DE2121248C3 - Antibiotikum Axenomycin D mit der Summenformel C78 H125 O3 S Na, und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

CH₃

Spektrum in Methanol, das Maxima bei 250,255 und 330 my und eine Schulter bei 265 bis 268 ΐπμ aufweist. Ei*. 138 (255 Γημ) und einem Infrarotspektrum in KBr mit Banden bei 3440, 2980, 2950, 2890, 1735, 1705, 1675, 1630, 1610, 1465, 1385, 1355, 1290, 1265, 1195,1170, 1115, 1080,1050,1005.995,975,945, 925, 895, 865, 810, 700 cm"¹, das als Teilstrukturen ein makrocyclische? Lacton der Formel

F=O

OH OH OH OH

OH OH OH OH OH O CH₃

H₃CCO
' \

L- OH

O OH OH OH

OH

OH

zwei Zuckerreste und einen 2-Methyl-1,4-naphthochinonchromophor aufweist.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Axenomycin D, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lisandri n. sp. NCIB 10 985 in einem üblichen Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 23 bis 37°C während eines Zeitraums von 60 bis 160 Stunden bei einem pH-Wert von 6 bis 9 in an sich bekannter Weise kultiviert, wobei der Gehalt des Kulturmediums bezüglich der Kohlenstoffquelle höher als 10%, der Gehalt an Phosphaten jedoch möglichst niedrig ist, die Rührbedingungen einer Leistungsaufnahme von 2 bis 4 Watt/Liter, und einer Luftzufuhr von 0,7 bis 2,0 Liter pro Liter Medium pro Minute entsprechen und anschließend das gebildete Axenomycin D aus dem abfiltrierten Mycel durch Lösungsmittelextraktion mit einem Alkohol zusammen mit den Axenomycinen A und B gewinnt und durch übliche Chromatographie abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung des Axenomycins D an einer Kieselsäuresäule vornimmt, mit Äthylacetat-Methanol-Wasser (125:25:17) eluieit, die unterschiedlichen Fraktionen durch Dünnschichtchromatographie analysiert und die axenomycinhahigen Fraktionen sammelt, im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und den erhaltenen Rückstand aus Methunol-Isopropanol umkristallisiert.

Die Erfindung bezieht sich auf den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. In der DE-OS 19 29 107 werden der antibiotische Komplex Axenomycin A und Axenomycin B und seine Herstellung durch Züchten von Streptomyces lisandri n. sp. 1. M. I. 137 178 und I. M. R. U. 3935 beschrieben. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß durch submerse und aerobe Kultivierung von Streptomyces lisandri 1. M. I. 178 = 1. M. R. U. 3935 = NCIB 10 985 (die Kultur wird vom Commonwealth Mycological Institut, Ferry Lane, Kew, Surry, unter der Bezeichnung I. M. 1.137 178 bzw. von der National Collection of Industrial Bacteria unter der Bezeichnung NCIB 10 985 auf Verlangen an Dritte nach Maßgabe der Rechtsvorschriften über den Umgang mit Mikroorganismen abgegeben, vgl. Bl. f. PMZ 1975, Seite 171) unter den erfindungsgemäßen Bedingungen ein neues Antibiotikum, Axenomycin D. das eine hohe therapeutische Aktivität aufweist, erhalten wird.

Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Glukose, Dextrin und Melasse verwendet werden. Als Stickstoffquelle können Getreideweiche, Sojamehl, Erdnußmehl, Fleischextrakt, Pepton, Kasein und Kaseinhydrolysate verwendet werden.

Verwendbare Mineralsalze sind Calciumcarbonat, Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Kupfer-, Zink-, Mangan- und Kobaltchlorid. Phosphate sind dagegen nicht geeignet; es wurde vielmehr gefunden, daß mit Zunahme ihrer Konzentration im Nährboden die Ausbeute an antibiotischer Substanz sich vermindert.

Die Fermentation kann im Erlenmeyerkolben oder Laboratoriums- oder Industriefermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden.

Axenomycin D ist in Alkoholen löslich und in Wasser und Benzol unlöslich. Die Verbindung besitzt einen Drehwert von [a] i = +11 (c = 0,5 in Methanol) und besitzt im übrigen die in Anspruch I angegebenen Parameter. Wie spätere Untersuchungen zeigen konnten, enthalten die Axenomycine einen makrocyclischen Lactonring, zwei Zuckerrestc und ein 1,4-Napthochinonchromophor. Dies kann z. B. durch Chromsäureoxydation von Axenomycin B bzw. Methanolyse mittels O₁OSn-HCI bei Raumtemperatur und Vergleich der erhaltenen Bruchstücke mit authentischem Material nachgewiesen werden. Die Struktur des Axenolids, dem Aglykon von Axenomycin B ergibt sich aus dem Abbau durch alkalische Hydrolyse und Behandlung mit Natriumperjodat und Natriumborhydrid sowie aus den spektrographischen Daten CPMR und Massenspektrum.

Das Antibiotikum Axenomycin D der Erfindung weist eine hohe wurmhemmende Aktivität sowie eine Aktivität gegen Protozoen und Pilze auf.

Die wurmhemmende Aktivität des Axenomycin D wurde an Mäusen geprüft, die experimentell mit Hymenolepis nana infiziert waren. Die Versuche

wurden an Gruppen von jeweils 10 Mäusen durchgeführt. Axenomycin D wurde auf oralem Wege zwischen dem zwölften und zwanzigsten Tag der Infektion verabreicht In Tabelle 1 sind die Werte der geheilten Tiere angegeben.

Tabelle 1

Zusammensetzung

Dosis
mg/kg

Verbesserung

Axenomycin D
Axenomycin D

2,5
5,0

65,0
100,0

Bei den aus der DE-OS 19 29107 bekannten Axenomycinen A und B liegt die 100%-Dosis bei 10 mg/kg.

Die akute Toxizität des Axenomycin D, ausgedruckt als DLm, bei Mäusen beträgt bei oraier Verabreichung 200 mg/kg und entspricht damit der DL₅₀ von Axenomycin A, während Axenomycin B eine DL,₀ von 300 mg/kg bei oraler Verabreichung besitzt.

Darüber hinaus wurde die erfindungsgemäße Verbindung Axenomycin D mit den aus der DE-OS 19 29 107 bekannten Verbindungen Axenomycin A und B hinsichtlich ihrer antiprotozoischen, antibakteriellen und antifungalen Aktivitäten sowie ihrer wurmhemmenden Aktivität verglichen. Die Versuchsergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen Il und III zusammengefaßt.

Tabelle II

Antiprotozoische, antibnkterielle und antifungale In-vitro-Aktivität von Axenomycin A, Bund D

	MIC, [ig/ml	Axenomycin B	Axenomycin D
	Axenomycin A	3	1,5
Entamocba histolytica	1,5	0,1	0,1
Trichomonas foetus	0,1	>100	>100
Staphylococcus aurcus	>100	>100	>100
Bacillus subtilis	>100	>100	25
Mycobacterium smegmatis	50	>100	> 100
Escherichia coli	>100	>100	>100
Salmonella abortivoequina	>100	0,78	1,56
Candida ulbicans	6,25	0,04	0,08
Saccharomyces calsbergcnsis	0,30	25	10
Trichophyton mcntagrophytcs	>IOO	10	2,5
Epidcrmophyton floccosum	25	10	2.5
Sabouraudites gypscum	25	2,5	2,5
Bothritis cincrca	10

Tabelle III

Wurmhemmendc In-vilro-Aktivität von Axenomycin A, B und D

MlC oder M.Im.C, ^g/ml

Axenomycin Λ Axenomycin B Axenomycin D

Rhabditis macroccrca
Syphacia obvelata
Hymcnolcpis nana
Schistosoma mansoni

Axenomycin D wurde ferner mit dem als gut wirksam bekannten Arzneimittel N,N-Dibutyl-4-hexyloxynaphthylamidin (Bunamidin, von der WHO vorgeschlagener Freiname), die in Progress in Drug Research 17 (1973), Seite 110 beschrieben ist, hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegenüber Hymenolcpis nana verglichen.

Schweizer pathogenfreie Cobs-Mäuse wurden experimentell mit Eiern von Hymcnolepis nana, die aus nächtigen l'roglotlidcn gewonnen worden waren, infiziert. Es wurden 100 Eier pro Maus per os verabreicht.

Nach 12 Tagen wurden die Tiere mit den untersuchten Verbindungen per os behandelt. Nach 24 Stunden

15,6	n.d.	3,9	3,9
>1000	>1000	>1000
3,1	1,55	1,55
5	2,5

wurden die Mäuse getötet, und die Eingeweide wurden untersucht, um die Anwesenheil von Hymcnolcpis nana zu bestimmen.

Hierbei wurden die nachfolgend aufgeführten Ergcbnisse erhalten:

Substanz	mg/ kg	LDs0	Therapeu
			tischer
	mg/kg	Index

Axenomycin D
Bunamidin

2,15
62

93,2
540

43,3
8,7

Die Untersuchungen zeigen deutlich, daß Axenomycin D dem bekannten Produkt überlegen ist.

Die Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

Ein 2000-ml-K.olben, der 500 ml Kulturmedium enthielt, wurde bei 120⁰C während 20 Minuten sterilisiert. Zum Animpfen wurde folgendes Kulturmedium verwendet:

Konzentration KH2PO4

Axenomycin D y.'ml

0,005
0,01
0,05

2060
2040
1485
1005

Dextrin

Calciumcarbonat

Getreideweiche

Kasein

Ammoniumsulfat

Dikaliumphosphat

Leitungswasser auf

4%
0,5%
1,0%
1,0%
0,2%
0,01%
100%

15

Der Kolben wurde mit einer Sporensuspensäon angeimpft, die durch Waschen der Patina von vier, 15 Tage alten, auf Glukose-Kartoffel-Agar entwickelten Schrägkulturen von Streptomyces lisandri NCIB 10 985 erhalten wurde.

Nach der Bebrütung bei 23° C während etwa 48 Stunden auf einem Drehschüttler mit 120 UpM wurden 50 ml dieser Kulturbrühe dazu verwendet, einen 5-1-Glasfermenter, der 3 Liter des Mediums derselben Zusammensetzung enthält, anzuimpfen. Die Kulturbrühe wurde mittels zwei Turbinenrührern mit gekrümm- jo ten Schaufeln gerührt und mit einer Luftzufuhr von 0,7 Liter je Liter Medium pro Minute bei einer Temperatur von 27 bis 28° C belüftet. Mit einem Teil der unter den obigen Bedingungen erhaltenen Kulturbrühe, entsprechend 5 Volumenprozent des produktiven Mediums, 3ϊ wurden 5-1-Glasfermenter, welche 3 Liter Kulturmedium enthalten, angeimpft.

Das produktive Medium wies folgende Zusammensetzung auf:

Beispiel 3

Das Verfahren wurde in 5-1-Fermentern unter denselben Bedingungen, wie sie in Beispiel 1 angegeben sind, mit 12% Glukose und bei 500 und 650 UpM sowie einer Luftzufuhr von 1 I und 1,7 I pro Liter Nährboden pro Minute durchgeführt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Rühren
UpM

500
500
650
650

Ein rostfreier 80-1-Stahlfermenter, der 50 I Medium zur Herstellung des Inoculums enthält, das dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 1 hat, wurde mit 500 ml einer Kultur, die in einem 2000-ml-Kolben unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen erhalten wurde, angeinipft. Nach 24 Stunden langer Bebrütung im Fermenter unter Belüften und Rühren erhielt man ein Mycelwachstum, das ausreichte, einen rostfreien 500-ml-Stahlfermenter anzuimpfen. Dieser Fermenter enthielt 300 ml Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung:

Luftzufuhr	Axenomycin D
Liter/Liter/Minute	7/ml
1,0	2410
1,7	3050
1,0	3630
1,7	4100
Beispiel 4

Glukose	10 und 12%	MVl	Glukose	13%
Sojamehl	3,0%		Sojamehl	3,0%
Getreideweiche	2,0%		Getreideweiche	2,5%
Caiciumcarbonat	1,O"/o		Calciumcarbonat	1,2%
Natriumchlorid	0,25%		Natriumchlorid	0,25%
Sojaöl	0,5%	45	Sojaöl	0.6%
Leitungswasser auf	100%		Leitungswasser auf	100%

Die Kulturbrühe wurde mit 500 UpM in einem Fermenter gerührt, der mit zwei Turbineurührern mit je 6 gekrümmten Schaufeln versehen war, und mit einer Luftzufuhr von 1 I pro Minute pro Liter Nährboden belüftet.

Nach 136 Stunden Gärung wurden folgende Ausbeuten erhalten:

Glukosekonzentration

Axenomycin D
y/ml

10 12

1350
2050

Beispiel 2

Man wiederholte eine Fermentation in 5-l-Fermentern unter denselben Kultur- und mechanischen Bedingungen, wie sie in Beispiel 1 angegeben sind.

Das Medium der produktiven Phase, das 12% Glukose enthält, wurde mit kleinen Mengen KH₂PO₄ versetzt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Nach 136 Stunden langer Bebrütung bei 28°C mit einer Luftzufuhr von 0,7 1 pro Liter pro Minute und Rühren bei 250 UpM in einem Fermenter, der mit zwei Turbinenrührern mit je acht flachen Schaufeln versehen war (Absorptionskraft = 2,5 W/Liter), mit einem Gegendruck von 1 atm erhielt man eine Fermentationsausbeute von 3050 y/ml.

Das durch Filtration von 14 Liter Kulturbrühe gewonnene Mycel wurde unter heftigem Rühren zweimal mit je 4 1 Butanol extrahiert Die vereinten Extrakte wurden auf ungefähr 300 ml konzentriert. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren

bo gewonnen, mit Äthyläther gewaschen und unter Vakuum getrocknet Das so erhaltene rohe Produkt wurde in Methanol gelöst, durch Filtrieren von dem wenigen unlöslichen Produkt abgetrennt und das Filtrat durch eine Kieselsäuresäule Chromatographien und mit Äthylacetat-Methanol-Wasser(125 :25 :17)eluiert.

Während der Eluierung wurden Proben der verschiedenen Fraktionen durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Die ersten Fraktionen (ungefähr 2 Liter

Eluat) wurden entfernt. Die folgenden Fraktionen enthielten Axenomycin D₁ welches durch Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum gewonnen wurde.

Durch Kristallisation aus Mcthanol-Isopropanol wurden 7 g Produkt erhallen, das aus reinem Axenomycin D besteht.

Aus der s""rn Fraktion wurden 1.34 g Axenomycin A uiiu 1.24 g Axenomycin B erhalten.

Beispiel 5

Man geht, wie im Beispiel 4 angegeben, vor mit dem einzigen Unterschied, daß der Prozentsatz der Glukose

von !3°/» auf 8⁰A reduziert wurde. AIJe übrigen Bedingungen blieben gleich.

Die Aufarbeitung des gewonnenen Mycel erfolgte wie im Beispiel 4 angegeben, und die prozentuale Zusammensetzung der so erhaltenen Fraktionen A, B und D ist in der nachfolgenden Tabelle angegeben im Vergleich zu derjenigen, die im Beispiel 4 beschrieben ist.

A %

B%

D%

Ciukosc	13%	(Beispiel	4)	14	13	73
Glukose	8%	(Beispiel	5)	40	60	Spuren

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Antibiotikum Axenomycin D mit der Summenformel C7sHi25O33SNa, einem Molekulargewicht von 1646,83, einem Schmelzpunkt von 174 bis 175° C, einem Rf-Wert von 035 auf Kieselgel (Äthylacetat-Isopropanol-Wasser 100 : 35 :5), einem Ultraviolett-