EP2564195A1 - Bestimmung von wechselwirkungen zwischen einer substanz oder einem substanzgemisch und einem target - Google Patents

Bestimmung von wechselwirkungen zwischen einer substanz oder einem substanzgemisch und einem target

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EP2564195A1
EP2564195A1 EP11716236A EP11716236A EP2564195A1 EP 2564195 A1 EP2564195 A1 EP 2564195A1 EP 11716236 A EP11716236 A EP 11716236A EP 11716236 A EP11716236 A EP 11716236A EP 2564195 A1 EP2564195 A1 EP 2564195A1
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EP
European Patent Office
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substance
target
sample
buffer solution
mixture
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11716236A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hinnerk Boriss
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Sovicell GmbH
Original Assignee
Sovicell GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Sovicell GmbH filed Critical Sovicell GmbH
Publication of EP2564195A1 publication Critical patent/EP2564195A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining interactions between a substance or mixture of substances and a potential target and to a device which can be used in such a method.
  • a target is known to be a target compound or a target receptor to which, for example, can bind active or harmful substances.
  • targets to be investigated in particular biological targets such as proteins, - -
  • Enzymes antibodies, biological membranes or whole cells of interest.
  • a method for determining binding constants and distribution coefficients on membranes is known from DE 198 14 775.
  • solid-supported membranes are contacted with an aqueous solution of the substance to be assayed and incubated for a time sufficient to bind the solute to the membrane surface. Thereafter, the solid supported membranes are separated from the solution (e.g., by sedimentation).
  • the concentration of the substance to be investigated is determined in the remaining solution (supernatant) or optionally also in the separated solid-supported membranes by suitable measuring methods, namely for several different proportions of solid-supported membrane to substance to be examined.
  • the method according to the invention serves to determine interactions between a substance or a mixture of substances and a target.
  • a substance or a mixture of substances are suitable as target.
  • targets but also synthetic or semi-synthetic receptors of interest, such as lipid membrane model systems, as described in DE 198 14 775.
  • the substances or substance mixtures to be investigated may be, in particular, active ingredient molecules for pharmaceutical applications. Of course, it is also possible to investigate the effects of pollutants and pollutant mixtures on biological targets such as cells.
  • a method according to the invention always comprises at least the following steps:
  • the first and the second sample are incubated with different amounts of substance of the target, whereas, however, all sample containers in the incubation contain the same amount of buffer solution and preferably the same amount of substance to be examined substance or the substance mixture to be examined.
  • the total volume of the samples to be incubated (volume of the buffer solution + volume of the carrier together with the target immobilized thereon) varies.
  • the inventive method therefore provides much more reliable information about the interactions between a substance or a mixture of substances and a target, as is the case with conventional methods.
  • the support on which the target is immobilized is preferably a support that is insoluble in aqueous solution. It may consist of organic or inorganic material, in the latter case in particular metal oxides such as silica and alumina, silicates, aluminates, borates or zeolites are mentioned. Metals and precious metals can also be used in principle.
  • the carrier is particularly preferably particulate, ie in the form of particles. These particles usually have sizes in the ⁇ range, but may optionally be at least partially nanoscale.
  • the support in particular the particles, may be non-porous or even porous, the latter generally being associated with a significant increase in the usable support surface area (an "outer” surface formed by the outside of the support may still be added) usable “inner” surface in the form of pore walls added).
  • Targets can be immobilized on the outer as well as possibly also on the inner surface of the carrier in the usual way.
  • the preparation of immobilized target carriers of this kind is known to the person skilled in the art and described in detail, for example, for lipid membrane model systems as targets in the earlier DE 100 48 822 of the Applicant.
  • lipid membranes or lipid bilayers are immobilized as a target on a particulate carrier. These preferably surround the carrier particles at least partially, preferably completely.
  • the lipids are brain tissue lipids, i. to those that occur in the brain tissue of animals or humans.
  • said brain tissue lipids are derived from brain tissue extracts.
  • the corresponding lipids or extracts are known to the person skilled in the art and can be obtained commercially from various companies.
  • the separation of the carrier can be carried out, for example, by filtration or centrifugation and, if appropriate, subsequent decantation of the buffer solution.
  • carrier particles with magnetic properties can also be used. These can easily be separated from the buffer solution by applying a magnetic field.
  • aqueous solutions containing saline such as are customary and commercially available for biological applications, are used as the buffer solution.
  • a distribution coefficient and / or a binding constant is usually determined to determine interactions between the substance under investigation or the substance mixture investigated and the target.
  • the necessary mathematical instruments are known from the literature.
  • concentration values measured for different molar amounts of the target are required, which can be obtained according to the invention by measuring the concentration of the substance or of the substance mixture in the supernatant of the first and the second sample container. Basically, however, the error rate decreases the more concentration values can be used for the determination.
  • At least one further sample of the substance or the substance mixture is particularly preferred with the sample container containing at least one further buffer solution, preferably immobilized on a solid, preferably particulate carrier 1 - 10 additional buffer solution containing sample containers, incubated.
  • the further sample or the further samples are incubated with in each case different amounts of substance of the target, which in particular also depend on the corresponding target substance quantities in the first and in the second sample container. - - divorce.
  • the sample containers always contain the same amount of buffer solution during incubation as the first and the second sample container.
  • concentration of the substance or of the substance mixture in the respective supernatant is determined relative to at least one reference sample.
  • a reference sample is, in particular, a sample which contains only buffer solution and the substance or substance mixture to be investigated.
  • a device comprises a first and a second sample container, each containing a target immobilized on a solid, particulate carrier substance and buffer solution, wherein the first and the second sample container contain different amounts of substance of the target but the same amount of buffer solution.
  • the device may in particular be a microtiter plate.
  • the sample containers are correspondingly preferably the wells of a microtiter plate.
  • the substance samples can be incubated with a target.
  • the method according to the invention can be carried out particularly well with the aid of a microtiter plate which comprises at least a first and a second cavity, each containing a target immobilized on a solid, particulate carrier substance (as described above) and buffer solution.
  • the first and the second cavity contain different amounts of substance of the target but the same amount of buffer solution.
  • the wells of the microtiter plate thus form the sample containers.
  • microtiter plates are usually rectangular and consist of plastics such as polystyrene, polypropylene or polyvinyl chloride, for very special applications also made of glass. They contain a variety of - - wells which are usually isolated in rows and columns, the exact dimensions (length ⁇ width ⁇ height) are preferably 127.76 mm ⁇ 85.48 mm ⁇ 14.35 mm are a variety of formats, which usually always the same base area, but in part have a variable height, for example, there are microtiter plates
  • microtiter plate according to the invention can be present in all these constitutional and form variants.
  • the microtiter plate according to the invention preferably also has at least one further cavity, preferably between 1 and 10 further cavities, which are filled with the same amount of buffer solution as the first and the second cavity.
  • This at least one further cavity or one or a part of the further cavities can serve as the reference already mentioned above. In this case, they are or will be filled to perform the method according to the invention with the same amount of substance to be examined substance or substance mixture to be examined as the first and the second cavity, but are free of the immobilized target.
  • the at least one further cavity or one or a part of the further cavities can also be used to determine additional - -
  • Concentration values serve to lower the mentioned error rate when determining a distribution coefficient and / or a binding constant. In this case, they contain not only the same amount of buffer solution as the first and the second cavity nor a defined amount of substance of the immobilized target, but must deviate from the corresponding amounts of substance in the first and in the second cavity. To carry out the method according to the invention, they are then likewise filled with the same amount of substance to be examined substance or substance mixture to be examined as the first and the second cavity.
  • the sample containers are individual containers which are arranged removably on a holder.
  • the individual vessels may be, for example, simple Eppendorf -Tu bes, the holder to a frame or a shelf.
  • the holder preferably has the dimensions of a microtiter plate. Reference is made to the corresponding statements on the possible dimensions of a microtiter plate according to the invention.
  • the individual vessels can also be a container made of glass, in particular a glass vial. For example, silanized glass vessels are particularly suitable for - -
  • HSA human serum albumin
  • the HSA was fixed on the surface of silica beads as a carrier suspended in buffer solution (HSA suspension on carrier). - -
  • HSA human serum albumin
  • [A] stands for the concentration of unbound test substance
  • [B] for the concentration of HSA
  • [AB] for the concentration of the HSA test substance complex.
  • the concentration of unbound test substance can also be described as the product of the relative proportion of unbound test substance f u and sum of free and bound concentration of HSA:
  • / b stands for the relative proportion of bound ligand.
  • the binding parameter K D can thus be determined exactly and robustly.
  • measurement-related outliers can be easily recognized.
  • the unconformity method for outlier detection can be applied in linear regression.
  • the quality of the adaptation of the measured data to the binding model can be checked well, since the axis distance of the regression model should be zero. Deviations from this point to errors in the experiment, or indicate that the simple non-cooperative binding model is insufficient to describe the data.
  • the reciprocal of the free concentration versus the ligand concentration can be plotted.
  • the intercept of this plot corresponds to the reference concentration in the test system without ligand. If the reference concentration thus determined agrees with the reference concentration determined by measurement technology, then a good model adaptation is present.
  • the binding constant can then be determined from the regression of the quotient b / / u against the free receptor concentration.
  • the reciprocal of the slope corresponds to the binding constant K D.
  • the binding constants can be determined to membranes, if the molarity of Membraniipide is known.
  • the membrane affinity can be determined as a measure of the binding to membranes.
  • the membrane affinity (MA) is - defined as the ratio of the concentration of a test substance in the lipid to the concentration of the test substance in the buffer: c (lipid)
  • the membrane affinity corresponds to the slope of the regression model plus 1. Since the axis section of the regression model corresponds to the volume in the assay (volume of the buffer plus volume of the lipid), this model also has an internal quality control.
  • the brain lipids were fixed on the surface of silica beads as carriers suspended in buffer solution (supported lipid suspension).

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen einer Substanz oder einem Substanzgemisch und einem Target. Bei dem Verfahren werden zumindest eine erste und eine zweite Probe der Substanz oder des Substanzgemisches mit dem auf einem festen Träger immobilisierten Target inkubiert. Die Inkubation erfolgt jeweils in einem Probenbehältnis. Dabei werden die erste und die zweite Probe mit unterschiedlichen Stoffmengen des Targets inkubiert, wohingegen aber alle Probenbehältnisse bei der Inkubation die gleiche Menge Pufferlösung enthalten. Nach der Inkubation wird der feste Träger samt des darauf immobilisierten Targets und gegebenenfalls samt daran gebundener Substanz von den Pufferlösungen abgetrennt. Anschließend wird die Konzentration der Substanz oder des Substanzgemisches im jeweiligen Überstand gemessen. Weiterhin wird eine Vorrichtung beschrieben, mit der ein solches Verfahren durchgeführt werden kann. Sie umfasst zumindest ein erstes und ein zweites Probenbehältnis, jeweils enthaltend ein auf einer festen, partikulären Trägersubstanz immobilisiertes Target sowie Pufferlösung, wobei das erste und das zweite Probenbehältnis unterschiedliche Stoffmengen des Targets aber die gleiche Menge an Pufferlösung enthalten.

Description

Beschreibung
Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen einer Substanz oder einem Substanzgemisch und einem Target
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen einer Substanz oder einem Substanzgemisch und einem potentiellen Target sowie eine Vorrichtung, die in einem solchen Verfahren Verwendung finden kann.
Die Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen einer Substanz oder einem Substanzgemisch und einem Target spielt eine große Rolle in der pharmazeutischen und in der pharmakologischen Forschung. Beide Forschungsgebiete befassen sich mit Wechselwirkungen zwischen Substanz oder Substanzgemischen und Lebewesen. Dabei ist es essentiell, die Bindungseigenschaften einzelner Substanzen mit Bindungskonstanten oder Verteilungskoeffizienten zu quantifizieren. Bei einem Target handelt es sich bekanntlich um eine Zielverbindung oder einen Zielrezeptor, an den z.B. Wirk- oder Schadstoffe binden können. Als zu untersuchende Targets sind insbesondere biologische Targets wie Proteine, - -
Enzyme, Antikörper, biologische Membranen oder ganze Zellen von Interesse.
Ein Verfahren zur Bestimmung von Bindungskonstanten und Verteilungskoeffizienten an Membranen ist aus der DE 198 14 775 bekannt. Bei diesem Verfahren werden festkörperunterstützte Membranen mit einer wässrigen Lösung der zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht und für eine zur Bindung der gelösten Substanz an die Membranoberfläche ausreichende Zeit inkubiert. Danach werden die festkörperunterstützten Membranen aus der Lösung abgetrennt (z.B. durch Sedimentation). Die Konzentration der zu untersuchenden Substanz wird in der verbleibenden Lösung (Überstand) oder gegebenenfalls auch in den separierten festkörperunterstützten Membranen durch geeignete Messverfahren bestimmt, und zwar für mehrere verschiedene Mengenverhältnisse von festkörperunterstützter Membran zu zu untersuchender Substanz. Dazu können entweder unterschiedliche Mengen der auf Bindung zu untersuchenden Substanz in einheitlichen Lösungsvolumina mit immer derselben Menge an festkörperunterstützter Membran inkubiert werden oder die festkörperunterstützte Membran wird in unterschiedlichen Konzentrationen in einheitlichen Lösungsvolumina mit der zu untersuchenden Substanz in jeweils identischer Konzentration versetzt. Das Gesamtvolumen der zu inkubierenden Probe, das sich im Wesentlichen aus dem Volumen der Pufferlösung, in der die zu untersuchende Substanz oder das zu untersuchende Substanzgemisch gelöst ist, und dem Volumen des Trägermaterials mit der darauf aufgebrachten Membran zusammensetzt, wurde dabei stets konstant gehalten.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen einer Substanz oder einem Substanzgemisch und einem Target bereitzustellen, das gegenüber dem aus der DE 198 14 775 bekannten Verfahren optimiert ist. - -
Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 4 angegeben. Weiterhin trägt auch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 5 zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe bei. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den abhängigen Ansprüchen 6 und 7 angegeben. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient wie das aus der DE 198 14 775 bekannte Verfahren zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen einer Substanz oder einem Substanzgemisch und einem Target. Als Target kommen dabei insbesondere biologische Membranen, Proteine und Nukleinsäuren in Frage. Gleichermaßen sind als Targets aber auch synthetische oder halbsynthetische Rezeptoren von Interesse, beispielsweise Lipidmembranmodellsysteme, wie sie in der DE 198 14 775 beschrieben sind. Bei den zu untersuchenden Substanzen oder Substanzgemischen kann es sich insbesondere um Wirkstoffmoleküle für pharmazeutische Anwendungen handeln. Es können aber natürlich auch die Einflüsse von Schadstoffen und Schadstoffgemischen auf biologische Targets wie Zellen untersucht werden.
Ein erfindungsgemäßen Verfahren umfasst stets zumindest die folgenden Schritte:
1. Inkubieren einer ersten Probe der zu untersuchenden Substanz oder des zu untersuchenden Substanzgemisches mit einem Target in einem ersten, Pufferlösung enthaltenden Probenbehältnis. Das Target ist dabei stets auf einem festen, vorzugsweise partikulären Träger immobilisiert. - -
2. Inkubieren einer zweiten Probe der zu untersuchenden Substanz oder des zu untersuchenden Substanzgemisches mit dem Target in einem zweiten, Pufferlösung enthaltenden Probenbehältnis. Auch in diesem Fall ist das Target stets auf einem festen, vorzugsweise partikulären Träger immobilisiert.
3. Abtrennen des Trägers samt des darauf immobilisierten Targets sowie gegebenenfalls daran gebundener Substanz von der in den Probenbehältnissen enthaltenen Pufferlösung. Letztere enthält den nicht an das Target gebundenen Anteil der zu untersuchenden Substanz oder des zu untersuchenden Substanzgemisches.
4. Messung der Konzentration der Substanz oder des Substanzgemisches im jeweiligen Überstand, also in der jeweils verbleibenden Pufferlösung.
Dabei werden die erste und die zweite Probe mit unterschiedlichen Stoffmengen des Targets inkubiert, wohingegen jedoch alle Probenbehältnisse bei der Inkubation die gleiche Menge Pufferlösung sowie vorzugsweise die gleiche Stoffmenge der zu untersuchenden Substanz bzw. der zu untersuchenden Substanzmischung enthalten. Daraus resultiert, dass im Unterschied zu der aus dem eingangs zitierten Stand der Technik bekannten Vorgehensweise das Gesamtvolumen der zu inkubierenden Proben (Volumen der Pufferlösung + Volumen des Trägers samt des darauf immobilisierten Targets) variiert.
Wie oben erwähnt, wurde bei dem in der DE 198 14 775 beschriebenen Verfahren das Gesamtvolumen aus Puffervolumen und dem Volumen des Trägermaterials stets konstant gehalten. Mit Zunahme der Konzentration des Trägermaterials ergab sich entsprechend eine Verringerung des Puffervolumens. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass, obwohl das Volumen für das Trägermaterial im Verhältnis zum Puffervo- - - lumen in der Regel nur einen relativ kleinen Teil des Gesamtvolumens ausmacht, eine entsprechende Verringerung des Puffervolumens zum Teil zu sehr deutlichen Fehlern bei der Bestimmung von Bindungskonstanten und Verteilungskoeffizienten führen kann. Der Grund dafür liegt offensichtlich darin, dass der Target-Substanz-Bindungsprozess in vielen Fällen deutlich stärker konzentrationsabhängig verläuft, als dies bislang angenommen wurde.
Durch die erfindungsgemäße Vorgehensweise unter Konstanthaltung der Menge an Pufferlösung in den verwendeten Probenbehältnissen konnte diese Fehlerquelle beseitigt werden. Im Ergebnis liefert das erfindungsgemäße Verfahren daher wesentlich zuverlässigere Aussagen über die Wechselwirkungen zwischen einer Substanz oder einem Substanzgemisch und einem Target, als dies bei herkömmlichen Verfahren der Fall ist.
Bei dem Träger, auf dem das Target immobilisiert ist, handelt es sich bevorzugt um einen Träger, der in wäßriger Lösung unlöslich ist. Er kann aus organischem oder auch anorganischem Material bestehen, wobei im letzteren Fall insbesondere Metalloxide wie Siliziumdioxid und Aluminiumoxid, Silikate, Aluminate, Borate oder Zeolithe zu nennen sind. Auch Metalle und Edelmetalle sind grundsätzlich einsetzbar.
Wie bereits erwähnt, liegt der Träger besonders bevorzugt partikulär, also in Form von Teilchen, vor. Diese Teilchen weisen üblicherweise Größen im μιη-Bereich auf, können aber gegebenfalls auch zumindest teilweise nanoskalig sein. Der Träger, insbesondere die Teilchen, können nicht-porös oder auch porös sein, wobei letzteres in der Regel mit einer deutlichen Vergrößerung der nutzbaren Trägeroberfläche einhergeht (zu einer„äußeren" Oberfläche, die von der Außenseite des Trägers gebildet wird, kommt gegebenfalls noch eine nutzbare „innere" Oberfläche in Form der Porenwände hinzu). - -
Auf der äußeren sowie gegebenenfalls auch auf der inneren Oberfläche des Trägers können Targets auf fachübliche Art und Weise immobilisiert werden. Die Herstellung derartiger Träger mit immobilisierten Targets ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise für Lipidmembranmodell- systeme als Targets in der älteren DE 100 48 822 der Anmelderin ausführlich beschrieben.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind auf einem partikulären Träger Lipidmembranen bzw. Lipiddoppelschichten als Target immobilisiert. Diese umgeben die Trägerteilchen bevorzugt mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Lipiden um Hirngewebe- Lipide, d.h. um solche, die im Hirngewebe von Tieren oder auch von Menschen vorkommen. Vorzugsweise stammen die genannten Hirnge- webe-Lipide aus Hirngewebsextrakten. Die entsprechenden Lipide bzw. Extrakte sind dem Fachmann bekannt und können von verschiedenen Firmen kommerziell bezogen werden.
Das Abtrennen des Trägers kann beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation und gegebenfalls anschließendes Dekantieren der Pufferlösung erfolgen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch Trägerpartikel mit magnetischen Eigenschaften zum Einsatz kommen. Diese können problemlos durch Anlegen eines magnetischen Feldes von der Pufferlösung separiert werden.
Für die Messung der Konzentration der Substanz oder des Substanzgemisches im jeweiligen Überstand stehen zahlreiche bekannte Analytikverfahren zur Verfügung. Beispielhaft seien an dieser Stelle mas- senspektrometrische oder fluoreszenzspektroskopische Verfahren er- - - wähnt, die gegebenfalls mit einem chromatographischen Verfahren gekoppelt werden können.
Als Pufferlösung kommen im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens insbesondere wässrige, salzhaltige Lösungen zum Einsatz, wie sie für biologische Anwendungen üblich und kommerziell erhältlich sind.
Aus den gemessenen Substanzkonzentrationen wird zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen der untersuchten Substanz oder dem untersuchten Substanzgemisch und dem Target in der Regel ein Verteilungskoeffizient und/oder eine Bindungskonstante bestimmt. Das dazu notwendige mathematische Instrumentarium ist aus der Literatur bekannt.
Zur Bestimmung einer Bindungskonstante werden mindestens zwei für unterschiedliche Stoffmengen des Targets gemessene Konzentrationswerte benötigt, die erfindungsgemäß durch Messung der Konzentration der Substanz oder des Substanzgemisches im Überstand des ersten und des zweiten Probenbehältnisses erhalten werden können. Grundsätzlich sinkt jedoch die Fehlerquote je mehr Konzentrationswerte zur Bestimmung herangezogen werden können.
Besonders bevorzugt wird daher zusätzlich zur ersten und zur zweiten Substanzprobe mindestens eine weitere Probe der Substanz oder des Substanzgemisches, vorzugsweise zwischen 1 und 10 weitere Proben, mit dem auf einem festen, vorzugsweise partikulären Träger immobilisierten Target in mindestens einem weiteren Pufferlösung enthaltenden Probenbehältnis, vorzugsweise in 1 - 10 weiteren Pufferlösung enthaltenden Probenbehältnissen, inkubiert. Die weitere Probe oder die weiteren Proben werden dabei mit jeweils unterschiedlichen Stoffmengen des Targets inkubiert, die sich insbesondere auch von den entsprechenden Targetstoffmengen im ersten und im zweiten Probenbehältnis unter- - - scheiden. Stets enthalten die Probenbehältnisse bei der Inkubation jedoch die gleiche Menge an Pufferlösung wie das erste und das zweite Probenbehältnis.
Es ist bevorzugt, dass die Konzentration der Substanz oder des Substanzgemisches im jeweiligen Überstand relativ zu mindestens einer Referenzprobe bestimmt wird. Bei einer solchen Referenzprobe handelt es sich insbesondere um eine Probe, die nur Pufferlösung und zu untersuchende Substanz oder zu untersuchende Substanzmischung enthält.
Eine erfindungesgemäße Vorrichtung umfasst ein erstes und ein zweites Probenbehältnis, jeweils enthaltend ein auf einer festen, partikulären Trägersubstanz immobilisiertes Target sowie Pufferlösung, wobei das erste und das zweite Probenbehältnis unterschiedliche Stoffmengen des Targets aber die gleiche Menge an Pufferlösung enthalten.
Bei der Vorrichtung kann es sich insbesondere um eine Mikrotiterplatte handeln. Bei den Probenbehältnissen handelt es sich entsprechend bevorzugt um die Kavitäten einer Mikrotiterplatte. In diesen können die Substanzproben mit einem Target inkubiert werden. Besonders gut lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer Mikrotiterplatte durchführen, die zumindest eine erste und eine zweite Kavität umfasst, die jeweils ein auf einer festen, partikulären Trägersubstanz immobilisiertes Target (wie es oben beschrieben wurde) sowie Pufferlösung enthalten. Entsprechend den obigen Ausführungen enthalten die erste und die zweite Kavität dabei unterschiedliche Stoffmengen des Targets aber die gleiche Menge an Pufferlösung. Die Kavitäten der Mikrotiterplatte bilden somit die Probenbehältnisse.
Übliche Mikrotiterplatten sind meist rechteckig und bestehen aus Kunststoffen wie Polystyrol, Polypropylen oder Polyvinylchlorid, für sehr spezielle Anwendungen auch aus Glas. Sie enthalten eine Vielzahl von - - voneinander isolierte Kavitäten (engl, „wells"), die üblicherweise in Reihen und Spalten angeordnet sind. Die genauen Abmessungen (Länge χ Breite χ Höhe) betragen vorzugsweise 127,76 mm χ 85,48 mm χ 14,35 mm. Es gibt eine Vielzahl an Formaten, die in der Regel stets die gleiche Grundfläche, zum Teil aber eine variable Höhe aufweisen, z.B. gibt es Mikrotiterplatten mit
- 6 Kavitäten (2x3), Füllvolumen jeweils zwischen 2-5 ml
12 Kavitäten (3x4), Füllvolumen jeweils zwischen 2-4 ml
- 24 Kavitäten (4x6), Füllvolumen jeweils zwischen 0,5-3 ml
- 96 Kavitäten (8x12), Füllvolumen jeweils zwischen 0,3-2 ml
- 384 Kavitäten (16x24), Füllvolumen jeweils zwischen 0,03-0,1 ml
- 1536 Kavitäten (32x48), Füllvolumen jeweils ca.0,01 ml.
Die erfindungsgemäße Microtiterplatte kann in all diesen Beschaffen- heits- und Formvarianten vorliegen.
Bevorzugt weist die erfindungsgemäße Microtiterplatte neben der ersten und der zweiten Kavität noch mindestens eine weitere Kavität, vorzugsweise zwischen 1 und 10 weitere Kavitäten, auf, die mit der gleichen Menge Pufferlösung befüllt sind wie die erste und die zweite Kavität.
Diese mindestens eine weitere Kavität oder eine oder ein Teil der weiteren Kavitäten kann als die oben bereits angesprochene Referenz dienen. In diesem Fall wird bzw. werden sie zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der gleichen Stoffmenge an zu untersuchender Substanz bzw. an zu untersuchender Substanzmischung befüllt wie die erste und die zweite Kavität, sind jedoch frei von dem immobilier- ten Target.
Natürlich kann die mindestens eine weitere Kavität oder eine oder ein Teil der weiteren Kavitäten jedoch auch zur Bestimmung zusätzlicher - -
Konzentrationswerte dienen, um die erwähnte Fehlerquote bei der Bestimmung eines Verteilungskoeffizienten und/oder einer Bindungskonstante zu senken. In diesem Fall enthalten sie neben der gleichen Menge an Pufferlösung wie die erste und die zweite Kavität noch eine definierte Stoffmenge des immobilisierten Targets, die allerdings von den entsprechenden Stoffmengen in der ersten und in der zweiten Kavität abweichen muss. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden sie dann ebenfalls mit der gleichen Stoffmenge an zu untersuchender Substanz bzw. an zu untersuchender Substanzmischung befüllt wie die erste und die zweite Kavität.
In einer solchen Microtiterplatte könne grundsätzlich eine Vielzahl von einzelnen Proben gleichzeitig inkubiert werden. Auch die Bestimmung von Substanzkonzentrationen in den einzelnen Kavitäten einer solchen Platte kann simultan erfolgen.
Die einzelnen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens müssen somit keineswegs alle sequentiell durchgeführt werden, insbesondere sämtliche Inkubationsschritte und/oder Konzentrationsbestimmungen erfolgen bevorzugt simultan.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Probenbehältnissen um Einzelgefäße, die entnehmbar auf einem Halter angeordnet sind. Bei den Einzelgefäßen kann es sich beispielsweise um einfache Eppendorf -Tu bes handeln, bei dem Halter um ein Gestell oder eine Ablageplatte. Der Halter weist bevorzugt die Abmessungen einer Mikrotiterplatte auf. Auf die entprechenden Ausführungen zu den möglichen Abmessungen einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte wird Bezug genommen. Weiterhin kann es sich bei den Einzelgefäßen auch um ein Behältnis aus Glas, insbesondere um ein Glasfläschchen, handeln. Beispielsweise sind silanisierte Glasgefäße besonders geeignet für - -
Testsubstanzen, die eine starke Affinität zu Kunststoffoberflächen aufweisen.
Die genannten und weiteren Vorteile der Erfindung ergeben sich auch aus der nun folgenden Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dabei können die einzelnen Merkmale der Erfindung für sich allein oder in Kombination miteinander verwirklicht sein. Die beschriebenen Ausführungsformen dienen lediglich zur Erläuterung und zum besseren Verständnis der Erfindung und sind in keiner Weise einschränkend zu verstehen.
Zur Bestimmung der Affinität von Testsubstanzen an humanes Serum- Albumin (HSA) wurden 7 Kavitäten einer 96-well Microtiterplatte wie folgt befüllt:
Das HSA war auf der Oberfläche von Silicakügelchen als Träger fixiert, die in Pufferlösung suspendiert waren (HSA-Suspension auf Träger). - -
Zu diesen Kavitäten wurden jeweils 18 μΙ_ einer 20 μΜ Stammlösung einer Testsubstanz hinzugegeben. Als Testsubstanz diente z.B. De- sipramin. Nach Mischen durch Resuspension wurden die Silicakügel- chen samt dem darauf fixierten HSA abgetrennt. Die Konzentration der Testsubstanz in den Überständen wurde durch ein massenspektrometri- sches Verfahren (LCMS) bestimmt. Der Anteil an ungebundener Testsubstanz in den Kavitäten mit dem auf dem Träger immobilisierten HSA wurde relativ zu den Referenzen bestimmt (durch Verwendung der Referenzen kann eine Kalibrierung entfallen, zumindest solange die Beziehung von Signal zu Konzentration für die Testsubstanzen und das genutzte Quantifizierungssystem linear verläuft).
Die Affinität der Testsubstanz an humanes Serum-Albumin (HSA) lässt sich durch folgendes Standard-Bindungsmodell beschreiben:
[A][B]
[AB]
Dabei steht [A] für die Konzentration an ungebundener Testsubstanz, [B] für die Konzentration an HSA und [AB] für die Konzentration des HSA-Testsubstanz-Komplexes.
Die Konzentration an ungebundener Testsubstanz kann auch als Produkt des relativen Anteils an ungebundener Testsubstanz fu und Summe aus freier und gebundener Konzentration von HSA beschrieben werden:
[A] = fu - ([A] + [B])
Durch Umformung ergibt sich die folgende lineare Gleichung: - -
In dieser Gleichung steht /b für den relativen Anteil des gebunden Liganden.
Durch Auftragung des Verhältnisses b / /u gegen die Rezeptorkonzentration [ß] last sich somit der Bindungsparameter KD exakt und robust bestimmen. Insbesondere lassen sich gemäß dieser Vorgehensweise meßtechnisch bedingte Ausreißer gut erkennen. Dazu kann die Diskordanzmethode zur Ausreißererkennung in linearer Regression angewendet werden. Weiterhin läßt sich so die Qualität der Anpassung der Meßdaten an das Bindungsmodell gut überprüfen, da der Achsenab- schitt des Regressionsmodells Null sein sollte. Abweichungen davon deuten auf Fehler im Experiment hin, oder zeigen an, dass das einfache nicht-kooperative Bindungsmodell nicht ausreichend ist, um die Daten zu beschreiben.
Zur weiteren Qualitätskontrolle der Anpassung der in dem Experiment gemessenen Konzentrationen an das Bindungsmodell kann der Kehrwert der freien Konzentration gegen die Ligandenkonzetration aufgetragen werden. Der Achsenabschnitt dieser Auftragung entspricht der Referenzkonzentration im Testsystem ohne Ligand. Stimmt die so bestimmte Referenzkonzentration mit der meßtechnisch bestimmten Referenzkonzentration überein, so liegt eine guten Modellanpassung vor.
Die Bindungskonstante kann dann aus der Regression des Quotienten b / /u gegen die freie Rezeptorkonzentration bestimmt werden. Der Kehrwert der Steigung entspricht der Bindungskonstante KD.
Nach dem gleichen Prinzip können die Bindungskonstanten zu Membranen bestimmt werden, wenn die Molarität der Membraniipide bekannt ist. Alternativ kann aber auch die Membranaffinität als Maß für die Bindung an Membranen bestimmt werden. Die Membranaffinität (MA) ist - - definiert als das Verhältnis der Konzentration einer Testsubstanz im Lipid zur Konzentration der Testsubstanz im Puffer: c(Lipid)
MA
c(Puffer)
Aus der Summenformel für die Stoffmenge nt = c(Lipid)■ V {Lipid) + c(Puffer)■ (V(Assay) - V (Lipid)) läßt sich eine Formel ableiten, mit der die Membranaffinität experimentell bestimmt werden kann: c(Lipid)
V (Lipid) + V(Assay)
c(Puffer) \ c(Puffer)
Dies ist eine lineare Beziehung in Abhängkeit vom Lipidvolumen. Die Membranaffinität entspricht der Steigung des Regressionsmodells plus 1. Da der Achsenabschitt des Regressionsmodells dem Volumen im As- say (Volumen des Puffers zuzüglich Volumen des Lipids) entspricht, liegt auch in diesem Modell eine interne Qualitätskontrolle vor.
Zur Bestimmung der Membranaffinität MA von Testsubstanzen an Hirn- lipide wurden 7 Kavitäten einer 96-well Mikrotiterplatte wie folgt befüllt:
Kavität
1 2 3 4 5 6 7
Referenz
Referenz 1 V1 Lipid V2 Lipid V3 Lipid V4 Lipid V5 Lipid 2
Volumen: Lipid-Suspension
auf Träger 0.0 μΙ_ 1 1 .9 μΐ 21 .2 μΐ 37.7 μΐ 67.1 μΐ 1 19.4 μΐ 0.0 μΐ
Volumen: Träger 0.0 μΙ_ 1.4 μΐ 2.6 μΐ 4.5 μΐ 8.1 μΐ 14.4 μΐ 0.0 μί
Columen: Lipid 0.0 μΙ_ 0.1 μΐ 0.2 μΐ 0.4 μΐ 0.7 μΐ 1.2 μΐ 0.0 μί
Volumen: Puffer in Suspension 0.0 μΙ_ 10.3 μΐ 18.4 μΐ 32.8 μΐ 58.3 μΐ 103.8 μΐ 0.0 μΐ
Volumen: Zugabe Puffer 146.4 μΙ_ 136.1 μΐ 128.0 μΐ 1 13.6 μΐ 88.1 μΐ 42.6 μΐ 146.4 μί
Assay-Volumen 164.4 μΙ_ 164.5 μΐ 164.6 μΐ 164.8 μΐ 165.1 μΐ 165.6 μΐ 164.4 μΐ
Puffer-Volumen 164.4 μΙ_ 164.4 μΐ 164.4 μΐ 164.4 μΐ 164.4 μΐ 164.4 μί 164.4 μί
Gesamtvolumen inkl. Trägermaterial 164.4 μΙ_ 166.0 μΐ 167.2 μΐ 169.3 μΐ 173.2 μΐ 180.0 μΐ 164.4 μί - -
Die Hirnlipide waren auf der Oberfläche von Silicakügelchen als Träger fixiert, die in Pufferlösung suspendiert waren (Lipid-Suspension auf Träger).
Zu diesen Kavitäten wurden jeweils 18 μΙ_ einer 20 μΜ Stammlösung der Testsubstanz hinzugegeben. Nach Mischen durch Resuspension wurden die Silicakügelchen mit den darauf fixierten Hirnlipiden abgetrennt. Die Konzentration der Testsubstanz in den Überständen wurde durch ein massenspektrometrisches Verfahren (LCMS) bestimmt. Der Quotient der Testsubstanz wurde dann für alle Kavitäten mit Lipid aus der relativen Änderung der Substanzkonzentration in den Kavitäten 2 bis 6 zu den Referenzen 1 und 7 bestimmt. Eine Kalibrierung kann entfallen, solange die Beziehung von Signal zu Konzentration für die Testsubstanzen und das genutzte Quantifizierungssystem linear verläuft. Die Membranaffinität konnte aus der Regression des obigen Quotienten gegen das Lipidvolumen ermittelt werden.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen einer Substanz oder einem Substanzgemisch und einem Target, umfassend die Schritte
• Inkubieren einer ersten Probe der Substanz oder des Substanzgemisches mit dem auf einem festen, vorzugsweise partikulären Träger immobilisierten Target in einem ersten, Pufferlösung enthaltenden Probenbehältnis,
• Inkubieren einer zweiten Probe der Substanz oder des Substanzgemisches mit dem auf einem festen, vorzugsweise partikulären Träger immobilisierten Target in einem zweiten, Pufferlösung enthaltenden Probenbehältnis,
• Abtrennen des Trägers samt des darauf immobilisierten Targets und gegebenenfalls daran gebundener Substanz von der in den Probenbehältnissen enthaltenen Pufferlösung und
• Messung der Konzentration der Substanz oder des Substanzgemisches im jeweiligen Überstand, wobei
• die erste und die zweite Substanzprobe mit unterschiedlichen Stoffmengen des Targets inkubiert werden und
• alle Probenbehältnisse bei der Inkubation die gleiche Menge Pufferlösung enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass aus den gemessenen Substanzkonzentrationen ein Verteilungskoeffizient und/oder eine Bindungskonstante bestimmt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur ersten und zur zweiten mindestens eine weitere Probe der Substanz oder des Substanzgemisches, vorzugsweise zwischen 1 und 10 weitere Proben, mit dem auf einem festen, vorzugsweise partikulären Träger immobilisierten Target in mindestens einem weiteren Pufferlösung enthaltenden Probenbehältnis, vorzugsweise in 1 - 10 weiteren Pufferlösung enthaltenden Probenbehältnissen, inkubiert wird, wobei
• die Proben mit unterschiedlichen Stoffmengen des Targets inkubiert werden und
• alle Probenbehältnisse bei der Inkubation die gleiche Menge Pufferlösung enthalten wie das erste und das zweite Probenbehältnis.
Verfahren nach einem vorhergehenden der Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Substanz oder des Substanzgemisches im jeweiligen Überstand relativ zu einer Referenzprobe bestimmt wird.
Vorrichtung, umfassend ein erstes und ein zweites Probenbehältnis, jeweils enthaltend ein auf einer festen, partikulären Trägersubstanz immobilisiertes Target sowie Pufferlösung, wobei das erste und das zweite Probenbehältnis unterschiedliche Stoffmengen des Targets aber die gleiche Menge an Pufferlösung enthalten.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Probenbehältnissen um die Kavitäten einer Mikroti- terplatte handelt.
7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Probenbehältnissen um Einzelgefäße handelt, die entnehmbar auf einem Halter angeordnet sind, der bevorzugt die Abmessungen einer Mikrotiterplatte aufweist.
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