DE4420732A1 - Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe - Google Patents
Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer ProbeInfo
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Description
Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Behandlung von Nuklein
säuren aus einer Probe sowie ein System zur Handhabung dieser Vorrichtung.
Im Gegensatz zur klinischen Chemie und Immunologie spielt bei der Analyse
von Nukleinsäuren die Probenvorbereitung eine entscheidende Rolle, vor
allem wenn, Amplifikationsverfahren wie die Polymerase Chain Reaction
(US-A-4,683,195) oder auf Transkriptionsreaktionen basierende Amplifikatio
nen Teil des Analyseverfahrens sind. Dabei kann ein Nukleinsäureanalysever
fahren theoretisch in drei Teilschritte zerlegt werden. Nämlich eine Proben
vorbereitung, in der die Nukleinsäuren aus einer Probe zugänglich gemacht
und von störenden Probenbestandteilen abgetrennt werden, eine Amplifika
tion, bei der die Menge an Nukleinsäuren erhöht wird, und einen Detektions
schritt, in dem die gebildeten Nukleinsäuren nachgewiesen werden.
In derzeit erhältlichen Nukleinsäureanalysetests, z. B. für den Nachweis von
HIV aus Blut, sind eine ganze Reihe von chemischen und physikalischen Be
handlungsschritten erforderlich. Dazu gehören Zentrifugations-, Dekantie
rungs- und Extraktionsschritte. Diese Schritte finden in Reagenzröhrchen statt.
Ergebnis der Probenvorbereitung sind gefällte Nukleinsäuren, die für den Ein
satz in der Amplifikationsreaktion wieder aufgelöst werden.
Eine spezielle Variante, bei der die Nukleinsäuren nach der Probenvorberei
tung in an ein Gel gebundender Form vorliegen, ist in der EP-A-O 389 063 be
schrieben. Auch dieses Verfahren beinhaltet mehrere Zentrifugationsschritte
zur Abtrennung der Gelpartikel von der Probenflüssigkeit.
Ein besonderes Problem bei der Analyse von Proben auf Nukleinsäuren ist die
Gefahr einer Kontamination durch von außen, über die Luft oder Bearbei
tungsvorrichtungen eingeschleppte Nukleinsäuren. Die oben geschilderten
Verfahren sind zusätzlich noch besonders kontaminationsanfällig, da die
Probengläschen mehrmals geöffnet und geschlossen werden müssen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, Nachteile des Standes der
Technik zu vermeiden und insbesondere eine Vorrichtung zur kontaminations
armen und einfachen Behandlung von Nukleinsäuren bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist daher eine Vorrichtung zur Behandlung von
Nukleinsäuren aus einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen ersten
Reaktionsraum zur Abtrennung der Nukleinsäuren von anderen Probenbe
standteilen sowie einen damit über einen regelbaren Transportweg verbunde
nen zweiten Reaktionsraum zur Vermehrung der Nukleinsäuren enthält. Eben
falls Gegenstand der Erfindung ist ein System zur Behandlung von Nuklein
säuren, welches auf die erfindungsgemäße Vorrichtung abgestimmt ist.
Grundgedanke der Erfindung ist, daß die Teilschritte Probenvorbereitung und
Vermehrung von Nukleinsäuren besonders vorteilhaft aneinander gekoppelt in
einer einzigen Vorrichtung durchgeführt werden. Eine solche Kopplung der
Teilschritte wurde bisher noch nicht beschrieben.
Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind jegliche Art von Nukleinsäuren,
sowohl DNA als auch RNA, einzelsträngig, doppelsträngig oder mehrfach
strängig. Diese Nukleinsäuren können in jeder Art von Proben, insbesondere
flüssigen Proben, enthalten sein. Unter Proben ist hierbei ein Gemisch von
Stoffen zu verstehen. Sie können vor ihrem Einsatz in der erfindungsgemäßen
Vorrichtung einer Behandlung unterzogen worden sein, können jedoch auch
der Natur direkt entnommen sein, z. B. Körperflüssigkeiten wie Blut oder
Urin.
Eine Behandlung von Nukleinsäuren ist für die Durchführung verschiedenster
Verfahren erforderlich. Hierzu gehören Verfahren zum Nachweis von
Nukleinsäuren in einer Probe, wie sie bei der Erkennung von Infektionen
durch nukleinsäurehaltige Organismen erforderlich sind. Mehrere Behand
lungsschritte sind jedoch auch in Verfahren zur Feststellung des genetischen
Status von Organismen sinnvoll. In all diesen Verfahren sind eine Reihe von
Behandlungsschritten erforderlich. Da die Nukleinsäuren nur einen sehr gerin
gen Anteil der Komponenten des Gemisches ausmachen, wird oft eine Ab
trennung von Nukleinsäuren von anderen Probenbestandteilen vorgenommen.
Der Grad der Abtrennung bzw. Aufreinigung richtet sich nach dem beabsich
tigten Zweck der Gesamtbehandlung.
Die Vermehrung von Nukleinsäuren ist ebenfalls ein weit verbreiteter Schritt
bei der Behandlung von Nukleinsäuren. Es stehen diverse Verfahren zur Ver
mehrung von Nukleinsäuren bereit, z. B. die Polymerasekettenreaktion. Unter
Vermehrung von Nukleinsäuren ist im wesentlichen die in-vitro-Vermehrung
gemeint. Jedoch ist auch eine in-vivo-Vermehrung prinzipiell denkbar.
Gegenstand der Erfindung ist nun die Verknüpfung beider Behandlungsschritte
in einer einzigen Vorrichtung. Dabei findet die Abtrennung der Nukleinsäuren
von anderen Probenbestandteilen in einem ersten Reaktionsraum statt und die
Vermehrung der Nukleinsäuren in einem zweiten Reaktionsraum. Erfindungs
gemäß sind die beiden Reaktionsräume über einen Transportweg miteinander
verbunden, wobei dieser so gestaltet ist, daß er eine zeitliche Festlegung des
Transports einer Flüssigkeit vom ersten in den zweiten Reaktionsraum erlaubt.
Der Behandlungsschritt zum Abtrennen der Nukleinsauren im ersten Reak
tionsraum ist ein komplexer Vorgang, der je nach Probenart folgende
Unterschritte beinhalten kann, die in mehr als einem erfindungsgemäß ver
bundenen Reaktionsraum ablaufen können. Er kann beispielsweise beinhalten:
- a) Verflüssigung im Falle einer festen oder zähflüssigen Probe
- b) Vereinzelung von nukleinsäureenthaltenden Kompartimenten wie z. B. Zellen oder Zellkompartimente über geeignete, großteils bekannte Verfah ren.
- c) Anreicherung von nukleinsäureenthaltenden Kompartimenten wie z. B. Zellen oder Zellkompartimente über geeignete Verfahren (z. B. gemäß EP-A-0260280).
- d) Freisetzung von Nukleinsäuren aus den obenerwähnten Kompartimenten.
- e) Die Abtrennung von Nukleinsäuren von anderen Probenbestandteilen, vor allem solchen, die in den verschiedensten Vermehrungsprozessen inhibi torisch wirken, z. B. Polymeraseinhibitoren.
All diese Behandlungsschritte im ersten Reaktionsraum geschehen erfindungs
gemäß nicht über Zentrifugationsschritte. Möglichkeiten dafür sind als Ver
fahren in der Literatur beschrieben und beinhalten enzymatische Abbau
reaktionen, diverse immunchemische Verfahren mit verschiedensten Fest
phasen-Systemen wie Immunadsorption oder Einsatz von beschichteten
Magnetpartikeln. Möglichkeiten zur Abtrennung von Nukleinsäuren sind ge
geben durch Zurückhalten der Nukleinsäuren an einem Filtermaterial,
(unspezifische) Immobilisierung von Nukleinsäuren an ein im Reaktionsraum
enthaltenes Adsorbens wie beispielsweise Silikagel oder Glaspartikel, oder
biospezifische Immobilisierung von Nukleinsäuren an biospezifischen Ad
sorbentien, z. B. Affinitätsmaterialien. Hierbei kann die Fähigkeit von
Nukleinsäuren, mit hierzu im wesentlichen komplementären Nukleinsäuren an
einer festen Phase Hybride zu bilden, ausgenutzt werden.
Die Abtrennung der Nukleinsäuren kann auch über chromatographische Ver
fahren im ersten Reaktionsraum vorgenommen werden. Neben der Abtrennung
von Nukleinsäuren können im ersten Reaktionsraum zusätzlich weitere Be
handlungsschritte für Nukleinsäuren durchgeführt werden, z. B. Filtration von
nukleinsäurehaltigen Zellen, Lyse dieser Zellen oder Schritte zur Markierung
von Nukleinsäuren. Beispielsweise kann im ersten Reaktionsraum gemäß der
Erfindung in einem Schritt die Lyse und Immobilisierung von Nukleinsäuren
gemäß EP-A-O 389 063 durchgeführt werden. Je nach den im ersten Reak
tionsraum durchzuführenden Behandlungen, kann auch, angrenzend an den
Reaktionsraum, ein Heizelement vorgesehen sein. Dieses ist insbesondere bei
der Lyse von Zellen praktikabel.
Da einerseits bei allen hier gezeigten Verfahren vor einer Nukleinsäurever
mehrung die Kontaminationsgefahr sehr groß ist und ein hohes Risiko birgt,
falsch-positive Ergebnisse zu erzielen und andererseits wie beschrieben die
Prozesse für die entsprechende Probenaufarbeitung sehr unterschiedlicher
Natur sind, ist ein wichtiger Gegenstand der Erfindung die Verwendung von
kostengünstigen modular anwendbaren Einmalplastikartikeln, die in einem
weitgehend geschlossenem Verbund für Mehrstufenprozesse benutzt werden.
Die Vorrichtung stellt daher ein im wesentlichen geschlossenes System dar,
das an wenigen Stellen ohne Kontaminationsrisiko geöffnet werden kann, um
mindestens einen Reagenzeintrag in mindestens einen Reaktionsraum zu
ermöglichen. In einem ersten Aspekt der Erfindung stellt die Vorrichtung
daher ein anwendungsbereites Mehrfachreaktionsgefäß dar.
Die Abtrennung der Nukleinsäure von anderen Probenbestandteilen wird be
endet, indem die Flüssigkeit mit anderen Probenbestandteilen aus dem ersten
Reaktionsraum entfernt wird, wohingegen die angereicherten Nukleinsäuren
im Reaktionsraum verbleiben. Dazu weist der erste Reaktionsraum neben der
für das Einfüllen der Probe in den ersten Reaktionsraum erforderlichen Öff
nung eine weitere Öffnung bevorzugt am unteren Teil oder am Boden des
Reaktionsraumes auf, die im weiteren als Ventilöffnung bezeichnet wird.
Diese Ventilöffnung ist bevorzugt verschließbar. Sobald die Probe in dem
ersten Reaktionsraum vorliegt, ist der Verschluß normalerweise geschlossen.
Zur Abtrennung der anderen Probenbestandteile von den Nukleinsäuren wird
der Verschluß, solange erforderlich, geöffnet und die anderen Probenbestand
teile entnommen.
Als Verschluß im Sinne der Erfindung hat sich dafür insbesondere ein Ventil
verschluß erwiesen, der durch Anlegen eines Vakuums von außen an den
ersten Reaktionsraum geöffnet werden kann. Durch Anlegen eines Unter
drucks gegenüber dem im ersten Reaktionsraum vorherrschenden Druck wer
den die Probenbestandteile aus dem ersten Reaktionsraum entfernt. Wenn
diese nicht mehr weiterbewertet werden sollen, werden sie verworfen, bevor
zugt in ein Abfallgefäß transportiert.
Da die Öffnung zum Befüllen des Reaktionsraumes, die sich bevorzugt im
oberen Teil des Reaktionsraumes befindet, wegen der hohen Kontaminations
gefahr mit einem geeigneten automatisch zu öffnenden Deckel verschlossen
sein muß, wie er in DE-A-44 12 286 beschrieben ist, muß für einen
angemessenen Druckausgleich Sorge getragen werden. Erfindungsgemäße
Lösungen werden später beschrieben.
Anschließend werden die abgetrennten Nukleinsäuren in einen zweiten Reak
tionsraum überführt, in dem die Vermehrung der Nukleinsäuren stattfindet.
Zwischen dem ersten und zweiten Reaktionsraum können jedoch noch weitere
Reaktionsräume zur weiteren Aufreinigung oder andere Behandlungsschritte
vorgesehen sein. Die Nukleinsäuren werden aus dem ersten Reaktionsraum
durch Lösen in einer Flüssigkeit entfernt. Je nach Art der Immobilisierung der
Nukleinsäuren kann dies durch Anlegen eines Reagenzgradienten, eines die
Desorption bewirkenden Stoffes oder eine Verdrängung geschehen. Geeignete
Verfahren sind insbesondere aus der EP-A-O 389 063 bekannt.
Die die Nukleinsäuren enthaltende Flüssigkeit wird über einen Transportweg
zum zweiten Reaktionsraum transportiert. Erfindungsgemäß ist dieser
Transportweg regelbar. Unter regelbar wird verstanden, daß der Transportweg
Mittel enthält, mit denen sichergestellt wird, daß nur die nukleinsäurehaltige
Lösung, und nicht die mit anderen Probenbestandteilen beladene Flüssigkeit,
in den zweiten Reaktionsraum gelangt. Dies kann beispielsweise realisiert
werden durch einen konventionellen 3-Wege-Hahn, von dem jeweils ein Weg
zu dem ersten und zweiten Reaktionsraum führt und ein dritter Weg ein Ab
falltransportweg ist. Wenn die Flüssigkeit mit den anderen Probenbestand
teilen durch den Transportweg transportiert werden soll, verbindet das Ver
teilerelement den vom ersten Reaktionsraum kommenden Weg mit dem Ab
falltransportweg. Wenn die nukleinsäurehaltige Lösung in den zweiten Reak
tionsraum überführt werden soll, wird das Verteilerelement so gestellt, daß der
Weg vom ersten Reaktionsraum mit dem Weg zum zweiten Reaktionsraum
verbunden wird. Weitere Möglichkeiten zur Teilung der Flüssigkeitsströme
sind bekannt. Das Verteilerelement wird bevorzugt über eine zentrale Steuer
einheit gesteuert, so daß die Zugabe von Reagenzien in den ersten Reaktions
raum, die Initiation des Transports der Flüssigkeit mit den anderen Probenbe
standteilen bzw. der nukleinsäurehaltigen Lösung und die Stellung des Ver
teilerelements koordiniert werden kann.
Der zweite Reaktionsraum, welcher für die Durchführung der Vermehrungs
reaktion benutzt wird, enthält die hierfür erforderlichen Reagenzien entweder
bereits vor der Zugabe der nukleinsäurehaltigen Lösung oder diese Reagenzien
werden über eine Öffnung zu der nukleinsäurehaltigen Flüssigkeit im zweiten
Reaktionsraum zugegeben. Bevorzugt ist die hierfür vorgesehene Öffnung zur
Verringerung der Kontaminationsgefahr von außen verschließbar und wird
nach Herstellungen der Vermehrungsbedingungen verschlossen. Sofern die
Zugabe weiterer Reagenzien zu einem späteren Zeitpunkt erforderlich wird,
kann die Öffnung erneut geöffnet werden. Eine weit verbreitete Möglichkeit
der Vermehrung von Nukleinsäuren ist die PCR, z. B. EP-A-0 200 362. Der
zweite Reaktionsraum ist dazu bevorzugt so gestaltet, daß schnelle Tempera
turänderungen darin vollzogen werden können.
Nach der Vermehrungsreaktion kann die Reaktionsmischung für die Durchfüh
rung weiterer Reaktionen in dem zweiten Reaktionsraum verbleiben, oder aber
daraus entfernt werden. Hierfür steht entweder die oben genannte verschließ
bare Öffnung zur Verfügung oder es kann eine weitere Öffnung, wie für den
ersten Reaktionsraum beschrieben, vorgesehen sein.
Für die Durchführung von Nukleinsäurenachweistests kann der Nachweis im
zweiten Reaktionsraum geschehen, beispielsweise wie in der DE-A-43 44 742
beschrieben, oder nach Überführung in ein weiteres Gefäß, beispielsweise
einen dritten Reaktionsraum.
Die einzelnen Elemente der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind prinzipiell
bekannt bzw. sehr leicht herstellbar. Sie sind beispielsweise Tubes, die an
ihrem Boden ein durch Unterdruck zu öffnendes Ventil enthalten, indem eine
in der Mitte geschlitzte Gummidichtlippe sich in Richtung des Unterdruckes
wölbt und die außenliegenden Auslaßöffnungen des Tubebodens freigibt. Wird
der Unterdruck aufgehoben, so springt die Gummidichtlippe in die Ausgangs
position zurück und dichtet die Auslaßöffnungen.
Der Tubekörper kann aus geeigneten Materialien, wie beispielsweise Kunst
stoffen oder Glas, hergestellt sein. Die Gummidichtlippe kann aus elastischem
Kautschukgummi oder vergleichbar elastischen Material hergestellt werden,
wobei eine hohe Materialelastizität eine Öffnung durch geringen Unterdruck
und umgekehrt ermöglicht.
Die Herstellung erfolgt in zwei Schritten: a.) Spritzgußtechnische Verarbeitung
von Kunststoffen wie oben erwähnt zur Formgebung eines Grundkörpers, der
am unteren Ende einen Rand überstehen hat. b.) Einlegen der
Gummidichtlippe mit anschließender Umbördelung des Randes mittels
Schmelzen, wodurch die Befestigung der Gummidichtlippe an den
Grundkörper entsteht.
Der regelbare Transportweg kann aus einem Stück Schlauch bestehen, jedoch
auch aus einer festen Röhre aus Kunststoff oder Plastik bestehen. Als Ver
teilerelement können handelsübliche 3 -Wege-Verteilerelemente eingesetzt
werden. Als zweiter Reaktionsraum kann praktisch jedes Tube, wie es aus
Reagenzienautomaten bekannt sind, verwendet werden. Besonders vorteilhaft
ist die erfindungsgemäße Vorrichtung jedoch aus einem Stück gebildet, mit
Ausnahme der bewegten Teile, wie Ventil oder Verteiler. Zur Herstellung
stehen Spritzgußverfahren zur Verfügung.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist, daß sie als Einmal-Device
gestaltet werden kann, d. h. nach Abtrennung der Nukleinsäuren und ihrer
Vermehrung sowie Gewinnung der vermehren Nukleinsäuren kann die Vor
richtung verworfen werden.
Eine weitere mögliche Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung
sieht vor, daß die Vorrichtung aus einzelnen Modulen aufgebaut ist, die je
nach der Art der durchzuführenden Behandlungsschritte, die von der Art der
Probe und der gewünschten Behandlung abhängig ist, aus einzelnen Modulen
beliebig zusammengesetzt werden kann. Unter einem Modul wird eine Vor
richtung verstanden, die für einen Behandlungsschritt vorgesehen ist, und die
mit anderen Vorrichtungen zur Abarbeitung einer ganzen Kaskade von
Behandlungsschritten auf einfache Weise verbunden und kombiniert werden
kann. In einem Aspekt der Erfindung besteht die erfindungsgemäße
Vorrichtung aus im wesentlichen baugleichen, zusammensteckbaren Modulen,
so daß eine mehrstufige Reaktionsführung möglich ist. Im wesentlichen
baugleich bedeutet hier, daß mindestens zwei Module eine ähnliche äußere
Form und ein gleiches Prinzip für die Öffnung des Verschlusses, mit dem die
Entnahmeöffnung verschlossen werden kann, aufweist. Im Hinblick auf die
Inhalte des Reaktionsraumes des Moduls können je nach Einsatzzweck des
Moduls beträchtliche Unterschiede bestehen, z. B. kann ein Modul ein
Filtervlies, ein anderes Reagenz zur Lyse von Zellen, ein weiteres Materialien
zur Immobilisierung von Zellen oder Nukleinsäuren enthalten. Der Begriff
zusammensteckbar bedeutet, daß der Ausgang eines Moduls mit einer
Eingangsöffnung eines anderen Moduls schnell flüssigkeitsdicht verbunden
werden kann. Als Module können Module verwendet werden, die einen
Reaktionsraum sowie einen flüssigkeitsdichten Verschluß, der durch
Einwirkung von Vakuum von außen auf den Verschluß geöffnet werden kann,
aufweisen. Für die Abtrennung der Nukleinsäuren enthält das Modul die für
die Abtrennung erforderlichen Materialien und Reagenzien, während für die
Durchführung der Vermehrungsreaktion die vermehrungsreaktionsspezifischen
Reagenzien enthalten sind. Die Reaktionsmodule können über Verteilermodule
miteinander verbunden werden. Die Verteilermodule enthalten Ansätze für die
Verbindung mit den Reaktionsmodulen und einem Abfallgefäß, die
Transportwege und das Verteilerelement.
Der Transport der Gase und insbesondere Flüssigkeiten innerhalb der Vorrich
tung wird entweder über Kapillarität oder Unterdruck/Vakuum gewährleistet.
Bevorzugt ist die Benutzung von Unterdruck. Hierzu wird an den Abfallbe
hälter und/oder den zweiten Reaktionsraum ein leichter Unterdruck angelegt.
In Fig. 1 sind Module gezeigt, die für die Herstellung einer erfindungsge
mäßen Vorrichtung verwendet werden können und zeigt ein Universal
modul (1) für Reaktionsräume mit einer verschließbaren Bodenöffnung im ge
öffneten und geschlossenen Zustand. In einer bevorzugten Ausführungsform
besteht das Universalmodul aus einem Boden (2) mit mehreren Auslaßöffnun
gen (3) und einer geschlitzten Gummidichtlippe (4).
Fig. 1a zeigt die Aufsicht auf Boden (2) mit Auslaßöffnungen (3) sowie
Gummidichtlippe (4) mit Schlitz (5). Durch Anlegen von Unterdruck wölbt
sich die Gummidichtlippe (4), öffnet den Schlitz (5) und gibt die Bodenöff
nungen (3) frei.
Fig. 1b zeigt den Schnitt durch den Deckel für die obere Öffnung mit Be
lüftungsloch (6). Die Ausführungen Fig. 1c und 1d berücksichtigen den Kon
taminationsschutz, wobei in Fig. 1c eine Papiervliesscheibe (7) und in Fig. 1d
eine geschlitzte Gummidichtlippe (8) verwendet wird.
Fig. 1e zeigt ein Verteilerelement (9) mit einem Ansatz (10) für einen ersten
Reaktionsraum (11), einem Ansatz (12) für einen Abfallbehälter und einen
Ansatz (13) für ein zweites Modul mit einem zweiten Reaktionsraum (14) in
einer Kaskadenanordnung. Die Öffnung (15) dient zur Aufnahme eines
Deckels (19).
In Fig. 1f ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem ersten
Reaktionsraum (11), einem zweiten Reaktionsraum (14), einem Abfallbehälter
(16), Heizelementen (17) für den ersten und zweiten Reaktionsraum sowie
Vakuumansatzstutzen (18) für den zweiten Reaktionsraum und den Abfallbe
hälter gezeigt. Im gezeigten Zustand ist auf dem Verteilerelement in der Nähe
des zweiten Reaktionsraums ein Deckel (19) vorgesehen, durch welchen die
Reagenzien für die Vermehrung der Nukleinsäuren in den zweiten Reaktions
raum gegeben werden können. Ferner ist ein Magnet (20) angedeutet, der zur
Separierung magnetischer Phasen (z. B. Partikel von nicht magnetischen
Phasen) während oder nach der Vermehrungsreaktion benutzt werden kann
z. B. für eine vorgeschaltete Zellanreicherung mittels Immunadsorbtion.
Eine weitere Ausführungsform in einer planaren Anordnung zeigt Fig. 1g. Das
Verteilerelement (21) ist hier in die Deckellösung integriert. Über eine
Kapillare (22) kann die Reaktionslösung vom ersten Reaktionsraum (11) in
den zweiten (14) durch Unterdruck im zweiten Reaktionsraum (14) bei ge
schlossenem Ventil im ersten Reaktionsraum (11) überführt werden. Bei den
diversen Reaktionen anfallender Abfall kann dabei direkt über die Bodenöff
nungen (3) entfernt werden. Analog Fig. 1f können Heizelemente und Magnet
separator eingesetzt werden.
In Fig. 2 ist ein anderes Beispiel für den variablen Aufbau eines kontami
nationsfreien Reaktionsraumes aus Standardmodulen gezeigt, der zur immuno
logischen Adsorption von Zellen genutzt werden kann. Im gezeigten Zustand
ist das Modul durch einen Deckel (19) verschlossen. Bei Anlegen eines
Vakuums an den Anschlüssen (12, 13) würde ein Transport der Flüssigkeit aus
dem Modul schnell zum Erliegen kommen, wenn nicht eine weitere Öffnung
(6) zum Druckausgleich vorgesehen wäre.
In Fig. 3 ist die Kombination eines Moduls mit Reagenzien zur Immunad
sorption mit einem Modul für die Durchführung einer Vermehrungsreaktion
von Nukleinsäuren schematisch gezeigt. Es wird klar, daß, sofern die Über
gänge aufeinander abgestimmt sind, die erfindungsgemäßen Module für jeden
Behandlungsschritt adaptiert und mit entsprechenden Heizelementen oder
Magnetseparatoren versehen werden können und so analog Fig. 1a-g ein uni
verselles System aus einfachen Grundmodulen ergeben.
In Fig. 4 ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Probenvorbereitung und
Amplifikation von Nukleinsäuren aus Vollblut dargestellt. In einem Reak
tionsmodul (23) findet die Hämolyse statt. Die gewünschten Zellen werden
über ein Grobfilter (24) von Geweberesten befreit. Durch Druckausgleich über
den Ausgang (6) werden die Zellen auf einen Immunadsorber (25) aufgegeben.
Durch Elution mit Puffern im pH-Bereich 2-3 werden die Zellen eluiert und
die Suspension in einen Reaktionsraum (26) überführt, in dem die Lyse der
Zellen stattfindet. Das gesamte Lysat wird in ein Modul (27) überführt,
welches ein Glasvlies enthält. Daran werden die Nukleinsäuren adsobiert,
während die anderen Probenbestandteile im Filtrat verbleiben und dem Abfall
zugeführt werden. Nach Desorption mittels Puffer mit niedrigen Ionenstärken
wird die nukleinsäurehaltige Flüssigkeit in eine Amplifikationskammer (14)
überführt.
Der Transport von Flüssigkeiten wird in dem hier beschriebenen Device
mittels eines einzigen Mehrwegeventils (28) und Anlegen von Unterdruck
sowie der Belüftung (6) bewerkstelligt.
In Fig. 5 ist ein einteiliges Device für die Bearbeitung von EDTA-Blut ge
zeigt. Der Flüssigkeitstransport findet über ein Abfallvlies (29) (Kapillarität
zusammen mit Erdanziehungskraft) statt. In einem ersten Gefäß (23) findet
eine Preinkubation, wie z. B. enzymatische Verflüssigung oder die oben er
wähnte Hämolyse statt. Es schließt sich ein Immunadsorber (25) an. Die
Nukleinsäuren werden über ein anschließendes Glasvlies (27) immobilisiert
und von anderen Probenbestandteilen abgetrennt. Anschließend wird die
nukleinsäurehaltige Lösung in die Amplifikationskammer (14) überführt. Im
vorliegenden Fall sind die Verteilerelemente (28) 3-Wege-Hähne.
In Fig. 6 ist ein Schema für eine Aufbereitung von HIV-haltigem Vollblut für
einen Nachweis der DNA oder RNA gezeigt. Es wird hierbei auf die Be
schreibung von Fig. 1c verwiesen. Zusätzlich ist ein Magnet (20) auch im
ersten Modul vorgesehen. Darüber hinaus ist angedeutet, daß die amplifizier
ten Nukleinsäuren in ein konventionelles Tube (30) überführt und nachge
wiesen werden können. Diese Figur ist in Beispiel 1 näher beschrieben.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein System zur Behandlung von
Nukleinsäuren enthaltend eine Vorrichtung zum Pipettieren von Flüssigkeiten,
eine Vorrichtung zur Aufnahme einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und eine
Vorrichtung zum geregelten Transport von Gasen oder Flüssigkeiten in der
Vorrichtung gemäß Anspruch 1. Als Vorrichtung zum Pipettieren von Flüssig
keiten können übliche Pipettierautomaten z. B. der Firma Tecan verwendet
werden. Mit diesen Automaten können sowohl die nukleinsäurehaltige Probe
flüssigkeit als auch eventuell erforderliche Reagenzien aus Proben- bzw.
Reagenzvorratsgefäßen in die erfindungsgemäße Vorrichtung überführt wer
den. Der Transport in der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird bevorzugt
über das Anlegen von Unterdruck gesteuert. Hierzu wird eine Anschlußöff
nung der Vorrichtung mit einem Element verbunden, mit dem ein Unterdruck
erzeugt werden kann. Daß die Flüssigkeiten aus den einzelnen Reaktions
räumen wie gewünscht weiter transportiert werden, kann über eine Steuerung
der Verteilerelemente oder/und der Unterdruckanlage gewährleistet werden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung und
Vermehrung von Nukleinsäuren aus einer Probe durch
- - Immobilisierung der Nukleinsäuren in einem ersten Reaktionsraum,
- - Entfernung anderer Probenteile von den immobilisierten Nukleinsäuren über einen regelbaren Transportweg,
- - die Immobilisierung der Nukleinsäuren und Überführung der nukleinsäure haltigen Flüssigkeit über einen regelbaren Transportweg in einen zweiten Reaktionsraum,
- - Amplifikation der Nukleinsäuren im zweiten Reaktionsraum.
Vorteil der Erfindung ist die hohe Flexibilität des Einsatzes der Module, die
Möglichkeit, die Kontaminationen gering zu halten und die Automatisierbar
keit von Probenvorbereitung und Amplifikation bei nukleinsäure
diagnostischen Tests. Die Module sind bevorzugt so aufgebaut, daß sie nach
einmalige Benutzung verworfen werden könne. Der jedoch wohl größte Vor
teil der Erfindung ist die Möglichkeit, in den Schritten Probenvorbereitung und
Amplifikation jegliche Zentrifugation vermeiden zu können.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
Im Reaktionsmodul (1) werden mittels biotinyliertem Anti-T Helfer-
Zellen/CD4, human-Antikörper (Hersteller: Boehringer Mannheim
Biochemica Kat.Nr.: 881 171) und Streptavidin-Magnet-Partikeln (Hersteller:
Dynal, Oslo, Norwegen) die HIV-DNA-haltigen Zellen aus Vollblut
suspendiert, inkubiert und über einen ersten Magneten (20) zurückgehalten.
Durch Anlegen von Vakuum an den Abfallbehälter (16) über den Stutzen (18)
kann das nicht benötigte Vollblut ausgewaschen und entfernt werden.
Durch Zugabe von Proteinase K in einem geeigneten Puffersystem z. B. mit
1% Laureth 12 oder 0,5% Tween 20 nach Rolfs et al. (in PCR: Clinical
Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992) S. 84 ff oder mit Natrium-
Dodecylsulfatzusatz nach Anderson in Diagnostic Molecular Microbiology -
Principals and Applications Edtrs.: D.H. Persing, T.F. Smith, F.C. Tenover
und T.J. White; American Society of Microbiology; ISBN 1-55581-056-X
(1993) S. 197-202 können die Zellen nach Resuspension durch Erhitzen über
die erste Heizung (17) lysiert werden. Nach Zurückhalten der magnetischen
Partikel durch Magnet (20) und durch Anlagen von Vakuum an (18) kann die
Reaktionsmischung in Reaktionsmodul (14) überführt werden.
Durch den automatisch zu öffnenden Deckel (19) können anschließend PCR-
Reagenzien zugegeben und durch Thermocycling über die Heizung (17) des
Moduls (14) kann die DNA amplifiziert werden analog zu EPA-324474.
Danach wird durch Zugabe von biotinylierter DNA-capture-Probe, die zu dem
PCR-Amplifikat zwischen den Primerhybridisierungspositionen komplementär
ist, und Erhitzen über die Heizung (17) des Moduls (14) eine Hybridisierung
durchgeführt werden. Anschließend kann durch Vakuumanlegen an (31) die
gesamte Reaktionsmischung in ein Streptavidin (SA)-beschichtetes (ES) Tube
(30, Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 1602845) gefüllt in einem ES-
Gerät (Boehringer Mannheim GmbH, Best.-Nr. 1602845) detektiert und das
Ergebnis ausgewertet werden.
In einer Variante kann statt dessen in einem 2-Stufen-Prozeß statt PCR-
Reagenz nach EP-A-O 389 063 Silicagel mit GuSCN-Puffer zugegeben wer
den, der die DNA unspezifisch adsorbiert. Überschüssiges Material kann
durch Anlegen von Vakuum an (32) abgetrennt werden, falls zuvor eine ent
sprechende Filterschicht in (14) eingelegt wurde. Elution der Nukleinsäuren
vom Silicagel erfolgt durch niedrig Salzpuffer (10 mM Tris-Hydrochlorid-
1 mM EDTA (pH 8.0) nach Boom et al. J. of. Clinical Microbiology, Vol. 28,
Nr. 3; 1990; S. 496) mit anschließender PCR in einem weiteren,
zwischengeschalteten Modul, Hybridisierung und Detektion (wie in 1a).
In (1) wird Vollblut einer Hämolyse nach Rolfs et al. (in PCR: Clinical
Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992) S. 69-70 unterworfen. An
schließend werden durch Zugabe von biotinyliertem Anti-gp 120-Antikörper
vom Schaf (Hersteller: Aalto Bio Reagents Ltd. Dublin, Irland) Viruspartikel
über SA-beschichtete magnetische Beads (Hersteller: siehe Beispiel 1)
abgetrennt und gemäß Beispiel 1a oder 1b aufgearbeitet, wobei statt PCR zur
Amplifikation von RNA eine RT-PCR analog zu Wilber et al. in Diagnostic
Molecular Microbiology - Principals and Applications Edtrs.: D.H. Persing,
T.F. Smith, F.C. Tenover und T.J. White; American Society of Microbiology;
ISBN 1-55581-056-X (1993) S. 327-331 angewendet werden muß.
Gewebe wird analog der von Lewin et al. in "Methods in Enzymology" Vol.
171 "Biomembranes"; Edtrs: S. Fleischer und B. Fleischer; Academic Press; S.
444 ff nach der Pronase EDTA-Methode oder der Collagenase-Pronase-EDTA
Methode durch Erhitzen mittels Heizung (17) auf 37 Grad C in
Reaktionsmodul (1) in Einzelzellen übergeführt. Mittels spezifischer
biotinylierter Zelloberflächenmarker analog zu Garcia-Perez et al. in
"Methods in Enzymology" Vol. 171 "Biomembranes"; Edtrs: S. Fleischer und
B. Fleischer; Academic Press; S. 581 und Magnetpartikel (Hersteller sh.
Beispiel 1) werden spezifische Zellen isoliert und gereinigt, die gemäß Bei
spiel 1a oder 1b der PCR zugeführt werden.
Sputum wird zur Verflüssigung nach der Methode, beschrieben bei Rolfs et al.
(in PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992) S. 74 ff,
in das Reaktionsmodul (1) und mit N-Acetyl-L-Cystein/NaOH-Lösung
gegeben, wobei durch leichtes Erhitzen durch das Heizelement (17) die
Reaktion beschleunigt werden kann. Die in der Originalliteratur angegebenen
Zentrifugationsschritte werden ersetzt durch Einsatz spezifischer
biotinylierter Antikörper gegen Oberflächenmarker von Mycobacterium
hergestellt analog zu Garcia-Perez et al. in "Methods in Enzymology" Vol.
171 "Biomembranes"; Edtrs: S. Fleischer und B. Fleischer; Academic Press; S.
581 und Streptavidin beschichteten Magnetpartikel (Hersteller sh. Beispiel 1).
Spezifische Zellen werden isoliert und wie in Beispiel 3 weiterbehandelt.
Reaktionsmodul (1) wird-vor Zugabe der HIV-haltigen Probe befüllt mit
Streptavidin-gekoppelter Bromcyan-aktivierter Sepharose (Hersteller
Streptavidin: Boehringer Mannheim 1097679; Verfahren beschrieben in
"Immunchemische Charakterisierung der ATP-Synthetase von E. coli K12",
G. Bienhaus, Dissertation Universität Tübingen, S. 66, 1980). Dazu werden
Reagenzien analog Beispiel 1a gegeben. Nach Reaktion wird überschüssiges
Material durch Anlegen von Vakuum an (4) abgetrennt, falls eine ent
sprechende Filterschicht in (1) zuvor eingelegt wurde.
Statt der PCR kann auch das NASBA-Verfahren (Cangene USP 5 130 239)
angewendet werden, wobei über die Heizung (17) des Moduls (14) eine
konstante Temperatur erzeugt werden kann.
Statt der Variante 1b kann auch gemäß DE 41 39 664 eine Ionenaus
tauschchromatographie zur Isolierung von Nukleinsäuren benutzt werden.
Bezugszeichenliste
1 Reaktionsmodul
2 Boden von 1
3 Auslaßöffnungen in 2
4 Gummidichtlippe
5 Schlitz in 4
6 Belüftungsloch in 1
7 Papiervliesscheibe
8 geschlitzte Gummidichtlippe im Deckel
9 Verteilerelement
10 Ansatz
11 erster Reaktionsraum
12 Ansatz für Abfallbehälter
13 Ansatz für zweites Modul
14 Reaktionsraum des Amplifikationsmoduls
15 Öffnung des zweiten Moduls
16 Abfallbehälter
17 Heizelement der Module
18 Vakuumansatzstutzen
19 Deckel
20 Magnet
21 Verteilerelement einer planaren Anordnung
22 Kapillare
23 Reaktionsmodul für Hämolyse
24 Grobfilter
25 Immunadsorber
26 Reaktionsraum für Lyse
27 Modul für Adsorption von Nukleinsäuren
28 Mehrwegeventil
29 Abfallvlies
30 Tube
31 Vakuumansatzstutzen an Tubehalter
32 Vakuumansatzstutzen an Abfallbehälter
2 Boden von 1
3 Auslaßöffnungen in 2
4 Gummidichtlippe
5 Schlitz in 4
6 Belüftungsloch in 1
7 Papiervliesscheibe
8 geschlitzte Gummidichtlippe im Deckel
9 Verteilerelement
10 Ansatz
11 erster Reaktionsraum
12 Ansatz für Abfallbehälter
13 Ansatz für zweites Modul
14 Reaktionsraum des Amplifikationsmoduls
15 Öffnung des zweiten Moduls
16 Abfallbehälter
17 Heizelement der Module
18 Vakuumansatzstutzen
19 Deckel
20 Magnet
21 Verteilerelement einer planaren Anordnung
22 Kapillare
23 Reaktionsmodul für Hämolyse
24 Grobfilter
25 Immunadsorber
26 Reaktionsraum für Lyse
27 Modul für Adsorption von Nukleinsäuren
28 Mehrwegeventil
29 Abfallvlies
30 Tube
31 Vakuumansatzstutzen an Tubehalter
32 Vakuumansatzstutzen an Abfallbehälter
Claims (18)
1. Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe, dadurch
gekennzeichnet, daß sie einen ersten Reaktionsraum zur Vorbereitung der
Probe sowie einen damit über einen Transportweg verbundenen zweiten
Reaktionsraum zur Vermehrung der Nukleinsäuren enthält.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein ge
schlossenes System darstellt, das an einigen wenigen Stellen ohne Kon
taminationsrisiko geöffnet werden kann, um mindestens einen Reagenz
eintrag in mindestens einen Reaktionsraum zur Verfügung zu stellen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Proben
vorbereitung Schritte aus den Schritten Verflüssigung, Anreicherung,
Freisetzung und Abtrennung von Substanzen, die die anschließende Ver
mehrung der Nukleinsäure stören, oder einer Kombination davon ausge
wählt wird.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite
Reaktionsraum eine Öffnung zur Entfernung der Reaktionsmischung aus
dem Reaktionsraum aufweist.
5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste
Reaktionsraum Mittel enthält, an welche Nukleinsäuren immobilisiert
werden können.
6. Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch ge
kennzeichnet, daß der Transportweg ein 3-Wege-Verteilerelement ent
hält, von dem jeweils ein Weg zu dem ersten und zweiten Reaktionsraum
führt und ein dritter Weg ein Abfalltransportweg ist.
7. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens
ein Reaktionsraum beheizbar ist.
8. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite
Reaktionsraum eine verschließbare Öffnung zur Zugabe von Reagenzien
für eine Vermehrungsreaktion aufweist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das ge
schlossene System aus Einwegmodulen besteht.
10. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das ge
schlossene System aus mehreren im wesentlichen baugleichen zu
sammensteckbaren Modulen besteht, die mehrstufige Reaktionsabfolgen
ermöglichen.
11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens
ein Reaktionsraum mittels Unterdruck entleert werden kann.
12. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens
ein Reaktionsraum mit einem Magnetseparator versehen ist zur Trennung
magnetischen und nicht-magnetischen Phasen.
13. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das ge
schlossene System als anwendungsbereites Mehrfachreaktionsgefäß ver
wendet wird.
14. System zur Behandlung von Nukleinsäuren enthaltend
- - eine Vorrichtung zum Pipettieren von Flüssigkeiten
- - eine Vorrichtung zur Aufnahme einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und
- - eine Vorrichtung zum geregelten Transport von Gasen oder Flüssig keiten in der Vorrichtung gemäß Anspruch 1.
15. System gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Vor
richtung zum Erhitzen eines oder mehrerer der Reaktionsräume der
Vorrichtung des Anspruchs 1 enthält.
16. System gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder
mehrere Magneten enthält, die in der Nähe des ersten und/oder zweiten
Reaktionsraumes positioniert werden können.
17. Modul für die Behandlung von nukleinsäurehaltigen Flüssigkeiten, ent
haltend
- - einen Behandlungsraum
- - einen flüssigkeitsdichten Verschluß, der durch Einwirkung von Vakuum von außen auf den Verschluß geöffnet werden kann.
18. Modul gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Verschluß
ein am Boden des Behandlungsraums angebrachtes Ventil ist.
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DE4420732A DE4420732A1 (de) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe |
AT95108929T ATE234155T1 (de) | 1994-06-15 | 1995-06-09 | Verfahren und vorrichtung zur behandlung von nukleinsäuren aus einer probe |
DE59510578T DE59510578D1 (de) | 1994-06-15 | 1995-06-09 | Verfahren und Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe |
EP95108929A EP0687502B1 (de) | 1994-06-15 | 1995-06-09 | Verfahren und Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4420732A DE4420732A1 (de) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DE4420732A1 true DE4420732A1 (de) | 1995-12-21 |
Family
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DE4420732A Withdrawn DE4420732A1 (de) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe |
DE59510578T Expired - Lifetime DE59510578D1 (de) | 1994-06-15 | 1995-06-09 | Verfahren und Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe |
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EP (1) | EP0687502B1 (de) |
JP (1) | JP3130449B2 (de) |
AT (1) | ATE234155T1 (de) |
DE (2) | DE4420732A1 (de) |
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