DE3688527T2

DE3688527T2 - Verfahren und vorrichtung zur behandlung einer flüssigkeit.

Info

Publication number: DE3688527T2
Application number: DE86905815T
Authority: DE
Inventors: Ehrenfried L Mehl
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-09-26
Filing date: 1986-09-25
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2006-09-26
Also published as: DE3688527D1; WO1987001956A1; EP0239600B1; US4774058A; EP0239600A1; JPH063453U; JPS62501967A; CA1289894C

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Aufnahme einer Substanz und zur Änderung der Eigenschaften der Substanz, mit mindestens einem hohlen Trägerteil, das aus einem fluiddichten Material besteht und ein größeres Ende sowie ein kleineres Ende und ein durchlässiges Teil innerhalb des Trägerteils in dichter Verbindung zu diesem aufweist.
Diese Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Änderung der Eigenschaften einer Substanz unter Verwendung einer Vorrichtung, die mindestens ein hohles Trägerteil aus fluiddichtem Material mit einem kleineren Ende und einem größeren Ende sowie ein durchlässiges Teil aufweist, das innerhalb des Trägerteiles in dichter Verbindung zu diesem angeordnet ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt, Einbringen einer Lösung der Substanz in das offene Ende des Trägerteils und Durchlaufenlassen der Lösung durch die Scheibe zur Adsorption der Substanz an das durchlässige Material und Aufbringen eines Reagenz auf die Scheibe.
Fluide werden zu verschiedenen Zwecken in Filter eingebracht. Zum Beispiel, können Fluide in Filter eingebracht werden, um Absorption oder Adsorption der Fluidbestandteile an die Materialien in dem Filter zu erreichen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß Fluide in Filter eingebracht werden können, um chemisch mit anderen Reagenzien in den Filtern zu reagieren. Zudem können noch andere Fluide in die Filter eingebracht werden, um zu ionisieren und durch ionische Wechselwirkungen an andere ionisierte Materialien in den Filtern gebunden zu werden. Beziehungsweise, können Fluide in ein Filter eingebracht und mit Materialien, in oder auf dem Filter, auf andere als die oben genannten Affinitätsarten gekoppelt werden.
Es ist zu bedenken, daß das in dem vorhergehenden Abschnitt für diese Zwecke beschriebene Einbringen von Fluiden in Filter millionen-, und sogar milliardenmal in der Welt in jedem Jahr durchgeführt wird. Besonders in den letzten Jahren hat ein derartiges Einbringen von Fluiden in Filter zugenommen, aufgrund der beträchtlichen Ausweitungen der Aktivitäten auf dem Gebiet der Biotechnik. Trotz solcher umfassenden Verwendung und solcher zunehmenden Aktivitäten, gibt es einige ernsthafte Unzulänglichkeiten in den Verfahren und in den Vorrichtungen zur Handhabung der Fluide in den Filtern. Die Filter weisen, zum Beispiel, Toträume auf, die eine vollständigen Bearbeitung der Fluide in den Filtern behindern, und die das Säubern der Filter nach einer durchgeführten Bearbeitung, um nachfolgend andere Fluide für weitere Bearbeitungen aufnehmen zu können, verhindern. Die Filter haben auch den Nachteil, daß sie relativ groß sind und demgemäß große Fluidmengen benötigen, um eine definierte Bearbeitung an solchen Fluiden zu erreichen. Andere Nachteile sind, daß die Filter nicht wirkungsvoll in der Erleichterung der gewünschten Reaktionen an den Fluiden, die sie aufnehmen, sind. Die vorher diskutierten Nachteile existieren schon seit vielen Jahren, trotz der umfangreichen Anstrengungen sie zu beseitigen.
Eine Vorrichtung und ein Verfahren der oben erwähnten Art sind aus DE-A-32 14 287 bekannt. Die Veröffentlichung offenbart ein kleines Röhrchen zur Bearbeitung von Radioimmunoassays. Das Röhrchen weist eine kegelstumpfförmige Verengung und ein mikroporöses am oberen Teil der Verengung angebrachtes Filter auf. Das Filter ist vorzugsweise zwischen zwei Trägerplatten angeordnet. Nach der kegelstumpfförmigen Verengung ist ein Verbindungsstück angeordnet. Da das Filter nicht bündig mit der unteren Vorderkante des Röhrchen sitzt, ist die Fluidaufnahme durch Kapillarwirkung nicht möglich. Da das Filter nicht im konischen Teil des Röhrchen eingepreßt ist, sondern mehr im zylindrischen Teil des Röhrchen sitzt, ist es schwierig das Filter zum Röhrchen hin flüssigkeitsdicht abzudichten.
Weiterhin offenbart US-A-4 534 863 eine für die Verwendung in einer Zentrifuge angepaßte Zentrifugenfiltriervorrichtung zur Mikrofiltration geringer Fluidvolumen in der Probenvorbereitung zur chemischen Analyse von Flüssigkeiten und/oder fester Bestandteile der Proben. Das Gerät weist eine Filtereinheit mit einem Probenröhrchen, einem Filterträgerelement, das zum Auslaßende des Probenröhrchens ultraschallgeschweißt ist, und ein zwischen das Probenröhrchen und das Trägerelement eingespanntes Filter auf. Da das Filter zwischen das Probenröhrchen und das Trägerelement eingespannt ist, ist Flüssigkeitsaufnahme durch Kapillarwirkung zweifelsohne nicht möglich. Flüssigkeit kann in die Filterscheibe an der Stelle, an der sie eingespannt ist, eindringen und in diesen Räumen (Toträumen) verloren gehen und kann nicht mehr wiedergewonnen werden, selbst wenn mit hoher Umdrehungsgeschwindigkeit zentrifugiert wird.
Die beanspruchte Erfindung hat sich zum Ziel gesetzt diese Nachteile zu beseitigen. Sie löst die Aufgabe, eine Vorrichtung und ein Verfahren der oben beschriebenen Art zu entwickeln, welche eine präzise Bearbeitung geringer Fluidvolumen gestatten, und ermöglichen, die Fluide so vollständig wie nur möglich nach der Bearbeitung zurückzugewinnen.
Die Erfindung sieht ein Verfahren und eine Vorrichtung vor, die die in dem vorhergehenden Abschnitt diskutierten Nachteile minimiert oder beseitigt. Die Erfindung weist Filter auf, die keine Toträume ausbilden, so daß an dem gesamten in den Filter eingebrachten Fluid eine vollständige Bearbeitung durchgeführt werden kann. Die Filter sind zudem so gebaut, daß sichergestellt ist, daß das gesamte in das Filter eingebrachte Fluid exakt gehandhabt werden kann.
Die erfindungsgemäßen Filter sind relativ klein, so daß die in das Filter eingebrachte Fluidmenge minimiert ist. Das zu bearbeitende Fluidvolumen kann jedoch auf jede gewünschte Größe durch das Anordnen von einer Vielzahl von Filtern in eine Aufnahmeplatte erweitert werden. Die erfindungsgemäßen Filter besitzen einen weiteren Vorteil, da sie Einwegartikel sind. Das gestattet es, die Filter nur zu einem einzigen Bearbeitungsvorgang zu verwenden und dann wegzuwerfen. Der Einmalgebrauch der Filter wird dadurch gefördert, daß die Filter billig in der Herstellung sind.
Eine Ausführungsform der Erfindung weist ein Filter mit einem undurchlässigen an einem Ende offenen Trägerteil und einer durchlässigen Scheibe auf, die am entgegengesetzten kleineren Ende an dem Trägerteil sicher befestigt ist. Die Scheibe kann aus Fasern, vorzugsweise von einer Stärke von etwa 0.5-50 Mikrometern, gebildet werden, oder sie kann aus einer Vielzahl zwischen zwei von Membranen gehaltenen Partikeln oder Kügelchen (Beads) bestehen. Wegen der einfachen Herstellung hat dieses durchlässige Teil normalerweise Scheibenform und wird hier als Scheibe bezeichnet. Das Material, aus dem das durchlässige Teil hergestellt ist, steht im engen Kontakt mit dem undurchlässigen Trägerteil, und somit wird seine endgültige Form durch die Bauweise des undurchlässigen Teils bestimmt.
Wenn die Scheibe relativ klein ist, wie zum Beispiel, 1 Millimeter im Durchmesser, kann sie in das engere Ende des Trägerteils gepreßt werden. Wenn die Scheibe einen größeren Durchmesser hat, kann sie an das Trägerteil geschweißt werden.
Eine Vielzahl von Aufnahmegefäßen kann in einer Aufnahmeplatte angeordnet sein, um als Filter zu dienen oder die Filter aufzunehmen, derart, daß sie für den Fluiddurchfluß durch das Filter dienen. Das Fluid kann durch die Filter mittels Zentrifugation der die Trägerteile tragenden Aufnahmeplatten geschickt werden.
Die Aufnahmeplatten können in einem Behälter zentriert sein, damit der Kontakt mit den Behälterwänden verhindert wird. Fluiddampf kann durch den Behälter geschickt werden, um mit dem Material auf den zentrierten Filtern in Wechselwirkung zu treten. Ein mit diesem Fluid befeuchtetes Absorptionsblatt kann gegen die Behälterwände gestellt werden, um den Dampfgehalt innerhalb des Behälters auf das Maximum einzustellen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische perspektivische Ansicht eines Filters gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 2 ist eine vergrößerte schematische Teilaufrißansicht eines Querschnitts des in Fig. 1 gezeigten Filters und stellt im besonderen den Aufbau der Scheibe dar, wenn die Scheibe in das Filter eingesetzt ist;
Fig. 3 ist eine vergrößerte schematische Teilaufrißansicht eines Querschnitts eines Filters, ähnlich dem in Fig. 1 gezeigten Filter;
Fig. 4 ist eine schematische perspektivische Ansicht einer Aufnahmeplatte mit Aufnahmegefäßen, die als Filter dienen oder Filter aufnehmen und so gebaut sind, wie in den vorhergehenden Figuren dargestellt;
Fig. 5 ist eine perspektivische Teilansicht eines Querschnittes der in Fig. 4 gezeigten Aufnahmeplatte und der in die Aufnahmeplatte positionierten Filter;
Fig. 6 ist eine schematische perspektivische Explosionsdarstellung der Filter, die in den Aufnahmegefäßen in einer Aufnahmeplatte angeordnet sind, wobei die Aufnahmegefäße in der Aufnahmeplatte wiederum zusammenwirkend mit den Aufnahmeröhrchen in einem Halter angeordnet sind, so daß die Filter, die Aufnahmeplatte und der Halter beim Zentrifugieren verwendet werden können; und
Fig. 7 ist eine schematische perspektivische Darstellung der Vorrichtung, um flüssige Reaktionsteilnehmer und/oder Lösungen in Dampfform auf die Filter in der in Fig. 4, 5 und 6 gezeigten Aufnahmeplatte aufzubringen.
In der in den Fig. 1, 2 und 3 gezeigten Ausführungsform der Erfindung ist ein generell mit 10 bezeichnetes Filter vorgesehen. Das Filter umfaßt ein Trägerteil 12, das aus einem geeigneten Material, wie Polypropylen oder Glas, hergestellt ist. Das Trägerteil 12 kann auch aus anderen geeigneten Materialien hergestellt werden, wie Polyethylen, Tetrafluorethylen (von E.I. DuPont de Nemours in Wilmington, Delaware, als "Teflon" bezeichnet), kunststoffbeschichteten Verbundwerkstoffen mit einer Metall- oder Silikabasis und Perfluoralkoxy-Derivaten.
Das Trägerteil 12 hat ein offenes Ende 14 und ein dem offenen Ende gegenüberliegendes Ende 16. Vorzugsweise weist das Trägerteil die Form, beilspielsweise, eines Konus auf, wobei das Ende 14 größer als das Ende 16 ist. Das Trägerteil 12 kann käuflich erworben werden. Geeignete Trägerteile 12 können, zum Beispiel, von Eppendorf-Pipettenspitzen abgeschnitten werden, gekennzeichnet mit der Artikel-Nummer 5089- 801 von American Scientific Product.
Eine Filterscheibe 18 wird unter Druck in das Ende 16 des Trägerteils 12 eingesetzt. Die Scheibe 18 kann aus einem geeigneten durchlässigen Material mit gewebter oder nicht gewebter Ausprägung hergestellt sein. Vorzugsweise wird die Scheibe 18 aus geeigneten Fasern gebildet, wie Glas, Kohlenstoff, Quarz oder Kunststoffmaterialien, wie, beispielsweise, einem Acryl, Polypropylen oder einem Tetrafluorethylen, wie, zum Beispiel, das von E.I. DuPont de Nemours mit dem Handelsnamen "Teflon" bezeichnete. Die Scheibe 18 kann auch aus jeder Kombination der oben genannten Materialien hergestellt sein. Wenn die Scheibe 18 in das Ende 16 des Trägerteils 12 eingesetzt wird, wird sie durch das Trägerteil so fest gehalten, daß sie nicht verschoben werden kann, auch wenn das Filter 10 bei Geschwindigkeiten zentrifugiert wird, die höher als zehntausend Umdrehungen pro Minute (10.000 Upm) sind. Obgleich das durchlässige Teil 18 in der Beschreibung als eine Scheibe bezeichnet wurde, kann es im Grunde genommen gemeinhin als ein durchlässiger Stopfen betrachtet werden mit jeder gewünschten Gestalt, aber der eine exakte einheitliche Ebene für den Kontakt mit Blotting-Papier aufweist.
Das Filter 10 ist vorzugsweise klein. Die Öffnung 16 in dem Trägerteil 12 kann, zum Beispiel, einen Durchmesser von annähernd einem Millimeter (1 mm) und die Filterscheibe 18 einen Durchmesser in der Größenordnung von einem und zwei zehntel Millimeter (1,2 mm) haben. Die Dicke der Scheibe 18 kann in der Größenordnung von vier zehntel Millimeter (0,4 mm) liegen. Die Stärke der Fasern in der Scheibe kann in der Größenordnung von einem halben Mikrometer (0,5 um) bis zu fünfzig Mikrometer (50 um) liegen. Die Länge des Trägerteils 12 kann in der Größenordnung von sechs und einem halben Millimeter (6,5 mm) liegen.
Das oben beschriebene Filter 10 besitzt bestimmte wichtige Vorteile. Es ist so klein, daß es Fluid in das Trägerteil 12 über Kapillarwirkung aufnehmen kann. Das Filter 10 kann, zum Beispiel, umgekehrt werden und in ein Fluid enthaltendes Aufnahmegefäß (nicht gezeigt) getaucht werden. Dieses Fluid gelangt dann in das Trägerteil 12 und wird im Trägerteil zurückgehalten, auch wenn das Trägerteil von dem Aufnahmegefäß entfernt wird. Das Filter 10 kann dann in seine aufrecht stehende Lage (siehe Fig. 1) umgekehrt werden, während das Fluid in dem Trägerteil 12 zurückgehalten wird.
Fluid kann auch in das Trägerteil 12 gebracht werden, wenn das Trägerteil aufrecht steht. Dies läßt sich durch Eintauchen des verpfropften Endes 16 in das Fluid eines Aufnahmegefäß (nicht gezeigt) durchführen. Das Fluid strömt dann über die Scheibe 18 in das Trägerteil 12 mittels Kapillarwirkung. Das Fluid wird dann in dem Trägerteil 12 durch Kapillarwirkung zurückgehalten. Fluid kann auch in die Scheibe 18 übergeführt werden, indem die Spitze 16 mit einem Fluid enthaltenden dochtähnlichen Material in Berührung gebracht wird.
Abgesehen davon, daß das Filter das Strömen von Fluid und das Zurückhalten des Fluids in dem Trägerteil 12 durch Kapillarwirkung ermöglicht, hat das Filter 10 auch noch andere wichtige Vorteile. Es hält, zum Beispiel, die Scheibe 18 in fester Verbindung mit dem Trägerteil 12 zusammen nur aufgrund des Druckes zwischen der Scheibe und dem Trägerteil. In dieser festen Verbindung kann kein Fluid durch das Filter 10 am Grenzbereich zwischen dem Trägerteil 12 und der Scheibe 18 durchsickern. Diese feste und dichte nicht leckende Verbindung wird sogar aufrechterhalten, wenn das Filter bei Kräften, die etwa dem zehntausendfachen der Schwerkraft entsprechen (10.000 g), zentrifugiert wird.
Die Scheibe 18 kann entweder unmodifiziert oder modifiziert sein, zum Beispiel, mit Chemikalien. Modifikationen des Filters durch Chemikalien sind im Stand der Technik bekannt. Die Scheibe 18 kann, zum Beispiel, durch Trimethylsilanisierung derivatisiert sein, um die Sequenzierung der Aminosäuren eines Peptides zu ermöglichen. Die Derivatisierung von Filtern ist in einer Anzahl von sehr verschiedenen Anwendungen, die im Stand der Technik bekannt sind, vorgesehen.
Das Filter 10 hat auch noch weitere wichtige Vorzüge. Das Fluid in dem Trägerteil 12 kann, zum Beispiel, von dem Trägerteil durch gegen die Scheibe 18 angelegtes Blotting-Papier überführt werden. Mit den oben angegebenen Maßen hält die Scheibe 18 außerdem ein Fluidvolumen von nur etwa einem halben Mikroliter (0,5 ul) zurück. Dies führt zu einer sparsamen Verwendung von derivatisiertem Filtermaterial in der Scheibe 18 und hat eine nahezu quantitativen Entfernung des Fluids in dem Filter bei Zentrifugation zur Folge. Wegen der geringen Größe der Scheibe 18 werden Hintergrundeffekte in der Scheibe minimiert, um dadurch die Empfindlichkeit beim Nachweis von Substanzen in dem unteren Picomol- oder Femtomol-Bereich zu verbessern.
Die Scheibe 18 kann einzeln aus einem Streifen Filterpapier durch ein Schneidwerkzeug geschnitten und in dem Schneidwerkzeug während des Transfers in die Öffnung 16 in dem Trägerteil 12 gehalten werden. Das Schneidwerkzeug kann aus einer aus rostfreien Stahl bestehenden Kanüle mit einem Außendurchmesser von einem und vier zehntel Millimeter (1,4 mm), einem Innendurchmesser von einem und zwei zehntel Millimeter (1,2 mm) und einer Länge von fünfzig Millimeter (50 mm) hergestellt sein. Das Schneidwerkzeug kann eine rostfreie Stahlkanüle sein, die einen verschiebbaren rostfreien Stahlstab zum Herauspressen und Positionieren der Scheibe 18 enthält. Der Durchmesser des Stabes kann ein und einen zehntel Millimeter (1,1 mm) betragen.
Zur Endpositionierung der Scheibe 18 in die Öffnung 16 in das Trägerteil 12, kann das Trägerteil 12 gedreht und auf einer aus geeignetem Material, wie Glas, hergestellten Platte angeordnet werden. Die Scheibe 18 kann dann mit dem Stab aus rostfreiem Stahl solange zusammengedrückt werden, bis die Scheibe am Ende des Trägerteils 12 sitzt. Das Zusammendrücken der Scheibe 18 genügt, um sie in der Öffnung 16 an Ort und Stelle zu halten, ohne daß man irgendwelche Siebe, Abdichtungen oder Haltevorrichtungen benötigt, sogar bei Zentrifugalkräften von etwa dem zehntausendfachen der Schwerkraft (10 000 g).
Das Filter 20 ist dem Filter 10 ähnlich in Bezug auf Größe, Form, Materialien und dem Verfahren die Filterscheibe 22 zu schneiden. Eine zusätzliche Filterscheibe 26 mit einem größeren Durchmesser als die Scheibe 22 wird unter Verwendung des vorher beschiebenen Schneidwerkzeuges eingesetzt. Das Schneidwerkzeug kann einen Innendurchmesser von einem und einem halben Millimeter (1,5 mm) oder, zum Beispiel, zwei Millimeter (2 mm) haben. Zwischen den Membranen 22 und 26 ist ein Vielzahl 24 von Teilchen oder Kügelchen (Beads) übereinander geschichtet angeordnet und durch Druckpassung eingepreßt. Dadurch wird eine leckersichere Dichtung zwischen den durchlässigen Teilen und dem undurchlässigen Trägerteil 28 erhalten. Die Membranen können aus Streifen von Glasfaserpapier (Whatman, GF/C) oder anderen Materialien mit einem Faserdurchmesser im Bereich von zehn Nanometern (10 nm) bis fünfzig Mikrometern (50 um) hergestellt werden. Die Partikel oder Kügelchen können aus einer Vielfalt von verschiedenen Materialien, die Quarz, Glas, Silikagel, Platin, Polyester, Polyether und Polyamid umfassen, hergestellt sein. Die Oberfläche der Partikel kann unmodifiziert oder durch kovalent gebundene Substanzen, durch reaktive Gruppen und adsorbierte Substanzen modifiziert sein. Partikel der verschiedensten Größe im Größenbereich von zehn Nanometern (10 nm) bis 100 Mikrometern (100 um) können verwendet werden. Vorzugsweise können Beads mit einem Durchmesser von fünf Mikrometern (5 um) verwendet werden. Die Beads können derivatisiert sein, wie Ionenaustauscher, und diese sind käuflich erwerblich für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC).
Zur noch festeren Fixierung der Scheibe 26 in das Trägerteil 28 wird ein Positionierteil 280 in das offene Ende des Filters 20 gepreßt, bis es mit der Scheibe 26 in Berührung kommt. Das Positionierteil dichtet lecksicher an das Teil 28. Das Positionierteil hat eine konische Form und ein erstes und zweites offenes gegenüberliegendes Ende. Das erste Ende des Positionierteils 280 ist kleiner als das offene Ende des Filters 20. Das zweite Ende des Positionierteils ist größer als das offene Ende des Filters 20. Eine Umfangsnut 281 kann an der Außenfläche des Positionierteils als eine Sollbruchstelle vorgesehen sein, um das Filter 20 nach vollständiger Filtration zu erhalten. Das Positionierteil kann aus einem undurchlässigen, wie für das Trägerteil beschriebenen, Material hergestellt sein. Vorzugsweise können Polypropylen-Pipettenspitzen verwendet werden, wie sie von Gilson Company, Frankreich (Produktbeschreibung: Tipac C 20/TJ oder Tipac C 200/TB) erhältlich sind.
Das das Positionierteil 280 aufweisende Filter 20 hat wichtige Vorteile. Das Teil 280 kann zeitweise als Haltegriff zur Manipulation des kleinen Filters 20 dienen. Es stellt einen Platz dar, um die Probe mit einem Etikett zu versehen. Es kann auch als Verbindung zwischen dem Filter und einer Pipettiervorrichtung verwendet werden, wobei es den Fluidtransfer durch positiven oder negativen Gasdruck, sowohl durch Zentrifugation als auch durch Kapillarwirkung, ermöglicht. Das Filter 20 hat den Vorteil, daß das Fluidvolumen, wenn es durch Kapillarwirkung in die Poren der Scheibe aufgenommen worden ist, exakt durch Einstellen des Strömungswiderstandes der Scheibe kontrolliert werden kann. Wenn die Beadsteilchen, zum Beispiel, im Größenbereich von einem Durchmesser zwischen drei Mikrometern (3 um) und zehn Mikrometern (10 um) liegen, ist der Strömungswiderstand hoch genug, um eine quantitative Fluidaufnahme zu gewährleisten, ohne daß Luftblasen entstehen. Nur die Zwischenräume in der Scheibe sind mit Fluid gefüllt, wobei ein Überschuß an freiem Fluid in dem Filter vermieden wird. Die präzise Fluidzufuhr im Mikromaßstab, im Nanoliterbereich, nur in die Zwischenräume der Scheibe ist in den Fällen außerordentlich wichtig, in denen lösliche Biopolymere nacheinander mit Reagenzien oder Reagenzlösungen, in denen die Biopolymere löslich sind, behandelt werden. Die Methode der präzisen Dosierung und Förderung von Mikrovolumen durch Kapillarwirkung, in dem das Fluid alternierend von der äußeren oder der inneren freien Oberfläche der Scheibe aufgetragen wird, kombiniert mit einer Fluidverdampfung von der Filterinnenseite, ist besonders geeignet Auswaschvorgänge oder Verluste des Polymers aus dem Filter zu verhindern. Nach jeder nacheinanderfolgenden Behandlung ist das Polymer zudem noch in einer ziemlich gleichmäßigen Schicht angeordnet, was die Vollständigkeit der chemische Reaktionen und der Waschschritte verbessert. Das auf dem Prinzip des "alternierenden Kapillarflußes" beruhende Verfahren kann nützlich sein, wenn Polymere oder Biopolymere sequentiell abgebaut werden müssen, wie in der Sequenzierungstechnik, beispielsweise, beim Edman-Abbau von Proteinen und Peptiden. Nach diesem Prinzip des "alternierenden Kapillarflußes" kann manuelle und automatisierte Flüssigphasen-Mikrosequenzierung noch viel effizienter durchgeführt werden.
Die in Fig. 1 bis 3 gezeigten und oben beschriebenen Filter können in eine generell in den Fig. 4 und 5 mit 60 bezeichnete Aufnahmeplatte eingesetzt werden. Die Aufnahmeplatte 60 kann aus einem geeigneten Material, wie Glas, Polypropylen, Polyamid, Teflon, anderem Kunststoff, Metall, Keramik oder einem Verbund der vorhergenannten Materialien hergestellt sein. Das für die Aufnahmeplatte 60 ausgewählte bestimmte Material ist abhängig von der Anwendung und der Anforderung oder dem Wunsch nach chemischer Inertheit. Die Aufnahmeplatte 60 kann von einem flachen Teil 61 mit in die Aufnahmeplatte integrierten konischen Ausstülpungen 62 gebildet werden. Die Ausstülpungen 62 können Scheiben 68 aufweisen, um als Filter 10 und 20 zu wirken. Diese Filter werden generell mit 66 bezeichnet. Die Ausstülpungen sind an ihrem endgegengesetzten Ende offen, um den Fluidfluß durch die Scheiben zu ermöglichen. Anstelle des integrierten Baus der Filter in die Aufnahmeplatte 60, können die Filter auch getrennt ausbildet sein und können dann in Aufnahmen, die den Ausstülpungen in der Aufnahmeplatte entsprechen, eingesetzt werden.
Das Anordnen von Filtern 66 in solch eine Aufnahmeplatte, wie zum Beispiel, der Aufnahmeplatte 60 ist erwünscht, da es eine gleichzeitige und im wesentlichen gleichförmige Bearbeitung an einer Vielzahl von Filtern erleichtert. Um einen Zentrifugiervorgang an den Filtern in der Aufnahmeplatte 64 zu erleichtern, kann die Aufnahmeplatte 64 in eine Haltevorrichtung, generell in der Fig. 6 mit 70 bezeichnet, eingesetzt werden. Die Haltevorrichtung 70 weist eine Vielzahl von Röhrchen 72 zur Aufnahme der Filterenden 63 in der Aufnahmeplatte 64 auf. Die Röhrchen 72 in der Haltevorrichtung 70 können verlängert werden, um für einen gleichmäßigen geordneten Fluidfluß aus den Röhrchen zu sorgen, wenn die Aufnahmeplatte 64 und die Haltevorrichtung 70 zentrifugiert werden. Die Aufnahmeplatte 64 ist kompatibel mit den Haltevorrichtungen für eine Microfuge B (Mikrozentrifuge). Ein Zentrifugiervorgang an den Filtern in der Aufnahmeplatte 60 kann in gleicher Weise mit einem genau passenden Zentrifugenkopf durchgeführt werden. Ein Satz von sechsundneunzig (96) Filtern in einer Aufnahmeplatte kann, zum Beispiel, gleichzeitig bearbeitet werden, wobei die Filter innerhalb von etwa einer (1) Minute befüllt, gewaschen, extrahiert oder geleert werden.
Fig. 7 stellt eine Anordnung zur Einleitung von Dampf in eine Vielzahl von Filtern dar. Diese Anordnung umfaßt einen Behälter 80 mit einen Deckel 82. Ein aus einem geeigneten Material wie, zum Beispiel, Papier- oder Glasfaser hergestelltes absorbierendes Blatt 84 kann in den Behälter 80 gegen die Innenwand des Behälters angeordnet sein. Das absorbierende Blatt 84 kann, zum Beispiel, aus Whatman GF/C-Material hergestellt sein. Das Filterpapier 84 kann gegen die Seitenwand des Behälters 80 durch eine Teflonsieb 86 mit einer Siebweite von etwa vier tausendstel eines Inches (0,004'') gehalten werden. Wenn es mit dem gleichen Fluid 96 wie in der Flasche 94 befeuchtet ist, hält dieses befeuchtete absorbierende Blatt den Dampfgehalt innerhalb des Behälters auf sein Maximum.
Ein Zentrierungsteil 88 ist am Boden des Behälters 80 angeordnet. Das Zentrierungsteil 88 kann vorzugsweise von konischer Form sein. Das Zentrierungsteil 88 trägt die in Fig. 4 gezeigte und oben beschriebene Aufnahmeplatte 60, so daß die Aufnahmeplatte und die Filter in der Aufnahmeplatte nicht die Wand des Behälters 80 oder das Filterpapier 84 berühren. Auf diese Weise kann eine wirkungsvolle Übertragung des Dampfes zwischen dem Behälter und den Filtern in der Aufnahmeplatte hergestellt werden.
Eine Leitung 90 erstreckt sich vom Innenraum des Behälters 80 durch den Deckel 82 und durch einen Deckel 92 zu der Dampfflasche 94. Die Leitung 90 kann aus einem geeigneten Material wie, zum Beispiel, Tetrafluorethylen (Teflon) hergestellt sein. Die zu verdampfende Flüssigkeit 96 befindet sich in der Flasche 94. Der Dampf dieser Flüssigkeit geht durch die Leitung 90 in den Behälter 80 zur Füllung der Filter in dem Behälter.
Der Deckel 92 weist einen Einlaß 93 für die Stickstoffzufuhr auf. Der Stickstoff kann in die Flasche 92 durch einen Einlaß 93 eingeleitet werden, um den Behälter 80 mit einem inerten Gas zu durchspülen. Auf diese Weise kann der Behälter 80 nach der Verwendung in einer Reaktion von dem Reaktanten freigespült und zur Verwendung für eine nachfolgende Reaktion vorbereitet werden.
Diese Filter sind optimal geeignet zur Verwendung bei manueller Peptidsequenzierung nach dem Edman-Abbau, manueller Peptid-Synthese und bei anderen analytischen und diagnostischen Verfahren, die einen schnellen Reagenzientransfer durch Kapillarwirkung, Lösungsmittelauswaschen durch Zentrifugation und Durchdringung von Gasphasen-Reagenzien oder Lösungen erfordern.

Verwendung der Filter in der Peptidsequenzierung

Im Fall der manuellen Edman-Chemie, einem Verfahren, das verwendet wird, um sequentiell eine Aminosäure nach der anderen von einem Polypeptid beginnend am NH&sub2;terminalen Ende zu entfernen, kann der Benutzer schnell mittels der Filter und Aufnahmeplatten der Erfindung sowohl Flüssig- als auch Gasphasen-Reaktionen durchzuführen zusammen mit Lösungsauswasch- und Trocknungsschritten, und dies viel bequemer, als es nach dem Stand der Technik möglich war.
Die oben beschriebenen Gegenstände und Vorrichtungen wurden in der manuellen Edman-Chemie zur Sequenzierung eines Peptides verwendet. Die Filter waren gebaut, wie in den Fig. 1, 2 und 3 bei 10 gezeigt, und und wiesen die Scheibe 18 mit einem Durchmesser von einem und zwei zehntel Millimetern (1,2 mm) und einem Gewicht von etwa fünfundsiebzig Mikrogramm (75 ug) auf. Die Filter-Scheiben 18 wurden aus einem Glasfaser- Filterblatt (Whatman GF/C) hergestellt, das mit Trimethylsilyl- Gruppen derivatisiert war. Die Filterscheiben 18 wurden in die Trägerteile 12 eingesetzt, die mit einen Durchmesser von etwa einem Millimeter (1,0 mm) am Ende 16 hergestellt waren. Diese Trägerteile wurden von Eppendorf-Pipettenspitzen mit der Artikel-Nr. 5089-801 von American Scientific Products abgeschnitten. Jedes der Filter 10 wies eine Länge von etwa sechs und einem halben Millimeter (6,5 mm) auf.
Ein Satz von acht (8) Filtern 10 wurde in die Aufnahmeplatten 64 eingesetzt. Die Aufnahmeplatten 64 wiesen die Maße von etwa fünfzig Millimeter (50 mm) mal zwölf Millimeter (12 mm) mal einem Millimeter (1 mm) oder einem und einem halben Millimeter (1,5 mm) auf. Die Anordnung der Filter in der Aufnahmeplatte 64 paßte zu der einer Microfuge-B-Zentrifugenröhrchen-Haltevorrichtung, wie in der Fig. 6 mit 70 gezeigt.
Eine Scheibe 18 in einem Filter, wie, zum Beispiel, 10 (Fig. 1), wurde mit einer zehn prozentigen (10%) Lösung Polybren in Wasser (Aldrich Artikel-Nr. 10768-91) befeuchtet und dann unter Stickstoff einige Minuten getrocknet. Die von dieser Polybren-Lösung verwendete Menge lag in der Größenordnung von einem halben Mikroliter (0,5 ul) bis zu einem Mikroliter (1,0 ul). Polybren ist wegen seiner hohen Affinität zu Peptiden und Proteinen erwünscht. Eine Polypeptid-Probe (im ng- bis ug-Bereich) im Volumenbereich von einem halben Mikroliter (0,5 ul) bis einem Mikroliter (1,0 ul) wurde in die Scheibe 18 durch Kapillarwirkung oder durch Zentrifugation durch das Filter aufgesaugt.
Die Scheibe 18 wurde durch Kapillarwirkung mit einem Reagenz bestehend aus fünf Volumenprozent (5%) Phenylisothiocyanat in Heptan befeuchtet. Eine Aufnahmeplatte 64, wie in Fig. 6 zum Halten der Filter 10 gezeigt, wurde dann in einen eine gesättigte Atmosphäre von Triethylamin in Wasser enthaltenden Behälter, wie beispielsweise, der Behälter 80, hineingestellt. Die Reaktionszeit betrug etwa zehn (10) bis fünfzehn (15) Minuten, und die Reaktionstemperatur lag bei etwa 50ºC. Das Filter in der Aufnahmeplatte 64 wurde danach unter Vakuum für einen Zeitraum von etwa drei (3) Miniiten getrocknet, drei-(3)mal mit Ethylacetat durch Eintauchen (15 ul durch Kapillarwirkung) und dann drei-(3)mal zentrifugiert bei zehn tausend Umdrehungen pro Minute (10.000 UpM).
Die Aufnahmeplatte 64 mit dem Filter 10 wurde dann in einem zweiten Behälter 80, der mit Dampf aus wasserfreier Trifluoressigsäure gesättigt war, überführt. Die Reaktionszeit betrug etwa zehn (10) bis fünfzehn (15) Minuten, und die Reaktionstemperatur lag bei etwa 50ºC.
Das in der Aufnahmeplatte 64 gehaltene Filter 10 wurde mit einer Haltevorrichtung 70 der Fig. 6 zusammengebaut. Die Haltevorrichtung 70 war mit Polypropylen- Mikroröhrchen (Cole Scientific, Calabasus, California) mit einem Volumen von dreihundert Mikrolitern (300 ul) ausgestattet und wurde mittels einer Zentrifuge bei etwa zehntausendfacher Schwerkraft (10 000 g) mit etwa fünfzehn Mikrolitern (15 ul) Butylchlorid pro Filter gespült. Die Butylchloridspülung, die das Anilinothiazolinon-Derivat der abgespaltenen Aminosäure des Polypeptides enthält, wurde in einer Vakuum-Zentrifuge getrocknet. Der Rückstand wurde mit etwa zehn Mikrolitern (10 ul) einer fünfundzwanzig prozentigen (25%) wäßrigen Trifluoressigsäure für etwa fünfzehn (15) Minuten bei 50ºC zur Überführung (Konvertierung) in das Phenylthiohydantoin-Derivat behandelt. Dieses Derivat wurde mit Hilfe der Reverse- Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatographie, HPLC) identifiziert.
Die oben diskutierten Schritte wurde in Folge wiederholt, um die zweite Aminosäure des NH&sub2;-terminalen Endes des Polypeptides abzuspalten (weniger als die erste Aminosäure). Nachfolgende Zyklen, wie oben genauer beschrieben, bewirken einen schrittweisen Aminosäureabbau vom NH&sub2;-Terminus des Polypeptides (weniger als die vorher abgespaltenen Aminosäuren). Die abgespaltenen Aminosäure-Phenylhydantoine wurde durch HPLC identifiziert.
Die oben beschriebenen Beispiele beschreiben die Sequenzierung eines einzigen Peptides. Ein Vielzahl von Peptiden kann in ähnlicher Weise sequenziert werden unter Verwendung einer Vielzahl von Filtern, wie in den Fig. 4-7 dargestellt.

Verwendung der Filter in der Peptid-Synthese

Die Scheiben 18 hatten einen und zwei zehntel Millimeter (1,2 mm) Durchmesser und etwa fünfundsiebzig Mikrogramm (75 ug) Gewicht. Für die Peptid-Synthese wurden die Scheiben aus einem aminopropylsilylierten Glasfaser-Blatt (Whatman GF/C) hergestellt.
Zur Durchführung der Aminopropylsilylierung wurden die Scheiben in ein Reagenz eingetaucht, das ein (1) Volumenteil Aminopropyltriethoxysilan, ein (1) Volumenteil Pyridin und acht (8) Volumenteile Tetrahydrofuran enthielt. Dieser Tauchvorgang wurde etwa dreißig (30) Minuten ohne Feuchtigkeit durchgeführt, etwa zehn (10) bis fünfzehn (15) Minuten bei Feuchtigkeit (luftgesättigt mit feuchtem Dampf) und weitere sechzig (60) Minuten ohne Feuchtigkeit. Die derivatisierten Scheiben wurden danach nacheinander mit Tetrahydrofuran, Methanol und Tetrahydrofuran gewaschen und dann luftgetrocknet. In der Tat kann jedes Verfahren, mit dem eine reaktive Aminogruppe einführt werden kann, für die Peptid-Synthese verwendet werden.
Die Aufeinanderfolge der Schritte bei der Synthese von Peptiden und die für die Peptide-Synthese verwendeten Materialien waren die gleichen, wie sie beim Stand der Technik verwendet werden, um die Kupplung einer säure- oder basespaltbaren Bindung an die Aminogruppe des Trägers zu erhalten, gefolgt von sequentiellen Addition einer durch ihre Carboxyl-Gruppen geeigneten blockierten -NH&sub2;-Aminosäuren. Mehrere Proben wurden jedoch gleichzeitig in dieser Erfindung bearbeitet und der Reagenzientransfer wurde mittels Kapillarwirkung ausgeführt.
Die oben beschriebenen Schritte können so oft wie gewünscht wiederholt werden, um ein Peptid von jeder gewünschten Länge herzustellen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um mehrfache Kopien von einem einzigen Peptid herzustellen. Das Verfahren kann auch verwendet werden, um eine einzige Kopie von mehreren Peptiden durch Verwendung mehrerer Filter, wie in Fig. 6 dargestellt, herzustellen.
Die wie oben beschrieben synthetisierten Peptide können von der Festphase entfernt und gereinigt werden, oder, wenn erwünscht, an der Festphase zur direkten Verwendung in Immunoassays belassen werden. Für diesen Fall ist es nützlich entweder eine Synthese-Strategie auszuarbeiten, bei der ein Peptid deblockiert werden kann, ohne es von dem Festphasenträger zu entfernen, oder es direkt an eine nicht spaltbare funktionelle Gruppe an den Träger zu binden.
Obgleich diese Erfindung offenbart und mit Bezug auf besondere Ausführungsformen dargestellt wurde, sind die darin enthaltenen Prinzipien in zahlreichen anderen Ausführungsformen anwendbar, was für Personen, die mit dem Stand der Technik vertraut sind, offensichtlich ist. Die Erfindung ist deshalb nur im Rahmen der an hängenden Ansprüche eingeschränkt begrenzt.

Claims

1. Vorrichtung zur Aufnahme einer Substanz und zum Ändern der Eigenschaften der Substanz, mit mindestens einem hohlen Trägerteil (12; 28; 32), das aus fluiddichtem Material besteht und ein größeres Ende sowie ein kleineres Ende und ein durchlässiges Teil (18; 22; 34) innerhalb des Trägerteils in dichter Verbindung zu diesem aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß das durchlässige Teil (18; 22; 34) unter radialer Kompression innerhalb des Trägerteiles bündig mit der Frontkante des kleineren Endes des Trägerteiles sitzt, wobei das Material des durchlässigen Teiles mit dem fluiddichten Material des Trägerteils zusammenwirkt, um das durch lässige Teil in einer festen Verbindung in Bezug auf das Trägerteil längs seiner gesamten Umfangsfläche zu halten, so daß es bei der Zentrifugierung auftretenden Zentrifugalkräften widerstehen kann.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägerteil aus Kunststoffmaterial besteht.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das durchlässige Teil mindestens teilweise aus Fasern besteht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fasern härter als das fluiddichte Material sind.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das durchlässige Teil mit dem Trägerteil in einer Schweißverbindung steht.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Verbindung zwischen dem Trägerteil (12; 28, 32) und dem durchlässigen Teil (18; 22; 34) das Durchsickern von Fluid in dem Verbindungsbereich zwischen dem durchlässigen Teil (18; 22; 34) und dem Trägerteil verhindert.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Aufnahmeplatte (60), die eine Vielzahl von Trägerteilen (12; 28; 32) mit durchlässigen Teilen (18; 22; 24) derart aufnimmt, daß das Fluid durch die Trägerteile und die durchlässigen Teile hindurch strömen kann.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fasern in jedem der durchlässigen Teile eine Dicke im Bereich von 0,005 Mikrometer bis 50 Mikrometer aufweisen.

9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Schicht (24) aus Partikeln oder Kügelchen auf dem durchlässigen Teil (22) innerhalb des Trägerteils (28) angeordnet ist und daß die Schicht (24) mit einem zusätzlichen durchlässigen Teil (26) belegt ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch ein Positionierteil (280) von konischer Form, das in Dichtkontakt in das Trägerteil (28) eingepreßt ist und das zusätzliche durchlässige Teil (26) in seiner Position hält.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Positionierteil (280) mit einer Umfangsnut (281) versehen ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmeplatte (60) in einem hohlen Behälter (80) angeordnet ist, daß ein Blatt aus einem Fasermaterial (86) gegen die Wand des Behälters gelegt ist, so daß es durch in den Behälter eingeleitetes Fluid befeuchtet wird, daß Mittel vorgesehen sind, die das Faserblatt gegen die Wand des Behälters (80) halten, daß Zentrierungsmittel in dem Behälter (80) vorgesehen sind, um die Aufnahmeplatte (60) in dem Behälter zu positionieren und auf diese Weise einen Kontakt zwischen dem Blatt aus Fasermaterial und den in der Aufnahmeplatte angeordneten Trägerteilen sowie den durchlässigen Teilen zu vermeiden, und daß Mittel (90) zusammenwirkend mit dem Behälter (80) vorgesehen sind, um ein dampfförmiges Fluid in den Behälter einzuleiten, um das Fluid durch Reaktion mit Materialien innerhalb des Behälters während des Durchflusses des Fluids durch die Scheiben zu bearbeiten.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltemittel ein Sieb und die Zentrierungsmittel einen Konus umfassen, der in dem Behälter angeordnet ist, um die Aufnahmeplatte (60) aufzunehmen.

14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das durchlässige Teil (18; 22; 34) und das Trägerteil (12; 28; 32) so dimensioniert sind, daß sie Flüssigkeit durch Kapillarwirkung aufnehmen können.

15. Verfahren zur Änderung der Eigenschaften einer Substanz unter Verwendung einer Vorrichtung, die mindestens ein hohles Trägerteil aus fluiddichtem Material mit einem kleineren und einem größeren Ende sowie ein durchlässiges Teil aufweist, das innerhalb des Trägerteiles dicht in Bezug auf dieses angeordnet ist, wobei ein erstes Fluid in das offene Ende des Trägerteiles eingebracht wird, um das durchlässige Teil zur Absorption zu durchlaufen, und ein zweites Fluid auf das durch lässige Teil aufgebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung verwendet wird, bei der das durchlässige Teil bündig mit der Vorderkante des kleineren Endes des Trägerteiles angeordnet ist, und daß das zweite Fluid durch Kapillarwirkung von dem kleineren Ende des Trägerteiles her aufgetragen wird, um es mit dem ersten Fluid zur Reaktion zu bringen, und daß das Reaktionsprodukt durch Zentrifugation oder Übertragung auf Fließpapier gewonnen wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiteres Reagenz auf das durchlässige Teil dadurch aufgetragen wird, daß die Vorrichtung einer Dampfphase ausgesetzt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß als erstes Fluid eine Polymerlösung verwendet wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluide wiederholt aufgetragen werden, um das Polymer sequentiell abzubauen.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluide auf das durchlässige Teil von dem kleineren Ende und dem größeren Ende des Trägerteils aus in alternierender Weise aufgetragen werden.