DE2122255A1 - Verfahren und Reagens zur spezifischen Bestimmung von Creatinin - Google Patents

Verfahren und Reagens zur spezifischen Bestimmung von Creatinin

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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann, \
Dipl.-Ing. H.Weici&mann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke IiMY Dipl.-Ing.~F. A. Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
8 MÖNCHEN 27, DEN
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 3921/22
int. Nr. 1748
,... .. BQEHRIIiGER MABBHBIM GMBH "' ' "' ·.
68 Mannheim-Waldhof, Sandhofer Str. 112-132
Verfahren und Reagens zur spezifischen Bestimmung von
Oreatinin
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren und ein Reagens zur spezifischen enzymatischen Bestimmung von Creatinin.
In der klinischen Chemie, insbesondere für die Punktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung des Creatinins eine wichtige Rolle. Die Bestimmung des Creatinins im Serum, bzw. im sogenannten Clearance-Test, die gleichzeitige Bestimmung im Serum und Harn gehört zu den Standarduntersuchungsmethoden im klinischen Labor.
Die ;bisher übliche Bestimmungsmethode beruht auf der von M. Jafte gefundenen Farbreaktion von Creatinin mit Pikrinsäure im alkalischen Milieu. Hierbei wird nach saurer Enteiweißung der Probe (z.B. mit Trichloressigsäure oder mit Pikrinsäure) im überstand nach Zugabe von Pikrinsäure und Alkalisieren eine Färbung entwickelt und photometrisch gemessen. Ein wesentlicher Nachteil dieses an. sich einfachen Verfahrens besteht jedoch darin, daß es nicht für Creatinin spezifisch ist.
209847/0961
21222&5
Eine Reihe von Modifikationen der Jaffe-Reaktion verbessert zwar die Präzision und die Durchführbarkeit, ohne diesen prinzipiellen Mangel zu beheben. Auch blieb die Jaffe-Methode sehr störanfällig und schon geringe Verschiebungen in der H- bzw. OH-Ionenkonzentration führen zu einer Verän-' derung der Farbtiefe. ' -
Eine weitere bekannte Methode wandelt Creatinin unter Zusatz von o-Nitrobenzaldehyd in Methylguanidin um, welches dann nach der Sakaguchi-Reaktion bestimmt wird. Weiter wurde auch eine Farbreaktion zwischen Creatinin und Kalium-Quecksilber-" Thiocyanat beschrieben. Beide Methoden erwiesen sich jedoch für das klinische Labor als ungeeignet.
Von Dubos und Miller (J.biol.Chem. 121, 457 (1937)) wurde . eine Modifikation der Jaffe-Reaktion beschrieben, bei der mit einem Rohextrakt eines bestimmten Bakteriums in einem Aliquot einer Probe Creatinin abgebaut, während der Rest der Probe unbehandelt blieb. In beiden Probeteilen wurde dann die Bestimmung nach Jaffe durchgeführt und aus der Differenz der Extinktionen der Creatinin-Gehalt bestimmt. Diese Methode ist zwar sehr spezifisch, die Durchführung ist jedoch recht umständlich und erfordert es, das Bacterium laufend zu züch- \ ten.
Es besteht daher Bedarf an einem einfachen, aber spezifischen Test für Creatinin.
Die Erfindung löst dieses Problem durch ein Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Creatinin, welches darin besteht, daß eine wäßrige, Creatinin enthaltende Lösung mit Creatininamidohydrolase bei einem pH-Wert zwischen etwa 7>5 und 9 inkubiert und entweder gebildetes Creatin oder die Abnahme an Cr.eatinin in an sich bekannter Weise bestimmt wird.
Das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Enzym Creatininamidohydrolase und ein Verfahren zu seiner Gewinnung
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21222&5
sind in der gleichzeitig unter der internen Nummer ,1749 eingereichten Patentanmeldung P
■beschrieben. Das Enzym Creatininamidohydrolase,welches bisher noch nicht "beschrieben"wurde, katalysiert die Reaktion!
-Creatininamidohydrolase
Creatinin + H9O Creatiri
^ ^ ———————
Das gebildete Creatin kann nach bekannten Methoden direkt gemessen werden, beispielsweise durch Phosphorylierung mit Creatinkinase und Adenosintriphosphat (ΑΪΡ) unter Bildung von Adenosindiphosphat, welches in bekannter Weise bestimmt wird. Eins andere Möglichkeit besteht darin, die Abnahme des Creatinine nach Jaffe zu messen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 7,8 und 8,5 durchgeführt. Zur Einstellung des pH-Wertes können beliebige Puffer verwendet werden. Es ist jedoch darauf zu achten, daß der verwendete Puffer die angeschlossene Bestimmungsmethode nicht stört. Wenn beispielsweise anschließend nach Jaffe die Creatiniii-Differenz bestimmt wird, soll ein Puffer verwendet werden, welcher die Jaffe-Reaktion nicht herabsetzt.Ungünstig sind beispielsweise Glycin- und Glycylglycin-Puffer; nicht störend sind Phosphat- und Pyrophosphat.-Puf.fer. Falls jedoch nicht nach Jaffe bestimmt wird, sondern das gebildete C^eatin mit Creatinkinase und ATP bestimmt wird, so können auch G-lycir.-Puffer und ähnliche Puffer verwendet werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist eine vorherige En'teiweißung der Probe nicht erforderlich. Eine Enteiweißung kann jedoch für die nachfolgende Bestimmung des Creatins zweckmäßig sein.
Gemäß einer besonderen Au sführungs forin des erf j ndungs gemäßen Verfahrens wird gebildetes Groatin unter Verwendung des Enzyms
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BADORlGiNAL
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Creatinase in Sarcosin und Harnstoff überführt und letzterer nach bekannten Methoden bestimmt. Das Enzym Creatinase ist in der oben erwähnten, gleichzeitig eingereichten Anmeldung beschrieben und kann systematisch auch als Creatinamidinohydrolase bezeichnet werden.
Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise durchgeführt, indem ein Creatininase und Creatinase gemischt enthaltendes Enzympräparat für die Bestimmung eingesetzt wird.
Wird gebildetes Creatin in an sich bekannter Weise unter Verwendung von Creatinase und ATP bestimmt, so ist eine Enteiweißung vorteilhaft, da hierdurch die Empfindlichkeit des Tests erhöht wird. Diese größere Empfindlichkeit beruht darauf j daß bei Enteiweißung konzentrierter gearbeitet werden kann, so daß die Extinktionsdifferenz, bezogen auf eine bestimmte Creatinmenge, vergrößert wird.
Die Verwendung eines Kombinationsenzyms, enthaltend Creatininamidohydrolase und Creatinase ist auch dann von Vorteil, wenn die Bestimmung des Creatini-ns nach Jaffe erfolgt, da durch die Creatinase das Gleichgewicht zugunsten der Bildung von ) Creatin verschoben wird.
Die Erfindung schafft auch eine neue Reagentienkombination zur spezifischen Bestimmung von Creatinin. Die erfindungsgemäße Heagentienkoinbination besteht aus
1. Creatininstandard
2. Pikrinsäure
3. Katronlauge und
4. Creatininamidohydrolase allein oder zusammen mit Puffer sowie gegebenenfalls Creatinase,
in vor Gebrauch unvermischbarem Zustand.
Eine weitere ei-findungsgemäße Reagentienkombination besteht
BAD ORIGINAL 209847/0961
21222S5
1. Puffer, reduz.Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH), ATP und Phosphoenolpyruvat (PEP)
2. Lactatdehydrogenase (IDH), Pyruvatkinase (PK) und MgCl2,
3. Creatinkinäse (CK) und 4· Creatininaniidohydroläse
in vor Gebrauch unvermischbarem Zustand.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Reagentienkombination schaffen erstmals die Möglichkeit einer spezifischen Creatinin-Bestimmung, die sich auch zur Routineanwendung im klinischen labor eignet und eine ausreichende Empfindlichkeit für praktische Zwecke besitzt. Die einzige bisher bekannte spezifische Bestimmungsmethode nach Miller und..Dubos war hingegen für die Verwendung zur Routineuntersuchung unbrauchbar (vgl. R.J.Henry, Clinical Chemistry, 1964, Seite 288).
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Vorfahren und die erfindungsgemäße Testkombination weiter.
Beispiel 1
Bestimmung unter anschließender Anwendung der Jäffe-Reaktion,
1,0 ml einer Creatinin-haltigen Probe (Serum oder verdünnter Urin) werden in 0,050 bis 0,2M Puffer (besonders geeignet Pyrop]"osphat-, Phosphat-, Diäthanolamin/HOl- oder Glycylglyej.u/ HCl-Puffer) mit Creatininamidohydrolase in einer Menge von mindestens 5 U/Test (1 U= lyuMol Substratumsatz/min) und Creatinase in einer Menge von mindestens 0,8 U/Terst bei 370C 45 bis 60 Minuten inkubiert. Dann wird mit 3M 'friehlcu— essigsäure enteiweißt, zusammen mit einer Probe, der kein Enzyingemisch zugesetzt wurde. Mit dem Überstand der beiden Proben wirr3 die Jaffo-Reaktion durchgeführt. Aus der Extinktionsdifferftns der beiden Proben bei 546 nm ergibt, sich d.u-Creatinin-Menge untor Bezug auf einen
2098Λ7/0961 bad
21222S5
Die Farbreaktion nach Jaffe wird durchgeführt durch Zusatz von Pikrinsäure und NaOH, 15 Minuten Stehenlassen bei Raumtemperatur und Messen in einer Küvette mit 2 cm Schichtdicke bei 5.46 nni.
In der beigefügten Zeichnung zeigt Pig. 1 in graphischer Darstellung die Linearität zwischen mg fo Creatinin und der Extinktionsdifferenz bei 546 nm.
Beispiel 2
Messung des Creatine mittels Creatinkinase
Das Prinzip dieser Ausführungsform besteht darin, daß mit Hilfe von Creatininase das Greatinin zu Creatin hydrolysiert und gebildetes Creatin nach M.L. Tanzer (J.of Biol.Ohem. 2J5£> S.3201 .(1959)) mit Creatinkinase und ATP phosphoryliert, gebildetes ADP mit PEP und PK in ATP umgewandelt und dabei entstandenes Pyruvat mit IiADH und lactatdehydrogenase zu Lactat reduziert wird unter Bildimg von IAD. Die Umsetzung von 1 Mol WADH (Messung bei 334? 340 oder 366nm). entspricht der Gegenwart von 1 Mol Creatinin.
Zur Durchführung wird ein Reagentiengemisch, das HADH, ATP, PEP und Magnesiumchlorid in 0,11M Puffer bei pH 9,0 enthält, " mit Lactatdehydrogena.se (LDH), Pyruvatkinase (PK) gemischt und auf 25°C temperiert. Dann werden Serum und Creatinkinase zugesetzt und bei der angegebenen Temperatur maximal 30 Minuten inkubiert. Durch Zugabe von mindestens 5 U Creatininase wird die Reaktion gestartet. Der Extinktionsabfall wird registriert. Die Reaktionsdauer beträgt je nach Creatinin-Gehalt 40 biß 90 Minuten. Der Creatinin-G-ehalt errechnet sich direkt Uher dori molaren Extinktionskoeffizienten von IJADH.
In Pig. 2 der beigefügten Zeichnung wird in graphischer Darstellung die Linearität dieser Abführung ω form des erfindungijgemüßen Verfahrens gezeigt»
209847/Π961
21222S5
Vorteile dieser Ausführungsform sind.Einsparung an Untersuchungsmaterial um den Faktor 10 gegenüber der Jaffe-Methode, ein Serum-Leerwert ist nicht erforderlich, keine Enteiweißung, kein -Zentrifugieren nötig.
BAD ORIGINAL
209 8 47/0961

Claims (9)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Creatinin, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige, Creatiniii enthaltende Lösung mit Creatininamidohydrolase bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,5 und 9 inkubiert und entweder gebildetes Creatin oder die Abnahme an Creatinin in an sich bekannter Weise bestimmt wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Phosphat- oder Pyrophosphat-Puffer verwendet und die Creatinin-Differenz durch Messung der mit Pikrinsäure und
    " Natronlauge gebildeten Färbung bestimmt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch' 1, dadurch gekennzeichnet, daß gebildetes Creatin durch Phosphorylierung mit Creatinkinase und Adenosintriphosphat und Messung des .gebildeten Adenosindiphosphats in bekannter Weise bestimmt wird.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß gebildetes Creatin in Gegenwart von Creatinase unter Harnstoffbildung gespalten und gebildeter Harnstoff nach be-
    . kannten Methoden bestimmt wird.
    )
  5. 5. Verfahren nach.einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung mit Creatinase bei pH 7,8 bis 8,3 durchgeführt wird.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Probe enteiweißt wird vor der Messung des Creatins unter Verwendung von Creatinkinase, -
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Creatininaraj-dohydrolase zusammen mit Creatinaae zugesetzt wird.
    209847/0981 BAD ORIGINAL
    21222S5
  8. 8. Reagentienkombination zur spezifischen -Beatlmmung con Creatinin, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus
    1. Creatinin-Standard
    2. Pikrinsäure
    3. Natronlauge .
    4. Creatininamidohydrolase allein oder eusansatn mit Puffer sowie gegebenenfalls mit CreAtinae·.
    in vor Gebrauch unverraisclibarera Zustand besteht.
  9. 9. Reagentienkorabination zur spezifischen Bestimmung von Creatinin, dadurch gekennzeichnet, daß eie aus
    1. Puffer, NADH, ATP und Phosphoenolpyruvat
    2. Laotatdehydrogenase, Pyruvatkinase und 3« Creatinkinase und
    4. Creatininamidohydrolase
    in vor Gebrauch unvermi3chbarem Zustand bestent.
    BAD ORIGINAL 2090/»7/0961
    Leerseite
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