DE2602961A1

DE2602961A1 - Verfahren zum nachweis und zur bestimmung eines reduzierten coenzyms

Info

Publication number: DE2602961A1
Application number: DE19762602961
Authority: DE
Inventors: Bastiaan Cornelis Goverde; Peter Silvester Lamber Janssen; Aarne Ilmari Dr Konttinen
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1975-01-28
Filing date: 1976-01-27
Publication date: 1976-07-29
Also published as: NZ179837A; NL7500951A; US4097338A; BE837936A; BR7600471A; DK20676A; AU1032976A; ZA76176B; PT64723A; SE7600817L; JPS51100787A; PT64723B; ES444617A1; FR2299644A1; CA1073328A; FI760146A; GB1532694A

Description

Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines reduzierten Coenzyms

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines reduzierten Goenzyms oder eines Derivates davon in einem wäßrigen System auf fluorimetrische Weise.

Ein reduziertes Coenzym kann spektrophotometrxscli oder fluorometrisch bestimmt werden. Eine große Anzahl enzymatischer Bestimmungen wird z.B. mit Hilfe spektrophotometrischer Verfahren durchgeführt und beruht auf der Messung eines der Coenzyme, die an der Reaktion teilnehmen. In solchen Fallen wird im allgemeinen die Tatsache ausgenutzt, daß das Coenzym ein Absorptionsmaximum bei einer bestimmten Wellenlänge besitzt und daß die oxidierte 3?orm keine Absorption bei dieser Wellenlänge besitzt oder in dem Bereich}der diese Wellenlänge umfaßt. Die reduzierten Formen der Coenzyme MD und EADP, nämlich

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HADH "bzw. MDPH zeigen z.B. Absorptionsmaxima bei 345 nm, während die oxidierten Formen dieser Coenzyme nahezu keine Absorption zwischen 300 und 400 nra besitzen. Die UV-spektrophotometrische Messung ist jedoch nicht sehr empfindlich.

Bei der spektrophotometrischen Bestimmung -von reduzierten Coenzyraen werden auch Redox-Verbindungen angewandt, wie Tetrazoliumsalzejin Gegenwart eines geeigneten Elektronenakzeptors wie z.B. Phenazin-methosulfat (PMS). In Gegenwart von PMS werden Tetrazoliumsalze durch reduzierte Coenzyme wie z.B. ITADH und MDPH zu gefärbten Verbindungen umgewandelt, den sogenannten Formazanen. Diese Verfahren lassen jedoch viel zu wünschen übrig aufgrund ihrer geringen Empfindlichkeit und mangelnden Spezifität besondersjwenn sie für klinische Zwecke angewandt werden.

Die fluormetrische Bestimmung stellt ein "verhältnismäßig empfindlicheres Verfahren zum nachweisen eines reduzierten Coenzyms dar. Absolut gesehen ist dieses Verfahren ebenfalls noch ziemlich unempfindlich, da die Eigenfluoreszenz (native fluorescence) reduzierte: Coenzyme in allgemeinen gering ist.

Eine Voraussetzung für ein schnelles empfindliches und reproduzierbares Verfahren besteht darin, daß die Fluoreszenz eines reduzierten Cοenzyms,selbst wenn dieses in geringer Konzentration vorliegt, unzweideutig gemessen werden kann und nicht beeinflußt wird von anderen Faktoren, die in dem wäßrigen System möglicherweise vorliegen können.

Überraschenderweise konnte diese Aufgabe gelöst werden, durch ein Verfahren zum fluorimetrischen Nachweis und zur Bestimmung eines reduzierten Coenzyms oder eines Derivates davon in einem wäßrigen System, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Fluoreszenz in gleichzeitiger

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Gegenwart einer organischen Flüssigkeit, die mit Wasser mischbar ist oder eines mit Wasser mischbaren Gemisches organischer Flüssigkeiten sowie einer Dispersion von einer oder mehreren geringlöslichen oder unlöslichen organischen und/oder anorganischen Substanzen durchgeführt wird, die in situ durch Ausfällung gebildet und/oder als solche zugesetzt werden. Das gleichzeitige Vorhandensein einer Dispersion von einer oder mehreren schwer löslichen oder unlöslichen Substanzen und einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit oder einem mit Wasser mischbaren Gemisch organischer Flüssigkeiten scheint überraschenderweise die Eigenfluoreszenz der reduzierten Coenzyme oder ihrer Derivate deutlich zu intensivieren. Ein Vorteil, der sich direkt daraus ergibt, besteht darin, daß es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich ist, sehr viel geringere Konzentrationen des reduzierten Coenzyms oder der Derivate davon auf sehr einfache Weise nachzuweisen oder zu bestimmen₍als es bisher mit Hilfe fluoriraetrischer Verfahren möglich war. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß in vielen Fällen geringere Mengen der im allgemeinen sehr teueren Reagentien ausreichen. Zwar ist es möglich, die Eigenfluoreszenz eines reduzierten Coenzyms oder Derivates durch Zugabe einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit z.B. Aceton zu dem die Substanz enthaltenden wäßrigen System zu intensivieren. Auf diese Weise kann die Intensität der Eigenfluoreszenz jedoch nur leicht erhöht werden. In Gegenwart einer mit Wassermischbaren organischen Flüssigkeit oder eines Gemisches von Flüssigkeiten zusammen"mit einer Dispersion aus einer oder mehreren schwer lösöichen oder unlöslichen anorganischen und/oder organischen Substanzen wird die Eigenfluoreszenz jedoch um ein Vielfaches intensiviert, unabhängig davon .ob die schwer- oder unlöslic^-hen Substanzen in situ durch Ausfällung gebildet und/oder als

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solche zugegeben worden sind. Es hat sich z.B. gezeigt, daß es möglich ist ι die Eigenfluoreszenz von ITADPH, die üblicherweise in Wasser nicht oder kaum meßbar ist, um ungefähr das 60-fache zu intensivieren mit Hilfe des beschriebenen Verfahrens. Im allgeimeinen kann die Eigenfluoreszenz eines reduzierten Coenzyms um einen Faktor 20 bis mehr als 50 erhöht werden mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens. Eine synergistische Wirkung in einer solchen G-rößenordnung konnte nicht vorhergesehen werden und war für den Fachmann höchst überraschend.

Obwohl im Prinzip irgendeine Substanz, die unter den Meßbedingungen unlöslich oder nur schwer löslich ist, angewandt werden kann, werden vorzugsweise Proteine angewandt, die in situ ausgefällt werden und die Enzymproteine sind oder andere Proteine, die in situ ausgefällt werden, und anorganische Verbindungen, die in^itu ausgefällt oder als solche zugesetzt werden sowie Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Gruppen. Eine in situ gebildete schwerlösliche oder unlösliche Substanz kann erhalten werden durch Ausfallen irgendeines Proteins, das gegebenenfalls in dem wäßrigen System, das das reduzierte Ooenzym oder ein Derivat davon enthält, vorhanden ist. Dieses Protein kann ein Enzymprotein oder ein anderes Protein sein. Wenn das reduzierte Coenzym als Komponente einer Ezymreaktion nachgewiesen oder bestimmt werden soll, stammt das ausgefällte Protein vollständig oder teilweise von dem vorhandenen Enzym. Die Intensivierung der Fluoreszenz scheint zuzunehmen proportional zu der Menge des vorhandenen ausgefällten Enzyms.bis ein optimaler Wert erreicht ist. Eine verhältnismäßig große Menge ausgefallenen Proteins tritt auch auf, wenn das reduzierte Coenzym eine Komponente eines Reaktionsgemisches unterschiedlicher möglicherweise störender Enzymreaktionen ist oder wenn eine Enzymreaktion in einem

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wäßrigen System stattfindet, das aus anderen Gründen sohon Protein enthält, wie z.B. Blutserum. Es ist daher bevorzugt, daß ein Protein zur Ausfällung zu einem wäßrigen System zugesetzt wird, das kein Protein enthält oder nur Bnzymprotein. Im Prinzip kann irgendein Protein oder Polypeptid zugesetzt werden z.B. ein Protein tierischen oder pflanzlichen Ursprungs. Gute Ergebnisse werden erzielt, wenn beispielsweise Albumin zugesetzt wird.

Nach Ausfällung des schon vorhandenen und/oder zugesetzten Proteins wird die Fluoreszenz gezeigt oder gemessen in dem so erhaltenen heterogenen System in Gegenwart einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit oder eines mit Wasser mischbaren Gemisches organischer Flüssigkeiten.

Diese organische Flüssigkeit oder Kombination solcher Flüssigkeiten kann gleichzeitig als protein-ausfällendes Reagenz dienen. Es ist jedoch auch möglich, das Protein mit Hilfe anderer geeigneter Mittel auszufällen. Wenn andere Mittel zum Ausfällen angewandt werden,muß eine mit Wasser mischbare organische Flüssigkeit oder eine Kombination solcher Flüssigkeiten zu dem wäßrigen Testsystem zugesetzt werden.

Andere Substanzen, die unter den Yersuchsbedingungen unlöslich oder schwer löslich sind, können außerdem oder anstelle des ausgefällten Proteins nach dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden. Solche Substanzen können organischer oder anorganischer Natur sein.

Vorzugsweise werden Substanzen angewandt, die zu der zuletzt genannnten Gruppe gehören, wie anorganische Salze, die in

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dem Iestmedium unlöslich oder nur mit Schwierigkeiten löslich sind.

Diese können auf bekannte Weise erhalten werden, z.B. durch Zugabe von zwei in Wasser löslichen Salzen, wobei das Metallion des einen Salzes mit dem Anion des anderen Salzes die unlösliche oder schwerlösliche Substanz ergibt. Zwei-oder mehrwertige Metallionen werden vorzugsweise als Metallion angewandt.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wird auf ein wäßriges System, das ein Reaktionsgemisch von einer Enzymreaktion enthält, kann das Metallion des entsprechenden Enzymaktivators angewandt werden. In diesem Falle muß nur eine Substanz, die ein Ausfällen des Anion bewirkt., zugesetzt werden. Wenn die Konzentration dieses Metallions sehr gering ist, kann eine weitere Menge des gleichen Anions oder ein anderes geeignetes Anion gegebenenfalls zugesetzt werden. Es ist selbstverständlich, daß,wenn bereits ein geeignetes Anion vorhanden ist, es ausreichen kann, eine geeignete Metallverbindung zuzusetzen. Geeignete Metallverbindungen sind z.B. wasserlösliche anorgnis^che Salze von Metallen, wie Zink, Magnesium, Mangan, Calcium und Alumini um. Geeignete AnioneHsind u.a.

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HCO.,, HPO , und SO . oder solche, die abgeleitet sind von Oxalsäure, Zitronensäure und Weinsäure.

Die schwerlösliche oder unlösliche Substanz kann auch als solche zu der zu untersuchenden Flüssigkeit zugegeben werden. In diesem Falle xverden vorzugsweise anorganische Substanzen angewandt, wie z.B. Metallcarbonate, Metallsulfate, Metallphosphate, Metallsilicgte und Metalloxide, die unter den YerSuchsbedingungen unlöslich oder schwerlöslich sind. Beispiele für solche Substanzen umfassen Zinkcarbonat, Magnesxumcarbonat, Calciumphosphat, Zinkphosphat, Calciumsulfat (Gipspulver), Aluminiumoxid, Kieselsäure und pulveiisierte natürliche Silicate. .

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Die bevorzugte Endkonzentration an der schwerlöslichen oder unlöslichen anorganischen Verbindung liegt zwischen 10 und 250 mMol/l.

Die Auswahl einer solchen Verbindung hängt im allgemeinen von dem pH-Wert der das zu bestimmende reduzierte Coenzym enthaltenden Flüssigkeit oder,allgemeiner, dem pH-Wert oder pH-Wert-Bereich ab, bei dem oder über den das reduzierte Coenzym stabil ist· In den meisten Fällen werden die Messungen in neutralem oder schwach-alkalischem Medium durchgeführt.

Die Anwendung schwerlöslicher oder unlöslicher anorganischer Verbindungen anstelle des Proteinniederschlages bei Bestimmungen, die durchgeführt werden z.B. an Sera mit verschiedenen Proteinkonzentrationen,ergibt den Vorteil, daß keine Abhängigkeit mehr besteht von der Proteinkonzentration, was im Falle der Proteinausfällung natürlich der Fall ist. Wie aus dem oben gesagten deutlich hervorgeht, besitzt die Proteinkonzentration einen deutlichen Einfluß auf die Fluoreszenz.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip auf irgendein wäßriges System angewandt werden, das ein reduziertes Coenzym enthält. Das einfachste Beispiel ist eine Lösung von NADH in Wasser. Das Verfahren kann jedoch auch erfolgreich auf komplexere wäßrige Systeme, wie biologische Flüssigkeiten,angewandt werden. Diese biologischen Flüssigkeiten umfassen: Blut, Plasma, Serum* Gerebrospinal-Flüssigkeit (liquor)| Cervical-Flüssigkeit, Speichel, Galle, Synavial-Flüssigkeit, Urin und auch Flüssigkeiten mikrobiologischen Ursprunges, wie Kulturmedien. Wie oben gesagt, braucht im allgemeinen kein weiteres Protein zu einer biologischen Flüssigkeit zugesetzt zu werden zur Bildung eines Niederschlages.

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Das erfindungsgemäße Verfahren kann erfolgreich angewandt werden zum Nachweis und zur Bestimmung eines reduzierten Coenzyms, das das Reaktionsprodukt einer Enzymreaktion ist, z.B. entsprechend der Formel

GH₅GOCOOH + HS-CoA + MD 5VOH₅CO-S-CoA + CO₂ + MADH + H⁺ ,

wobei HS-CoA das Coenzym A, MAD Coenzym I und MDH die reduzierte Form von Coensym I ist.

Gute Ergebnisse werden auch erzielt,wenn das Verfahren auf Reaktionsgemische von Enzymreaktioneii angewandt wird, bei dem eine Dehydrogenase, ein Substrat für die Dehydrogenase und die oxidierte Form eines Coenzyms die Reaktionsprodukte sind.

Beispiele für solche Reaktionen umfassen:

Isocitrat Dehydrogenase

Isocitronensäure + UADP (Coenzym II) ■^-Γ~^--~--^> -Ketoglutarsäure + CO₂ + BADPH + H⁺ Malat Dehydrogenase

Apfelsäure +NAD (Coenzym I)<^=r■=·=-·==-·= τ=^, Oxalessigsäure +

NADH + H⁺

G-lucose-6-phosphat Dehydrogenase

Glucose-6-phosphat + NADP ^-=~ - = - q> 6-Phosphogluconat +

NADPH + H⁺

Das angewandte Reaktionssystem muß jedoch nicht auf eine Enzymreaktion, umfassend eine Dehydrogenase mit gleich-

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zeitiger Bildung eines reduzierten Coenzyms beschränkt sein. Der Enzyrareaktion bei der dieses auftritt, können auch einige oder mehrere andere Reaktionen vorausgehen, die enzymatisch oder nicht-enzymatisch sein können. ZvB. ist die oben als letzte angegebene Reaktion mit Grlucose-6-phosphat Dehydrogenase (G--6-PD) die Reaktionsstufejin der das reduzierte Goenzym NADPH gebildet wird und die daher als Indikatorreaktion bezeichnet werden kann. Diesa: Reaktion kann z.B. die folgende Reaktion vorausgehen:

Hexokinase (HK)

Glucose + Adenosin-triphosphat (ATP) <============»· Glueose-

6-Phosphat + Adenosindiphosphat (ADP)

Dieser Reaktion kann wieder die folgende Reaktion vorausgehen:

CK
Kreatin-phosphat (GP) + ADP<========,Kreatin + ATP CK = Kreatin-kinase

Die Menge an reduziertem Coenzym ist ein Maß für die Menge der zu bestimmenden Komponente in der Indikatorreaktion. Wenn der Indikatorreaktion eine oder mehrere Reaktionen vorausgehen, ist die bestimmte Menge an reduziertem Coenzym ein Maß für die Menge der zu bestimmenden Komponente in diesen vorausgehenden Reaktionen,vorausgesetzt, daß optimale Reaktionsbedingungen gewählt worden sind. Wenn die zu bestimmende Komponente ein Enzym ist, kann die bestimmte Menge an reduziertem Coenzym in der Indikatorreafction auch ein Maß für die Aktivität des betreffenden Enzyms sein.

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Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt eine schnelle und gute Möglichkeit,Kreatinkinase zu bestimmen. Da sich Kretinkinase (GK) als muskelspezifisches Enzym in bestimmten Körperflüssigkeiten während pathologischer

das j

Prozesse findet, bedeutete daß das erfindungsgemäße Verfahren eine schnelle und reproduzierbare Möglichkeit zur Bestimmung von Myοcardial-Infarkten und anderen Krankheitszuständen darstellt und auch das Ausmaß der Manifestation anzeigt.das eingetreten ist.

Nach den oben angegebenen Beispielen wird das gebildete Coenzym immer nachgewiesen oder quantitativ bestimmt. Wenn die Reaktionen in der umgekehrten Richtung verlaufen, ist es jedoch auch möglich, die Abnahme der Menge an reduziertem Coenzym zu zeigen bzw. quantitativ zu bestimmen. In anderen Worten,es ist auch möglich, die Abnahme der Fluoreszenz zu messen. Voraussetzung hierfür ist jedoch, daß die Fluoreszenz der Anfangsphase stark genug ist und daß die Fluoreszenz in der Endphase noch ausreichend intensiviert werden kann, um gemessen zu werden. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht es leichtydiese Bedingungen zu erfüllen. In diesem Falle_fin dem das reduzierte Coenzym die Ausgangsverbindung ist, muß die Fluoreszenz sowohl in der Anfangs- als auch in der Endphase gemessen werden. Zur Bestimmung der Fluoreszenz in der Anfangsphase wird ein bestimmter abgemessener Toil der zu untersuchenden Flüssigkeit entnommen und dem erfindungsgemäßen Verfahren getrennt unterworfen.

In diesem Falle ist die Abnahme der Fluoreszenz oder besser dieser vorhandenen Menge an reduziertem Coenzym ein Maß für die zu bestimmende Komponente der Reaktion.

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Wenn der Indikatorfeaktion folglich die Reaktion_fin der das reduzierte Coenzym oxidiert wird, eine oder mehrere andere Reaktionen vorausgehen, die enzymatisch oder nicht-enzymatisch sein können, ist die noch vorhandene Menge an reduziertem Coenzym ein Maß für die Menge der in dem System zu "bestimmenden Komponente.

Diese Variante macht das Verfahren sehr gut geeignet für andersartige Bestimmungen wie im folgenden für die Bestimmung von Kreatinkinase beispielhaft angegeben ist.

CK
Kreatin + ATP —-^Kreatinphosphat + ADP (Hauptreaktion)

Pyruvatkinase Phosphor-enol-pyruvat +ADP > Pyruvat +ATP

(Nebenreaktion)

Pyruvat +-MDH + H⁺ ---->Lactat + NAD⁺ (I^ ikatorr eaktion) (LDH = Lactatdehydrogenase)

Aus dem oben angegebenen Beispiel geht hervor, daß zwischen Hauptreaktion, Nebenreaktion und Indikatorreaktion unterschieden werden kann. Unter Indikatorreaktion ist die Reaktion zu verstehen, in der das reduzierte Coenzym gebildet oder oxidiert wird. Wenn in dem zuletz-; genannten Beispiel die Hauptreaktion weggelassen wird, wird die llebenr eaktion zur Hauptreaktion. Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren im Prinzip auf jedes reduzierte Coenzym anwendbar ist, sind die reduzierten Pyridin-nucleotide und deren Derivate j besonders ITADH und NADPH-Derivate , bevorzugt. Unter Derivaten^/Bler z.B. die Acylverbindungen, wie die Acetylpyridinverbindungen.zu verstehen.

Als mit Wasser mischbare organische Flüssigkeiten können z.B. die folgenden angewandt werden:

Methanol, Äthanol, 2-Propanol, Athylenglykol, Propylenglykol, 2-Methoxy-äthanol (Methyl-cellosolv), 2-Ä'thoxyäthanol (Äthylcellosolv), 2-(?£thoxyäthoxy)äthanol, Glycerin, Aceton, Methyl-äthyl-keton, Dimethyl-sulfoxid (DMSO), Formamid, Dimethylformamid (DMF), Pyridin sowie Gemische von zwei oder mehreren der angegebenen Verbindungen.

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Die meisten dieser Flüssigkeiten und deren Gemische sind aaßerdem geeignet als proteinausfällende Mittel oder deren Bestandteile· Zur Ausfällung -von Protein kann ein Gemisch aus Aceton, Methanol, Äthanol und 2-Methoxyäthanol angewandt werden. Gute Ergebnisse werden erzielt unter Anwendung eines Gemisches der folgenden Zusammensetzung:

Aceton 20 Vol.-Teile

Methanol 10 " «

Äthanol 30 " "

Äthylenglykol-monoäthyläther 20 " "

Wenn die schwerlösliche oder unlösliche Substanz nur ein anorganisches SaIa umfaßt, können auch sehr gute Ergebnisse er ha It en.,"""wenn als mit Wasser mischbare organische Flüssigkeit eine solche angewandt wird, die nicht zu den üblichen proteinausfällenden organischen Lösungsmitteln gehört.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren besteht in der Zugabe einer Suspension fester Teilchen in einer organischen Flüssigkeit, die vorzugsweise nicht zur Ausfällung von Proteinen führt. Als Beispiel für diese bevorzugte Ausführungsform ist die Anwendung einer Suspension eines unlöslichen Zinksalzes in Athylenglykol zu erwähnen. Das Zinksalz kann das Reaktionsprodukt von Zinksulfat und Natriumbicarbonat sein.

Die Erfindung betrifft auch diagnostische Analyseneinheiten, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandt werden können. Derartige Analyseneinheiten enthalten neben gepufferten Enzym-Substrat-Getaischen Coenzyme, Stabilisatoren, Metallaktivatoren und SH-Schutzverbindungen

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soweit erforderlich ein Protein und/oder ein- zwei- oder mehrwertiges Metallsalz, das in Wasser löslich ist» und/oder ein Salz»dessen Anion einen schwerlöslichen oder unlöslichen organischen Niederschlag ergibt, oder ein Salz, das als solches unlöslich oder schwerlöslich ist, wie oben beschrieben, sowie ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel oder ein mit Wasser mischbares Lösungsmittelgemisch, wie oben beschrieben. Die Erfindung betrifft daher auch Analyseneinheiten für diagnostische Zwecke mit dem angegebenen Inhalt.

Wenn die Bestimmung in einem System stattfindet, in dem eine oder mehrere Enzymreaktionen eine bestimmende Rolle spielen, muß das wäßrige System eine bestimmte Zeit lang inkubiert werden. Die Dauer der Inkubation hängt u.a. ab von der gewählten Temperatur und ist im allgemeinen bei 25⁰C langer als bei 37⁰G. Die Inkubation wird durchgeführt, wie es für derartige Systeme üblich ist.

Die fluor/metrische Bestimmung kann auf sehr einfache Weise mit Hilfe eines Pluorimeters durchgeführt werden. Wenn einige Standardlösungen für Vergleichszwecke angewandt werden, kann sogar ein System mit einer einfachen UY-Lampe ausreichen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Dabei, sowie in der gesamten Beschreibung, werden die folgenden Abkürzungen angewandt:

MD Nicotinamid-adenin-dinucleotid

IADH reduziertes NAD

NADP Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat

NADPH reduziertes NADP

APAD Acetylpyridin-adenin-dinucleotid

APADH reduziertes APAD

AMP Adenosin-5'-monophosphat

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ADP	Adenosm-5' -diphosphat
ATP	Adenosin-5'-trlphosphat
PEP	Ph.osphor-enolp.yru.vat
GSH	Glutathion
G-6-PDH	Glucose-ö-phosphat-dehydrogenase
HK	Hexokinase
SDH	Sorbit-dehydrogenase
CK	Kreatinkinase
Beispiel 1

Die folgenden Reagentien wurden nacheinander in zwei Meß-Cuvetfcen pipettiert, die als A und B bezeichnet wurden:

0,25 ml 10 ""^m MDH in 0,05 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer, pH 7,5; 0,25 ml einer 4^-igen lösung von Rinderserum-albumin in dem gleichen Puffer. in die Cuvette A werden 3,75 ml physiologische Kochsalzlösung und in die Cuvette B 3,75 ml 2-Mathoxyathanol zugegeben.

Nach Homogenisieren des Inhalts der "beiden Cuvetten wurd= die Fluoreszenz ^{Ul1 e}Sptimalen Anregungs- und Emissionsbedingungen gemessen.

In. Cuvette B ist die gemessene Intensität der Fluoreszenz 50 mal so groß wie in Cuvette A, die weder ausgefallenes Protein noch 2-Methoxyäthanol enthält.

Beispiel 2

0,5 ml Anteile einer 10"^m-Lösung von NADPH In 0,1 ml Triäthanolamin-Puffer, pH 7,0, wurden in zwei Meß-Cuvetten die als A und B bezeichnet waren, pipettiert. 0,5 ml destilliertes Wasser wurde dann zu Cuvette A gegeben und 0,25 ml 0,5 m Zinksulfat-Lösung und anschließend 0,25 ml 0,5 m Fatriumbicarbonat-Lösung zu Cuvette B.

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Nach heftigem Schütteln der gelatineartigen Suspension in Cuvette B wurden zu "beiden Cuvetten 3,75 ml Äthylenglykol gegeben.

Die Intensität der Fluoreszenz in Cuvette B scheint 12 mal so groß zu sein wie diejenige in Cuvette A, die Äthylenglykol aber kein Zinksalz enthält.

Beispiel 3

0,5 ml 10 m APADH werden zu einem gelatinösen heterogenen System gegeben, das hergestellt worden ist durch Vermischen- von 0,25 ml 0,5 m Magnesiumchlorid-Lösung und 0,25 ml 0,5 m Natriumhydrogenphosphat-Lösung. Nach heftigem Schütteln werden 4»5 ml einer 10^-igen Lösung von Glycerin in Äthanol zugegeben. Die Intensität der Fluoreszenz wird um den Faktor 66 intensiviert, verglichen mit einem identischen System, das keinen Feststoff und organische Flüssigkeit enthält.

Beispiel 4

0,25 ml o,O5 m Triäthanolamin-Puffer (pH 7,6), in dem 0,4 mMol NADP und 40 mMol Magnesiumacetat gelöst sindj und 0,25 ml 14mMol Glukose-6-phosphat in 0,05 m Triäthanolamin-Puffer (pH 7>6) werden in einem Reagenzglas vermischt, das dann 5 Minuten in ein Wasserbad von 37 C gestellt wird. Anschließend werden 25 p.1 eines Hämolysats von menschlichen Erythrocyten in das Reagenzglas pipettiert und anschließend die Flüssigkeit 15 Minuten

bei 37⁰C inkubiert. Schließlich werden 3,75 ml einer 1%-igen Suspension von feinteiligen Calciumsulfaten in Äthylenglykol zugegeben. Die Fluoreszenzaktivität QAnregung = 345 nmjjEniission = 435 nm) ist 12 mal so groß wie diejenige eines identischen Systems, das kein Calciumsulfat enthält.und ungefähr 30 mal so großjwie die eines identischen

.Systems, das weder Calciumsulfat noch Äthylenglykol enthält·

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Das Verfahren kann daher als empfindlicher Nachweis zur Bestimmung von Glukose-6-phosphat-dehydrogenaseaktivität in E_rythrocyten angewandt werden.

Beispiel 5

0,5 ml einer Lösung von Magnesiumacetat (2mMol), ATP (0,2 raMol), NADP (0,2 mMol) Rinderserumalbumin (230 mg), HE von Hefe (25 Einheiten) und G-6-PDH (35 Einheiten) in 100 ml 0,25 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (pH 7»5) werden kurz auf 37⁰C erwärmt.

Anschließend werden 10 JiI Blutserum zugegeben und das G_emisch 10 Minuten bei 37⁰C inkubiert.

3,9 ml eines Gemisches von analytisch reinem Aceton, Äthanol und 2-Methoxyäthanol in einem Verhältnis (ToI.) von 20:30:50 werden dann zugegeben und das gesammte Gemisch geschüttelt. Die fluoreszenz wird unter den in Beispiel 4 angegebenen Bedingungen gemessen. Die Intensität der Fluoreszenz ist 54 mal. so groß wie diejenige eines identischen Gemisches, das anstelle des Gemisches der organischen Flüssigkeiten eine physiologische Salzlösung enthält.

Beispiel 6

200 jal einer Lösung von 0,1 mMol HADH in 0,1 m Triäthanolamin-Puffer ( pH 7>4) und 20 ul Serum werden in zwei Meßgeräten, die als A und B bezeichnet werden vermischt. Die Cuvetten werden anschließend 30 Minuten in ein Wasserbad von 25⁰C gegeben und anschließend je 200 ^l einer 100 mMol-Lösung von Fructose in dem oben angegebenen Puffer zugegeben (Zeit 0).

Nach genau 5 Minuten langer Inkubation bei 25⁰C werden zu Cuvette A 3,0 ml Dimethylformaid zugegeben und nach genau 10 Minuten Inkubation die gleiche Menge Dimethylformamid zu Cuvette B. 200^,Ul NADH-Lösung, 200 /Xl Eructose-Lösung, 3,0 ml Dimethylformamid und 20 μΐ Serum, wie oben angegeben, werden dann nacheinander in eine als C bezeichnete Cuvette gegeben und anschließend die

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Fluoreszenz in den drei Cuvetten unter optimalen Bedingungen gemessen. Die Sorbit-dehydrogenaseaktivität des Serums kann sehr empfindlich aus dem Unterscheid er Intensitäten der Fluoreszenz zwischen den Guvetten A und B, verglichen mit der Cuvette C, berechnet werden, während der Verbrauch an teueren Reagentien nur 5$ desjenigen betragt.der für übliche TJV-Untersuchungen und fluorimetrische Untersuchungen erforderlich ist.

Beispiel 7

Ein lyophiliciertes Enzym-Substrat-Gemisch, das pro G-Ias die folgenden Bestandteile enthält:

300 ug Kreatinphosphat

35 ug ADP
400 jig AtIP

35 ug MDP
250 ^g Glukose

1 mg Magnesiumacetat
200 jig Glutathion
200 ug Dithiothreitol

0,02 Einheiten Hexokinase

0,01 Einheiten Glukose-6-phosphat-dehydrogenase

wird in' 200 ul 0,05 Iris-(hydroxymethyl)-aminomethanpuffer pH 7>4 gelöst. Dann werden 10 ul Plasamzugegeben und das erhaltene Gemisch 15 Minuten bei 37⁰C inkubiert.

Anschließend wird ein Gemisch,bestehend aus gleichen Teilen Aceton, Methanol, Äthanol und 2-Methoxyäthanol, zugegeben. IJacn dem Schütteln wird die Intensität der Fluoreszenz bei einer Anregungs- Wellenlänge von 345 nra und einer emittierten Wellenlänge von 435 nm gemessen und mit derjenigen einer wäßrigen Lösung von

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Chininsulfat ( 1 ^ug/ml) -verglichen. Hit Hilfe dieses Verfahrens kann die Kreatinkinase-aktivität von Patientenblut schnell und einfach bestimmt werden, während die Bestimmung mit \°/o der Menge an Reagentien durchgeführt werden kann, die zur Bestimmung mit Hilfe üblicher UV- und Fluoreszenzverfahren erforderlich ist„

Bei einem anderen Versuch werden 200 ml der wie oben angegeben gepufferten Enzymlösung mit 1,5 ml eines Gemisches vermischt, enthaltend:

70 ml 0,5 m ZnSO,-Lösung 70 ml 0,5 m ITaHGO₅-Lösung Äthylenglykol auf 1000 ml

Die Intensität der Fluoreszenz wird bei einer Anregungs-Wellenlänge von 34-5 nm und einer emittierten Wellenlänge von 455 nm gemessen.

Beispiel 8

Ein lyophxliziertes Gemisch,enthaltend pro Glas 20 /ig llatriumpyruvat und 40 p.g ß-NADH Di-na tr ium salz wird in 300 ul 0,05 m Phosphat-Puffer pH 7,5 gelöst. Anschließend werden 10 μΐ Plasma zugegeben und das Gemisch bei 25°G inkubiert.

Schließlich werden 1,5 ml eines Gemisches, bestehend aus:

30 ml CaCl₂ 2 m-Lösung

30 ml ITa₂IIPO, 2 m-Lösung

Äthylenglykol auf 1000 ml

zugegeben und anschließend die Intensität der Fluoreszenz, wie oben beschrieben,gemessen. Hit Hilfe dieses Verfahrens kann die Milchsäure-dehydrogenase-aktivität (LDH:EC 1.1.1.27) sehr schnell und einfach gemessen werden.

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Beispiel 9

a) Herstellung von HOG—GöPDH-Konjugöt.

10 rag Huraan-choriongonadotrophin (HCG) und 20 rag Glukose-6-phosphat-dehydrogenase (G 6 PDIi) werden in 2 ml 0,1 m-Phosphat-puffer pH 7,2 enthaltend 0,25 °p (Gew./Vol.) Glutarald.ehyd gelöst. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend über vernetztes Dextrangel (Sephadex G-200) in 0,1 m Phosphat-puffer pH 7,2 fraktioniert. Die Fraktionen, die die Säule ohne Verzögerung verlassen _i werden gesammelt (12 ml). Diese Fraktionen enthalten sowohl HCG (immunologisch gemessen) als auch G 6 PDH (enzymatisch gemessen).

b) Bestimmung der erforderlichen Menge an HCG-G6PDH-Konjugat.

Es wird eine Verdünnungsreihe der,wie unter A "beschrieben, gesammelten Fraktionen in 0,05 m Triäthanolamin-puffer pH 7,6, enthaltend 0,1 $ (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin

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hergestellt. Die Verdünnungen betragen 1:10 bis 1:10 Nach 5 Minuten Vorinkubation bei 57⁰G werden 200 ,ul von jeder Verdünnung in ein Glas gegeben, enthaltend ein vorinkubiertes Gemisch von 0,25 ml einer Lösung von 0,4 mMol FADP und 40 mMol Mg-acetat in 0,05 m Triäthanolamin-puffer pH 7,6 und 0,25 ml einer lösung von 14mMol Glukose-6-phospha.t in 0,05 m Triäthanolamin-puffer pH 7,6.

Das Gemisch wird 15 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend 3,75 ml einer ^^B/>-igen Suspension von feinteiligen Calciumsulfat in Äthylenglykol zugegeben. Schließlich wird die Fluoreszenzaktivität gemessen W^nregung= 345 nm;^Emission^35 nm). Mit Hilfe dieses Verfahrens kann eine Enzymaktivit'ät in einer Verdünnung von 1:3x10 gemessen werden.

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; PATENTANSPRÜCHE

Claims

PATE IT TA Ή SP RÜCHE

1. Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung eines reduzierten Coenzyms oder eines Derivates davon in einem wäßrigen System auf fluorimetrisohe Weise, dadurch gekennz eichnet, daß man die Messung der Fluoreszenz "bei gleichzeitigem Vorliegen einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit oder eines mit Wasser mischbaren Gemisches organischer Flüssigkeiten, und einer Dispersion von einer oder mehreren schwer-löslichen, oder unlöslichen organischen und/oder anorganischen Substanzen, die in situ durch Ausfällung gebildet und/oder als solche zugegeben worden sind, durchführt.

2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 'daß man als schwer-lösliche oder unlösliche Substanzen in situ ausgefällte Proteine verwendet, die Enzymproteine und/oder andere Proteine sind und/oder in situ ausgefällte oder als solche zugesetzte anorganische Salze,

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Fällen,wo kein oder nur ein Enzymprotein vorhanden ist, weiteres Protein zusetzt.

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4. Verfahren nach. Ansprach 1 Ms 3, dadurch g e k e n η zeichnet, daß man das Protein mit Hilfe eines proteinausfällenden Mittels, das die mit Wasser mischbare organische Flüssigkeit oder das mit Wasser mischbare Gemisch organischer Flüssigkeiten ist oder enthält, ausfällt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als reduziertes 'Coenzym das Reaktionsprodukt einer Ezymreaktion anwendet, bei der eine Dehydrogenase,ein Substrat dafür und das Coenzym in oxidierter Form miteinander reagieren.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der enzymatischen Reaktion eine: oder mehrere, enzymatisch^ und/oder nichb-enzymatische Reaktionen vorausgehen, wobei die fluorlraetrisch bestimmte Menge des reduzierten Coenzyms ein Maß Ist für die Menge der zu bestimmenden Reaktionskomponente in einer der vorausgehenden Reaktionen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die erste Reaktion (Hauptreaktion) mit Kreatin, (phospho^ klnase, die zweite Reaktion (Hebenreaktion) mit 'einer Hexokinase und die dritte Reaktion (Indikatorreaktion) in der das reduzierte Coenzym entsteht mit G-lukose-6-phosphat-dehydrogenase durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Hauptreaktion mit Kreatin

(phosphor)kinase, die Kebenreaktion mit Pyruvatkinase und die Indikatorreaktion in der die Menge des reduzierten Coenzyms abnimmt, mit Milchsäure-dehydrogenase durchgeführt wird.

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9· Verfahren nach Anspruch. 1 "bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension eines unlöslichen Zinksalzes in Äthylenglykol verwendet.

10· Verfahren nach Anspruch 1 bis 9> dadurch gekennzeichnet, daß man als reduziertes Coenzym NADH, ITADPH oder ein Derivat davon "bestimmt.

11. Analyseneinheit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 "bis 9, _ die . neben gepufferten Enzym-Substrat-G-emischen_t Coenzyme, Stabilisatoren, Metallaktivatoren und SH-Schutz-Mittel, wenn erforderlich ein Protein, das nicht das Enzymprotein'ist, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein proteinausfällendes Mittel und/oder ein Mittel, das einen anorganischen Niederschlag bildet oder eine schwer-lösliche oder unlösliche Substanz als solche sowie eine mit Wasser mischbare organische Flüssig» keit oder ein mit Wasser mischbares Gemisch organischer Flüssigkeiten enthält, wobei die organische Flüssigkeit oder das Gemisch der organischen Flüssigkeiten gleichzeitig das proteinausfällende Mittel sein kann.

12. Analyseneinheit nach Anspruch 10, dadurch g e kennz ei chne t, daß sie ein proteinausfällendes Mittel, das die mit Wasser mischbare organische Flüssigkeit oder das mit Wasser mischbare Gemisch organischer Flüssigkeiten ist oder enthält und/oder in Wasser lösliche Salze,von denen das Metallion des einen Salzes mit dem Anion des zweiten Salzes einen in Wasser unlöslichen oder nur schwer-löslichen Niederschlag bildet oder eine unlösliche oder schwer-lösliche anorganische Verbindung enthält.

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