an produzierter phenolischer Aminosäure

L-Tyrosin DOPA 2,4-Dihydroxy- phenylalanin

(g/dl)

(g/dl) (g/dl)

Erwinia herbicola 1,0 0,8 0,6

ATCC 21 433

Citrobacter freundii 0,8 0,6 0,5

ATCC 6750

Proteus mirabilis 0,8 0,5 0,5

ATCC 15 290

Pseudomonas perlurida 0,5 0,5 0,5

ATCC 490

Aerobacter aerogenes 0,5 0,5 0,5

ATCC 7256

Salmonella gallinarum 0,5 0,3 0,3

ATCC 9148

Citrobacter freundii 0,4 0,2 0,3

ATCC 8090

Paracolobactrum 0,4 0,2 0,2

coliforme

ATCC 11 605

Xanthomas campestris 0,3 0,2 0,2

ATCC 7381

Alcaligenes faecalis 0,3 0,2 0,1

ATCC 8315

Beispiel 6

Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 5 gezüchtet; 10 Liter der Züchtiingsbrühc wurden zur Sammlung der Bakterien-

zellen zentrifugiert, und die erhaltenen Zellen wurden durch Ultraschallwellen von 20 kHz 20 Minuten in einer 0,05 m Phosphatpufferlösung aufgebrochen. Die sich ergebende Lösung wurde zur Entfernung der Bakterienzellen zentrifugiert, das Enzym des überstehenden Teiles wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat ausgefällt und durch Behandlung mit Protamin und Cellulose-Ionenaustauscher raffiniert. 50 mg (als Protein) des erhaltenen Enzymes wurden einer 100-ml-Lösung, die 1,0 g/dl Ammoniumacetat, 2,0 g/dl Ammoniumsulfat, 2,0 g/dl Natriumpyruvat, 1,3 g/dl Phenol und 2 mg/dl Pyridoxalphosphat enthielt und einen pH-Wert von 8,0 hatte, zugegeben und das Gemisch 20 Stunden bei einer Temperatur von 37° C gehalten. Es wurde festgestellt, daß die Mischung 1,6 g/dl L-Tyrosin enthielt.

Beispiel 7

Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, gezüchtet, 0,7 g Phenol, 2,0 g Kaliumpyruvat und 2,0 g Ammoniumacetat wurden zu 100 ml der Kulturbrühe zugegeben, und der pH-Wert der Mischung wurde auf 8,0 mit Ammoniakwasser eingestellt. Das Gemisch wurde bei 37⁰C bebrütet; jeweils 0,4 g Phenol wurden nach jeweils 2 Stunden lOmal nach der Inkubation der Mischung zugegeben. 10 g Brenztraubensäure und 1,0 g Ammoniumacetat wurden nach 4 bzw. 8 Stunden nach Beginn der Bebrütung der Mischung zugegeben, und die Reaktion wurde insgesamt 42 Stunden lang ausgeführt. Es wurde festgestellt, daß das Reaktionsgemisch 5,2 g/dl L-Tyrosin enthielt.

100 ml der, wie oben beschrieoen, hergestellten Züchtungsbrühe wurden mit 4,7 g Phenol, 4,0 g Kaliumpyruvat und 5,0 g Ammoniumacetat gemischt, und der pH-Wert der Mischung wurde auf 8,0 eingestellt. Die sich ergebende Mischung wurde 42 Stunden bei einer Temperatur von 37°C gehalten; das Reaktionsgemisch enthielt 1,8 g/dl L-Tyrosin.

Eine ähnliche Reaktion wurde wiederholt, wobei statt 2,0 g des anfänglich verwendeten Acetates 4,0 g des anfänglich verwendeten Ammoniumacetates und statt Kaliumpyruvat Oxalessigsäure verwendet wurden, die Reaktion wurde durchgeführt, wobei wie im Falle von Pyruvat die Substrate ergänzt wurden; die Reaktionsmischung enthielt 4,2 g/dl L-Tyrosin.

100 ml der Züchtungsbrühe wurden mit 4,7 g Phenol, 4,0 g Oxalessigsäure und 6,0 g Ammoniumacetat gemischt, der pH-Wert der Mischung wurde mittels Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt, und die Reaktion wurde 42 Stunden bei einer Temperatur von 37°C ausgeführt. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 1,8 g/dl L-Tyrosin enthielt.

Aus den Ergebnissen der beiden obenbeschriebenen Reaktionsreihen ist ersichtlich, daß die Reaktion gemäß der Erfindung durch die Substrate gehemmt werden kann.

Beispiel 8

100 ml Züchtungsbrühe von Citrobacter freundii ATCC 6750, die in gleicher Weise, wie in Beispiel 5 angegeben, hergestellt wurde, wurden mit 0,6 g Brenzcatechin, 2,0 g Natriumpyruvat, 2,0 g Ammoniumacetat, 0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, der pH-Wert der Mischung wurde mittels Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt, und dann ließ man das Reaktionssintern bei einer Temperatur von 17"C reagieren.

Vier Stunden nach Beginn der Reaktion wurde das Brenzcatechin auf die ursprüngliche Menge ergänzt; während 42 Stunden wurden 2,8 g Brenzcatechin verbraucht. Acht Stunden nach Beginn der Reaktion , wurden 1,0 g Natriumpyruvat und 1,0 g Ammoniumacetat und nach zwölf Stunden wurde 1,0 g Ammoniumacetat dem Reaktionssystem zugegeben. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 2,5 g/dl DOPA enthielt.

in 100 m) Züchtungsbrühe von Citrobacter freundii ATCC 6750 wurden mit 3,0 g Natriumpyruvat, 4,0 g Ammoniutnacetat, 0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, der pH-Wert der sich ergebenden Mischung wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt, und das Reaktionssystem wurde 42 Stunden bei einer Temperatur von 17° C gehalten. Es wurde festgestellt, daß die Reaktionsmischung 0,4 g/dl DOPA enthielt.

Beispiel 9

:o Ein Kulturmedium wurde hergestellt, das 0,2 g/dl L-Tyrosin, 0,1 g/dl Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 g/dl Magnesiumsulfat, 0,7 g/dl Fumarsäure, 0,6 g/dl Glycerin, 0,5 g/dl Hefeextrakt und 0,01 g/dl Pyridoxin enthielt, der pH-Wert des Mediums wurde mittels einer

r> KOH-Lösung auf 7,5 eingestellt, und das Medium wurde 5 Minuten bei einer Temperatur von 110°C in einem Autoklav sterilisiert. Erwinia heirbicola ATCC 21433 vorher auf einer Nährstoffagar-Schräge bei 28⁰C 2C Stunden gezüchtet, wurde 60 ml des oben hergestellter

jo Mediums eingeimpft und unter Schütteln 24 Stunden be einer Temperatur von 30° C gezüchtet.

100 ml der Züchtungsbrühe wurden zur Sammlung der Bakterienzellen zentrifugiert, die Zellen wurden der nachstehenden 50 ml Lösungen (A), (B), (C) und (D

η zugegeben, und die Lösungen wurden während eine: Zeitraumes von 20 Stunden bei einer Temperatur vor 22° C gehalten.

Lösung (A)	2,0 g/dl
Ammoniumpyruvat	1,0 g/dl
Brenzcatechin	2,0 g/dl
Ammoniumacetat	0,2 g/dl
Na₂SO₃
pH-Wert: 8,0 (mittels NH₄Ol 1)

Lösung (B)

Ammoniumpyruvat 2,0 g/dl

Brenzcatechin 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

EDTA 0,2 g/dl pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NI 1.,OH)

Lösung (C)

Ammoniumpyruvat 2,0 g/dl

Brenzcatechin 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

Na₂SO, o,2 g/dl

EDTA o,2 g/dl pH-Wert:8,0(eingestellt mittels ΝΗ.,ΟΗ)

Lösung (D)

Ammoniumpyruvat 2,0 p/dl

Brenzcatechin 1,0 p/dl

Ammoniumacetat 2,0 p/dl

pH-Wert: 8,0(eingestellt mittels Nl UOI I)

Die Mengen an in den Lösungen produzierten waren, wie folgt;

Reaktionssystem

Menge an
produziertem
DOPA (g/dl)

Lösung (A)
Lösung (B)
Lösung (C)
Lösung (D)

1,2
0,8
1.4
0,7

Bakterienzellen von Erwinia herbicola ATCC 21433, erhalten aus 100 ml der Züchtungsbrühe, wurden einer 50 ml Lösung, die 2,0 g/dl Ammoniumacetat, 2,0 g/dl Ammoniumpyruvat und 1,0 g/dl Resorcin enthielt, zugegeben; der pH-Wert des Gemisches wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt; man ließ die Reaktion bei einer Temperatur von 17° C 42 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,2 g/dl NazSCb und

Tabelle III

0,2 g/dl EDTA fortschreiten. In der Reaktionsmischung, die Natriumsulfit und EDTA enthielt, wurde L-2,4-Dihydroxyphenylalanin in einer Menge von 1,2 g/dl und in der Reaktionsmischung, die kein Natriumsulfit enthielt, in einer Menge von 0,4 g/dl produziert.

Beispiel 10

Bakterienzellen, erhallen aus 100 ml Züchtungsbrühe der in Tabelle 3 angegebenen Bakterien wurden zu 30-ml-Lösungeri zugegeben, die 2,0 g/dl Oxalessigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glyoxylsäure, Milchsäure und Malcinoxim, 1,0 g/dl Phenol und 2,0 g/dl Ammoniumacetat enthielten, die pH-Werte der Mischungen wurden auf 8,0 eingestellt und jede Mischung wurde 20 Stunden bei einer Temperatur von 37°C gehalten. Die Mengen an in den Reaktionsmischungen produzierten L-Tyrosin sind in der nachstehenden Tabelle III angegeben.

Menge an Tyrosin produziert aus (g/dl)

Oxal- Malein- Fumar- Glyoxyl-

cssigsäure säure säure säure

Milchsäure

Malcinoxim

Erwinia herbicola, ATCC 21433 1,50 0,62 0,38 0,48 0,95 0,52

Citrobacter freundii, ATCC 6750 1,08 0,78 0,30 0,45 0,62 0,68

Proteus mirabilis, ATCC 15 290 0,88 0,80 0,30 0,50 0,55 0,70

Pseudomonas perlurida, ATCC 490 0,52 0,40 0,42 0,35 0,48 0,30

Salmonella gallinarum, ATCC 9148 0,82 0,88 0,52 0,32 0,71 0,77

Citrobacter freundii, ATCC 8090 1,02 0,70 0,28 0,45 0,82 0,60

Paracolobactrum coliforme, ATCC 11605 0,80 0,52 0,25 0,40 0,55 0,40

Xanthomonas campestris, ATCC 7381 0,66 0,21 0,15 0,32 0,35 0,11

Alcaligenes faecalis, ATCC 8315 0,31 0,20 0,31 0,21 0,21 0,11

Aerobacler aerogencs, ATCC 7256 0,42 0,20 0,45 0,48 0,20 0,15

Beispiel 11

100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433, hergestellt in gleicher Weise, wie in Deispiel 1 beschrieben, wurde zentrifugiert, die erhaltenen Bakterienzellen wurden den nachstehenden Lösungen (A), (B) und (C) zugegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 37°C gehalten.

Lösung (A) (Vcrgicichsvcrsuch)
Oxalessigsäure 2,0 g/dl

Ammoniumacetat 2,0 g/dl

pH-Wert:8,0(eingcstcllt mittels NIM)H)

Lösung (B)

Oxalessigsäure 2,0 g/dl

Phenol 1,0 g/dl

Ainmoniumacctat 2,0 g/dl

pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NhI₄OII)

Lösung (C")

Natriiimpyruvat 2,0 g/dl

Phenol ' 1,0 g/dl

pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NI 1.,OH)

Die erhaltenen Reaktionsniisehungcn wurden hinsichtlich ihres Gehaltes an Brenztraubensäure und L-Tyrosin analysiert. Die Ergebnisse waren die folgenden :

Rcaktionsmisehung

Menge an

Brenztraubensäure 1.-Tyrosin

(g/dl) (g/dl)

Lösuni· (A)
Lösung (B)
Lösung (C)

0,3
0,5

Beispiel 12

0,9

1,3

[•in Enzym von Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel b beschrieben, hergestellt; es wird im nachstehenden als Enzym (A) bezeichnet. Eine Oxalncclatdccarhnxylasc wurde aus den Zellen von Citrobacter freundii ATCC 6750 gemäß der Arbeitsweise, wie in D. Herbert, ■Symposia Soc. Exp. Biol., Bd. 5, (1951) Seite 52 beschrieben, hergestellt; sie werden im folgenden als Enzym (B) bezeichnet. Aus den /eilen von Microcoecus !ysodeikticus wurde ebenfalls in der gleichen Weise wie im Falle von Citrobacter freundii eine Oxalacclatdccar· boxylase hergestellt, die als Enzym ((') bezeichnet wird.

50 mg Enzym (A) (als Protein) und 50 g Enzym (B) oder 50 mg Enzym (A) und 50 mg Enzym (C) wurden r\\ 100 ml wäßrigen Lösungen zugegeben, die 2,0 g/dl Oxnlcssigsllure, 1,0 g/dl Phenol, 1,0 g/dl Ammoniumncctat, 2,0 g/cJI Ammoniumsulfut und 2 mg/dl Pyridoxal-

phosphat enthielt und einen pH-Wert von 8,0 hatte; die Gemische wurden 20 Stunden bei einer Temperatur von 37⁰C gehalten.

Die Reaktionsgemische der Enzyme (A) und (B) enthielten 1,2 g/dl L-Tyrosin und die der Enzyme (A) und (C) enthielten 1,4-g/dl L-Tyrosin.

Beispiel 13

Erwinia herbicola ATCC 21433 wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, gezüchtet, 100 ml der Züchtungsbrühe wurden mit 0,6 g Brenzcatechin, 2,0 g Milchsäure, 2,0 g Ammoniumacetat, 0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, der pH-Wert der Mischung wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt und man ließ die Reaktion bei einer Temperatur von 17°C einsetzen. Nach Beginn der Reaktion wurde nach jeweils vier Stunden Brenzcatechin in dem Reaktionssystem ergänzt, um seine Konzentration auf 0,6 g/dl zu bringen, und die Bebrütung wurde 42 Stunden lang ausgeführt.

Ähnliche Bebrütungen wurden wiederholt, wobei Brenzcatechin ergänzt wurde, um seine Konzentration auf 0,3 g/dl, 1,0 g/dl und 1,5 g/dl zu bringen. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Brenzcatechinkon-	Menge an ver	Menge an
zentration nach	brauchtem Brenz	produziertem
Ergänzung	catechin	DOPA
(g/dl)	(g/dl)	(g/dl)
0,3	2,5	1,25
0,6	3,2	1,80
1,0	3,6	2,15
1,5	2,3	1,05

100 ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433 wurden mit 3,0 g Milchsäure, 4,0 g Ammoniumacetat, 0,2 g Natriumsulfit und 0,2 g EDTA gemischt, die sich ergebende Mischung wurde mit jeweils 1,0 g, 1,5 g, 2,0 g und 2,5 g Brenzcatechin versetzt; bei einem pH-Wert von 8,0 ließ man die Gemische während eines Zeitraumes von 42 Stunden bei einer Temperatur von 17°C reagieren. Die Mengen an in den Reaktionsmischungen produziertem DOPA waren, wie folgt:

Menge ah zugegebenem
Brenzcatechin (g/dl)

Menge an produziertem
DOPA (g/dl)

0,84
0,65
0,34
0,21

Beispiel 14

Bakterien/eilen von Erwinia herbicola 21433, gezüchtet wie im Beispiel 9 und aus 2 Liter Züchtungsbrühe isoliert, wurden zu einer 1-Liter-Lösung zugegeben, die 4,0 g/dl Brenzcatechin, 3,0 g/dl Brenztraubensäure, 2,2 g/dl Borsäure und 2,0 g/dl Ammoniumphosphat enthielt und deren pH-Wert mittels Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt wurde, und die Mischung wurde bei 15°C 24 Stunden gerührt. Das Rcaklionsgcmisch enthielt 2,8 g/dl DOPA. Die Reaktionsmischung wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt und ergab 13 g reines kristallines DOPA.

Zu Vergleichszwecken wurden 2,2 g/dl Borsäun nicht der vorgenannten Züchtungsbrühe zugesetzt unc die Reaktion auf die gleiche Weise ausgeführt.

Die sich ergebende Reaktionsmischung enthielt nui 0,6 g/dl DOPA.

Beispiel 15

Citrobacter freundii ATCC 6750 wurde auf einerr Medium, wie im Beispiel 9 beschrieben, unter Schüttelr bei einer Temperatur von 27° C 24 Stunden gezüchtet Die aus 100 ml Züchtungsbrühe isolierten Bakterienzel len wurden zu 50 ml der Lösungen (I) bis (VIi; zugegeben, deren Zusammensetzungen nachstehenc angegeben sind; man ließ die Mischungen bei einei Temperatur von 20° C 20 Stunden reagieren.

Lösung (I)

Brenzcatechin 4,0 g/dl

Natriumpyruvat 3,6 g/dl

Ammoniumacetat 4,0 g/dl

Borsäure 2,2 g/dl

Na₂SO₃ 0,2 g/dl

EDTA 0,3 g/dl i; pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

Lösung (II)

Brenzcatechin 4.0 g/dl

Natriumpyruvat 3,6 g/dl

jo Ammoniumacetat 4,0 g/dl

Na₂SO₃ 0,2 g/dl

EDTA o,3 g/dl pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

j-, Lösung(III)

Brenzcatechin 1,0 g/dl

Natriumpyruvat 3,6 g/dl

Ammoniumacetat 4,0 g/dl

Na₂SO₃ o,2 g/dl

•ίο EDTA o,3 g/dl pH-Wert: 8,0 (eingestellt mittels NH₄OH)

Lösung (IV)

Brenzcatechin:
•r, (viermal nach jeweils

4 Stunden nach Beginn der

Inkubation wurden jeweils

0,5 g zugegeben)

Brenztraubensäure
,ο Ammoniumacetat

Na₂SO₃

EDTA

pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NH₄OH)

v, Lösung (V)

Brenzcatechin

Brenztraubensäure

Ammoniumacctal

Borsäure
i,o pH-Wcrt:8,0(eingcstcllt mittels NI I₄OIl)

Lösung (Vl)
Brenzcatechin
Brcnztraubensilure
ι,-, Ammoniumucetat
Borsäure
Na₂SOj
pH-Wcrt:8,0(cingcstelll mittels Kssigsllurc)

3,6 g/dl 4,0 g/dl 0,2 g/dl 0,3 g/dl

4,0 g/dl 3,6 g/dl 4,0 g/dl 2,2 g/dl

4,0 g/cll 3,6 g/cll 4,0 g/cll 2,2 g/dl 0,2 g/dl

15

16

Lösung (VIl)
Brenzcatechin
Brenztraubensäure
Ammoniumacatat

4,0 g/dl 3,6 g/dl 4,0 g/dl

Borsäure ' ?'.2 g/dl

EDTA 0,3 g/dl

pH-Wert:8,0(eingestellt mittels NH₄OH)

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Ί abelle IV angegeben.

Tabelle IV

Reaktionsmischung Menge an produziertem DOPA (g/dl)

Lösung (I)
Lösung (H)
Lösung (111)
Lösung (IV)
Lösung (V)
Lösung (VI)
Lösung(VII)

2,52 0,23 1,32 1,80 1,60 1,86 1,68

Beispiel 16

Brenzcatechin und Borsäure wurden in Wasser gelöst, der pH-Wert der wäßrigen Lösung wurde mit Ammoniakwasser auf einen Wert von 8,0 eingestellt, und der sich bildende Ammonium-Brenzcatechin-Borsäure-Komplex-Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert. Der Niederschlag, äquivalent einer Menge von 4,0 g Brenzcatechin und 2,2 g Borsäure, wurde zu ml Züchtungsbrühe von Erwinia herbicola ATCC 21433 züge ;eben; dann wurden 3 g Natriumpyruvat, 4 g Ammoniumacetat und 300 ml Wasser hinzugefügt und der pH-Wert der sich ergebenden Mischung wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt. Die Mischung wurde 40 Stunden unter Schütteln bei 20⁰C bebrütet; die Reaktionsmischung enthielt 1,65 g/dl DOPA.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Hydroxyphenylalaninen der allgemeinen Formel

in der Ri und R₂ Wasserstoff oder die Hydroxylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung aus:
(a) 0,1 bis 20% GewVVol. eine Phenolverbindung der allgemeinen Formel