DE2121248A1 - Neue antibiotische Substanz und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Neue antibiotische Substanz und Verfahren zu deren Herstellung

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DE2121248A1 DE19712121248 DE2121248A DE2121248A1 DE 2121248 A1 DE2121248 A1 DE 2121248A1 DE 19712121248 DE19712121248 DE 19712121248 DE 2121248 A DE2121248 A DE 2121248A DE 2121248 A1 DE2121248 A1 DE 2121248A1
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Description

iiüficnen, 29. üToril 1971 11/11485
PATENTANWÄLTE
PR0F.DR.DR.J.REIT5TÖTTER DR.-ING. W. BÜMTE DR. K. G. LÖSCH
D-8 MÜNCHEN 13, BAUERSTR. 22 Neue antibiotische» Substanz und Verfahren zu deren Herstellung·
109847/1678
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue antibiotische Substanz und auf das Verfahren zu deren Herstellung. In der Stammanmeldung Nr.P li&9l.07/69werden der antibiotische Komplex Axenomycin A und Axenomycin B und seine Herstellung durch Züchten von Streptomyces lisandri beschrieben und beansprucht. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß durch submerse und aerobe Kulturen von Streptomyces lisandri unter verschiedenen und neuen Bedingungen ein neues Antibiotikum, genannt Axenomycin D, das eine hohe therapeutische Aktivität aufweist, erhalten wird. Insbesondere wurde gefunden, daß der Mikroorganismus Streptomyces lisandri I.M.R.U. 3935,/in der Stammanmeldung, unter besonderen,im nachstehenden beschriebenen Bedingungen eine neue antibiotische P Substanz herstellen kann.
Das erfindungsgemäße mikrobiologische Verfahren besteht in der Fermentation des Mikroorganismus Streptomyces lisandri in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält. Um Axenomycin D in hohen Ausbeuten zu erhalten, ist es notwendig, daß der Kohlenstoffgehalt im produktiven Medium gleich oder höher als 10 % ist, und außerdem die Rühr- und Luftzufuhrbedingungen derart sind, daß in jedem Zeitpunkt eine genügende Menge Sauerstoff in der Kultur gewährleistet ist. Insbesondere entsprechen die "optimalen" Rührbedingungen einer Absorptionskraft von 2 bis 4 W/Liter und einer Luftzufuhr von 0,7 bis 2 1 pro Liter Medium pro Minute. Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Glukose, Dextrin und Melasse verwendet werden. Als Stickstoffquelle können Getreideweiche, Sojamehl, Erdnußmehl, Fleischextrakt, Pepton, Kasein und Kaseinhydrolysate verwendet werden.
Verwendbare Mineralsalze sind Kaliumcarbonat, Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Eisen-, Kupfer-, Zink-, Mangan- und Kobaltchlorid. Die Phosphate werden nicht für geeignet gehalten; es wurde in der Tat gefunden, daß eine Zunahme ihrer Konzentration im produktiven Nährboden die Ausbeute an antibiotischer Substanz vermindert.
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Die Fermentation wird bei einer Temperatur von 23 bis 370C während eines Zeitraumes von 60 bis 160 Stunden bei einem pH-Wert von 6 bis 9 durchgeführt.
Die Fermentation kann in Erienmeyerkolben oder Laboratoriums- oder Industriefermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden.
Wenn die Fermentation vorbei ist, wird Axenomycin D aus einem von der Kulturbrühe durch Extraktion mit geeigneten Lösungsmitteln abgetrennten Mycel isoliert und in an sich bekannter Weise durch Chromatographie gereinigt.
Axenomycin D ist in Alkoholen löslich und in Wasser und Benzol unlöslich. Die Verbindung schmilzt bei 174 bis 1750C mit Zersetzung; [<*Jq = + 11 (c = 0,5 in Methanol); Rf 0,35 auf Silikagel (Äthylacetat-Isopropanol-Wasser 100 : 35'.5).
Die U.V.-Spektren, gemessen in Nethanoi, ergeben Absorptionsmaxima bei den folgenden Wellenlängen: 250, 255 und 330 m.u und eine Schulter bei 265 bis 268 m.u.
E \ % cm 138 (255 iiyi).
Im I.R.- Spektrum, gemessen in KBr, bemerkt man Banden bei 3440, 2980, 2950, 2890, 1735, 1705, 1675, 1630, 1610, 1465, 1385, 1355, 1290, 1265, 1195, 1170, 1115, 1080, 1050, 1005, 995, 975, 945, 925, 895, 865, 810 und 700 cm"1.
Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C 60,25 %, H 7,92 %, 0 30,35 %.
Das Antibiotikum Axenomycin D der vorliegenden Erfindung weist eine hohe wurmhemmende Aktivität sowie eine/gegen Protozoen und Pilze auf.
Die wurmhemmende Aktivität des Axenomycin D wurde an Mäusen geprüft, die experimentell mit Hymenolepis nana infiziert waren. Die Versuche wurden an Gruppen vor/jeweils 1Ό Mäusen durchgeführt. Axenomycin D wurde auf oralem Wege zwischen dem zwölften und zwanzigsten Tag der Infektion verabreicht. In Tabelle I sind die Werte der geheilten Tiere angegeben.
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Tabelle I
Zusammensetzung Dosis
mg/kg 		Verbesserung
%
Axenomycin D
Axenomycin D 		2,5
5,0 		65,0
100,0
Die akute Toxizität des Axenomycin D, 'ausgedrückt als DL50, bei Mäusen beträgt bei oraler Verabreichung 200 mg/kg.
Die Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern» P ohne daß diese jedoch hierauf beschränkt sein soll.
Beispiel 1: Ein 2000 ml-Kolben, der 500 ml Kulturmedium
enthielt, wurde bei 12O0C während 20 Minuten sterilisiert. Zum
Animpfen wurde folgendes Kulturmedium verwendet:
Dextrin 4 %
Kaliumcarbonat 0,5 %
Getreidewache 1,0 %
Kasein 1,0 %
Ammoniumsulfat 0,2 % Di kaiiumphosphat 0,01 % Leitungswasser auf 100
Der Kolben wurde mit einer Sporensuspension angeimpft, die durch ψ Waschen der Patina von vier, 15 Tage, alten, auf Glukose-Kartoffel-Agar entwickelten Schrägkulturen erhalten wurde.
Nach der Bebrütung bei 280C während etwa 48 Stunden auf einem Drehschüttler-mit 120 U.p.M. wurden 50 ml dieser Kulturbrühe dazu verwendet, einen 5 1-Glasfermenter, der 3 Liter des Mediums derselben Zusammensetzung enthält, anzuimpfen. Die Kulturbrühe wurde mittels zwei Turbinenrührern mit gekrümmten Schaufeln gerührt und mit einer Luftzufuhr von 0,7 Liter je Liter Medium pro Minute bei einer Temperatur von 27 bis 280C belüftet. Mit einem Teil der unter den obigen Bedingungen erhaltenen Kulturbrühe, entsprechend 5 Vol.% des produktiven Mediums, wurden 5 1-Glasfermenter, welche 3 Liter Kulturmedium enthalten, ange-
imPft· 109847/1678
Das produktive Medium wies folgende Zusammensetzung auf:
Glukose - 10 und 12 %
Sojamehl 3,0 %
Getreideweiche 2,0 %'
Kaliumcarbonat 1,0 %
Natriumchlorid 0,25 %
Sojaöl 0,5 %
Leitungswasser auf 100
Die Kulturbrühe wurde mit 500 U.p.M. in einem Fermenter gerührt, der mit zwei Turbinenrührern mit je 6 'gekrümmten Schaufeln versehen war, und mit einer Luftzufuhr von 1 1 pro Minute pro Liter Nährboden belüftet.
Nach 136 Stunden Gärung wurden folgende Ausbeuten erhalten:
Glukosekonzentration Axenomycin D % γ/ml
10 . 1350 12 2050
Beispiel 2: Man wiederholte eine Fermentation in 5 1-Fermentern unter denselben Kultur- und mechanischen Bedingungen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind.
Das Medium der produktiven Phase» das 12 % Glukose enthält, wurde mit kleinen Mengen KHpPO. versetzt. Folgende Ergebnisse wurden
erhalten: Axenomycin D
Konzentration ΚΗ«ΡΟ, γ/ml
% 2060
0 2040 -
0,005 1485
0,01 1005
0,05
Beispiel 3: Das Verfahren wurde in 5 1-Fermentern unter denselben Bedingungen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, mit 12 % Glukose und bei 500 und 650 U.p.M. sowie einer Luftzufuhr von 1 1 und 1,7 !pro Liter Nährboden pro Minute durchgeführt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
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Rühren Luftzufuhr Axenomycin D
U.p.M. Liter/Liter/Min. γ/ml
500 1,0 2410
500 1.7 3050
650 1.0 3630
650 1.7 4100
Beispiel 4: Ein rostfreier 80 1-Stahlfermenter, der 50 1 Medium zur Herstellung des Inoculums enthält, das dieselbe Zusammensetzung wie in Beispiel 1 hat, wurde mit 500 ml einer Kultur, die in einem 2000 ml-Kolben unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen erhalten wurde, angeimpft. Nach 24 Stunden langer Bebrütung im Fermenter unter Belüften und Rühren erhielt man ein Mycelwachstum, das ausreichte, einen rostfreien 500 ml-Stahlfermenter anzuimpfen. Dieser Fermenter enthielt 300 Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung:
13 %
3,0 %
2 5 t
1,2 %
0,25 %
0,6
100
Glukose Sojamehl Getreideweiche Kalziumcarbonat Natriumchlorid Sojaöl' Leitungswasser auf
W Nach 136 Stunden langer Bebrütung bei 280C mit einer Luftzufuhr von 0,7 1 pro Liter pro Minute und Rühren bei 250 U.p.M. in einem Fermenter, der mit zwei Turbinenrührern mit je acht flachen Schaufeln versehen war (Absorptfonskraft = 2,5 W/Liter), mit einem Gegendruck von 1 atm erhielt man eine Fermentationsausbeute von 3050 γ/ml.
Das durch Filtration von 14 Liter Kulturbrühe gewonnene Mycel wurde unter heftigem Rühren zweimal mit je 4 1 Butanol extrahiert. Die vereinten Extrakte wurden auf ungefähr 300 ml konzentriert. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen, mit Äthyläther gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das so erhaltene rohe Produkt wurde in Methanol gelöst, du^sh Filtrieren von dem wenigen unlöslichen Produkt abgetrennt und des Filtrat
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durch eine Kieselsäuresäule chromatographiert und mit Äthylacetat-Methanol-Wasser (125:25:17) eluiert.
Während der Eluierung wurden Proben der verschiedenen Fraktionen durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Die ersten Fraktionen (ungefähr 2 Liter Eluat) wurden entfernt. Die folgenden Fraktionen enthielten Axenomycin D, welches durch Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum gewonnen wurde.
Durch Kristallisation aus Methanol-Isopropanol■wurden 7 g Produkt erhalten.
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Claims (4)

- 8 -Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Axenomycin D, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces'lisandri I.M.R.U. 3935 in einem Nährmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, kultiviert wird, indem die Kultur bei einer Temperatur von 23 bis 370C während eines Zeitraumes von 60 bis 160 Stunden bei einem pH-Wert von 6 bis 9 stark gerührt und belüftet wird, und dann Axenomycin 0 aus der Kulturbrühe durch Lösungsmittelextraktion und Chromatographie isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle in einer Menge von 10 % oder mehr eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rührbedingungen einer Absorptionskraft von 2 bis 4 W/Liter und einer Luftzufuhr von 0,7 bis 2 1 pro Liter Medium pro Minute entsprechen.
4. Anti biotische Substanz Axenomycin O.
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DE2121248A 1970-05-04 1971-04-29 Antibiotikum Axenomycin D mit der Summenformel C78 H125 O3 S Na, und Verfahren zu dessen Herstellung Expired DE2121248C3 (de)

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DE2121248B2 DE2121248B2 (de) 1978-06-22
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CH (1) CH518360A (de)
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DK (1) DK127559B (de)
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YU (1) YU35163B (de)
ZA (1) ZA712820B (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL153271B (nl) * 1968-06-11 1977-05-16 Farmaceutici Italia Werkwijze voor het bereiden van antibiotica met behulp van een streptomycesorganisme, alsmede geneesmiddelen met daarin deze antibiotica.

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IT1044819B (it) 1980-04-21
NL7105286A (de) 1971-11-08
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ZA712820B (en) 1972-01-26
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