DE3408062A1 - Verfahren zur bestimmung von ss-hydroxibuttersaeure und eine zusammensetzung zur bestimmung von ss-hydroxibuttersaeure - Google Patents
Verfahren zur bestimmung von ss-hydroxibuttersaeure und eine zusammensetzung zur bestimmung von ss-hydroxibuttersaeureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung von
ρ-Hydroxibuttersäure und eine einheitliche Festphasen-Zusammensetzung,
die eine einfache und schnelle Bestimmung dieser Säure möglich macht.
p-Hydroxibuttersäure, eine Art von Ketonkörper, ist ein
Zwischenprodukt des Fettsäurestoffwechsels und wird bei Diabetikern (Menschen und Tieren) in großen Mengen in den
Körperflüssigkeiten (Blut, Urin usw.) gefunden. Die Erfindung wird am Fall der Bestimmung von p-Hydroxibuttersäure in
Körperflüssigkeiten nachstehend genauer beschrieben.
Eine Kohlenhydratstoffwechselstörung, wie Insulinmangel infolge Pankreas-Incretionsstörung verursacht erhöhte Fettsäureoxidation
in der Leber. Dies resultiert in abnormer Erhöhung der Ketonkörper wie Aceton, Acetessigsäure und
p-Hydroxibuttersäure, die sich in den Geweben, im Blut und Urin übermäßig ansammeln (Ketose). Es ist daher erforderlich,
im Fall hochgradiger Pankreas-Incretionsstörung, insbesondere schwerer Diabetis, oder wenn ein Patient kohlehydratarme
Nahrung erhält, dem Auf und Ab der Ketonkörper in den Körperflüssigkeiten Aufmerksamkeit zu schenken.
Es wird allgemein gesagt, daß wenn Ketose bei schwerer Diabetis auftritt, von den Ketonkörpern p-Hydroxibuttersäure im Blut
merklich ansteigt, was in einem erhöhten Verhältnis von
ß-Hydroxibuttersäure/Aceton+Acetessigsäure resultiert und
so abnormen Stoffwechsel am deutlichsten anzeigt.
Eine bekannte quantitative ß-Hydroxibuttersäure-Bestimmungsmethode
ist die von Williamson et al, bei der ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase
verwendet wird (Biochemical Journal, Vol. 82, Seite 90, 1962), Bei dieser Methode wird
ß-Hydroxibuttersäure mit ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase und Diphosphorpyridin-nucleotid (dpn) umgesetzt und die
Absorbanz des erzeugten reduzierten Diphosphopyridinnucleotids (DPNH) bei der spezifischen Absorption von 3^0 nra
gemessen. Die Menge ß-Hydroxibuttersäure wird aus dem MoIekular-Extinctionskoeffizienten
bestimmt. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, daß ein hochwertiges Ultraviolett-Spektrofotoraeter
erforderlich ist und die Durchführung der Analyse Fachkenntnis erfordert und zeitraubend ist.
Um diese Nachteile zu beseitigen ist eine einfache kolorimetrische
Methode hoher Empfindlichkeit gegenüber Ketonkörpern
im Blut entwickelt worden, bei der kein Ultraviolett-Spektrofotometer
benötigt wird (Tokkai Sho 55-35232). Bei dieser Methode wird zuerst ß-Hydroxibuttersäure mit ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase
und Nicotinamidadenin-dinucleotid (NAD) umgesetzt, um enzymatisch zu Acetessigsäure oxidiert
zu werden, und dann mit p-Nitrophenyldiazonium-fluoborat
zusammen mit der Acetesssigsäure, die ursprünglich im Blut
vorlag, in eine Azoverbindung übergeführt. Die Azoverbindung
wird mit hypophosphoriger Säure zu einer stabilen Hydroazo-Verbindung
reduziert und die gesamte Acetessigsäure durch kolorimetrische Bestimmung der Hydroazo-Verbindung unter Verwendung
der Wellenlänge 390 mn bestimmt. Separat wird nur die ursprünglich im Blut enthaltene Acetessigsäure nach der
gleichen kolorimetriechen Methode bestimmt, aber ohne Einwirkung
von p-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase. Der erhaltene ¥ert wird vom Gesamt-Acetessigsäurewert abgezogen, um die
Menge ß-Hydroxibuttersäure im Blut zu erhalten. Aber auch
diese Methode hat für eine täglich durchzuführende klinische
Methode zahlreiche Nachteile. Sie muß von Fachkräften durchgeführt werden und erfordert eine längere Zeit, da die Blutprobe
vorbehandelt werden muß (Eiweiß muß entfernt werden); es ist eine komplexe Arbeitsweise, zu der Spezialgeräte und
ein hochwertiges Spektrofotometer erforderlich sind.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von ß-Hydroxibuttersäure anzugeben, das einfach
und sicher durchzuführen ist und für das keine besonderen Geräte erforderlich sind. Darüber hinaus soll eine Zusammensetzung
zur schnellen und einfachen Bestimmung von p-Hydroxibuttersäure angegeben werden; diese Zusammensetzung soll von
Ärzten, Schwestern sowie von den Patienten selbst ohne weitere Geräte benutzt werden können.
Die Aufgabe wird durch das Verfahren des Anspruches 1 und die Zusammensetzung des Anspruches 4 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen
sind in den Unteransprüchen angegeben.
Es ist ein einfaches Verfahren gefunden worden, das eine schnelle ß-Hydroxibuttersäure-Bestimmung ermöglicht. Bei
diesem Verfahren wird p-Hydroxibuttersäure durch ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase
in Gegenwart von Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) oxidiert (dehydriert) und das erzeugte
NAD des reduzierten Typs (NADU) reduziert Tetrazoliumsalz
durch einen Elektronenübertrager. Der Farbgrad des so erzeugten Formazane wird gemessen und liefert eine schnelle und einfache
Bestimmung von p-Hydroxibuttersäure. Es ist auch eine einheitliche
Festphasen-Zusammensetzung geschaffen worden, die
durch Imprägnieren eines absorptiven Trägers mit p-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase,
Nicotinamidadenin-dinucleotid (NAD), Elektronenübertrager und Tetrazoliumsalz oder durch
Aufbringen dieser Substanzen auf einen Träger und Trocknen erhalten worden ist.
Die Erfindung wird nachstehend näher beschrieben, wobei auf die beigefügten Figuren Bezug genommen wird. Es zeigen:
Fig. 1 eine grafische Darstellung des Reaktionszeitverlaufs
für die Rezeptur des Beispiels 1 nach der Erfindung, und
Fig. 2 eine Eichkurve für die Rezeptur des Beispiels 1 nach,
der Erfindung.
Erfindungsgemäß wird p-Hydroxibuttersäure zuerst durch ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase
in Gegenwart von Nicotinamidadenindinucleotid NAD zu Acetessigsäure oxidiert (dehydriert), wie
nachstehend gezeigt. Das hierbei erzeugte reduzierte NAD (NADU) reduziert Tetrazoliumsalz durch einen Elektronenübertrager zu
farbigem Formazan, Der Farbvergleich dieses Formazane gibt
die Menge p-Hydroxibuttersäure quantitativ an.
p-Hydroxibuttersäure + NAD
(p-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase)
Acetessigsäure + NADH
NADH + Tetrazoliumsalz
(Elektronenübertrager) y NAD + Formazan
(Elektronenübertrager) y NAD + Formazan
Wenn ein Tropfen der Probe auf die erfindungsgemäße Zusammensetzung
aufgebracht wird, erscheint die der p-Hydroxibuttersäure-Konzentration
in der Probe entsprechende Farbe nach einigen Minuten an der Zusammensetzung. Lediglich ein Vergleich
dieser Farbe mit der Standardfarbtafel, die vorher hergestellt
worden ist, mit dem bloßen Auge gibt den Wert der p-Hydroxibuttersäure-Konzentration
an. Der Zusammensetzung können verschiedene Additive zugesetzt sein, wenn erforderlich, wie
Puffer, Rückhaltemittel, Stabilisatoren und Reaktionsbeschleuniger.
Die bei dem Verfahren verwendete ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase
kann irgendeine sein, die ß-Hydroxibuttersäure zu
Acetessigsäure oxidieren kann/ einschließlich solche, die von
Bakterien stammen, wie Rhodopseudoraonas spheroides und Pseudomonas
lemoignei, und solche, die aus tierischen Geweben, wie Tierherzen und Schweinenieren extrahiert sind.
Das NAD, das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird,
ist ein Coenzym, das ¥asserstoff-Akzeptorwirkung bei Oxidations-Reduktions-System-Reaktionen
besitzt. Geeignete Coenzyme sind zum Beispiel solche, die aus tierischen Geweben
wie Leber und Niere sowie aus Enzymen extrahiert worden sind. Ihre Natrium- und Lithiumsalze sind ebenfalls verwendbar.
Der erfindungsgemäß verwendete Elektronenübertrager kann
irgendeiner sein, der die Wasserstoff-Donatorwirkung des
erzeugten NADH aktiviert. Als Beispiel sei Diaphorase, eine Art Flavin-Enzym, genannt und intermediäre Elektronenübertrager,
wie 9-Dimethylaminobenzo-oC-phenazoxonium-chlorid
(abgekürzt mit Meldola's Blau), N-Methylphenazonium-methosulfat
(abgekürzt mit PMS) und i-Methoxi-5-methylphenazoniummethylsulfat
(abgekürzt mit 1-Methoxi-PMS). Besonders bevorzugt
wird 1-Methoxi-PMS, weil es stabil und wirtschaftlich
ist.
.../1O
Die Tetrazoliumsalze werden zu Formazanen, gefärbte Substanzen,
in Gegenwart reduzierender Substanzen reduziert und schließen viele Monotetrazoliumsalze und Ditetrazoliumsalze ein. Typische
Beispiele für Monotetrazoliumsalze sind: 3-(p-Jodphenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium-chlorid
(abgekürzt mit INT) und 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-bromid
(abgekürzt mit MTT). Typische Beispiele für Ditetrazoliumsalze sind 3,3'-(3,3'-Dimethoxi-4,4l-biphenyllylen)-bis-(2,5-c3iphenyl-2H-tetrazolium-chlorid)
(abgekürzt mit TB) und 3, 3'-(3, 3f-Dimethoxi-*f, *H-biphenylylen)-bis- [2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium]
(abgekürzt mit Nitro-TB). Von diesen Verbindungen wird Nitro-TB besonders bevorzugt, weil es in Wasser leicht löslich und relativ
stabil ist.
Der pH-Puffer kann irgendeiner sein, der die besten pH-Wert-Bedingungen
(7 bis 10)für die Enzymreaktion und die Farbreaktion gibt. Geeignete Puffer sind zum Beispiel Phosphorsäure-,
Borsäure-Puffer, Tris-Puffer und Good's-Puffer. Andere Additive
können auch zugefügt werden.
Die vorstehend aufgeführten Reagenzien werden gelöst, zum Beispiel in Wasser, und ein absorptiver Träger, wie Filterpapier,
wird eingetaucht. Das eingetauchte Filterpapier wird, nachdem es getrocknet ist, geschnitten, zum Beispiel in etwa
2
5 mm -Stücke, um Teststücke zu bilden und an ein Ende eines
5 mm -Stücke, um Teststücke zu bilden und an ein Ende eines
Plastikfilmstreifens angeheftet. Außerdem kann die vorstehend
" .../11
beschriebene wäßrige Lösung nach Zugabe eines Binders auf einen
Träger, wie einem Polyesterfilm, in gewünschter Dicke aufgetragen und getrocknet werden«
Wenn eine Probe einer Körperflüssigkeit, wie Serum, Blut,
Plasma oder Urin, auf das Teststück aufgetropft wird, entwickelt sich nach einigen Minuten Farbe. Wenn die Probe
Gesamtblut ist, bildet es eine semipermeable Schicht, die es niedrigmolekularen Substanzen, wie ß-Hydroxibuttersäure
gestattet hindurchzugehen, nicht aber makromolekularen Sub stanzen, wie den roten Blutkörperchen. Dies erlaubt die Beobachtung der Farbe auf dem Teststück ohne Beeinflussung durch
die rote Farbe der roten Blutkörperchen,-da letztere nach Ablauf der Farbreaktion abgewaschen oder abgewischt werden
können.
Die so entwickelte Farbe wird mit der Standardfarbtafel 2,
die im voraus hergestellt worden ist und die Konzentration von ß-Hydroxibuttersäure in der Körperflüssigkeit angibt,
mit bloßem Auge verglichen. Man kann eine höhere Genauigkeit der Messung erreichen, wenn man ein einfaches Reflektometer
verwendet, das eine Lichtquelle hat, die dem entwickelten Farbton entspricht.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele, die
bevorzugte Ausführungsformen darstellen, näher erläutert.
.../12
Es wurde ein Reagenz hergestellt durch Lösen von 10 mg
ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase (Ursprungs Pseudomonas
lemoignei, relative Aktivität: 10 U/mg), 33 mg NAD, 3 mg eines
Elektronenübertrages (1-Methoxi-PMS) und 17 sng Tetrazoliumsalz
(Nitro-TB) in 100 ml einer 0,1M Trishydroxi-aminomethan-salzsäure-pufferlösung
(pH 8,5).
Von diesem Reagenz wurden jeweils 3,0 ml in je ein Reagenzglas gegeben und jeweils 20 μΐ einer wäßrigen ß-Hydroxibuttersäure-Lösung
(Standardlb'sungen: 0, 2, 4, 6, 8, 10 mMol/l) zugefügt.
Die Absorbanz jeder Mischung wurde nach einer Wartezeit von 0»5» 1, 2, 3 , h und 5 Minuten bei 37°C mittels eines Kolorimeter
s mit monochromatischem Licht von 520 mn gemessen. Die
Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Reaktionszeit 0,5 Min. 1 Min. 2 Min. 3 Min. 4 Min. 5 Min.
0 mM 0,257 0,260 0,263 0,264 0,263 0,264
2 mM 0,282 0,346 0,407 0,434 0,440 0,441
4 mM 0,308 0,437 0,533 0,591 0,609 0,608
6 mM 0,363 0,512 0,669 0,752 0,784 0,782
8 mM O,4o6 0,607 0,810 0,915 0,949 0,952
1OmM 0,511 0,748 1,008 1,106 1,129 1.131
.../13
Um den Reaktionszeitverlauf zu zeigen, wurde in Fig. 1 die Reaktionszeit auf der Abszisse und die Absorbanz auf der Ordinate
aufgetragen. So wurde gefunden, daß die Reaktion den Endpunkt nach etwa h Minuten erreicht.
Außerdem wurde eine Eichkurve aufgestellt (Fig. 2), indem die Absorbanz jeder Standardlösung nach h Minuten, wo die
Reaktion ihren Endpunkt erreicht hatte (abzüglich eines Blindwertes, der Absorbanz 0,263 von 0 Mol/l) auf der Ordinate und
die Konzentration der Standardlösungen auf der Abszisse aufgetragen wurden. Es wurde eine Gerade vom Ausgangspunkt bis
zur Absorbanz der Standardlösung 10 Mol/l ß-Hydroxibuttersäure erhalten.
Zu 20 jul einer Serumprobe eines Patienten wurden 3,0 ml Reagenz
der vorstehenden Rezeptur gegeben und die Mischung bei 37 C 5 Minuten reagieren gelassen. Die Absorbanz der Mischung wurde
unter Verwendung monochromatischen Lichtes einer Wellenlänge
von 520 nm mit 0,27 gemessen. Aus der Eichkurve der Fig. 2
ergibt sich eine Konzentration von p-Hydroxibuttersäure von 3,10 mMol/l.
So ermöglicht das Verfahren nach der Erfindung die Bestimmung von p-Hydroxibuttersäure in der Probe durch Zufügen von 20 jal
der Probe zu 3,0 ml des Reagenzes nach Beispiel 1, Reagierenlassen der Mischung bei einer bestimmten Temperatur h bis 5
.../lh
Minuten lang, Messen der Absorbanz von Licht einer Wellenlänge
von etwa 520 nm durch die reagierte Mischung und Vergleichen
der Absorbanz mit der im voraus unter den gleichen Bedingungen aufgestellten Eichkurve.
Es wurden sechzehn Lösungen hergestellt, von denen jede enthielt: 10 rag NAD, 100 U (Einheiten) ß-Hydroxibuttersäure-
Dehydrogenase und 1 g Gelatine, gelöst in einem Gemisch von 9 ml Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 8,0) und 1 ml Methanol.
Jede 1:1-Kombination von jeweils 1,5 mg der vier Elektronenübertrager
Diaphorase, Meldola's Blau, PMS und 1-Methoxi-PMS
mit jeweils 10 mg der vier Tetrazoliumsalze INT, MTT, TB und
Nitro-TB wurde in diesen l6 Lösungen gelöst. Jede dieser
Lösungen wurde nach. Dispergieren in 25 ml einer Lösung von
4 g Celluloseacetat/dl Aceton au!" einen Polyesterfilm in einer
Dicke von 0,2 rnm aufgebracht; auf den so erhaltenen Teststreifen
wurden 0,5 mM wäßrige p-Hydroxibuttersäure getropft
und nach 3 Minuten geprüft. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
Die Ergebnisse zeigen, daß jede Kombination von Elektronenübertrager
und Tetrazoliumsalz' für die p-Hydroxibuttersäure-Bestimmung
geeignet ist.
.../15
In allen folgenden Beispielen wurde die Kombination von dem
Elektronenübertrager 1-Methoxi-PMS und dem Tetrazoliumsalz
Nitro-TB als ReprUsentativbeispiel benutzt.
| TABELLE 2 | Meldolas Blau |
PMS | 1-Methoxi-PMS | |
| Diaphorase | hellrot purpurn |
hellrot purpurn |
hellrot purpurn |
|
| INT | hellrot purpurn |
rot-purpurn | rot-purpurn | rot-purpurn |
| MTT | rot-pupurn | blau purpurn |
blau purpurn |
blau purpurn |
| TB | blau purpurn |
tief purpurn |
tief purpurn |
tief purpurn |
| Nitro-TB | tief purpurn |
10 mg NAD, 1 mg 1-Methoxi-PMS, 20 mg Nitro-TB, 100 rag Rinderseriumalbumin
als Stabilisator und 50 U ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase
(Ursprung: Pseudomonas lemoignei) vurden in 10 ml einer 0,1 M Borsäure-Pufferlösung (pH-¥ert 8) gelöst. In diese
Lösung wurde Filterpapier getaucht und bei Raumtemperatur getrocknet.
Aus dem getrockneten Filterpapier wurde ein 5 nim großes
Teststück geschnitten und auf das Ende eines 5x70 mm PVC-FiImstreifens
mit doppelt beschichtetem Klebestreifen aufgebracht. Das Teststück wurde in eine Probe getaucht oder es wurde ein
Tropfen der Probe auf das Teststück aufgebracht. Nach 3 Minuten
Reaktionszeit hatte sich eine blau-purpurne Farbe auf dem Teststück entwickelt.
Die Konzentration von ß-Hydroxibuttersäure in der Probe kann ermittelt werden durch Vergleich des Farbtons der entwickelten
Farbe mit der vorher hergestellten Standard-Farbtafel, die die Farbtöne der entwickelten Farben zeigt, die O, 0,1, 0,2, 0,5»
1,0, 2,0, 5»0 und 10,0 mMol/l ß-Hydroxibuttersäure entsprechen.
1,5 mg 1-Methoxi-PMS, 1,5 g Gelatine, 8 rag NAD, 100 mg Nitro-TB
und 100 U ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase (Ursprung: Rhodopseudomonas spheriodes) wurden in 10 ml einer 0,1 M Trishydroxiaminomethan-salzsäure-pufferlösung
(pH 8,5) gelöst. Diese Lösung wurde in durchgehend gleicher Dicke von 0,4 mm auf einen Polyesterfilm unter Verwendung eines Farbauftragmessers
aufgebracht und 2 Stunden bei 25 C getrocknet.
Aus dem getrockenten Film wurden 5*7 mm große Teststücke geschnitten
und jeweils auf ein Ende eines 5x90 mm PVC-Filrastreifens
unter Bildung eines Teststreifens aufgebracht. Jeweils ein Tropfen von Patientenseruira,, das verschiedene
Konzentrationen von p-Hydroxibuttersäure enthielt, wurde auf das Teststück des Teststreifens aufgebracht. Nach 2 Minuten
.../17
langer Reaktionszeit wurde überschüssiges Serum mit absorptivera
Papier leicht aufgesaugt. Nach weiteren 3 Minuten, nachdem sich die entwickelte Farbe stabilisiert hatte, wurde
mit dem bloßen Auge mit der Standardfarbtafel verglichen,
die vorher hergestellt worden war und die entwickelten Farbtöne zeigte, die 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 und 10,0 mMol/l
p-Hydroxibuttersäure entsprechen. So wurde die ß-Hydroxibuttersäure-Konzentration
in Patientenserum erhalten.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der ß-Hydroxibuttersäure- .
Konzentrationsbestimmung in gleichen Serumproben, einmal nach der Erfindung (Messung X) und einmal nach der im japanischen
Patent 55-35232 von Tokkai Sho beschriebenen
Methode (Messung Y). Beide Messungen zeigen gute Korrelation mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,988 und der
Regressionsgleichung:
Y = 1,θβχ - 0,02
.../18
| X | TABELLE 3 | 07 | Probe Nr. | X | 1 | Ul | 1 | Y | 04 | |
| Probe Nr. | 0,05 | Y | 47 | 16 | ο, | 1 | ο, | 20 | ||
| 1 | 0,5 | o, | 25 | 17 | ο, | 2 | ο, | 07 | ||
| 2 | 0,2 | o, | 73 | 18 | ο, | 3 | ο, | 09 | ||
| 3 | 0,7 | o, | 51 | 19 | ο, | 5 | ο, | 24 | ||
| 4 | 0,3 | o, | 36 | 20 | ο, | 5 | ο, | 29 | ||
| 5 | 1,5 | O9 | 52 | 21 | ο, | 5 | ο, | 43 | ||
| 6 | 1.5 | 1·, | 23 | 22 | 0, | 1 | ο, | 62 | ||
| 7 | 0s2 | 1. | 25 | 23 | 0, | 05 | 57 | |||
| 8 | 0,3 | O8 | 31 | 24 | 0, | 1 | oa | 1 | ||
| 9 | 2,0 | O5 | 76 | 25 | ο, | 25 | o, | 08 | ||
| 10 | 2,0 | 2, | 05 | 26 | ο, | 3 | o, | 12 | ||
| 1 1 | 3,0 | 1» | 76 | 27 | O9 | 0 | o, | 32 | ||
| 12 | 3,0 | 3, | 84 | 28 | ο, | o, | 27 | |||
| 13 | 5»o | 2, | 17 | 29 | ο, | o, | 07 | |||
| 14 | 5,0 | 4, | 30 | 1. | I9 | |||||
| 15 | ||||||||||
Die Zusammensetzung des Beispiels 3 wurde zu 1 g Ethylcellulose,
gelöst in 10 ml Chloroform und 1,5 ml 20%iger wäßriger
Gelantinelösung gegeben und durch starkes Rühren eine W/O-Emulsion
gebildet. Diese Emulsion wurde gleichmäßig unter Verwendung eines Farbauftragsmessers in einer Dicke von 0,15 nun
.../19
aufgetragen und gab nach h$ Minuten langem Trocknen bei 30 C
eine poröse semipermeable Membran*
Die erhaltene Membran wurde vie in Beispiel 3 beschrieben zu einem Teststreifen verarbeitet. Ein Tropfen einer Gesamtblutprobe
wurde auf das Teststück des Teststreifens aufgebracht. Nachdem überschüssige Probe nach 3 Minuten mit absorbierender
Baumwolle abgewischt worden war, war die Blutkörperchenkomponente entfernt und es zeigte sich die blau-purpurne Farbe,
die der Konzentration von ß-Hydroxibuttersäure im Gesamtblut entspricht.
Die Beispiele zeigen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung,
die jedoch nicht darauf beschränkt ist. Es sind viele verschiedene Änderungen daran möglich, ohne den Rahmen der
Erfindung zu verlassen. So können zum Beispiel verwendet werden: Proteine und Polysaccharide als Enzymstabilisatoren;
farberzeugende Mittel und Hydrazinverbindungen und Magnesiumverbindungen
als Reaktionsbeschleuniger; verschiedene Additive
wie Zurückhaltemittel, Konsistenz beeinflussende Mittel und Surfactants.Es ist auch möglich, eine Zusammensetzung herzustellen,
die eine oder mehrere der vorstehenden Materialien enthält, sie muß nicht notwendigerweise alle Komponenten enthalten.
Als Lösungsmittel können zahlreiche organische Lösungsmittel gewählt werden, es muß nicht Wasser sein. Jedes Material
kann in dem Lösungsmittel und der Bildung einer Suspension
.../20
oder Emulsion dispergiert werden, es muß nicht gelöst werden. Außerdem kann die Erfindung auch zur quantitativen Bestimmung
von ß-Hydroxibuttersäure in Nahrungsmittelzusätzen oder anderen Proben angewendet werden; die Anwendung der Erfindung ist nicht
auf den vorstehend beschriebenen klinischen Sektor beschränkt.
Wie vorstehend im einzelnen offenbart, ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren, bei welchem ß-Hydroxibuttersäure in
Gegenwart von NAD durch p-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase dehydriert wird. Das dabei erzeugte NADH reduziert Tetrazoliumsalz
mittels eines Elektronenübertragers zu einem gefärbten Formazan im Verhältnis zur Menge ß-Hydroxibuttersäure, und
die Menge der ß-Hydroxibuttersäure wird durch Vergleich der entwickelten Farbe des Formazane mit einer Standard-Farbtafel
bestimmt. Die Erfindung schließt auch eine gleichmäßige feste Zusammensetzung der vorstehenden Reagenzien ein.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist im Gegensatz zu den bekannten Bestimraungsmethoden leicht ausführbar. Es erfordert
keine Vorbehandlung der Probe (insbesondere Blut), keine besonderen Geräte, komplexen Arbeitsvorgänge und Fachkenntnisse
und gibt die Ergebnisse in kurzer Zeit.
Die Zusammensetzung nach der Erfindung ermöglicht schnelles und einfaches Arbeiten und die Verwendung kleinster Probemengen,
was wesentliche Forderungen für die tägliche Untersuchung in
.../21
der Klinik sind. Es braucht nur ein Tropfen der Probe auf die Zusammensetzung aufgebracht zu werden, und die Farbentwicklung
ist in wenigen Minuten beendet. Insbesondere ermöglicht die feste Zusammensetzung nach der Erfindung mit
den Urinzucker- und Blutzucker-Teststücken, die im Handel erhältlich sind, die Messung sowohl der Zucker- als auch
der ß-Hydroxibuttersäure-Konzentration im Urin und im Blut
durch einen einfachen Vorgang. Dies ist für Ärzte und Schwestern sehr geeignet, aber auch für an Diabetis leidenden
Patienten, bei denen die Bestimmung zu Hause durchgeführt werden kann. So ist die Zusammensetzung nach der Erfindung
von außerordentlich hohem praktischem Wert.
.../22
Claims (6)
- 043-21 .··.:— .··.—: .-·.: ο/no nc oHAUC1K, SCHMITZ, (JRAAIJH, WKHNKKT, I)OHINCiIIAMHlHfJ mONC'IIKN I)USHKUK)HI'1I1VTKVUNWM ιι· · m-vkh wai.i. ji am«ι ιιλμιιγμι. »η I>ipl.-IMiy». W. SCHMITZ - DipL-ln«. '*·· CHAAIJ"T) Kabushiki Kaishä' Kyoto Däiichi Kagaku ν.·...-.· w«ii λι ■ aooo n.imi.urK :jo57, Nishiaketa-cho, Higashikujo, r.-i.-r«» + τ,.ι,-ι-ορί.τ «ι«) aotn-on.... ' τ> ji lolf-x Oail7MU Input ΛMinami-ku,KyOtO-Shi, KYOTO/JAPAN \>\\>\. Inn. H.H.MC Κ - Πίρΐ.-Ιηκ. W.WI HNI.HIM(iv.ni-lMti-nll<» MW ■ HOOO Mflni-heii 2
- 2) Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. Ί«·ΐ,.η>η + i»i€..<.pii-t· ioh») Rananu35, Higashisotobori-cho, Higashi-ku, ii>u-v onaionn:) pnmu ·ιNagoya-shi, i>,-..i,,K. w. ιΛκιμ.AICHI/JM'AN K.-Wilhflm HiiiK 41 . 4OOO I Χιμμ.-ΙιΙογΓ 1!S.\ -.STHI.! I -.MiSANSt UHU I IM-I-' \S-il-. HKI'I.Y TCJ:ιΐΛΜΐ«·ι«ί. 29. Februar 1984Verfahren zur Bestimmung von p-Hydroxibuttersäure und eine Zusammensetzung zur Bestimmung von ,ji-HydroxibuttersäureAnspruch e :Verfahren zur Bestimmung von ^-Hydroxibuttersäure, dadurch gekennzeichnet, daß p-Hydroxibuttersäure in Gegenwart von Nicotinamidadenin-dinucleotid durch ^9-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase oxidiert (dehydriert) wird, wobei ein Elektronenübertrager und Tetrazoliumsalz anwesend sind, und der Grad der Farbentwicklung des erzeugten Formazans gemessen wird.RiiroiKMMi I'jitoul Auoi-m'VH Λιι^«·Ιιινκ<μκ· \'»·γι«·ιί.«·γ ΙιιΊΐη Ktiropiiinrlion I'iitfiHiuiitI.)(>utHrli<> Hank Λ<3 IIiiriIiiii'k, Nr. OS 2H 4H7 (Hl1/. L'I)(I7IH)O()| ΙΌηΙηι'ΙκηΨ I tmtiluu'K ÜHIÜ \HT-it-..w,<„„,■ M,mk AC; lliiinlxirir. Ni-. I):«J(IO Hfi (HI,Z U(H)H(X)(H))2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Elektronenübertrager mindestens eine Verbindung aus der Gruppe Diaphorase, °--Dimethylaminobenzo-ot-phenazoxoniunichlorid, N-Methylphenazonium-methosulfat und 1-Methoxi-5-methylphenazonium-raethyl-sulfat eingesetzt wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Tetrazoliumsalz mindestens eine Verbindung aus der Gruppe 3-(p-Jodphenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium-Chlorid, 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-di-diphenyl ■ 2H-tetrazolium-bromid, 3,3-Diraethoxyl-4,^J.biphenylen-bis-(2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-chlorid) und 3,3'-Dimethoxy-4,4l-biphenylen)-bis £2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumj eingesetzt wird.
- k, Zusammensetzung zur Bestimmung von p-Hydroxibuttersäure, gekennzeichnet durch ß-Hydroxibuttersäure-Dehydrogenase, Nicotinsäureamidadenin-dinucleotid (NAD), einen Elektronenübertrager und Tetrazoliumsalz, eingesogen in einen absorptivert Träger oder aufgebracht auf einen Träger und getrocknet.
- 5. Zusammensetzung nach Anspruch k, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektronenübertrager mindestens eine Verbindung aus der nachstehenden Gruppe ist: Diaphorase, 9-Eimethylaminobenzo-oc-phenazoxonium-Chlorid, N-Methylphenazonium-methosulfat, und i-Methoxi-jj-methyl-phenazium-methyl-sulf at.
- 6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Tetrazoliumsalz mindestens eine Verbindung aus der nachstehenden Gruppe ist: 3-(i>-Jodphenyl)-2-(p-nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium-chlorid, 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl) ^^-di-diphenyl^H-tretrazoliura-bromid, 3, 3'-(3, 3fDimethoxy-4,4«-biphenylen)-bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-chlorid) und 3, 3 * -(3,3'-Dime thoxy-4,4'-biphenylen-bis f2-p-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazoliumJ.
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