SU1144629A3 - Способ определени креатинина в сыворотке крови - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЕАТИНИНА В СЬгаОРОТКЕ КРОВИ, о т л ич а ю щ и и с   тем, что, с целью повьшени  специфичности способа, к пробе добавл ют гфеатининаминогвдролазу , инкубируют при рН 7,8-8,3 в течение 45-60 мин при 37°С и по уровню уменьшакщегос  креатинина или образовавшегос  креатина определ ют креатинин в пробе. i w

Description

Изобретение относитс  к медицине а именно к способу дл  специфическ го ферметативного определени  креатинина . Известе-н способ определени  креа тинина путем смешивани  креатинина с щелочным пикратом il . Однако данный способ  вл етс  недостаточно специфическим при вы в лении креатинина в сыворотке крови Цель изобретени  - повышение специфичности способа. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу определени  креатинина к пробе добавл ют кр атининаминогидролазу, инкубируют при рН 7,8-8,3 в течение 45-60 мин при 37 С и по уровню уменьшающегос  креатинина или образовавшегос  креатинина определ ют креатинин в пробе. Способ осуществл ют следующим образом. Фермент - креатининаминогидролаз получают по известному методу. Этот фермент катализирует реакцию : Креатинамидогидролаза Креатинин+Н-рО у . : Креатин Образовавшийс  креатин можно измерить известными способами, например , фосфорилированием креатиновой киназой и аденозинтрифосфатом (АТФ с образованием адёнозиндифосфата. Друга  возможность состоит в измерении уменьшени  количества креатинина по Жафе. Способ осуществл ют при рН между 7,8 и 8,3. Дл  установки величины рН можно примен ть любые буферные растворы. Однако следует обращать внимание на то, чтобы примен емый буфер не преп тствовал используемом методу определени . Если, например затем по Жафе определ ют изменение содержани  креатинина, нужно применить буфер, который не подавл ет реакцию Жафе. Неблагопри тные дл  реакции, например, глициновые и гли цилглициновые буферные растворы. Предпочтительными  вл ютс  фосфатны и пирофосфатные буферы. Однако если определение производитс  не по Жафе а образовавщийс  креатин определ ют с помощью креатиновой киназы и АТФ . то можно примен ть также глициновые и им подобные буферные растворы. 9J Согласно предлагаемому способу предварительное отделение белка не требуетс . Однако отделение белка целесообразно дл  последующего определени  креатина. Креатин перевод т при применении фермента креатиназы в саркозин и мочевину и последнюю определ ют с помощью известных методов. Этот вид осуществлени  способа примен етс  дл  определени  фермента , содержащего креатинкиназу и креатиназу в смеси. Если образовавшийс  креатин определ ют известным способом с применением креатиназы и АТФ, то отделение белка выгодно, так как благодар  этому повышаетс  чувствительность теста. Применение фермента, содержащего креатинамидогидролазу и креатиназу, предпочтительно, когда определение креатинина производитс  по Жафе, так как благодар  креатиназе равновесие перемещаетс  в сторону образованн  креатина. Изобретение создает также новую комбинацию реактивов дл  специфического определени  креатинина, котора  состоит из креатинового стандарта , пикриновой кислоты, едкого натра, креатининамидогидролазы (одной или вместе с буфером), а также в том или ином случае креатиназы, в не смешиваемом до употреблени  состо нии . Кроме того, комбинаци  состоит из буфера, восстановленного никотинамид-аденин-динуклеотида (NADN), АТР и фосфоенолпирувата (ФЕП): лактатдегидрогенозы (LDH), пируваткиназы (РК) и MgC ; креатинкиназы (СК), креатининамидогидролазы в не смешиваемом до употреблени  состо нии, 1 П р и м е р 1. Определение с непосредственно/ следующим применением реакции Жафе, 1,0 мл содержащей креатинин пробы (сыворотка или разбавленна  моча) инкубируют в 0,050-0,2 М буфера (особенно пригодны пирофосфатный, фосфатный, диэтаноламии) HCR, или глицилглицин (НСЕ - буфер) креатининамидогидролазой в количестве минимум 5 и (тест), 1 U 1 ммоль, превращенного субстрата за 1 мин и креатиназой в количестве минимум 0,8 и (тест) при З7с в течение 453 60 мин. Затем производ т отделение белка с помощью 3 М трихлоруксусной кислоты вместе с пробой, к которой не прибавл ют смеси ферментов. В на досадочной жидкости обеих проб прово д т реакцию Жафе. Из разности экстинкций обеих проб при 546nm получаетс  количество креатинина по отно шению к стандартной величине креатинина . Реакцию окрашивани  по Жафе провод т путем добавлени  пикриновой кислоты и NaOH, выдержки в течение 15 мин при комнатной температуре и измерени  и кювете с толщиной сло  2 см при 546 . П р и м е р 2. Измерение креатина с помощью креатинкиназы. С помощью креатинкиназы креатинин гидролизуетс  в креатин и образовавшийс  креатин фосфорилируетс  по известной методике креатинкиназой и АТФ. Образовавшийс  АБФ превращаетс  посредством ФЕК и ПК в АТФ и при этом получившийс  пируват восстанавливаетс  посредством NADH и лактатдегидрогеназы в лактат при 294 об1эазовании NAD. Обмен 1 ммоль NADH, измерение при 334, 340 или 366 п m (соответствует присутствию 1 ммоль креатинина). определени  смесь реактивов, содержаща  NADH, ATP, PEP и хлорид магни  в 0,11 М буфера при рН 9,0 смешивают с лактатдегидрогеназой (LDH), пируваткиказой (РК) и термостатируют до . Затем добавл ют сыворотку и креатинкиназу, и при указанной температуре производ т инкубирование максимум в течение 30 мин. Путем добавлени  минимум 5 U креатинкиназы начинают реакцию. Падение экстинкции регистрируют. Продолжительность реакции составл ет 40- 90 мин. Содержание креатина вычисл ют непосредственно по мол рным коэффициентам экстинкции NADH. Преимуществом данного способа  вл етс  повышение специфичности определени  креатинина, упрощение по сравнению с базовым способом, отсутствие необходимости отделени  белка в сыворотке крови.

Claims (1)

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЕАТИНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ, отличают и й с я тем, что, с целью повьшения специфичности способа, к пробе добавляют креатининаминогид ролазу, инкубируют при pH 7,8-8,3 в течение 45-60 мин при 37°С и по уровню' уменьшающегося креатинина или образовавшегося креатина определяют креатинин в пробе.

   SU „ 1144629