DE1922843C - - Google Patents

Description

Es ist bekannt, daß die verschiedensten Verbindüngen auf mikrobiologischem Wege oxydiert werden können. So ist beispielsweise die mikrobiologische Oxydation primärer Alkohole zu Carbonsäuren in lebenden Organismen allgemein üblich. Es ist daher auch schon bekannt, zahlreiche, oxydierend wirkende Mikroorganismen auf geeigneten, verschiedene organische Verbindungen enthaltenden Kulturen oder Nährböden zu züchten, um entweder Oxydationsnebenprqdukte oder Zellstoffwechselprodukte zu gewinnen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß derartige Kulturen oder Nährböden nicht immer sehr ergiebig sind oder nicht angegriffen werden. So ist es beisoielsweise bekannt, z. B. aus dem Aufsatz von De Ley und K erste rs »Oxidation of Aliphatic Glykols by Acetic Acid Bacteria«, veröffentlicht in der Zeitschrift »Biological Reviews«. Bd. 28. Nr. 2. S. ! 64 bis 180. und der Arbeit von K e r s ι e r s und Dc Ley »The Oxidation of Glycols by Acetic Acid Bacteria«. veröiTenilicht in der Zeitschrift »Biochim. Bioplys. Acta.«. Bd. 71, S. 311 bis 331 (1%3). daß der mehrwertige Alkohol »Pentaerythrit« durch H;.kterien und andere Mikroorganismen, insbesondere durch Essigsäurebakterien, nicht angegriffen wird.

Verschiedene, auf einer Oxydation von Pentaerythrit beruhende chemische Verfahren zur Herstellung von Tris(hydro\ymethyl)essigsaure haben sich als unbefriedigend erwiesen, da sie !ediglich zu äußerst geringen Ausbeuten führen. Im übrigen sind derartige chemische Verfahren nicht leicht durchführbar und oder in großtechnischem Maßstab ichr teuer, da hierbei einerseits nitriert werden muß und andererseits Platinkatalysatoren erforderlich sind. Die Tris(hy- droxymethyl)essigsäure stellt jedoch beispielsweise ein wertvolles Zwischenprodukt für die Herstellung substituierter 3-Pyrazolidine, beispielsweise zur Herstellung der in der belgischen Patentschrift 700008 beschriebenen 3-Pyrazolidone dar, welche ihrerseits eine besondere Bedeutung als photographische Entwicklerverbindungen haben. Verfahren zur Herstellung von 3-Pyrazolidonen aus Tris(hydroxymethyl)-essigsäure sind bekannt und werden beispielsweise in den USA.-Patentschriften 2 772 282, 2 843 598 und 2 743 279 beschrieben.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Pentaerythrit zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure aufzufinden, das bei geringem Kostenaufwand hohe Ausbeuten an der Säure liefert.

Es wurde überraschenderweise ge^runden, daß das Bakterium »Flavobacte>-^:um oxydans« (ATCC Nr. 21 245) ein hervorragend wirksamer, oxydierend wirkender Mikroorganismus ist und Pentaerythrit unter aeroben Bedingungen in Tris(hydroxymethyl)-essigsäure zu überführen vermag.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von Pentaerythrit zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure unter aeroben Bedingungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die mikrobiologische Oxydation unter Verwendung ,on Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21 245) in einem wäßrigen, Pentaerythrit enthaltenden Nährmedium bei einem pH-Wert zwischen 3,0 und 9,5 bei einer Temperatur zwischen 20 und 37^cCduichführt.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung können übliche, das Wachstum von Bakterien fördernde Nährmedien oder Nährböden verwendet werden.

Die Tatsache, daß sich Pentaerythrit auf mikrobiologischem Wege zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure oxydieren läßt, war insbesondere deshalb nicht zu erwarten, weil bisher keinerlei Anzeichen für eine Angreifbarkeit von Pentaerythrit durch oxydierend wirkende Organismen, speziell Essigsäurebakterien, vorlagen. Im Gegenteil war seit längerer Zeit bekannt, daß der Alkohol gegenüber einer biologischen Oxydation beständig ist. Im übrigen hat es sich gezeigt, daß die verschiedensten, oxydierend wirkenden Mikroorganismen der verschiedensten Gattungen, einschließlich Essigsäurebakterien, ζ. B. Bacillus, Saccharmyces, Pseudomonas, Flavobacterium, Nocardia, Rhizopus,

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Acetohacter. Mvcobacterium. Lactobacillus. Peni- cillium. Xanlhamonas. Chromobacterium. Arthrobacter. Rhodospirillum und Helicostylum. nicht zur Hersiellung \on Saure aus Pentaerythrit geeignet sind. Insbesondere greifen /. \i. Flavobacterium aquatile. Flavobacterium sua\eoiens. Flavobacterium devo- rans. Nocardia Carolina. Pseudomonas putida und Arthrobactcr owdariN Pentaerwhrit nicht oxydativan.

Das Verfahren «.Lm i Hindun» ermöglicht erstmals unter Verwendung eine·* neuen Mikroorganismus auf mikrobiologischem U ege Pentaerythrit zu Tris-(hydroxymclh\ lL'^>i^-.ni!'e /u owdiercn. Das Verfahren der l.rlinJ.ii'iL! li.it im Gegensatz zu den bisher bekannten Pcntaerwhrit - (ixydationsverlahren. bei denen die Tris(h\dro\> meth>! !essigsäure nur in üuß;rst geringen Ausbeuten erhalten wird, den Vorteil, daß es leicht durchführbar ist. und zwar auch im großtechnischen Maßstab und /^M Ausbeuten an Tris-(hydrcxvmethyl)essigsiiure führt, die mit den bisher bekannten Verfahren nicht erreicht wurden. Ein weiterer Vorteil gegenüber den bekannten Oxydationsverfahren besteht darin, daß das beanspruchte Verfahren in einer Stufe zu dem gewünschten Endprodukt führt und daß die Verwendung von teuren Platinkatalysatoren vermieden wird.

In vorteilhafter Weise arbeitet man derart, daß man den zu oxydierenden Pentaerythrit zuerst in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 3 Gewichtsprozent pro Liter ILulturmedium in das Gä: medium einträgt, worauf man portionsweise weitere Anteile der zu oxydierenden Verbindung zusetzt, bis deren Konzentration pro Liter Kulturmedium bis zu etwa 10, vorzugsweise etna 6 Gewichtsprozent beträgt. Auf diese Weise erreicht l.ian besonders hohe Ausbeuten an Tris(hydroxymethyl)essigsäure.

Eine lOgewichtsprozentige Lösung von Pentaerythrit kann bei einer Temperatur von etwa 30^c C eine gesättigte Lösung im Nährmedium darstellen.

Als das Wachstum des Bakteriums fordernde Nährmedien und Energiequellen können übliche bekannte kohlenstoffhaltige Verbindungen verwendet werden. z. B. die üblichen bekannten Zucker- und Stärkeprodukte sowie Mischungen derselben, z. B. Essigsäure, Surrose, Glucose, Glycerin, Bernsteinsäure, Äthylenglykol und/oder Zitronensäure. Die Konzentration derselben soll ausreichen, um ein genügendes Wachstum der Mikroorganismen zu gewährleisten.

Zweckmäßig enthält das Fermentations- oder Gärmedium etwa 0,1 bis etwa 0,3 und vorzugsweise 0,2 Gewichtsprozent kohlenstoffhaltige Verbindungen.

Im übrigen enthält das im Rahmen des Verfahrens der Erfindung verwendete Gärmedium, abgesehen von den angegebenen Bestandteilen, üblicherweise in Gärmedien verwendete Mineralsalze. Ferner kann das Gärmedium in vorteilhafter Weise übliche Stickstoff-, Phosphor- und/oder Schwefellieferanten sowie Spuren von Eisen-, Mangan- und/oder andere Spuren von Metallionen enthalten. Beispiele für geeignete Verbindungen mit derartigen Ionen sind Ammoniumnitrat, Kaliumdiphosphat, Eisen(II)-sulfat und Magnesiumsulfat. Zweckmäßig werden diese Verbindungen zunächst in Wasser aufgelöst, worauf die erhaltene Lösung auf einen pH-Wert von etwa 5.5 bis etwa 8,5, vorzugsweise etwa 7,2 bis etwa 7,6, eingestellt wird.

Gegebenenfalls lassen sich Ausbeute und Produktionsgeschwindigkeit an Tris(hydroxymethyl)essigsäure weiter dadurch'steigern, daß man dem Gärmedium zusätzlich pro Liter etwa 0.1 bis etwa 0.3. vorzugsweise etwa 0.2 g. eines das Wachstum des Mikroorganismus stimulierenden Stoffes, beispielsweise einen Hefeextrakt, zusetzt. Andere, das VVachsturn des Mikroorganismus stimulierende Stoffe sind beispielsweise reine Vitaminmisch jngen. getrocknete und pulverisierte Maismaische sowie flüssige Mais· oder Getreidemaische.

Als Stickstofflieferant können de verschiedensten

ίο Stoffe, beispielsweise getrockneter Heieextrakl. in einer Konzentration von z.B. etwa 1% verwendet werden. Bei dieser Konzentration liefert der Heieextrakl auch noch andere Nährstoffe, z. B. Sulfat-. Phosphat- und verschiedene Metallionen.

ij Zu der angegebenen Gruppe von Nährstoffen gehören ferner beispielsweise Baumwolisajimehl und Sojabohnenmehi. Weitere geeignete einfache Stickstofflieferanten sind beispielsweise Glutaminsäure. Glutamin, Aspartate, d. h. Salze der der Asparagin säure, z. B. das Natriumsalz der Asparaginsäure.

Harnstoff, Nitrate und Mischungen solcher Stoffe,

beispielsweise Mischungen aus Glutaminsäure und Asparagin.

Zur Förderung des Wachstums des beim Verfahren

der Erfindung verwendeten Mikroorganismus werden somit übliche Kohlenhydrate und/oder andere übliche Kohlenstoffenergiequellen verwendet.

Bei dem zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Mikroorganismus handelt es sich um einen neuen Mikroorganismus, von dem Kulturen unter der Nummer ATCC 21 245 bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C, USA, und dem Büro in Rockville, Maryland, USA, 12 301 Park Lawn Drive, erhältlich sind.

Der Mikroorganismus wurde in Rochester, N.Y., USA, nach einem speziellen Kulturverfahren aus dem Boden isoliert. Hierbei wurden 150 g Erde in 250 ml eines Mediums Her folgenden Zusammensetzung:

Nährstoff

Pentaerythrit ..
(NHJ₂SO₄

K₂HPO₄

MgSO₄-7H₂O

MnSO₄ -7H₂O
FeSO₄-7H₂O.

NaCl

CaCl-2H₂O ..

ZnSO₄-7 H₂O.
Hefeextrakt....

g. I Wasser

20,0
2,0
2,0
0,25
0,27
0,028
0.0006
0,001
0,0006
0,2

eingetragen und ohne Bewegung 2 Wochen lang be einer Temperatur von etwa 30⁰C inkubiert. Hierau wurden Teile der erhaltenen Kultur zum Impfen eine; frischen, sterilen Kulturmediums verwendet. Diese; wurde erneut 1 Woche lang bei einer Teniperatui von etwa 30⁰C inkubiert. Als zweckmäßig hat es siel dabei erwiesen, das Kulturmedium während de: Inkubation, beispielsweise mit einer Rührgeschwin digkeit von etwa 400 U/Min., zu rühren.

Bei der Isolierung des Mikroorganismus wurdi gefunden, daß dieser aus mindestens zwei Stämmei mit den im folgenden angegebenen Kultur- und phy

siologischen Eigenschaften besteht. Auf Grund dieser Eigenschaften läßt sich der Mikroorganismus identifizieren und von anderen bekannten Mikroorganismen unterscheiden. Aus den Mikroorganismen lassen sich spontan ähnliche, oxydierend wirkende Mutanten entwickeln. Sie lassen sich bei dem als Flavobacterium oxydar.s (ATCC Nr. 21 245) bezeichneten Mikroorganismus leicht nachweisen. Ferner lassen sich aus den neuen Mikroorganismen auch durch andere bekannte Maßnahmen, beispielsweise durch Einwirkenlassen verschiedener mutagener Verbindungen, beispielsweise Älhylmethansulfonat. oder von UV-Strahlers Mutationen erzeugen.

Zwei der Stämme, im folgenden als Pe 25 und Pe 25 sm¹ bezeichnet, unterscheiden sich vonein- '5 ander lediglich dadurch, daß der erstere. bei dem es sieh um einen bevorzugten Stamm handelt, auf Pentaerythrit als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen und diesen metabolisieren kann, während der letztere, ein anderer besonders vorteilhafter Stamm, eine Kohlenstoffquelle des später b.schriebenen Typs an Stelle des Pentaerythrits benötigt. Die beiden Stämme unterscheiden sich ferner visuell voneinander dadurch, daß bei einem pH-Wert der Farbton eines Pentaerythrit enthaltenden Nährmediums verschieden ist sowie durch ihre Koloniengröße.

Der Mikroorganismus »Flavobacterium oxydans« (ATCC Nr. 21 245) besitzt die im folgenden angegebenen Kultur- und physiologischen Eigenschaften, auf Grund welcher er identifiziert und von anderen bekannten Mikroorganismen unterschieden werden kann:

Färbeeigenschaften Alter in Stunden

18 Gram (-)

168 Gram ( + ) und (-

Nicht säurebeständig

Zellmorphologie (nach bis zu 7tägigem Wachstum auf einem Glucose-

Hefeextrakt-Medium)

Form

Bewegungsvermögen

Nicht sporenbildend Nicht verkapselt

Stäbchen, 0,6 bis 0,7 μ χ 0,8 bis 1,0 μ; sehr oft in Paaren oder kurzen Ketten mit bis zu etwa 8 Mikroorganismen nicht frei beweglich

Agar-Kolonien (Glucose-Hefeextrakt-Medium)

Alter 72 Stunden

Form rund

Erhöhung konvex Oberfläche glatt Rand ganzrandig Farbstoffbildung zunächst grauweiß,

in 5 Tagen gelb werdend

Agar-Abstrich (Glucose-Hefeextrakt-Medium)

Alter 72 Stunden

Form fadenförmig

(Filiform)

Konsistenz butterartig

Farbbildung zunächst grauweiß.

hierauf nach 5 Taaen

gelb

Nährbrühe

Alter 7 Tage

Oberflächenwachstum... keines

Trübung geringfügig

Sediment kompakt

Menge spärlich

Gelatineansatz gelatin Stab) (Glucose-Hefeextrakt und 5 % Gelatine)

Alter 14 Tage

Verflüssigung keine

Wachstum reichliches Oberflächenwachstum

Kartoffeln-Dextrose-Kolonien

Alter 7 Tage

Wachstum keines Hugh-Leifson-Kohlehydrat-Medium

Alter 14 Tage

Sauerstoffabhängigkeit streng aerob Glucose, geringfügig

sauer keine Gasbildung

Lactose, alkalisch keine Gasbildung Sucrose, sauer keine Gasbildung Glycerin, sauer keine Gasbildung Mannitol, sauer keine Gasbildung Wirkung auf Milch

Alter 14 Tage

Lackmus alkalisch, keine

Koagulation; keine Reaktion

Ulrich alkalisch unter

Reduktion

Loeffler-Blutserum

Alter 21 Tage

Wachstum keines

Sim-Medium

Alter 14 Tage

Selbständiges Bewegungsvermögen keines

H₂S kein

Indol kein

Kliglcr-Eisen-Agiir
Alter 14 Tage

H₂S

kein

Dextrose und Lactose werden nicht fermentiert.

Alkalisches E: -Medium

Alter 14 Tage

Keine proteolytische Aktivität.

Weitere SpezialUntersuchungen

A. Gutes Wachstum innerhalb von 4 Tagen in einem 5% Äthanol und 1% Hefeextrakt enthaltenden Medium; pH-Wert bleibt bei 7,5; kein Wachstum in einem 10% Äthanol und 1% Hefeextrakt enthaltenden Medium;

B. gutes Wachstum innerhalb von 7 Tagen in einem Citratmedium; Bildung eines schwachen Häutchens;

C. gutes Wachstum innerhalb von 72 Stunden in einem 3% Natriumchlorid enthaltenden Glucosc-Hefecxtrakt; kein Wachstum, wenn der Natriumchloridgchalt auf 10% erhöht wird;

D. kein Wachstum innerhalb von 14 Tagen in einem Harnsäuremedium;

Methylrot negativ

Voges-Proskauer negativ

Stärke wird nicht hydrolysiert.
Aus Nitrat wird Nitrit erzeugt.
Cellulose wird nicht hydrolysiert.

Temperaturabhängigkeit

Alter 72 Stunden

4 C kein Wachstum

25 C schwaches Wachstum

30 C reichliches

Wachstum
37 C" kein Wachstum

Geeignete Kohlenstofflieferanten

(a) beide Stämme wachsen auf Acetat. Succinat, Äthylenglykol, i>Ribitol, i-Erythrit. D-Xylose;

(b) Für das Wachstum von Stamm Pe 25 allein: Pentaerythrit, Dipentaerythrit, 2 - Hydroxymethyl-2-methyl-1,3-propandiol, 2-Hydroxymethyl - 2«äi&yl -1,3 - propandiol, 2 - Hydroxymethyl-2-propyl-l,3«propandiol, 2^-Dhnethyl-1,3 - propandiol, NeopentylalkohoL. Monoacetin, D-XyIh, D-Arabit, Sorbit.

Kein oder schwaches Wachstum auf:

(a) 2 - Desoxy - D - glucose, d - Glucoronolacton, DulcitoL 2-(Hydroxymethyl)-2-nitrol- U-propandioL 2 - (Hydroxymethyl) - 2 - amino -1,3 - propandiol, 2 - (Hydroxymcthyl) - 2.2 - diphenyi-1,3-propandiol, 2-Methyl-2-nitro- 13-propandiol.

Geeignete StickstoffHeferanten

Wachstum auf NO₇", NH₄ ⁺, Asparagin, Glutamat, complexeo natürlichen Lieferanten, wie BaumwolliaatmehL Hefeextrakt, Caseinhydrolvsat, veschiedelen Peptonen und Sojabohnenmehl.

Schwacher Stickstofflieferant; Harnstoff.
Zweckmäßig wird das Verfahren der Erfindung bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 37° C und vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 28 bis etwa 30⁰C unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Als zweckmäßig hat es sich ferner erwiesen, das Gärmedium zu rühren, obwohl es auch in anderer geeigneter Weise, beispielsweise in Schüttelflaschen, bewegt werden kann.

ίο Die Wachstumsgeschwindigkeit des neuen Mikroorganismus läßt sich in unerwarteter Weise vorteilhaft durch Ändern der Temperatur- und Belüftungsbedingungen und/oder der Impfstoffmenge und des Impfstoffzustands steuern. In nährstoffreichen Nährböden gestattet eine unter der maximalen Wachstumsgeschwindigkeit liegende Wachstumsgeschwindigkeit der betreffenden Mikroorganismen eine maximale Induktion oxydierender Enzyme. Insbesondere läßt sich die Wachstumsgeschwindigkeit der Gärmedien unter Rühren beispielsweise leicht dadurch steuern, daß man die Temperatur von etwa 30 auf etwa 22 bis etwa 24 und vorzugsweise auf etwa 23 C erniedrigt. Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, das Gärmedium wenig zu belüften, d. h. pro Volumen Gärmedium und Minute nur etwa 0,10 bis etwa 0,14 und vorzugsweise Ο.Γ. Volumina Luft zu verwenden.

Als vorteilhaft hat es sich ferner erwiesen, einen Impfstoff aus der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase, d h. in der Zeit zwischen dem etwa 40- und 72stündigen Wachstum und vorzugsweise nach etwa 48stündigem Wachstum, zu verwenden.

Aus dem später folgenden Beispiel 6 ergibt sich die logarithmische Wachstumsphase des Mikroorganismus Flavobacterium oxydans (ATCC Nr. 21 245). Bei dieser Altersstufe von Flavobacterium oxydans erfolgt die Induktion des Pentacrythritenzyms bis nahe an den maximalen Wert, so daß in der Regel etwa 50 bis zu etwa weniger als 100%, d. h. meistens bis zu etwa 97ⁿ/o, des Alkohols bei der Inkubation zu Tris(hydroxymethyl)essigsäure oxydiert werden. Das Auftreten von Tris(hydroxymethyl)essigsäure wird durch ein entsprechendes Verschwinden von Pentaerythrit, welcher daneben noch in äußerst geringer Menge durch Nebenreaktionen verlorengeht, begleitet. Während zunächst ein Anstieg des pH-Wertes des Nährmediums von etwa 7,0 auf etwa 8,0 zu verzeichnen ist, sinkt dieser hierauf infolge der Bildung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure auf etwa 5, ab. Zweckmäßig hält man den pH-Wert des Nährmediums auf

so einem Wert von etwa 3,0 bis etwa 9,5, vorzugsweise auf einem Wen von etwa 6,0 bis etwa 8,0.

Die Kultur wächst in der Regel (lediglich) während der ersten 3 Tage der Inkubation und verbleibt hierauf in einer stationären Wachstumsphase. Während dieser Zeit läuft jedoch die Oxydation weiter. Das auf diese Weise im Nährmedium oder im Nährboden gebildete Oxydationsprodukt, beispielsweise TrisflrydroxymethyDessigsäure, kann mit einer geeigneten Base, beispielsweise Kaliumcarbonat oder Calciumcarbonat, neutralisiert werden.

Gibt man z. B. zu dem im Nährmedium bereits in einer Konzentration von etwa I bis etwa 3 Gewichtsprozent vorhandenen Pentaerythrit portionsweise weiteren Pentaerythrit zu, bis dessen Konzentration im Nährmedium insgesamt etwa 10 und vorzugsweise etwa 6 Gewichtsprozent beträgt, so lassen sich Ausbeuten bis zu 64 g/l (97% der theoretischen Ausbeute) erreichen.

Zur Reindarstellung der Tris(hydroxymethyl)essigsäure, kann die gesamte Kulturbrühe, einschließlich der Mikroorganismen, zentrifugiert werden, wobei die Mikroorganismen entfernt werden. Hierauf kann die erhaltene Brühe durch Zugabe von beispielsweise Kaliumhydroxyd, Calciumhydroxyd oder Kalk auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert werden. Nach dein Neutralisieren wird die Brühe mit einem Ionenaustauschharz in Kontakt gebracht. Hierbei wird die Säure zunächst an das Ionenaustauschharz adsorbiert und hierauf mit einer wäßrigen Säurclösung cluicrt. Zum Adsorbieren der Säuren eignen sich übliche stark basische Anionenaustauscherharze. Zum Hluiercn der adsorbierten Säuren ist Ameisensäure besonders geeignet.

DieTris(hydroxymethyl)essigsäure läßt sich aus der wäßrigen Lösung, beispielsweise durch Eindampfen der wäßrigen Lösung bis zur Trockne, isolieren. Die Säure kann gegebenenfalls, beispielsweise durch Umkristallisieren aus einem organischen Lösungsmittel, z. B. Äthanol, Benzol oder Isopropanol, oder einer Lösungsmittclmischung. beispielsweise einer Mischung aus Äthanol und Benzol, weiter gereinigt werden.

Da die biologische Oxydation von Kohlenstoffverbindungen in der Regel in einzelnen Stufen unter Bildung von Zwischenprodukten abläuft, wobei als Endprodukt CO₂ erhalten wird, kann ein anderes (icwinnungsverfahren zur Reindarstcllung von Vorteil sein, wenn es notwendig ist, das Carbonat zu zersetzen, aus dem das CO₂ gebildet wird, welches durch die Aiistau^chcrsäuls perh, wcrirs Ameisensäure zugesetzt wird.

In diesem lalle wird die vorher zentrifugierte Fermentationsbrühc durch Zugabe einer Säure, beispielsweise Ameisensäure, auf einen pH-Wert von etwa 4 gebracht und 1 Stunde lang nut Stickstoff gespült. Daraufhin wird der pH-Wert der Gärbrühc durch Zugabe einer Base, beispielsweise Kalium- oder Natriumhydroxyd, auf etwa 7 eingestellt. Hierauf wird die Gärbrühc erneut zentrifugiert und auf die lonenaustauschcrsäule aufgegeben.

Die Menge der in der Gärbrühe gebildeten Tris-(hydroxymcthyl)cssigsäure. läßt sich entweder durch vollständige Isolierung der Säure oder aber auf ga.schromatographischem Wege in der später näher beschriebenen Weise ermitteln.

Während der einzelnen Verfahrensstufen können die Temperatur- und Druckbedingungen, abgesehen von den bereits angegebenen Werten, in üblicher bekannter Weise abgewandelt werden.

Das Verfahren der Erfindung kanu in der verschie densten Wehe abgewandelt werden. So kann das Pentaerythrit beispielsweise dem Nährmedium einverleibt werden, nachdem zunächst die Inkubation der Mikroorganismen eingeleitet wurde. Andererseits können die Mikroorganismen auch einem das Pentaerythrit bereits enthaltenden Medium zugesetzt werten. Schließlich können die Mikroorganismen als Impfstoff, bestehend aus ganzen Zellen. Zellbruchitöcken oder Zellextrakten, zugegeben werden, um ein Bakterienwachstum zu erreichen. Werden Zelthruchstücke verwendet, so können diese fach den verschiedensten Verfahren, beispielsweise nach physikaischen oder diemischen Verrohren, z. B. durch Vibrationen, erzeugt worden sein.

Wird der Mikroorganismus Flavobacterium oxylam auf einem reichhaltigen unspezifischen Medium, beispielsweise einem Nährmedium aus Hefeextrakt (1%) und Glucose (1%) oder einem der beschriebenen, Säure erzeugenden Medien, d. h. auf einem Medium, auf dem auch andere Kulturen wachsen und existieren können, gezüchtet, so kann er langsam seine Oxydationsfähigkeit verlieren. Zur Gewährleistung einer ausreichenden Wirksamkeit der Mikroorganismen, d. h. zur Erzielung hoher Ausbeuten an Tris(hydroxymethyl)essigsäure, können solchen Kulturen Säure produzierende Kolonien selektiv entnommen und auf-

!o bewahr! werden. Diese Kolonien lassen sich 3 bis 5 Tage, nachdem sie auf einen den pH-Wert anzeigenden und Pentaerythrit enthaltenden Nährboden aufgebracht wurden, leicht durch eine auf eine Säureproduktion hindeutende Färbung von keinen Säure produzierenden Stämmen, welche naturgemäß auch zu keiner, auf eine Säureproduktion hindeutenden Färbung führt, unterscheiden. Die abgetrennten Kolonien können in einer Lösung, die das Wachstum der Bakterien ermöglicht und die Kulturen enthält, bcispiclswcise in einer physiologischen Kochsalzlösung, dispcrgicrt und auf Nährboden, beispielsweise Agarflächcn, ausgestrichen werden. Nach 2tägigem Wachstum bei einer Temperatur von etwa 30 C können die Kulturen bei verminderten Temperaturen über einige

2s Monate hinweg oder langer aufbewahrt werden, ohne daß ihre Oxydationslahigkeit verlorengeht. Nach einem anderen Aufbcwahrungs- und Konservierungsverfahren können die Kulturen z. B. aus einer wäßrigen Suspension,beispielsweise Magermilch, gefricrgetrocknet werden. Worden diese Kulturen unter Verschluß gehalten, meinen sie für eine iange Zeit icncnstühig.

Für die Durchführung gaschromalographischcr Bcstimmungsvcrfahrcn lassen sich übliche bekannte Gaschrnmatographen mit einem thermischen Lcit-

n fahigkeitsdetektor verwenden. DieChromatographiersäuK'kann /- B. aus einem etwa 1,8 m langen, rostfreien Stahlrohr mit einem Außendurchmesser von etwa 3,2 mm bestehen. Die Packung der Säule kann z. B. aus kalzinierten Kicselpiiraggregaten mit einem (/ehalt an 10" ο Silikonkautschuk bestehen.

Der Heliiimfluß beträgt 30 ml-Min. Die Temperatur an der Einsprilzöffnung kann r B. 295 C betragen, wahrend die Säulentempcratur auf 120 bis 265 C bei einer Temneraturslcigerung von 30OMin. programmicrt werden kann. Der thermische Leitfähigkeitsdetektor kann /. B. bei einer Temperatur von 300 C unter Verwendung eines Brückenstroms von 150 Milliampere betrieben werden.
Bei der Durchführung des Meßverfahrens wird

so zunächst I ml der Gärbrühe in einer Gefriertrocknungsvorrichtung zor Trockne »eingedampft«. Zu dem erhaltenen Rückstand werden dann 0.3 ml C'hlortrimethylsilan. 03 ml I,l.M33-Hexamethyldisila/an und OJ ml einer Lösung von Octadecan in Pyridin

(0.08 g Octadecan mit Pyridin auf I ml aufgefüllt) zugegeben. Nach 4stündigem Stehenlassen wird die Probe gaschromatographisch analysiert. Hierbei werden Einspritzvolumina von 1,4 bis l.6Mikroliter verwendet.

&> Die Konzentration an Tnsf.hydroxymethyl)essigsäuie in 1 ml Gärbrühe IaBt sich wie folgt bestimmen: Verschiedene Mengen einer analysenreinen TnsfliydroxymtthyDessigsäure, nämlich 1 bis 40 mg. werden in ihre Trimethylsilyiderivate übergeführt. Die ein-

zelnen Proben werden hierauf in der beschriebenen Weise analysiert Wenn das Verhältnis des Peakbezi.ks des rrimethyisilvldenvats zu dem Peakbezirk von Octadecan gegen die in der jeweiligen Probe

enthaltene Menge Tris(hydroxymethyl)essigsäure in Milligramm aufgetragen wird, erhält man eine Eichgerade.

Wird nun eine Probe der Gärbrühe in der beschriebenen Weise analysiert, so entspricht die Milligrammmenge Tris(hydroxymethyl)cssigsäure in der Testprobe auf" der Eichgeraden dem Verhältnis des Peakbezirks des Trimethylsilylderivats zum Peakbczirk des Octadecans.

Das Infrarotspektruni der,durch mikrobiologische Oxydation hergestellten Tris(hydroxymethyl)essigsäurc sowie das Massenspektrum ihres Trimethylsilylderivats sind mit den mit einer Prlbc der durch Platin katalysierte Oxydation von Pentaerythrit hergestellten Säure aufgenommenen Spektren identisch.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

In einer Reihe von 125 ml fassenden und mit jeweils einem rostfreien StahlvcrschluB nach Morton ausgestatteten Erlcnmeyerkolben wurden Gärungen durchgeführt. Die einzelnen Kolben enthielten jeweils 25 ml eines wäßngen Nährmediums mit Essigsäure, 2 g/1 eines Kohlcnstoffliefcrantcn, 10 g/l Hefeextrakt und 20 g/l Pentaerythrit. Die einzelnen Nährmedien wurden durch Zugabe von Kaliumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert und hierauf in einem Autoklav 15 Minuten lang bei einem Dampfdruck von 2,05 kg'ctrr sterilisiert. Die in den einzelnen Kolben enthaltenen 25 ml Nährmedium wurden mittels einer öse mit jeweils etwa 0.75 mg (Trockengewicht) einer vorher 2 Tage lang auf einem schrägen Nährboden bei einer Temperatur von etwa 30' C gezüchteten Kultur angeimpft. Hierauf wurden die einzelnen Kolben bei einer Temperatur von 30i 1 C mit 400 U/Min auf einer sich drehenden Schüttelvorrichtung bcwcnt. Von Zeit zu Zeit wurden aus der Gärbrühe Proben entnommen und untersucht, wobei die in der folgenden Tabelle angegebenen Ergebnisse erhalten wurden.

	Gchildcic	Säurcmcngc in	n 1 nach
Kolben Nr	2lägiger	4lä giger	7lapigcr
		Kcrmcnlalion
1		10.(X)	10.27
2	5.38	12J5Ü	15.65
3	6.80	10.30	11.42
4	6.25	8,41	10.60
5	2.65	1032	11.08
6	5.70	10,20	11.15
7	6.03	10,77	11.07
8	5.25	10,48	14.85
9	7.35	9,72	12.05
10	3,13	10.00	10.85
11	5.90	10.00	11.2?
12	3.50	9.80	11.31
2,40

Beispiel 2

Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß während der Inkubationsdauer an den in der folgenden Tabelle mit ⁺ bezeichneten Tagen schrittweise 250 mg Pentaerythrit und 200 mg Calciumcarbonat zugesetzt wurden. Es konnte eine erhöhte Ausbeute an Tris(hydroxymethyl)essigsäure im Vergleich zu den Ergebnissen des Beispiels 1 nach 7tägiger Fermentation festgestellt werden.

/.ei! in Tugcn	Gebildete Menge an Tris(hydroxymclhyl (essigsäure in g/1
0	0
34	13,2
44	19,1
5 +	22,3
6^	35.5
7	45,0
11	64,0

Beispiel 3

Bei der Herstellung von Tris(hydroxymcthyl)essigsäure in einem kleinen Gärgefäß unter Rühren und automatischer Neutralisation mit Kaliumcarbonatlösung konnte eine Produkiionssieigcfung bis zu 97% der theoretischen Oxydation von Pentaerythrit zu Tris(hydroxymcthyl)essigsäurc erreicht werden.

Die Gärung wurde in einem zylindrischen, aus Glas bestehenden Gärgefäß mit einer Kapazität von 650 ml, einem Durchmesser von 7 cm und einer Höhe von 14 cm durchgeführt. Das Rühren erfolgte mit einem 5 cm langen, magnetischen Rührstäbchen, welches mit einer Geschwindigkeit von 12(F U/Min umlief. Die Belüftungsgeschwindigkeit betrug 80 ml/Min. (O.I2vvm)*) bei einer Temperatur von 30 C. Die Schaumbildung wurde dadurch gesteuert, daß jeweils, wenn der Schaum einen Schaumfühler erreichte, automatisch ein übliches (unter der Handelsbezeichnung Antifoam C der Firma Dow Corning, Midland Michigan, vertriebenes) Netzmittel zugegeben wurde. Das Nährmedium entsprach dem Nährmedium des Beispiels 1. Das Beimpfen des Nährmediums erfolgte in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise.

An den durch * in der folgenden Tabelle gekennzeichneten Tagen wurden 10 g festes Pentaerythrit zugegeben. Ab dem zweiten Tag erfolgte eine automatische Steuerung des pH-Wertes auf 7,0 ir 03 unter Zulauf einer

Zeit in Tagen

2* 5* 7

Gebildete Menge an TiTshydroxyTnethyDessjgsäure

in g/l

34,7 543

In die Kolben Nr. 2 (nach 2 Tagen) und Nr. 8 (nach 4 Tagen) wurden jeweils 200 mg Calciumcarbonat eir.gefüllL

"1 - 0.12 Vohimma Luft Volumina Medium/Minute.

13

Beispiel 4

Der Einfluß einer Steuerung der Belüftungsgeschwindigkeit auf die Anhäufung von Tris(hydroxymethyl)essigsäure in Gärgefäßen, beispielsweise in einen Rührer aufweisenden Gärgefäßen, ergibt sich aus folgenden Daten: (Die Züchtung der Kultur erfolgte 48 Stunden lang in einer dem Beispiel 3 entsprechenden Weise.)

IO

Bclüflungsgcschwindigkcit Volumina I.ufl/Volumcn Niihr-

medium/Min.

0,06
0,12
0,25

Gebildete Menge an

Tris(hydroxymclhyl)e5.sig<«iurc

in g/l

2,2

8,8

Spur

Beispiel 6

Nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren wurden aus bei einer Temperatur von 30° C inkubierten Kulturen zu bestimmten Zeiten Proben entnommen, in denen die entsprechenden Mengen Pentaerythrit und Tris(hydroxymethyl)essigsäure bestimmt wurden. Ferner wurde das Bakterientrockengewicht, d. h. das Wachstum der Mikroorganismen, bestimmt, indem das Absorptionsvermögen bei 650 πΐμ gemessen und der hierbei erhaltene Wert mit dem Trockengewicht gegenüber der Absorption verglichen wurde.

Beispiel 5

In entsprechender Weise wie im Beispiel 3 ergibt sich der Einfluß der ursprünglichen Konzentralion an Pentaerythrit auf die Anhäufung von Trisfliydroxymethy!)essigsäurc während des Gärvorgangs aus der folgenden Tabelle:

Pentaerythrit. %

0,5
1,0
2,0
4,0
6.0
8,0
10,0

Trislhydroxymcthyllcssigsäiirc, g/l

4,6

8,0
16,0
17,0
17,3
18,2

4,0

Zeil in Std.

24
40
48
60
72
80
96
120

icbildetc Menge	ρ"	Wachstum
l'enlitcrythrit in mg, ml	7,0	mg/ml
20,0	7,5	0,0
20,0	8,0	0,1
18,3	7,9	1,7
17,8	7,2	2,5
12,8	6,8	4,4
10,2	6,2	4,6
9,4	5,8	4,6
8,6	5,4	4,6
7,8	4,5

Gebildete Menge

a,i Tris(hydroxy-

mclhyl)cssigs;iurc

in mg/ml

0,0

0,0

3,2

4,0

8,0
10,0
11.2
12,2
13.0

Die vorhergehenden Beispiele veranschaulichen die Ergebnisse, die mit einem vorzugsweise verwendeten Nährmedium, d. h. einem Pentaerythrit enthaltenden Nährmedium, erhalten wurden. Wie bereits erwähnt, läßt sich jedoch eine entsprechende biologische Oxydation erreichen, wenn der Pentaerythrit durch andere oxydierbare Kohlenstoffverbindungen ersetzt wird. An Stelle von Pentaerythrit können somit beispielsweise mit gleichem Erfolg Alkohole, wie Neopentylalkohol, Sorbit, Mannit und Aldehyde, wie Xylose, Ribose u. dgl., verwendet werden.

Claims (8)

922 Patentansprüche:

1. Verfahren /ur mikrobiologischen Oxydation von Peniaer\t!irii /u Tris(hydroxymciii> liessigsäure unter .umben Bedingungen, dadurch gekenn/eich net. daß man die mik mhiiv logische ()\ydation unter Verwendung von I hi\ohacterium oxydans (ATCC Nr. 21 245) in einem wäßrigen. Pentaerythrit enthaltenden Nährmcdiiim so bei einem pH-Wert zwischen 3.0 und 9.5 und einer Temper.nur zwischen 20 und 37 C durchführt.

2. \ ei !.ihren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation bei einer Temperatur zwischen ?.2 und 24"C tlurchfiihit. is

3. Verfahren nach den An->piu>.hen 1 und 2. dadurch gekennzeichnet, daü man cm Nährmedium verwendet, das mindestens eine das Wachstum von Flavobactcrium oxydans (ATCC Nr. 21 245) fördernde Kiihlen>inlT\crbindune enthält.

4. Verfahren 11.ich \n-pruch 3, dadurch gekenn zeichnet, üaß man als das Wachstum des Bakteriums fordernde Kohlenstoffverbindung Essigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Glycerin, Glucose, Äthylenglykol und/oder Saccharose verwendet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wäßriges Nährmedium verwendet, das pro Liter Nährmedium etwa 5 bis etwa 100 g Pentaerythrit enthält.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium den Pentaerythrit zuerst in einer Kon- zentration von etwa 0,5 bis etwa 3 Gewichtsprozent und danach portionsweise in einer solchen Menge zugibt, daß seine Konzentration, bezogen auf 1 1 Nährmedium, bis zu etwa 10 Gewichtsprozent beträgt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von etwa 0,10 bis etwa 0,14 Volumina Luft pro Volumen Nährmedium pro Minute durchführt.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Oxydation Bakterien verwendet, die sich innerhalb ihrer 40- bis 72stündigen Wachstumsphase befinden.