DE1792403B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und die für ihr Wachstum erforderlichen Aminosäuren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Verhältnissen.

Es ist bekannt, zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin verschiedene Mikroorganismen-Mutanten zu verwenden, die Homoserin, Threonin + Methionin, Threonin + Cystathionin oder Threonin + Homocystein Tür ihr Wachstum benötigen (USA^Patentschrift 2 979 439). In der deutschen Auslegeschrift 1 177 104 werden zur Herstellung von L-Lysin die Mikroorganismen Micrococcus glutamicus ATCC 13 286 oder Micrococcus glutamicus ATCC 13 287 gezüchtet, in der französischen Patentschrift 1 486 235 wird die beste Ausbeute an L-Lysin durch Züchten von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19 350 erzielt.

Nachteilig bei den bisherigen Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin ist, daß die Verwendung der genannten Mikroorganismen-Mutanten zu unbefriedigenden L-Lysinausbeuten führt, insbesondere hinsichtlich der im Ausgangsmaterial verwendeten Zuckermenge. Außerdem sind diese Verfahren in ihrer Durchführung relativ kostspielig, da verhältnismäßig große Mengen an Aminosäuren oder Nährsubstanzen, die Aminosäuren enthalten, zum Züchtungsmedium gegeben werden müssen.

Aufgabe der Erfindung war die Entwicklung eines Verfahrens zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin, mit welchem merklich höhere Ausbeuten zu erreichen sind und die Nachteile und Mangel der bekannten Verfahren überwunden werden.

Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und die für ihr Wachstum erforderlichen Aminosäuren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Verhältnissen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253,—ATCC 21 254,—ATCC 21 255, — ATCC 21 299 oder — ATCC 21 300 einsetzt.

Nach Prüfung zahlreicher Mikroorganismen auf ihre Einsatzmöglichkeit zur Produktion von L-Lysin wurde gefunden, daß Corynebacterium glutamicum ATCC 13 287 und — ATCC 14 296 außerordentlich gut zur Produktion von L-Lysin mittels Fermentation geeignet ist (USA.-Patentschrift 2 979 439). Diese Stämme, welche die Ausgangsstämme für die beim erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Mikroorganismen darstellen, sind Mutanten mit Nährstoflbedürftigkeitseigenschaften für Homoserin, Threonin + Methionin, Threonin + Cystathionin oder Threonin + Homocystein für ihr Wachstum. Durch Bestrahlung dieser Ausgangsstämme mit UV-Strahlen ergab sich erfindungsgemäß, daß spezielle mutante Stämme erhalten werden, die sowohl die für die Ausgangsstämme beschriebenen Nährstofibedürfnisse als auch weiterhin ejae Nährstoffbedürftigkeit für Leucin, Histidin oder Isoleucin + Valin aufweisen. Diese neuen Mutanten besitzen nun überraschenderweise eine größere Fähigkeit zur Produzierung von L-Lysin als die ursprünglichen Stämme. Speziell werden die Ausbeute, bezogen auf die Ausgangsmenge an Zucker, und die L-Lysin-Konzentration in der erhaltenen Kulturflüssigkeit durch Verwendung der neuartigen Mutanten bis zu etwa 10 bis 25% erhöht.

Die neuartigen, erfindungsgemäß einzusetzenden Mutanten sind:

Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 254, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 255, Corynebacterium g'utamicum ATCC 21 299, Corynebacterium glutamicum ATCC 21 300.

Wenn man in einem Vergleichsversuch (s. Beispiel 6) die erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismenstämme von Corynebacterium glutamicum einerseits und die Mikroorganismenstämme der deutschen Auslegeschrift 1177104 (Micrococcus glutaminus ATCC 13286 und -13287) bzw. Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19 350 der französischen Patentschrift 1 486 235 unter gleichen Bedingungen züchtet, erbringen die erfindungsgemäß verwendeten Stämme wesentlich höhere Ausbeuten an L-Lysin.

In Tabelle 1 sind die Nährstofibedürfnisse der Ausgangsstämme und der neuartigen erfindungsgemäß angewendeten Stämme zusammengefaßt.

Tabelle 1 Mikroorganismus

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 13 287 (Ausgangsstamm)

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 21 253

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 21 254

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 21 255

Nährstofibedürfnisse

(Homoserin) oder

(Threonin

+ Methionin) oder

(Threonin

+ Cystathionin) oder

(Threonin

+ Homocystein)

Nährstoffbedürfnisse des Ausgangsstammes + Leucin

Nährstofibedürfnisse des Ausgangsstammes + Histidin

Nährstoflbedürfnisse des Ausgangsstammes + Isoleucin + Valin

Fortsetzung

Mikroorganismus

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 14 296 (Ausgangsstamm)

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 21 299

Corynebacterium
glutamicum

ATCC 21 300

Nährstoffbedürfnisse

Threonin

Nährstoffbedurfnisse
des Ausgangsstammes + Histidin

Nährstoffbedürfnisse
des Ausgangsstammes + Leucin

Diese Mutanten sind neuartige, bisher unbekannte L-Lysin produzierende Mikroorganismen. Bei der Durchführung einer L-Lysin-Fermentation unter Verwendung der erfindungsgemäß einzusetzenden Mutanten sind die Zusammensetzung des Grundmediums und die Züchtungsbedingungen praktisch dieselben, wie sie üblicherweise angewendet werden und z. B. in der USA.-Patentschrift 2 979 439 beschrieben sind. So ist entweder ein natürliches oder ein synthetisches Nährmedium geeignet, solange es die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus notwendigen Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind in der Technik bekannt und umfassen Substanzen, wie eine . Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische . Verbindungen u. dgl. in angemessenen Mengen, die von dem verwendeten Mikroorganismus ausgenutzt werden. So kommen als Kohlenstoffquellen beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen usw. oder jede andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie Glycerin, Sorbit, ferner organische Säuren, wie Essigsäure usw., in Frage. Diese Substanzen können entweder einzeln oder in Gemischen zweier oder mehrerer verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Stickstoffverbindungen verwendet wer-S den, wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniuainitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt usw. Auch diese Stoffe können einzeln oder in Gemischen' zweier oder mehrerer verwendet werden. Anorganische Verbindungen, die zu dem Züchtungsmedium hinzugegeben werden können, sind

is z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Mangansulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Calciumcarbonat, Natriumchlorid usw. Wenn jedoch Rohmaterialien, wie z. B. Abfallmelassen, verwendet werden, die größere Mengen anorganischer Stoffe enthalten, kann die Züchtung ohne Zugabe zusätzlicher anorganischer Substanzen zu dem Medium durchgeführt werden.
Darüber hinaus ist es für die biotechnische Herstellung von L-Lysin gemäß der Erfindung natürlich notwendig, die entsprechenden, für das Wachstum der Mikroorganismen benötigten Aminosäuren als Nährsubstanzen zu dem Züchtungsmedium hinzuzufügen. Man kann die Aminosäuren als solche oder als Gemische verschiedener Arten von Aminosäuren, die aus natürlichen Substanzen gewonnen werden, verwenden. Vorzugsweise werden jedoch im allgemeinen verschiedene Proteinhydrolysate, mikrobielle Hydrolysate, Sojabohnenkuchenhydrolysate, Weizenglutenkuchenhydrolysate u. dgl. verwendet.

Wie man aus Tabelle 2 ersehen kann, sind die benötigten Mengen erheblich geringer als diejenigen, die bei Verwendung der Ausgangsstämme notwendig sind. Dies ist ein überraschendes und unerwartetes Resultat und ein hervorstechendes Merkmal der Erfindung:

Tabelle 2

Nährsubstanz	Zugegebene Menge	ATCC 13287 (Ausgangsstamm)	Produzierte Menge an L-Lysin (mg/ml)	ATCC 21254	ATCC 21253
	(g/dl)	37,4	ATCC 21255	50,9	48,6
Getrocknetes Weizengluten-	2,0	40,3	48,6	49,5	52,1
kuchenhydrolysat	3,0	44,1	52,1	47,9	49,9
	4,0	43,4	49,9	47,5	48,7
	5,0	38,5	48,7	49,2	50,4
Proteinhydrolysat	1,5	42,4	51,4	46,0	45,2
	2,0	48,1

Anmerkung I: Zusammensetzung des Grundmediums: Melasse (als Glucose) 18 g/dl und Ammoniumsulfat 4 g/dl.

Anmerkung 2: Züchtungsverfahren: 3 1 des Züchtungsmediums werden in einen 5-1-Jarfermenter eingebracht und sterilisiert. Die oben angegebenen Stämme werden eingeimpft und bei einem pH-Wert von 7,0, einer Temperatur von 3O⁰C, einer Belüftung mit 3 1/Mih. und einer Rührgeschwindigkeit von 400 Upm 70 Stunden lang gezüchtet.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, wie z. B. aeroben Schütteln der Kultur oder durch Rühren einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa 24 bis 37⁰C, vorzugsweise etwa 3O⁰C, und einem pH-Wert von etwa 5 bis 8,5, vorzugsweise etwa 7,0, durchgeführt. Nach 2- bis 5tägiger Züchtung werden unter diesen Bedingungen wesentliche Mengen an L-Lysin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit gefunden.

Nach Abschluß der Züchtung kann das L-Lysin aus der Fermentationsflüssigkeit mit den üblichen Methoden, wie z. B. durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung mit Metallsalzen, Chromatographie

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od. dgL, abgetrennt werden. Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß fast kein L-VaUn als Nebenprodukt entsteht, womit eines der Probleme ausgeschaltet wird, welche bei Verwendung der Ausgangsstämme zur Produzierung von L-Lysin auftreten. Dieser Vorteil zeigt sich besonders bei Verwendung von Corynebacterium glutamicum ATCC 21253 und Corynebacterium glutamicum ATCC 21255. Das Reinigungsverfahren wird auf diese Weise wesentlich vereinfacht _to

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Eine Impfkulturflüssigkeit wird hergestellt, indem man 200 ml eines Züchtungsmediums, enthaltend 5 g/dl Abfallmelassen (als Glucose), 0,05 g/dl Kaliumhydrogenphosphat, 0,05 g/dl Dikaliümhydrogenphosphat, 0,3 g/dl Harnstoff und 4 g/dl Sojabohnen-Proteinhydrolysat, in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gibt. Corynebacterium glutamicum ATCC 21 255 wird in den Kolben eingeimpft. Die Züchtung wird dann unter aeroben Schütteln 24 Stunden lang bei 30⁰C durchgeführt.

31 eines Züchtungsmediums, enthaltend 18 g/dl Abfallmelassen (als Glucose), 4 g/dl Ammoniumsuliat und 1,5 g/dl Sojabohnen-Proteinhydrolysat, werden in einen 5-1-Jarfermenter eingebracht und sterilisiert. Anschließend werden 500 ml lies obigen Inoculums in das Fermentationsmedium eingeimpft und die Züchtung begonnen. Während der Züchtung werden eine Belüftung mit etwa 3 l/min und eine Rührgeschwindigkeit von etwa 400 Upm sowie eine Temperatur von 30⁰C aufrechterhalten. Der pH-Wert wird mit Ammoniakwasser auf etwa 6,8 bis 7,0 eingestellt. Nach 70 Stunden der Züchtung beträgt die Konzentration an L-Lysin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit 48,7 mg/ml (als Hydrochlorid) und die Ausbeute, bezogen auf die Zuckermenge, 27,0%. Die Konzentration des als Nebenprodukt erzeugten L-Valin beträgt weniger als 0,3 mg/ml. Wenn man die Züchtung in derselben Weise, jedoch unter Verwendung des Ausgangsstammes Corynebacterium glutamicum ATCC13287 als Kontrollversuch durchführt, betragen die Konzentrationen an produziertem i.-Lysin bzw. L-Valin 37,2 bzw. 1,8 mg/ml.

Nach Abschluß der Züchtung wird die Kulturflüssigkeit filtriert und mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz nach üblichen Arbeitsweisen behandelt. Anschließend wird das Eluat auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und konzentriert, um die Kristallisation zu bewirken. Als Ergebnis werden 120 g rohe Kristalle von L-Lysinhydrochlorid erhalten.

55 Beispiel 2

31 eines Züchtungsmediums, enthaltend 16 g/dl Saccharose, 0,15 g/dl Kaliumhydrogenphosphat, 0,05 g/"dl Dikaliümhydrogenphosphat, 4 g/dl Ammoniumsulfat, 0,05 g/dl Magnesiumsulfat, 0,002 g/dl Mangansulfat, 0,002 g/dl Eisensulfat, 30 μg/l Biotin, 120 (ig/ml Methionin, 300 (ig/ml Threonin, 500 μg/ml Leucin und 100 |Ag/ml Cystin, werden in einen 5-1-Jarfermenter eingebracht und sterilisiert. 500 ml des Inoculums von Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253, das zuvor durch Züchtung in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 erhalten worden ist, werdet in das.Züchtungsmedium eingeimpft. Die Züchtung wird dann unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt

Nach 70stündiger Züchtung beträgt die Konzentration an L-Lysin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit 54,6 mg/ml (als Hydrochlorid). Die Ausbeute, bezogen auf die Zuckermenge, beträgt 34,2%. Die Menge an L-Valin, die als Nebenprodukt in dem Medium produziert worden ist, beträgt weniger als 0,5 mg/mL Wenn man die Züchtung bei einem Kontrollversuch in derselben Weise wie es oben beschrieben worden ist, jedoch mit der Abwandlung, daß der Ausgangsstamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13 287 als Mikroorganismus verwendet wird, und daß in dem Ausgangsfermentationsmedium kein Leucin enthalten ist, durchführt, beträgt die erhaltene Konzentration an L-Lysin 42,1 mg/ml. Die Menge des beim Kontrollversuch als Nebenprodukt erzeugten L-Valins beträgt 1,7 mg/ml.

Beispiel 3

Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß Corynebacterium glutamicum ATCC 21 254 als Impfstamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit erhalten, die 50,7 mg/ml L-Lysin (als Hydrochlorid) enthält Die Ausbeute beträgt 28,1%, bezogen auf die eingesetzte Zuckermenge.

Beispiel 4

Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß Corynebacterium glutamicum ATCC 21 299 als Impfstamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit erhalten, die 53,2 mg/ml L-Lysin (als Hydrochlorid) enthält.

Beispiel 5

Die Züchtung wird in derselben Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abwandlung, daß Corynebacterium glutamicum ATCC 21 300 als Impfstamm verwendet wird. Als Ergebnis wird eine Kulturflüssigkeit erhalten, die 51,6 mg/ml L-Lysin (als Hydrochlorid) enthält.

Beispiel 6

In diesem Beispiel werden zu Vergleichszwecken die Versuchsstämme Micrococcus giutamicus ATCC 13 286 und ATCC 13 287 der deutschen Auslegeschrift 1 177 104 sowie der Mikroorganismenstamm Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19 350 (französische Patentschrift 1 486 235) gezüchtet.

Die Züchtung erfolgte innerhalb 70 Stunden in der gleichen Weise wie im Beispiel 1. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Tabelle 3

Mikroorganismenstamm	L-Lysin-Ausbeute (mg/ml)
Micrococcus giutamicus ATCC 13 286 ATCC 13 287 3revibacterium ammoniagenes ATCC 19 350	37,0 37,2 27,0

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Fortsetzung

Mikroorganismenstamm	L-Lysin-Ausbeute (mg/ml)
Corynebacterium glutamicum ATCC 21 253 ATCC 21254 ATCC 21 255 ATCC 21 299	54,6 50,7 48,7 53,2

Fortsetzung

Mikroorganismenstamm	L-Lysin-Ausbeute (mg/ml)
5 ATCC 21 300	51,6

Aus den Ergebnissen wird ersichtlich, daß die L-Lysin-Ausbeuten mit den erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismenstämmen bedeutend höher sind als mit Mikroorganismenstämmen, deren Einsatz von der Technik bereits vorgeschlagen worden ist.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen, Mineralsalze und die für ihr Wachstum erforderlichen Aminosäuren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Verhältnissen, dadurch gekennzeichnet, _ϊ0 daß man als Mikroorganismen Corynebacterium glutamicum ATCC 21253, — ATCC 21254, -ATCC 21 255, -ATCC 21 299 oder — ATCC 21 300 einsetzt

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