DE2122294B2 - Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase

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Description

20
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Creatinin-amidohydrolase aus Mikroorganismen.
In der klinischen Chemie, besonders für die Funktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung der Zwischen- und Endprodukte des Eiweißstoffwechsels eine wichtige Rolle. Hierzu zählen auch Creatinin und Creatin. Die Bestimmung von Creatinin wurde daher schon wiederholt beschrieben. Die meisten der bekannten Methoden basieren auf der nichtenzymatischen Jaff6-Reaktion, die jedoch den Nachteil hat, unspezifisch zu sein.
Weiter wurde bereits eine spezifische mikrobiologische Bestinimungsmethode mit isolierten Bakterien beschrieben, wobei gewaschene Zellsuspensionen zur Creatinin-Messung verwendet wurden und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak als Maß der Enzymwirkung herangezogen wurde. Lösliche, zum Creatininabbau befähigte Enzymextrakte konnten dabei jedoch nicht erhalten werden. Voraussetzung für die Schaffung einer spezifischen Creatinin-Bestimmung mit Hilfe von Enzymen war jedoch die Auffindung von geeigneten, löslichen Enzymen, welche spezifische und meßbare Umsetzungen des Creatinins katalysieren können.
Roche, Lacombe und Girard (BBA6, 210, 1950) charakterisierten in zwei Pseudomonas-Arten Creatinase, Creatininase und eine Glycocyaminase als spezifische Enzyme, die aus ihren Substraten aus der Guanidinogruppe Harnstoff in Freiheit setzten. Weiter wurde von Akamatsu und Mitarbeiter (Enzymologia, 15, Seiten 122,158,173,1951) in Erdbakterien ein als Creatinmutase bezeichnetes Enzym, welches die Gleichgewichtseinstellung zwischen Creatinin und Creatin bewirken soll, festgestellt. Hierbei wird folgender Abbauweg aes Creatinins vermutet:
Creatinin
Sarcosin
Creatin
Glycin
Harnstoff und
NH3
In der gleichzeitig unter der internen Nummer 1749 eingereichten Patentanmeldung P 21 22 298-41 wird ein Verfahren zur Trennung und Gewinnung von zwei Enzymen beschrieben, die erstmals aufgefunden und isoliert wurden, welche an diesem Abbauweg entscheidend beteiligt sind. Die Enzyme wurden aus Mikroorganismen isoliert. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Auffindung von Mikroorganismen, welche sich besonders als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des dort beschriebenen neuen Enzyms Creatinin-amidohydrolase signen.
Es wurde schon wiederholt versucht, mit Hilfe von Mikroorganismen Creatinin enzymatisch abzubauen. Es gelang jedoch nicht, wasserlösliche Enzymextrakte zu gewinnen, die Creatinin in ausreichendem Maße abbauen konnten. Derartige Versuche wurden beispielsweise mit Corynebakterium, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas ovalis und Pseudomonas eisenbergii und Clostridien durchgeführt
Aufgabe der Erfindung war es daher, Mikroorganismen zu finden und zu züchten, welche eine zur Gewinnung des obenerwähnten neuen Enzyms geeignete wasserlösliche Aufschlußfraktion liefern.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch, daß zur Gewinnung von Creatinin-amidohydrolase die Mikroorganismen Alcaligenes spec, WS 51 400 oder Penicillium WS 90 001 verwendet werden, die bei der DSM nachhinterlegt wurden.
Alcaligenes spec. WS 51 400 besitzt folgende Eigenschaften: strikt oxydative gramnegative Kurzstäbchen mit peritricher Begeißelung. Die Keime sind schwach oxydase-positiv, alkalisieren Lackusmilch und sind zur Denitrifikation befähigt Ferner wurden folgende Eigenschaften festgestellt:
Wachstum bei 4° C -
Wachstum bei 410C -
Gelatineverflüssigung -
Tributyrinspaltung —
Eigelbreaktion —
Pigmentbildung —
60
b5 Vergärung von:
Arabinose +
Glucose +
Maltose ( + )
Cellobiose (+)
Trehalose +
2-Ketogluconat +
Mannit (+)
m-Inosit -
Glycollat -
Pelargonat -
Adipat —
p-Hydroxybenzoat +
Phenylacetat — Valin
Arginin (+)
ö-Aminovalerat —
Tryptophan -
Betain +
Hippurat -
Acetamid —
Benzylamin -
Nach den gegenwärtigen Kenntnissen gehören die Keime zur Familie Achromobacteriaceae und sind mit großer Wahrscheinlichkeit zur Gattung Alcaligenes zu stellen.
Bei WS 90 001 handelt es sich um einen Pilz der Gattung Penicillium.
Um das gewünschte Enzym in den erfindungsgemäß zu verwendenden Mikroorganismen adaptiv anzureichern, werden diese vorzugsweise unter Zusatz von Creatinin zum Wachstumsmedium gezüchtet. Beide Mikroorganismen werden vorteilhaft auf einem Nährboden wachsengelassen, der Glucose oder Glycerin als
Kohlenstoffquelle, Creatinin sowie Salze und Vitamine in der in der Mikrobiologie bekannten Menge und Zusammensetzung enthält Ein besonders geeignetes Nährmedium weist folgende Zusammensetzung auf:
0,5Gew.-% Glucose oder Glycerin
0,5Gew.-% Creatinin
0,08Gew.-% Ammoniumsulfat
0,02Gew.-% Magnesiumsulfathydrat,
Eisensulfatspuren,
Calciumchloridspuren,
Mangansulfatspuren
0,05Gew.-% Hefeextrakt, Nicotinsäure,
Thiamin-p-aminobenzoesäure
Vitamin Be je 1 mg
0,1 mg Biotin
gelöst in m/10 Kaiiumphosphat-Puffer pH 6 (Pilz) bzw. pH 7 (Alcidigenes).
Die Stammerhaltung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen geschieht in üblicher Weise auf Agarschrägröhrchen durch Zusatz von 2% Agar zu einem geeigneten Nährboden, vorzugsweise dem oben angegebenen Nährboden, dem noch 5 ml/1 einer 0,05°/oigen Bromthimolblaulösung zugesetzt wird. Unter den bevorzugten Wachstumsbedingungen schlägt dieser Indikator bei dem erfindungsgemäßen Pilz nach 4 bis 6 Tagen, bei dem Bakterium in 2 bis 3 Tagen deutlich ins alkalische Gebiet um, bedingt durch den Creatinin-Creatin-Abbau. Creatinin verbrauchende Mikroorganismen, die den Abbau nicht nach dem obengenannten Stoffwechselschema mit den obengenannten Enzymen bewerkstelligen, zeigen diese Alkalisierung nicht
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Mikroorganismen ermöglichen die wirtschaftliche Gewinnung der Creatininamidohydrolase aus der aus ihrem Aufschluß erhaltenen wasserlöslichen Eiweißfraktion, wie in der oben erwähnten, gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung näher beschrieben ist.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
Anreicherung von aktivem Pilzmycel in
Submers-Schüttelkultur
21 eines Nährbodens mit 1 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-% Creatinin, 0,08 Gew.-% Ammoniumsulfat, 0,02 Gew.-% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,05 Gew.-% Hefeextrakt, je 1 mg Nicotinsäure, Thiamin-p-amino
benzoesäure und Vitamin Be, 0,1 mg Biotin, Eisensulfat, Calciumchlorid und Mangansulfat in Spuren, in 0,1OM Kaliumphosphatpuffer pH 6 werden in einem geeigneten Schattelkolben mit 200 ml einer 48 Stunden alten Vorkultur von Penicillium WS 90 001 beimpft und in einem Schüttelapparat 4 Tage kultiviert Der Creatinin-Gehalt sinkt in dieser Zeit von 0,5% auf knapp 0,1%, und die Glucose ist bis zu diesem Zeitpunkt nahezu verbraucht Der pH-Wert steigt dabei auf 7,5 bis 8,0. Man erhält so 3 bis 4 g WS 90 001 Trockengewicht/l Kulturlösung mit 45 bis 60 IU/g Trockengewicht Creatinonamidohydrolase.
Beispiel 2
In einem geeigneten Kulturgefäß werden 151 des in Beispiel 1 beschriebenen Mediums mit 1,51 gut bewachsender Vorkultur von Alcaiigenes spec. WS 51 400 bei kräftiger Durchlüftung kultiviert Dabei wird während der gesamten Kulturdauer der pH-Wert konstant auf 7,0 gehalten. Der Creatinin- und der Glucose-Gehalt werden laufend verfolgt Der Creatinin-Verbrauch vollzieht sich hauptsächlich im zweiten Drittel der Logphase, während Glucose zunächst abgebaut wird. Die Kultur wird bei 30° gehalten. Nach 35 Stunden können 1,5 g/l Kulturlösung Bakterientrockenmasse geerntet werden. Die spezifische Aktivität an Creatinin-amidohydrolase beträgt 1600 IU/g Trockengewicht
B e i s ρ i e 1 3
Es wird wie in Beispiel 2 beschrieben Alcaiigenes spec. WS 51 400 im Arbeitsvolumen von 601 kultiviert Sobald das gewünschte Wachstumsstadium erreicht ist, wird begonnen, frischen Nährboden dem Kulturgefäß zuzuführen und in gleichem Maß bewachsene Kulturlösung dem Kulturgefäß zu entnehmen. Die Verdünnungsrate (Fließgeschwindigkeit/Arbeitsvolumen) beträgt hierbei 0,13 bis 0,18, vorzugsweise 0,16. Pro Stunde werden 5001 Luft durchgeleitet Man erhält so in kontinuierlicher Züchtung eine Ausbeute von 3 bis 5 g/l Bakterientrockenmasse mit einer spezifischen Aktivität wie sie nach d&m in Beispiel 2 beschriebenen batch-Verfahren erhalten wird.
Der Alcaiigenes spec. WS 51 400 eignet sich gut zur kontinuierlichen Züchtung, wie vorstehend beschrieben wurde.
Beide Mikroorganismen sind in der Sammlung des Bakteriologischen Instituts der Technischen Universität
so München in Weihenstephan hinterlegt.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verwendung von Alcaligenes spec, WS 51400 (=DSM 717) oder Penicillium WS 90 001 (=DSM 718) zur Gewinnung von löslicher Creatinin-amidohydrolase.
2. Verwendung von in Anspruch 1 genannten Mikroorganismen, die auf einem Creatinin enthaltenden Nährmedium wachsengelassen wurden, für den Zweck von Anspruch 1.
3. Verwendung von in Anspruch 1 genannten Mikroorganismen, die auf einem Glucose oder Glycerin neben Creatinin, Salze und Vitamine enthaltenden Nährmedium gezüchtet wurden, für den Zweck von Anspruch 1.
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