DE19818485B4 - Reaktionsgefäße, beschichtet mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium, sowie Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Reaktionsgefäße, beschichtet mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium, sowie Verfahren zu deren Herstellung Download PDF

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Abstract

Reaktionsgefäß, dessen Oberfläche beschichtet ist mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Reaktionsgefäße, deren Oberfläche mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium beschichtet ist, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Testbestecke, enthaltend derartige Reaktionsgefäße.
  • Auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik besteht grundsätzlich das Bestreben, für die verschiedensten nachzuweisenden Substanzen kostengünstige, einfach zu handhabende, präzise und schnelle Nachweisverfahren und entsprechende Testbestecke zur Verfügung zu stellen. Ein wichtiges Feld stellt dabei im Rahmen der Diagnostik der Nachweis von Katecholaminen, wie z.B. Adrenalin, Noradrenalin oder Dopamin, in Proben von Körperflüssigkeiten dar. Ein erster wichtiger Schritt bei diesen Nachweisverfahren ist die Extraktion der Katecholamine aus der jeweiligen Probe. Herkömmlicherweise werden für diese Extraktion, die eine wesentliche Reinigung und gleichzeitig eine Aufkonzentrierung bewirkt, Substanzen als Affinitätsliganden verwendet, welche die cis-Diol-Strukturen der Katecholamine erkennen, z.B. immobilisierte Borsäure oder Borsäurederivate (siehe z.B. Speek et al., Clinica Chimica Acta 128 (1983), 103–113 oder Gelijkens und De Leenheer, Journal of Chromatography 183 (1980), 78–82) oder Aluminiumoxid (siehe z.B. Cooper et al., Journal of Neuroscience Methods 22 (1987), 31–39 oder Refshauge et al., Life Sciences 14 (1974), 311–322). Weitere Affinitätsliganden und entsprechende Analyte sind in DE 43 10 964 A1 (Seite 2, Tabelle 1) beispielhaft zusammengestellt. Gewöhnlicherweise wird zur Extraktion die entsprechende Probe mit einem Affinitätsmedium in Suspension gemischt, wobei sich das Medium auch in einer Chromatographiesäule oder einem anderen Gefäß befinden kann. In EP 0 288 425 B1 wird beispielsweise eine Säule beschrieben, die mit einem Immunglobulin G-spezifischen Affinitätsmedium gefüllt ist. In DE 44 20 732 A1 wird eine Vorrichtung zur Abtrennung von Nucleinsäuren beschrieben, wobei eine Immobilisierung von Nucleinsäuren an ein im Reaktionsraum enthaltenes Adsorbens, wie Silikat oder Glaspartikel, oder eine biospezifische Immobilisierung von Nucleinsäuren an biospezifischen Adsorbenzien, z.B. Affinitätsmaterialien genutzt werden kann. Die in DE 44 20 732 A1 zitierte Druckschrift EP 03 89 063 A2 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren, das ein in einem Reaktionsraum enthaltenes biospezifisches Affinitätsmedium beinhaltet. Das in DE 195 12 361 A1 beanspruchte Verfahren zur Aufreinigung von biologischem Material, stellt in einem Schritt das biologische Material als an eine komprimierbare poröse Matrix gebundene Form bereit. Hierbei werden säulenartig aufgebaute Schüttungen von körnigem Affinitätsmaterial beschrieben. DE 195 12 369 A1 offenbart eine säulenartig aufgebaute Vorrichtung zur Isolierung von Nucleinsäuren, die mit einem nucleinsäurebindenden Material gefüllt ist. Nach Waschen des Affinitätsmediums werden die daran gebundenen Substanzen wieder abgetrennt (siehe z.B. Mazzeo und Krull, Biochromatography 4 (1989), 124–130 und Hageman und Kuehn, Methods in Biology 11: Practical Protein Chromatography, Ed. Kennedy und Fowell, The Humana Press Inc. (1992), 45–71). Diese Vorgänge, die mehrere Zentrifugations-, Pipettierungs- bzw. Waschschritte umfassen, stellen eine erhebliche Fehlerquelle bei der präzisen Bestimmung der Konzentration der nachzuweisenden Substanz dar und sind darüber hinaus zeitintensiv.
    •
  • Der vorliegenden Anmeldung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Verfügung zu stellen, die die Extraktion von nachzuweisenden Substanzen aus Proben vereinfachen.
  • Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst. Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Reaktionsgefäß, dessen Oberfläche beschichtet ist mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium.
  • Derartige Reaktionsgefäße erlauben es nun, den Extraktionsschritt beim Nachweis von Substanzen mit cis-Diol-Struktur, wie z.B. Polyphenolen (z.B. Katecholaminen und Flavonoiden), 1,2-Hydroxysäuren, 1,2-Hydroxylaminen, Enzymen (z.B Serin-Proteinasen) und anderen Proteinen (z.B. Albumin), Nucleinsäuren (z.B. Nucleosiden, Nucleotiden und RNA's), Kohlenhydraten (z.B. Glucose) und anderen Verbindungen, die Kohlenhydrat-Strukturen enthalten, schneller und präziser durchzuführen. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße entfallen bei dem Extraktionsschritt alle Zentrifugationsschritte und die Pipettierungsschritte werden reduziert. Die Trennung der flüssigen von der festen Phase erfolgt in diesem Fall durch Dekantieren und Ausklopfen der Reaktionsgefäße auf einer saugfähigen Unterlage. Die US 5,565,622 A beschreibt ein Verfahren zur Extraktion von Komponenten aus einer flüssigen Probe, bei dem die innere Oberfläche einer Hohlnadel mit einer stationären Phase beschichtet wird, die kein Affinitätsmedium oder kein cis-Diol-spezifisches Affinitätsmedium ist.
  • Der Begriff "Reaktionsgefäß" umfaßt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jede Art von herkömmlicherweise in der Diagnostik verwendeten Gefäßen, die zur Aufnahme einer Probe, insbesondere in flüssiger Form geeignet sind. Hierzu zählen beispielsweise jede Art von Zentrifugenröhrchen, Makro- oder Mikrotiterplatten, Multischalen, Zell- oder Gewebekulturplatten oder -schalen, Röhrchen, Flaschen oder Wannen. Das Volumen dieser Gefäße spielt dabei keine Rolle. Es liegt vorzugsweise in einem Bereich von 5 μl bis 100 ml, besonders bevorzugt in einem Bereich von 500 μl bis 5 ml und insbesondere in einem Bereich von 1,5 ml bis 2,5 ml. Die Reaktionsgefäße sollten vorzugsweise aus Kunststoff sein. Bevorzugt bestehen sie ganz oder teilweise aus Polystyrol.
  • Der Ausdruck "dessen Oberfläche beschichtet ist" bedeutet, daß zumindest der Großteil derjenigen Oberfläche, die mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt kommt, mit dem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium beschichtet ist. "Beschichtet" bedeutet dabei, daß das Affinitätsmedium die Oberfläche des Reaktionsgefäßes überzieht und sich bei Kontakt mit der zu untersuchenden Probe nicht von dieser löst.
  • Unter dem Begriff "cis-Diol-spezifisches Affinitätsmedium" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Material verstanden, das aus einem Trägermaterial (Matrix) besteht, welches chemische Strukturen (Liganden) aufweist, die spezifisch Substanzen mit einer cis-Diol-Struktur binden können. Das Trägermaterial ist dabei vorzugsweise ein Material, wie es für die Herstellung von Chromatographie-Trennmedien verwendet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Matrix des cis-Diol-spezifischen Affinitätsmediums Polyacrylamid.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das cis-Diol-spezifische Affinitätsmedium ein Boronat-Affinitätsgel. Ein derartiges Gel ist kommerziell erhältlich, z.B. unter der Bezeichnung Affi-Gel 601 (Firma BIO-RAD, Katalognr. 153–6101 und 153–6102).
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes umfassend die folgenden Schritte:
    • (a) Inkontaktbringen des cis-Diol-spezifischen Affinitätsmediums mit der inneren Oberfläche des zu beschichtenden Reaktionsgefäßes;
    • (b) Erwärmen des Reaktionsgefäßes; und
    • (c) Abkühlen des Reaktionsgefäßes.
  • Das Inkontaktbringen mit dem Reaktionsgefäß gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorzugsweise derart, daß eine angemessene Menge des cis-Diol-spezifischen Affinitätsmediums in das Reaktionsgefäß gebracht wird und dort für einen längeren Zeitraum verbleibt. "Angemessene Menge" bedeutet dabei eine Menge, die geeignet ist, die Oberfläche des Reaktionsgefäßes zum gewünschten Ausmaß zu bedecken.
  • Das Inkontaktbringen nach Schritt (a) des Verfahrens kann sowohl derart erfolgen, daß das cis-Diol-spezifische Affini tätsmedium als solches direkt mit dem Reaktionsgefäß in Kontakt gebracht wird. Alternativ kann das Affinitätsmedium jedoch auch mit anderen Feststoffen, z.B. anderen Affinitätsmedien, Stabilisatoren, Füll- und Konservierungsstoffen, oder mit Gasen, z.B. Luft, Stickstoff oder Argon, gemischt werden und mit dem Reaktionsgefäß in Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise wird das cis-Diol-spezifische Affinitätsmedium vor dem Inkontaktbringen mit dem Reaktionsgefäß mit einer Flüssigkeit gemischt und das Gemisch aus Affinitätsmedium und Flüssigkeit wird in das Reaktionsgefäß eingebracht. Das Mischen erfolgt dabei vorzugsweise derart, daß das cis-Diol-spezifische Affinitätsmedium unter ständigem Rühren zu einer Flüssigkeit gegeben wird. Das entstandene Gemisch wird dann vorzugsweise für längere Zeit, insbesondere für ca. 30 Minuten, weiter gerührt, bis das Affinitätsmedium gut aufgeschlämmt ist und eine optisch homogene, fein verteilte Mischung des Affinitätsmediums in der Flüssigkeit vorliegt. Flüssigkeiten, die in diesem Zusammenhang verwendet werden können, sind beispielsweise wäßrige Lösungen (z.B. Puffer), organische Lösungsmittel (z.B. Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Ether), Säuren und Laugen. Bei der Flüssigkeit handelt es sich vorzugsweise um Reinstwasser.
  • Wird das Affinitätsmedium mit einer Flüssigkeit gemischt, so wird nach Schritt (a) ein Trocknungsschritt durchgeführt, der gewährleistet, daß in dem Gemisch vorhandene Flüssigkeit weitgehend, vorzugsweise bis zu einer Restfeuchte von weniger als 1 % und besonders bevorzugt vollständig, entfernt wird. Besonders bevorzugt wird das Trocknenlassen des in das Reaktionsgefäß eingebrachten Gemisches aus cis-Diol-spezifischem Affinitätsgel und einer Flüssigkeit derart durchgeführt, daß das mit dem Gemisch versehene Reaktionsgefäß über einen längeren Zeitraum, vorzugsweise für 5 Minuten bis 5 Stunden, bei einer Temperatur zwischen 4°C und 30°C aufbewahrt wird.
  • Die Höhe der Temperatur sowie die Dauer der Erwärmung gemäß Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens richtet sich gegebenenfalls nach dem Material des zu beschichtenden Reak tionsgefäßes sowie nach der Art der Matrix des Affinitätsmediums. Die Parameter können jedoch durch den Fachmann durch geeignete Versuche problemlos eingestellt werden.
  • Eine "Erwärmung" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Erwärmung auf eine Temperatur von mindestens 50°C, bevorzugt von mindestens 60°C, und besonders bevorzugt von mindestens 70°C. Ferner bedeutet eine Erwärmung vorzugsweise eine Erwärmung auf nicht mehr als 100°C, bevorzugt auf nicht mehr als 90°C. Eine Erwärmung im Bereich von 70°C bis 90°C ist besonders bevorzugt. Die Dauer der Erwärmung beträgt vorzugsweise mindestens 30 min, bevorzugt mindestens 60 min und besonders bevorzugt mindestens 120 min. Die Dauer übersteigt vorzugsweise nicht 360 min, bevorzugt nicht 300 min und besonders bevorzugt nicht 240 min. Ganz besonders bevorzugt erfolgt die Erwärmung für 1 bis 5 Stunden.
  • Das Abkühlen des beschichteten Reaktionsgefäßes gemäß Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorzugsweise durch Stehenlassen bei Raumtemperatur.
  • Im Zusammenhang mit dem Verfahren trifft für das Reaktionsgefäß und das cis-Diol-spezifische Affinitätsmedium dasselbe zu wie bereits weiter oben erläutert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zur Beschichtung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete cis-Diol-spezifische Affinitätsmedium ein Boronat-Affinitätsgel.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Matrix des cis-Diol-spezifischen Affinitätsmediums Polyacrylamid.
    •
  • Das folgende Beispiel dient der näheren Erläuterung der Erfindung.
  • Beispiel
  • Herstellung von mit Boronat-Affinitätsmedium beschichten Makrotiterplatten
  • Auf der Präzionswaage werden 28,8 g Affi-Gel 601 (Fa. Bio-Rad) ausgewogen. Das Gel wird unter Rühren zu 1200 ml Reinstwasser gegeben. Das Rühren mit Hilfe eines Magnetrührers wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die homogene Mischung wird für die Beschichtung von Makrotiterplatten (Fa. NUNC) weiterhin gerührt.
  • Zur Beschichtung dieser Platten wird eine Pipette (Fa. Eppendorf) verwendet. Pro Vertiefung der Makrotiterplatte werden 250 μl des Gel-/Wasser-Gemisches pipettiert. Der Combitip sollte vor und zwischen den Pipettiergängen immer wieder aufgezogen und ausgestoßen werden. Das Gel sollte sich nach dem Pipettieren gleichmäßig auf dem Boden jeder Vertiefung verteilen.
  • Die Makrotiterplatten mit dem eingebrachten Gel-/Wasser-Gemisch werden für 48 Stunden unter dem Abzug durch Abdampfen des Wassers bei Raumtemperatur getrocknet.
  • Die getrockneten Makrotiterplatten werden in einem Trockenschrank (VTR 5050, Fa. Heraeus Instruments) gestapelt und innerhalb von 2 Stunden auf eine Temperatur von 80°C erwärmt. Unter Aufrechterhaltung dieser Temperatur von 80°C wird das Erwärmen für weitere 2 Stunden fortgesetzt. Anschließend werden die Makrotiterplatten aus dem Wärmeschrank entnommen und durch Stehenlassen für 2 Stunden bei Raumtemperatur abgekühlt.

Claims (9)

  1. Reaktionsgefäß, dessen Oberfläche beschichtet ist mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium.
  2. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, wobei das cis-Diol-spezifische Affinitätsmedium ein Boronat-Affinitätsgel ist.
  3. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Matrix des Affinitätmediums Polyacrylamid ist.
  4. Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das eine Makro- oder Mikrotiterplatte, Multischale, Zell- oder Gewebekulturplatte oder -schale, Röhrchen, Flasche oder Wanne ist.
  5. Verfahren zur Herstellung eines Reaktionsgefäßes, dessen Oberfläche mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium beschichtet ist, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen des cis-Diol-spezifischen Affinitätsmediums mit der inneren Oberfläche des zu beschichtenden Reaktionsgefäßes; (b) Erwärmen des Reaktionsgefäßes auf eine Temperatur von mindestens 50°C für eine Dauer von mindestens 30 Minuten; und (c) Abkühlen des Reaktionsgefäßes auf Raumtemperatur.
  6. Verfahren nach Anspruch 5 weiterhin umfassend nach Schritt (a) einen Trocknungsschritt.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Reaktionsgefäß aus Polystyrol ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das cis-Diol-spezifische Affinitätsmedium ein Boronat-Affinitätsgel ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die Matrix des Affinitätsmediums Polyacrylamid ist.
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