DE1673281C3 - Verfahren zur Bestimmung von Leucinaminopeptidase - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Leucinaminopeptidase

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DE1673281C3 DE19671673281 DE1673281A DE1673281C3 DE 1673281 C3 DE1673281 C3 DE 1673281C3 DE 19671673281 DE19671673281 DE 19671673281 DE 1673281 A DE1673281 A DE 1673281A DE 1673281 C3 DE1673281 C3 DE 1673281C3
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leucine
lap
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leucine aminopeptidase
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Wolfgang Dr. Dipl.-Chem. Farr
Reinhard Prof.Dr.Med. Haschen
Dieter Dipl.Chem. X 4400 Bitterfeld Reichelt
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AWD Pharma GmbH and Co KG
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Arzneimittelwerk Dresden GmbH
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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Description

25
Die Erfindung belrilft ein Verfahren zur quanlitaiiv.'ii kolorimetrischen Bestimmung \on Leucin-Jiminopeptidase. " 3u
Verfahren zur quantitati\en Bestimmung der cnz.ymaiischen Aktivität der Leucinaminopeptidase (LAP). \or allem im Blutplasma und Blutserum, sind liekanni. Eür diese bekannten Verfahren wird als spezifisches Substrat Leucinamid verwendet. Es wurden mehrere Nachweisv erfahren verwendet. Das von der LAP aus dem Leucinamid freigesetzte Leucin kann quantitativ durch Bestimmung der Carboxylgruppen bzw. der basischen Gruppen auf litrimetrischem Wege bestimmt werden. +0
Mittels aufsteigender Papierchromatographie wird lias durch die Enzvmeinwirkung freigesetzte Leucin vο 111 Leucinamid getrennt, das Leucin mit Ninliydriii y.u einem Farbstoff umgesetzt, der nach der Stabilisterling mit Cu -Ionen kolorimetriert wird.
Weiterhin kann das durch das Enzym aus dem Leucinamid freigesetzte Ammoniak durch Borsäure chemisch gebunden und anschließend durch Säure titriert werden.
Der durch das Enzym bewirkte Zuwachs an 5" AminostiekstolT kann mittels der Ninhydrinmethode gemessen werden. Außerdem sind noch mehrere Verfahren zur Bestimmung der LAP mit ehromogenen Substraten bekannt. Das aus Leucin-p-nitroanilid durch LAP freigesetzte p-Nitroanilin kann auf Grund einer gelben Farbe direkt photometriert werden. Das aus Leucin-p'-naphthylamid durch LAP freigesetzte /i-Naphthylamin kann mit einem Diazoniumsalz umgesetzt und der entstehende Farbstoli kolorimetrisch bestimmt werden. Diese bekannten Verfahren weisen mehrere Nachteile auf. Neben einer umständlichen Arbeitsweise, einem hohen Zeitaiifwand und ungenügender Empfindlichkeit, beispielsweise bei den Nachweisverfahren mit Leucinamid, sind diese Verfahren für den Routinebetrieb auch ungeeignet.
Außerdem zeigen die Nachweisverfahren mit chromogenen Substraten eine ungenügende Spezifität.
da p-Nitroanilide und ,,'-Naphthylamide vorwiegend oder ausschließlich durch Aminosaiire-Aryl-amidase hydrolysiert werden.
" Zweck der Erfindung ist es. eine Bestimnum^- methode für LAP zu entwickeln, die besonders ah empfindliche Nachweisnielhode zur klinischen Diagnostik von Leberparenohymscliaden im Routinebetrieb geeignet ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Substrat zu linden, das für die LAP spezifisch lsi und dessen Spaltprodukte einlach und schnell bei »rolkr Empfindlichkeit der Nachweisreaktion zu Ivstimmen sind. Hs wurde gefunden, daß die LAP in der Lage ist, L-Leuciniiydrazid zu '..-Leucin und Hydrazin hydrolytisch zu spähen m gleicher Smrke. gleicher Spezilität und unter gleichen Bedingungen wie das bekannte, als spezifische Substrat liir LAI' verwendete L-Leucinamid.
Die gestellte Aufgabe wird somit erlindungsgema!', dadurch gelöst, daß zur quantiUiti\en kolonmein sehen Bestimmung \on Leucinaminopeptidase al-Substrat DL-Leucmliydra/id oder L-Leucinhydra/nl verwendet wird, das durch l.eucinaminopeptida-c abgespaltene Hydra/in mit p-Dimethylaminobenzaldehyd zu einem F-'arbstolf kondensiert wird und dieser kolorimetrisch bestimmt wird.
Die Hydrolyse des DL-Leucinhydrazids oder L-Leucinhydrazids durch die LAP wird je nach Inkubationsbedingungen bei einem pH-Wert zwischen 9.0 und 10.2 durchgeführt. Gleichzeitig mit dei Kupplung des durch die LAP aus dem Leucin-Iivdrazid freigesetzten Hydrazins mit p-Dimethvl· aminobenzaldehyd wird die Lösung auf einen pll-Wert unter 7 eingestellt, so daß sich aus dem durch Kondensation gebildeten gelben Farbstolf ein orangerotes Earbsalz bildet. [Dieses Farbsalz hat einen hohen molaren Absorptionskoelfizienten. so daß die Empfindlichkeit des Nachweises von LAP gegenüber den bekannten Verfahren erheblich gesteigert ist.
Durch das Ansäuern der Lösung wird die enzymatische Reaktion gleichzeitig unterbrochen.
Die Extinktion des der LAP mengenmäßig proportionalen Farbsalzes wird dann anschließend beim Absorptionsmaximum von 455 nm gemessen.
Durch das ermidungsgeniäfk Nachweisverfahren M man in der Lage, die LAP im Blutserum oder Blutplasma schnell und quantitativ zu bestimmen. Außerdem hat die erlindungsgemäße Nachweisreaktion gegenüber den bekannten Nachweisverfahren den Vorteil, daß sie äußerst spezifisch ist und eine hohe Empfindlichkeit aufweist.
Die Erfindung soll nachstehend an zwei Ausführungsbeispiclen näher erläutert werden.
.
Arbeitsweise
L Methode ohne zusätzliche Aktivierung
0,5 ml Substrat-PufTer-Lösung (aus 4 Teilen 0,2 M Monoäthanolamin-PulTer von pH K). 15 und I Teil ll2mM wässeriger Leucinhydrazid-Lösung) werden auf 2.'ic C temperiert und mit 0.2 ml Serum oder Enzymlösung eine bestimmte Zeit (für Serum 60 Min.) inkubiert. 5 ml Farbreagens, bestehend aus I Teil einer Lösung von 4 g p-Dimethylaminobenzaldchyd in 100 ml 96" oigem Äthanol oder Methanol und 17 Teilen 0,1 N Salzsäure, werden zugegeben, und nach 30 Min. Farbentwicklisng werden die Ansätze bei 455 nm gegen das Farbreagens gemessen.
Ein Leerwerl wird analog behandelt, nur erfolgt die Zugabe der verwendeten Enzymlosung erst nach der Zugabe des Reagens.
. Methode mit MgJ -Aktivierung
0.3 ml PufFer-Aktivator-Lüsung (aus 5 Teilen 0,25 M Monoätlianolamin-I'iilfer von pH ιλ25 und 1 Teil 40 mM MgC'l.-Lösung) werden mit 0.1 ml Serum oder Enzymlösung 2 Stunden bei 25 C prüinkubiert. Danach werden 0.1 ml SO m.M wässeriger Leueinhydrazid-Lüsimg zugegeben und 30 Min. hei 25 C inkuhieii. Nach Zugabe von 4.5 ml Farbreagens erfolgen die Farhentuicklung und Messung, v-ie unter I. besehrieben. Hin Leerwert wird analog behandelt, nur erfolgt die Zugabe der Hnzymlüsiing erst
nur erfg g
nach der Zugabe des Farbreagens.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen Besiimmuii!· von Leucinaminopeptidase. üadurch gckcnn/ciclinct, da« als Substrat DL- h/.w". L-I.eucinhydrazid verwendet wird, das durch Leucinaminopeplidase abgespaltene Hydrazin mit p-Dimcthylaminobenzaidehyd zu einem Farbstoll kondensiert wird und dieser koiorinieirisch bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch I. dadurch nckennzeichnet. daß die Hydrolyse des DL- bzw. L-Leucinhvdrazids durch' Leucinaminopeptidase spezilisch bei einem pH-Wert von ιλ0 bis 10.2 durchgeführt wird.
.v Verfahren nach Anspruch 1 und 2. dadurch üekennzcielinel. dal.! der I arhsloll im pH-Bereich unter 7 kolorimetrisch bestimmt wird.
20
DE19671673281 1967-08-28 1967-08-28 Verfahren zur Bestimmung von Leucinaminopeptidase Expired DE1673281C3 (de)

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DE1673281A1 (de) 1971-07-22
DE1673281B2 (de) 1973-05-24

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E77 Valid patent as to the heymanns-index 1977
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