DE19818485A1 - Reaktionsgefäße, beschichtet mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium, sowie Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Reaktionsgefäße, beschichtet mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium, sowie Verfahren zu deren Herstellung

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Abstract

Beschrieben werden Reaktionsgefäße, deren Oberfläche mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium beschichtet ist, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Testbestecke, enthaltend derartige Reaktionsgefäße. Die beschriebenen Reaktionsgefäße und Testbestecke eignen sich insbesondere zum Einsatz bei dem Nachweis von Katecholaminen in Körperproben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Reaktionsgefäße, deren Oberfläche mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium beschichtet ist, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Testbestecke enthaltend derartige Reaktionsgefäße.
Auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik besteht grund­ sätzlich das Bestreben, für die verschiedensten nachzuwei­ senden Substanzen kostengünstige, einfach zu handhabende, präzise und schnelle Nachweisverfahren und entsprechende Testbestecke zur Verfügung zu stellen. Ein wichtiges Feld stellt dabei im Rahmen der Diagnostik der Nachweis von Ka­ techolaminen, wie z. B. Adrenalin, Noradrenalin oder Dopamin, in Proben von Körperflüssigkeiten dar. Ein erster wichtiger Schritt bei diesen Nachweisverfahren ist die Extraktion der Katecholamine aus der jeweiligen Probe. Herkömmlicherweise werden für diese Extraktion, die eine wesentliche Reinigung und gleichzeitig eine Aufkonzentrierung bewirkt, Substanzen als Affinitätsliganden verwendet, welche die cis-Diol-Struk­ turen der Katecholamine erkennen, z. B. immobilisierte Bor­ säure oder Borsäurederivate (siehe z. B. Speek et al., Clinica Chimica Acta 128 (1983), 103-113 oder Gelijkens und De Leenheer, Journal of Chromatography 183 (1980), 78-82) oder Aluminiumoxid (siehe z. B. Cooper et al., Journal of Neuroscience Methods 22 (1987), 31-39 oder Refshauge et al., Life Sciences 14 (1974), 311-322). Gewöhnlicherweise wird dabei zur Extraktion die entsprechende Probe mit einem Affi­ nitätsmedium in Suspension gemischt, wobei sich das Medium auch in einer Chromatographiesäule oder einem anderen Gefäß befinden kann. Nach Waschen des Affinitätsmediums werden die daran gebundenen Substanzen wieder abgetrennt (siehe z. B. Mazzeo und Krull, Biochromatography 4 (1989), 124-130 und Hageman und Kuehn, Methods in Biology 11: Practical Protein Chromatography, Ed. Kennedy und Fowell, The Humana Press Inc. (1992), 45-71). Diese Vorgänge, die mehrere Zentrifuga­ tions-, Pipettierungs- bzw. Waschschritte umfassen, stellen eine erhebliche Fehlerquelle bei der präzisen Bestimmung der Konzentration der nachzuweisenden Substanz dar und sind dar­ über hinaus zeitintensiv.
Der vorliegenden Anmeldung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Verfügung zu stellen, die die Extraktion von nachzuweisenden Substanzen aus Proben vereinfachen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Reaktionsgefäß, dessen Oberfläche beschichtet ist mit einem cis-Diol-spezi­ fischen Affinitätsmedium.
Derartige Reaktionsgefäße erlauben es nun, den Extraktions­ schritt beim Nachweis von Substanzen mit cis-Diol-Struktur, wie z. B. Polyphenolen (z. B. Katecholaminen und Flavonoiden), 1,2-Hydroxysäuren, 1,2-Hydroxylaminen, Enzymen (z. B. Serin- Proteinasen) und anderen Proteinen (z. B. Albumin), Nuclein­ säuren (z. B. Nucleosiden, Nucleotiden und RNA's), Kohlen­ hydraten (z. B. Glucose) und anderen Verbindungen, die Koh­ lenhydrat-Strukturen enthalten, schneller und präziser durchzuführen. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reak­ tionsgefäße entfallen bei dem Extraktionsschritt alle Zen­ trifugationsschritte und die Pipettierungsschritte werden reduziert. Die Trennung der flüssigen von der festen Phase erfolgt in diesem Fall durch Dekantieren und Ausklopfen der Reaktionsgefäße auf einer saugfähigen Unterlage.
Der Begriff "Reaktionsgefäß" umfaßt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jede Art von herkömmlicherweise in der Diagnostik verwendeten Gefäßen, die zur Aufnahme einer Probe, insbesondere in flüssiger Form geeignet sind. Hierzu zählen beispielsweise jede Art von Zentrifugenröhrchen, Makro- oder Mikrotiterplatten, Multischalen, Zell- oder Ge­ webekulturplatten oder -schalen, Röhrchen, Flaschen oder Wannen. Das Volumen dieser Gefäße spielt dabei keine Rolle. Es liegt vorzugsweise in einem Bereich von 5 µl bis 100 ml, besonders bevorzugt in einem Bereich von 500 µl bis 5 ml und insbesondere in einem Bereich von 1,5 ml bis 2,5 ml. Die Re­ aktionsgefäße sollten vorzugsweise aus Kunststoff sein. Be­ vorzugt bestehen sie ganz oder teilweise aus Polystyrol.
Der Ausdruck "dessen Oberfläche beschichtet ist" bedeutet, daß zumindest der Großteil derjenigen Oberfläche, die mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt kommt, mit dem cis- Diol-spezifischen Affinitätsmedium beschichtet ist. "Be­ schichtet" bedeutet dabei, daß das Affinitätsmedium die Oberfläche des Reaktionsgefäßes überzieht und sich bei Kon­ takt mit der zu untersuchenden Probe nicht von dieser löst.
Unter dem Begriff "cis-Diol-spezifisches Affinitätsmedium" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Material ver­ standen, das aus einem Trägermaterial (Matrix) besteht; wel­ ches chemische Strukturen (Liganden) aufweist, die spezi­ fisch Substanzen mit einer cis-Diol-Struktur binden können. Das Trägermaterial ist dabei vorzugsweise ein Material wie es für die Herstellung von Chromatographie-Trennmedien ver­ wendet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Matrix des cis- Diol-spezifischen Affinitätsmediums Polyacrylamid.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das cis- Diol-spezifische Affinitätsmedium ein Boronat-Affinitätsgel. Ein derartiges Gel ist kommerziell erhältlich, z. B. unter der Bezeichnung Affi-Gel 601 (Firma BIO-RAD, Katalognr. 153-6101 und 153-6102).
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes umfas­ send die folgenden Schritte:
  • a) Inkontaktbringen des cis-Diol-spezifischen Affinitätsme­ diums mit der inneren Oberfläche des zu beschichtenden Reaktionsgefäßes;
  • b) Erwärmen des Reaktionsgefäßes; und
  • c) Abkühlen des Reaktionsgefäßes.
Das Inkontaktbringen mit dem Reaktionsgefäß gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorzugsweise derart, daß eine angemessene Menge des cis-Diol-spezifischen Affinitätsmediums in das Reaktionsgefäß gebracht wird und dort für einen längeren Zeitraum verbleibt. "Angemessene Menge" bedeutet dabei eine Menge, die geeignet ist, die Oberfläche des Reaktionsgefäßes zum gewünschten Ausmaß zu bedecken.
Das Inkontaktbringen nach Schritt (a) des Verfahrens kann sowohl derart erfolgen, daß das cis-Diol-spezifische Affini­ tätsmedium als solches direkt mit dem Reaktionsgefäß in Kon­ takt gebracht wird. Alternativ kann das Affinitätsmedium je­ doch auch mit anderen Feststoffen, z. B. anderen Affinitäts­ medien, Stabilisatoren, Füll- und Konservierungsstoffen, oder mit Gasen, z. B. Luft, Stickstoff oder Argon, gemischt werden und mit dem Reaktionsgefäß in Kontakt gebracht wer­ den. Vorzugsweise wird das cis-Diol-spezifische Affinitäts­ medium vor dem Inkontaktbringen mit dem Reaktionsgefäß mit einer Flüssigkeit gemischt und das Gemisch aus Affinitätsme­ dium und Flüssigkeit wird in das Reaktionsgefäß eingebracht. Das Mischen erfolgt dabei vorzugsweise derart, daß das cis- Diol-spezifische Affinitätsmedium unter ständigem Rühren zu einer Flüssigkeit gegeben wird. Das entstandene Gemisch wird dann vorzugsweise für längere Zeit, insbesondere für ca. 30 Minuten, weiter gerührt bis das Affinitätsmedium gut aufge­ schlämmt ist und eine optisch homogene, fein verteilte Mi­ schung des Affinitätsmediums in der Flüssigkeit vorliegt.
Flüssigkeiten, die in diesem Zusammenhang verwendet werden können, sind beispielsweise wäßrige Lösungen (z. B. Puffer), organische Lösungsmittel (z. B. Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Ether), Säuren und Laugen. Bei der Flüssigkeit handelt es sich vorzugsweise um Reinstwasser.
Wird das Affinitätsmedium mit einer Flüssigkeit gemischt, so wird nach Schritt (a) ein Trocknungsschritt durchgeführt, der gewährleistet, daß in dem Gemisch vorhandene Flüssigkeit weitgehend, vorzugsweise bis zu einer Restfeuchte von weni­ ger als 1% und besonders bevorzugt vollständig entfernt wird. Besonders bevorzugt wird das Trocknenlassen des in das Reaktionsgefäß eingebrachten Gemisches aus cis-Diol-spezifi­ schem Affinitätsgel und einer Flüssigkeit derart durchge­ führt, daß das mit dem Gemisch versehene Reaktionsgefäß über einen längeren Zeitraum, vorzugsweise für 5 Minuten bis 5 Stunden bei einer Temperatur zwischen 4°C und 30°C aufbe­ wahrt wird.
Die Höhe der Temperatur sowie die Dauer der Erwärmung gemäß Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens richtet sich gegebenenfalls nach dem Material des zu beschichtenden Reak­ tionsgefäßes sowie nach der Art der Matrix des Affinitätsme­ diums. Die Parameter können jedoch durch den Fachmann durch geeignete Versuche problemlos eingestellt werden.
Eine "Erwärmung" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfin­ dung vorzugsweise eine Erwärmung auf eine Temperatur von mindestens 50°C, bevorzugt von mindestens 60°C, und beson­ ders bevorzugt von mindestens 70°C. Ferner bedeutet eine Er­ wärmung vorzugsweise eine Erwärmung auf nicht mehr als 100°C, bevorzugt auf nicht mehr als 90°C. Eine Erwärmung im Bereich von 70°C bis 90°C ist besonders bevorzugt. Die Dauer der Erwärmung beträgt vorzugsweise mindestens 30 min. bevor­ zugt mindestens 60 min und besonders bevorzugt mindestens 120 min. Die Dauer übersteigt vorzugsweise nicht 360 min. bevorzugt nicht 300 min und besonders bevorzugt nicht 240 min. Ganz besonders bevorzugt erfolgt die Erwärmung für 1 bis 5 Stunden.
Das Abkühlen des beschichteten Reaktionsgefäßes gemäß Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vor­ zugsweise durch Stehenlassen bei Raumtemperatur.
Im Zusammenhang mit dem Verfahren trifft für das Reaktions­ gefäß und das cis-Diol-spezifische Affinitätsmedium dasselbe zu wie bereits weiter oben erläutert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zur Beschich­ tung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete cis-Diol-spezifische Affinitätsmedium ein Boronat-Affini­ tätsgel.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Matrix des cis-Diol-spezifischen Affinitätsmediums Polyacrylamid.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Reaktionsgefäße die erhältlich sind durch das erfindungsgemäße Verfahren.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung auch Testbestecke, insbesondere solche für diagnostische Zwecke, enthaltend ein erfindungsgemäßes Reaktionsgefäß.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein erfindungs­ gemäßes Testbesteck auch Puffer zur Extraktion von Substan­ zen mit cis-Diol-Struktur, die an die Beschichtung des er­ findungsgemäßen Reaktionsgefäßes binden. Darunter fallen beispielsweise Acetat-, Borat-, Carbonat-, Citrat- und Phos­ phat-Puffer sowie Puffer basischer Amine (z. B. Tris-, Etha­ nolamin- und HEPES-Puffer).
Das folgende Beispiel dient der näheren Erläuterung der Er­ findung.
Beispiel Herstellung von mit Boronat-Affinitätsmedium beschichteten Makrotiterplatten
Auf der Präzisionswaage werden 28,8 g Affi-Gel 601 (Fa. Bio- Rad) ausgewogen. Das Gel wird unter Rühren zu 1200 ml Reinstwasser gegeben. Das Rühren mit Hilfe eines Magnetrüh­ rers wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die homogene Mischung wird für die Beschichtung von Makrotiter­ platten (Fa. NUNC) weiterhin gerührt.
Zur Beschichtung dieser Platten wird eine Pipette (Fa. Eppendorf) verwendet. Pro Vertiefung der Makrotiterplatte werden 250 µl des Gel-/Wasser-Gemisches pipettiert. Der Combitip sollte vor und zwischen den Pipettiergängen immer wieder aufgezogen und ausgestoßen werden. Das Gel sollte sich nach dem Pipettieren gleichmäßig auf dem Boden jeder Vertiefung verteilen.
Die Makrotiterplatten mit dem eingebrachten Gel-/Wasser-Ge­ misch werden für 48 Stunden unter dem Abzug durch Abdampfen des Wassers bei Raumtemperatur getrocknet.
Die getrockneten Makrotiterplatten werden in einem Trocken­ schrank (VTR 5050, Fa. Heraeus Instruments) gestapelt und innerhalb von 2 Stunden auf eine Temperatur von 80°C er­ wärmt. Unter Aufrechterhaltung dieser Temperatur von 80°C wird das Erwärmen für weitere 2 Stunden fortgesetzt. An­ schließend werden die Makrotiterplatten aus dem Wärmeschrank entnommen und durch Stehenlassen für 2 Stunden bei Raumtem­ peratur abgekühlt.

Claims (11)

1. Reaktionsgefäß, dessen Oberfläche beschichtet ist mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsmedium.
2. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, wobei das cis-Diol-spe­ zifische Affinitätsmedium ein Boronat-Affinitätsgel ist.
3. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Matrix des Affinitätsmediums Polyacrylamid ist.
4. Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das eine Makro- oder Mikrotiterplatte, Multischale, Zell- oder Gewebekulturplatte oder -schale, Röhrchen, Flasche oder Wanne ist.
5. Verfahren zur Herstellung eines Reaktionsgefäßes, dessen Oberfläche mit einem cis-Diol-spezifischen Affinitätsme­ dium beschichtet ist, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Inkontaktbringen des cis-Diol-spezifischen Affini­ tätsmediums mit der inneren Oberfläche des zu be­ schichtenden Reaktionsgefäßes;
  • b) Erwärmen des Reaktionsgefäßes; und
  • c) Abkühlen des Reaktionsgefäßes.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Reaktionsgefäß aus Polystyrol ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das cis-Diol- spezifische Affinitätsmedium ein Boronat-Affinitätsgel ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Matrix des Affinitätsmediums Polyacrylamid ist.
9. Beschichtetes Reaktionsgefäß erhältlich nach einem Ver­ fahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8.
10. Testbesteck, enthaltend ein Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder nach Anspruch 9.
11. Testbesteck nach Anspruch 10, weiterhin enthaltend Puf­ fer zur Extraktion von Substanzen, die an die Be­ schichtung des Reaktionsgefäßes binden.
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