DE1917996A1 - Diagnostic agent for peroxides - Google Patents

Diagnostic agent for peroxides

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Abstract

Hydrogen peroxide and substances reacting with liberation of H2O2 as well as peroxidase and peroxidative active substances are detected and determined e.g. in blood etc. by reaction with a chromogenic mixture contg e.g. 1- 3-Et-benzoxazolone-(2) -2- 1-Et-X-(2) -azine (I) where X = pyridone, benzthiazolone, or quinolinone, In the parent specification the O in the present benzoxazolone moiety was an S atom. (I) may advantageously be accompanied by a reducing agent (II) examples of which are naphthalene- and amino-naphthalene-sulphonic acids, m-aminophenol, and p-aminosalicylic acid. Identification may be by spotting the sample and reagent on filter paper and quantitative detection by photometry (I) are prepd. in known manner by reaction of 2-Halogen or 2-mercapto-quaternary salts with a corresponding N-alkylated hydrazone salt and an amine pref. NEt3 in a polar solvent e.g. MeOH at 15-100 degrees.

Description

Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden und peroxidatisoh wirksamen Substanzen» Methods and diagnostic means for the determination of hydroperoxides and peroxidatisoh active substances »

Zusatz zur Patentanmeldung Aktenzeichen P 16 48 84O.7·Addition to the patent application file number P 16 48 84O.7

Gegenstand der Hauptanmeldung P 16 48 84O.7 sind diagnostische Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, aus denen durch eine vorgeschaltete Reaktion Wasserstoffperoxid-oder andere Hydroperoxide freigesetzt werden, sowie von Peroxidase bzw. anderen peroxidatisch wirkenden Substanzen. Als Indikatoren kommen im Hauptpatent die physiologisch unschädlichen Verbindungen der allgemeinen Formel I zur AnwendungThe main application P 16 48 84O.7 relates to diagnostic means and methods for the determination of hydroperoxides or substances, from which hydrogen peroxide or through an upstream reaction other hydroperoxides are released, as well as by peroxidase or other peroxidic substances. As indicators come in the main patent the physiologically harmless compounds of general formula I for use

N-NN-N

(D,(D,

in derin the

R, eine niedere Alkylgruppe,R, a lower alkyl group,

Rp Wasserstoff, eine Sulfoneäuregruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe, ,Rp hydrogen, a sulfonic acid group or an alkali sulfonate group, ,

R, Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe,R, hydrogen or a lower alkyl group,

X ein Schwerfeiatom, eine Vinylen- oder eine Iminogruppe, die gegebenenfalls durch niedere Alkylreste oder Arylreste substituiert ist,X is a heavy atom, a vinylene or an imino group, the optionally substituted by lower alkyl radicals or aryl radicals is,

•Λ• Λ

0098^2/07910098 ^ 2/0791

ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe, welche auch zusammen mit R, einen durch R„ substituierten Benzolring bildet, bedeuten.a nitrogen atom or a methine group which, together with R, is a benzene ring substituted by R " forms, mean.

In Ausgestaltung der Hauptanmeldung F 16 49 84O.7 wurde nun gefunden, daß auch jene Verbindungen der Formel I, in denen X zusätzlich ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom und gegebenenfalls R, zusätzlich ein Chloratom bedeutet, hervorragende Eigenschaften als Indikatoren besitzen.In an embodiment of the main application F 16 49 84O.7 it has now been found that also those compounds of the formula I in which X is additionally a Oxygen atom or a carbon atom substituted by two lower alkyl groups and optionally R also denotes a chlorine atom, have excellent properties as indicators.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Feroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung in an sich bekannter Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chromogene Substanzen der allgemeinen Formel I1 verwendet,The present invention accordingly provides a method for determining hydroperoxides or substances that react to release hydroperoxide and peroxidase or peroxidatically active substances with the aid of a chromogen using the reaction of the hydroperoxides with feroxidase or the peroxidatically active substances Evaluation of the discoloration in a manner known per se, characterized in that substances of the general formula I 1 are used as chromogenic substances,

in welcherin which

R1 eine niedere Alkylgruppe,R 1 is a lower alkyl group,

Rp Wasserstoff, eine SuIfonsäuregruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe,Rp hydrogen, a sulfonic acid group or an alkali sulfonate group,

009842/0791009842/0791

R-· Wasserstoff, ein Halogenatom oder eine niedere Alkylgruppe, Y ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe, welche gegebenenfalls auch zusammen mit R ' einen durch R- substituierten Benzolring bilden kann,R- hydrogen, a halogen atom or a lower alkyl group, Y is a nitrogen atom or a methine group, which optionally together with R 'is also substituted by R- Can form benzene ring,

einer der Reste X* ein Schwefelatom, eine Vinylengruppe, eine gegebenenfalls nieder-alkylierte oder-arylierte Iminogruppe, ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom bedeutet, während der andere Rest X1 ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffatom darstellt, wobei dieser für den Fall, daß R,· ein Halogenatom bedeutet, auch ein Schwefelatom, eine Vinylengruppe oder eine gegebenenfalls niedere alkylierte oder arylierte Iminogruppe sein kann.one of the radicals X * is a sulfur atom, a vinylene group, an optionally lower alkylated or arylated imino group, an oxygen atom or a carbon atom substituted by two lower alkyl groups, while the other radical X 1 is an oxygen atom or a carbon atom substituted by two lower alkyl groups , in the event that R, · denotes a halogen atom, this can also be a sulfur atom, a vinylene group or an optionally lower alkylated or arylated imino group.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen , die unter Freisetzung von Hydroperoxiden reagieren, sowie diagnostische Mittel zur Bestimmung ron Hämoglobin oder anderen peroxidatisoh wirksamen Substanzen.Further objects of the invention are diagnostic means for determination of hydroperoxides or substances that react to release hydroperoxides, as well as diagnostic agents for determining hemoglobin or other peroxidation-active substances.

Die Bestimmung von Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen geeignet, wie z.B. zur Bestimmung von Glucose, Galaktose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie Enzymaktivitäten. Die routinemäßige Bestimmung von derartigen Substraten ist wegen ihrer elementarenwichtigkeit aus der klinischen Chemie und aus der Lebensmittel-Chemie nicht mehr wegzudenken. Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise, wird diese von Glucoseoxidaee zu Gluconsäure oxydiert, wobei der Luftsaueretoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird, ύββ Wasserstoffperoxid oxydiert dann mittels Peroxidaae oder einer peroxidatisch wirkenden Substanz den erfindungsgemäC verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff.The determination of hydroperoxides by the method according to the invention is preferably suitable for coupled and uncoupled enzyme reactions, e.g. for the determination of glucose, galactose, amino acids, uric acid, Peroxides, hemoglobin, peroxidase or other peroxidatically active Substances as well as enzyme activities. The routine determination of such substrates is, because of their elementary importance, from clinical practice Chemistry and food chemistry can no longer be imagined without it. When determining glucose, for example, this is determined by Glucoseoxidaee Gluconic acid oxidizes, the oxygen in the air to hydrogen peroxide is reduced, ύββ hydrogen peroxide then oxidizes by means of Peroxidaae or a peroxidic substance, the indicator used according to the invention for the corresponding dye.

Die Auswertung -erfolgt beispielsweise durch optische Ausmessung im Spektralphotometer oder bei Verwendung von Testpapierstreifen bzw. Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zu-The evaluation takes place, for example, by optical measurement in the Spectrophotometer or when using test paper strips or test films by comparing the color strength with blank samples of known additives

•Λ• Λ

009842/Q791009842 / Q791

sammensetzung bzw. Farbtafeln. Besonders vorteilhafte und gut abgestufte Farbänderungen*erhält man überraschenderweise, wenn man die Substanzen i) zusätzlich mit Reduktionsmitteln der Formel II versetzt, . .composition or color tables. Particularly advantageous and well graded Color changes * are surprisingly obtained if the substances i) additionally mixed with reducing agents of the formula II,. .

(II),(II),

in welcherin which

Ar einen Benzol- oder Naphthalinkern,Ar is a benzene or naphthalene nucleus, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe,V is a hydroxyl or amino group,

VI Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe,V I hydrogen or an optionally alkylated or arylated hydroxyl or amino group,

W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-,· Aryl-, Carboxy- oder SuIfonsäuregruppe undW is an amino, alkoxy, alkyl, aryl, carboxy or sulfonic acid group and

W1 Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder SuIfonsäuregruppe, sowie gegebenenfalls deren Alkalisalze bedeuten.W 1 is hydrogen or an amino, alkoxy, alkyl, aryl, carboxy or sulfonic acid group, and optionally alkali metal salts thereof.

Diese Substanzen, die als "Modifier" wirken, geben für sich alleine keine oder nur sehr unspezifische Verfärbungen und sind deshalb als Indikatoren im allgemeinen nicht geeignet. Zusammen mit den Substanzen der allgemeinen Formel I* erhält man aber besonders deutliche und gutThese substances, which act as "modifiers", give on their own no or only very unspecific discoloration and are therefore classified as Indicators generally not suitable. Together with the substances of the general formula I *, however, one obtains particularly clear and good results abgestufte Farbumschläge. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegendengraduated color changes. Preferred embodiments of the present

f
Erfindung enthalten daher eine Kombination der Substanzen I1 und II als f
Invention therefore contain a combination of substances I 1 and II as

Indikator.Indicator.

Selbstverständlich läßt sich umgekehrt das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung der Indikatoren I1 sowie der Modifier II mit Hilfe von Hydroperoxiden und einer peroxidatisch wirksamen Substanz benutzen,Of course, conversely, the method according to the invention can also be used to determine the indicators I 1 and the modifiers II with the aid of hydroperoxides and a peroxidatically active substance,

•Λ• Λ

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was bei der Produktionaüberwachung dieser Diagnostika sehr nützlich ist,which is very useful in monitoring the production of these diagnostics is,

toto

Die Herstellung der Verbindungen I? erfolgt in an sich bekannter Weise durch Umsetzung von 2-Halogen- oder 2-Mercapto-Quartäraalzen mit einem entsprechenden N-alkylierten Hydrazonsalz unter Zugabe eines Amins, vorzugsweise von Triäthylamin in einem polaren Lösungsmittel (z.B. Methanol) bei einer Temperatur von 15-100 C. Die Reaktion ist je nach Reaktivität der einzelnen Komponenten innerhalb von 10 Minuten bis 2 Stunden beendet [S. Hünig et al.fLiebigs Ann. Chem. 676, S. 32-65 (1964)].The production of the connections I ? takes place in a manner known per se by reacting 2-halogen or 2-mercapto-quaternary salts with a corresponding N-alkylated hydrazone salt with the addition of an amine, preferably triethylamine in a polar solvent (eg methanol) at a temperature of 15-100.degree Depending on the reactivity of the individual components, the reaction is complete within 10 minutes to 2 hours [p. Hünig et al. f Liebigs Ann. Chem. 676 , pp. 32-65 (1964)].

Die Darstellung der als Ausgangaprodukte verwendeten Hydrazone sowie der Ν-quaternisierten Salze erfolgt analog den von S. Hünig (Ann. Chem. 6Ο9, S.160-180 [1957J) und H. Balli (Liebigs Ann. Chem. £££, S.1-8 [196IJ) angegebenen Vorschriften. Die Verbindungen I1 können erfindungsgemäß sowohl für den optischen Test in der Küvette, als auch auf Reagenzpapieren und in Reagenzfolien allein oder zusammen mit den "Modifiern" der Formel II eingesetzt werden.The hydrazones used as starting products and the Ν-quaternized salts are represented analogously to that of S. Hünig (Ann. Chem. 6Ο9 , pp.160-180 [1957J) and H. Balli (Liebigs Ann. Chem. £££, p 1-8 [196IJ) specified regulations. According to the invention, the compounds I 1 can be used both for the optical test in the cuvette and on reagent papers and in reagent foils either alone or together with the "modifiers" of the formula II.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel sind in den folgenden Beispielen näher erläutert:The method according to the invention and the diagnostic means are in explained in more detail in the following examples:

-Λ-Λ

0098427079100984270791

Beispielexample Reagenzfilm zum Nachweis von GlucoseReagent film for the detection of glucose

45 g Propiofan (BASF), 35 g einer Lösung von 37 g Algipon in 2 Liter eines 0,5 molaren Phosphat- oder Citratpuffers vom pH 5»7» 1 E Texapon P. (Pa. Henkel Düsseldorf), 10 ml Wasser, 0,075" 6 Peroxidase und 0,15 g Glucoaeoxidase werden zu einem homogenen Brei verrührt. Zu dieser Mischung gibt man 6 ml einer maximal 5 foigen methanolischen Lösung eines der nachstehend aufgeführten Indikatoren, sowie gewünschtenfalls einen der Modifier der Formel II, welcher in den nachfolgend angeführten Lösungsmitteln gelöst und zu der Indikatormischung gegeben wird. Mit den so hergestellten Mischungen, in denen bis zu 0,3 $ Indikator enthalten sind, werden Folien in einer Schichtdicke von 300 /u beschichtet und getrocknet. Auf einen derart hergestellten Teststreifen bringt man einen Tropfen glucosehaltigen Blutes, läßt diesen einige Zeit einwirken und erhält nach dem Abwischen des Tropfens die in der Tabelle I angegebenen Farbreaktionen, welche je nach Glucose-Konzentrationen mehr oder weniger stark abgestuft sinda45 g Propiofan (BASF), 35 g of a solution of 37 g Algipon in 2 liters of a 0.5 molar phosphate or citrate buffer with a pH of 5-7-1 E Texapon P. (Pa. Henkel Düsseldorf), 10 ml of water, 0.075 " 6 Peroxidase and 0.15 g Glucoaeoxidase are stirred to a homogeneous paste. To this mixture are added 6 ml of a maximum 5- fold methanolic solution of one of the indicators listed below and, if desired, one of the modifiers of the formula II, which is in the solvents listed below The mixtures produced in this way, which contain up to 0.3 $ indicator, are coated with a layer thickness of 300 μl and dried. A drop of glucose-containing blood is placed on a test strip produced in this way , lets it take effect for some time and, after wiping off the drop, receives the color reactions given in Table I, which are more or less pronounced depending on the glucose concentrations tiered are a

Indikatoren der Formel I1:Indicators of formula I 1 :

A 2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzoxazolon(2)] B l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)3-2-[l-äthylpyridon(2)]-azin C l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)J-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)J-azin D l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[l-äthylchinolinon(2)]-azinA 2,2'-azino-di- [3-ethylbenzoxazolone (2)] B l- [3-ethylbenzoxazolone (2) 3-2- [l-ethylpyridone (2)] azine C1- [3-ethylbenzoxazolone (2) I-2- [3-ethylbenzthiazolone (2) I-azine D l- [3-ethylbenzoxazolone (2)] - 2- [l-ethylquinolinone (2)] azine

E 1-[l-Äthyl-3 s 3-dimethyl-indolinon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin E 1- [1-ethyl-3 s 3-dimethyl-indolinone (2)] - 2- [3-ethylbenzthiazolone (2)] - azine

F l-[3-Methylbenzthiazolon(2)]-2-L,-athyl-6-chlorpyridon(2)J-azin F 1- [3-methylbenzthiazolone (2)] -2-L , -ethyl-6-chloropyridone (2) J-azine

G l-[l-Äthylchinolon(2)]-2-[l-äthyl-6-chlorpyridon(2)]-azinG l- [l-ethylquinolone (2)] - 2- [l-ethyl-6-chloropyridone (2)] azine

009842/0791009842/0791

Tabelle ITable I.

Indikator :Indicator: I1 Modifiersubatanzen jI 1 modifier substances j
IIII Modifier-Modifier
KönzentratioiKoenzentratioi gelöstsolved
ι inι in FarbreaktionenColor reactions I
' orange I.
'orange AA. fliederfarbenlilac violettviolet AA. (1-Amino-naphthol-(1-amino-naphthol-
8)-2,4-diaulfon-8) -2,4-diaulfone-
säureacid 0,20.2 Wasserwater grüngreen I
grün I.
green AA. Naphthylamin(1) -Naphthylamine (1) -
sulfonsäure(6)sulfonic acid (6) 0,050.05 |0Na0H| 0 NaOH rosapink i rosai pink
!! AA. p-Aminosalicyl-p-aminosalicylic
eäureacid 0,10.1 MethanolMethanol orangeorange AA. m-Aminophenolm-aminophenol 0,0070.007 Wasserwater orangeorange BB. o-Aminophenol-o-aminophenol
p-sulfonsäurep-sulfonic acid 0,20.2 Wasserwater blaublue BB. (1-Amino-naph-(1-amino-naph-
thol-8)-2,4-thol-8) -2,4-
disulfonsäuredisulfonic acid 0,20.2 Wasserwater grüngreen BB. p~Aminosalicyl~p ~ aminosalicylic ~
eäureacid 0,10.1 MethanolMethanol rosapink BB. m-Aminophenolm-aminophenol 0,0070.007 Wasserwater rosapink BB. p-Phenetidinp-phenetidine 0,050.05 MethanolMethanol rotbraunred-brown CC. Naphthylamin(I)-Naphthylamine (I) -
sulfonsäure(6)sulfonic acid (6) 0,050.05 |0Na0H| 0 NaOH fleischfarbenflesh colored CC. Napthylamin(l)-Napthylamine (l) -
sulfonsäure(e)sulfonic acid (s) 0,10.1 DimethylDimethyl
formamid rosa-violettformamid pink-violet CC. p-Aniino-sali-p-aniino-sali-
cy!säurecy! acid 0,10.1 MethanolMethanol DD. o-Arainophenol-o-arainophenol-
p-aulfonsaurap-aulfonic aura 0,20.2 Wasserwater DD. (i-Amino-naph-(i-amino-naph-
thol-8)-2,4-thol-8) -2,4-
disulfonsäuredisulfonic acid 0,20.2 Wasserwater DD. p-Aminoaalicyl-p-aminoaalicyl-
säureacid
•• 0,1
I
t 0.1
I.
t MethanolMethanol

009842/0791009842/0791

Fortsetzung Tabelle!Continuation of the table!

Indikator I'Indicator I ' ν
Modifiersubstanzenν
Modifier substances Modifier-Modifier gelöstsolved FarbreaktionenColor reactions IIII KonzentratiorConcentrator 1 in1 in EE. __ __ rotRed EE. p-Aminosalicyl-p-aminosalicylic säureacid 0,10.1 MethanolMethanol fliederfarbenlilac E ·E m-Aminophenolm-aminophenol 0,0070.007 Wasserwater violettviolet EE. (1-Aminonaphthol-(1-aminonaphthol- 8)-2,4-disulfon-8) -2,4-disulfone- säureacid 0,20.2 Wasserwater hellgrün-graugrlight green-gray-green FF. p-Aminosalicyl-p-aminosalicylic säureacid 0,10.1 MethanolMethanol geIbgrünyellow green ΰΰ p-Aminosalicycl-p-aminosalicyclic säureacid 0,10.1 MethanolMethanol braunBrown

Beispiel 2Example 2

Hochempfindlicher Nachweis von Wasserstoffperoxid in Flüssigkeiten.Highly sensitive detection of hydrogen peroxide in liquids.

1 ml einer 0,2 $igen methanolischen Lösung von l-[l-Äthyl-3,3-dimethylindolinon-(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin, 1 ml einer 0,1 $igen methanolischen Lösung von p-Aminosalicylsäure, 0,03 nl einer 1 ^igen Lösung von Peroxidase in einem 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH 5,7 und 0,05 ml einer Lösung von Wasserstoffperoxid werden zusammen pipettiert, umgerührt und bei einer Wellenlänge von 530 nm gemessen. Die1 ml of a 0.2% methanolic solution of l- [l-ethyl-3,3-dimethylindolinone- (2)] - 2- [3-ethylbenzthiazolone (2)] azine, 1 ml of a 0.1% methanolic solution of p-aminosalicylic acid, 0.03 nl of a 1 ^ igen Solution of peroxidase in a 0.1 molar phosphate buffer of pH 5.7 and 0.05 ml of a solution of hydrogen peroxide are pipetted together, stirred and measured at a wavelength of 530 nm. the

Wasserstoffperoxid-Konzentration wird mit Hilfe einer vorher aufgestellten Eichkurve bestimmt.Hydrogen peroxide concentration is determined using a previously established Calibration curve determined.

009842/0791009842/0791

Beispiel 3Example 3

Nachweis von Glucose im HarnDetection of glucose in urine

Ein Filterpapier (2316 der Fa. Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 75 mg Peroxidase, 143 mg Glucoseoxidase und 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 5»6 imprägniert und getrocknet. Das in dieser Weise imprägnierte Papier wird anschließend in eine Lösung von 0,2 g l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)J-2-[l-äthylchinolinon(2)]-azin und 0,1 g p-Aminosalicylsäure in 100 ml Methanol getaucht und getrocknet. Beim Benetzen eines Streifens des so hergestellten Heagenzpapieres mit Harn, welcher pathologische Glucosemengen enthält, verfärbt sich dieser je nach Glucosekonzentration verschieden stark rotviolett.A filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is mixed with a solution of 75 mg peroxidase, 143 mg glucose oxidase and 0.25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) impregnated in 100 ml of a 0.1 molar phosphate buffer with a pH of 5-6 and dried. The paper impregnated in this way is then in a solution of 0.2 g of l- [3-ethylbenzoxazolone (2) J-2- [l-ethylquinolinone (2)] - azine and 0.1 g of p-aminosalicylic acid immersed in 100 ml of methanol and dried. When wetting a strip of the so made heap paper with urine, which shows pathological glucose levels contains, it turns red-violet to varying degrees depending on the glucose concentration.

Beispiel 4Example 4 Nachweis von Blut in KörperflüssigkeitenDetection of blood in body fluids

Ein Filterpapier (23 S der Fa. Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) und 100 mg Natriumalginat in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffers vom pH 5,6 imprägniert und getrocknet. Das so hergestellte Papier wird mit einer Lösung von 0,2 g l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[l-äthylchinolinon(2)]-azin und 0,1 g p-Aminosalicylsäure in 100 ml Methanol imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Reagenzpapier einen Tropfen einer Körperflüssigkeit, welche,Blut enthält, und tropft anschließend 3 /£iges Wasserstoffperoxid auf das Papier, so färbt ea sich noch bei einer Blutkonzentration von 1:50.000 rotviolett.A filter paper (23 S from Schleicher & Schüll) is impregnated with a solution of 0.25 ml of Texapon P (from Henkel, Düsseldorf) and 100 mg of sodium alginate in 100 ml of a 0.1 molar phosphate buffer of pH 5.6 and dried. The paper produced in this way is impregnated with a solution of 0.2 g of l- [3-ethylbenzoxazolone (2)] - 2- [l-ethylquinolinone (2)] azine and 0.1 g of p-aminosalicylic acid in 100 ml of methanol and dried. If a drop of a body fluid which contains blood is placed on a reagent paper produced in this way, and 3 % hydrogen peroxide is then dripped onto the paper, it turns red-violet at a blood concentration of 1: 50,000.

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Beispiel 5Example 5

Nachweis von Hydroperoxiden in FlüssigkeitenDetection of hydroperoxides in liquids

Ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer Lösung von 40 m8 Peroxidase und 0,25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Düsseldorf) in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphatpuffeis vom pH 5,6 imprägniert und getrocknet. Anschließend wird das so vorbereitete Papier mit einer kalt gesättigten methanolischen Lösung von l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Reagenzpapier Lösungen von Wasserstoffperoxid in verschiedener Konzentration, so färben sich die Papiere je nach Wasserstoffperoxid-Konzentration verschieden stark grünblau. Die untere Nachweisgrenze liegt bei 0,01 γ Wasserstoffperoxid/ml. A filter paper (2316 of the firm Schleicher & Schull) is treated with a solution of 40 m 8 peroxidase and 0.25 ml Texapon P (Fa. Henkel, Dusseldorf) in 100 ml of 0.1 molar pH 5.6 Phosphatpuffeis from impregnated and dried . The paper prepared in this way is then impregnated with a cold, saturated methanolic solution of 1- [3-ethylbenzoxazolone (2)] - 2- [3-ethylbenzthiazolone (2)] azine and dried. If on a test paper thus prepared solutions of hydrogen peroxide in different concentrations, then the papers color depending on the concentration of hydrogen peroxide to different degrees green blue. The lower detection limit is 0.01 γ hydrogen peroxide / ml.

Beispielexample Nachweis von Glucose in LösungDetection of glucose in solution

1 ml einer Lösung, welche eine der nachstehend aufgeführten Indikatorverbindungen I1 je nach Löslichkeit bis zu einer Konzentration von 1 fo enthält, wird mit 1 ml einer Lösung von 150 mg Glucoseoxidaae und 75 cig Peroxidase in 100 ml eines 0,1 molaren Phosphat puffers vom pH 5 »6 und 1 ml einer Qlucoselöaung vereinigt. Man erhält die in der Tabelle II angegebenen Farbreaktionen. Als Modifier wird jeweils 0,1 ml einer 1 foigen methanolischen Lösung von p-Aminosalicylaäure zugegeben.1 ml of a solution which contains one of the indicator compounds I 1 listed below, depending on solubility up to a concentration of 1 fo , is mixed with 1 ml of a solution of 150 mg Glucoseoxidaae and 75 cig peroxidase in 100 ml of a 0.1 molar phosphate buffer from pH 5 »6 and 1 ml of a glucose solution combined. The color reactions given in Table II are obtained. 0.1 ml of a 1- fold methanolic solution of p-aminosalicylic acid is added as a modifier.

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Tabelle IITable II Indikator I«Indicator I «

Fp. 0CMp. 0 C Reaktionsfarbe ohne mit ModifierReaction color without with modifier

2,2'-Azino-di-[3-äthylbenzozazolon(2)J2,2'-Azino-di- [3-ethylbenzozazolone (2) J.

l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2- [1- äthylpyridon(2)]-azin1- [3-ethylbenzoxazolone (2)] - 2- [1- ethylpyridone (2)] azine

1-Γ 3-Äthylbenzoxazolon(2)]-2-[l- äthylohinolinon(2)J-azin1-Γ 3-ethylbenzoxazolone (2)] - 2- [l-ethylohinolinone (2) J-azine

l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)]-l- [3-ethylbenzoxazolone (2)] -

2-[3-äthylbenzthiazolon(2)]-azin2- [3-ethylbenzthiazolone (2)] azine

l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)J-2-[lf3-diäthylbenzimidazolon (2)]-azin1- [3-ethylbenzoxazolone (2) J-2- [lf3-diethylbenzimidazolone (2)] - azin

216-217 I45-I46216-217 I45-I46

199199

I93-I94I93-I94

215-216215-216

l-[3-Äthylbenzoxazolon(2)J-2-[l-äthyl-6-chlor-pyridon(2)J-azin l- [3-ethylbenzoxazolone (2) I-2- [l-ethyl-6-chloropyridone (2) I-azine

l-[l-Xthyl-3,3-dioethylindolinon(2)J-2-ί3-äthylbenzthiazolon(2)J-azin1- [1-Xthyl-3,3-dioethylindolinone (2) J-2-ί3-ethylbenzthiazolone (2) J-azine

1-[l-Äthyl-3,3-dimethylindolinon(2)J-2-Γ3-nethylbenzthiazolon(2)J-azin1- [1-ethyl-3,3-dimethylindolinone (2) J-2-Γ3-ethylbenzthiazolone (2) J-azine

1-[l-Äthyl-3,3-dinethylindolinonf 2)]-2~t1- äthylchinolinon(2)J-azin1- [1-Ethyl-3,3-dinethylindolinone (2)] - 2 ~ t1-ethylquinolinone (2) J-azine

2,2·-Azino-di[3-äthylbenzoxazolon-2-aulfonsäure-6]2,2 · -Azino-di [3-ethylbenzoxazolone-2-aulphonic acid-6]

2,2'-Azino-di[3-äthylbenz2,2'-azino-di [3-ethylbenz oxazolon-2-ama'oniuiD8ul-oxazolone-2-ama'oniuiD8ul- fonat-6]fonat-6]

206-209206-209

199 j199 y

258-260[Zers.]258-260 [decomp.]

300 [Zers.] blau 300 [decomp.] Blue

violett violett blau violet violet blue

violettviolet violettviolet

rotbraunred-brown

rotRed

rotRed

rotRed

braunorangebrown orange

rotRed

rotbraun rotviolettred-brown red-violet rotbraun rotviolettred-brown red-violet rotorange braunorangered-orange brown-orange

blaublue

blaublue

rotbraunred-brown

rotbraunred-brown

009842/0791009842/0791

Claims (6)

in welcherin which R, eine niedere Alkylgruppe,R, a lower alkyl group, R_ Wasserstoff, eine Sulfonsäuregruppe oder eine Alkalisulfonatgruppe, R_ hydrogen, a sulfonic acid group or an alkali sulfonate group, R,1 Wasserstoff, ein Halogenatom oder eine niedere Alkylgruppe,R, 1 is hydrogen, a halogen atom or a lower alkyl group, Y ein Stickstoffatom oder eine Methingruppe, welche gegebenenfalls auch zusammen mit R ' einen durch R„ substituierten Benzolring bilden kann,Y is a nitrogen atom or a methine group, which optionally also together with R 'one substituted by R " Can form benzene ring, einer der Reste X1 ein Schwefelatom, eine Vinylengruppe, eine gegebenenfalls nieder-alkylierte oder-arylierte Iminogruppe, ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen Substituiertes Kohlenstoffatom bedeutet, während der andere Rest X1 ein Sauerstoffatom oder ein mit zwei niederen Alkylgruppen substituiertes Kohlenstoffe ton; darstellt, wobei dieser für den Fall, daß R' ein Halogene ton bedeutet, auch ein ochwefelatoc, eine Vinylengruppe oder eine gegebenenfalls niedere alkylierte oder arylierte Iminogruppe sein kann.one of the radicals X 1 is a sulfur atom, a vinylene group, an optionally lower alkylated or arylated imino group, an oxygen atom or a carbon atom substituted with two lower alkyl groups, while the other radical X 1 is an oxygen atom or a carbon substituted with two lower alkyl groups ; represents, where this, in the event that R 'is a halogen clay, can also be an ochulfuratoc, a vinylene group or an optionally lower alkylated or arylated imino group. 009842/0791009842/0791 BAD ORIGINALBATH ORIGINAL 2. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxida'se oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen Substanzen der Formel I' enthalten.2. Diagnostic means for the determination of hydroperoxides or substances, which react with the release of hydroperoxide, consisting of peroxidase or a peroxidatically active substance and a Chromogen, characterized in that they contain substances of the formula I 'as chromogen. 3. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen Substanzen der Formel I1 enthalten.3. Diagnostic agents for the determination of hemoglobin or other peroxidatically active substances consisting of hydroperoxide or hydroperoxide-forming substances and a chromogen, characterized in that they contain substances of the formula I 1 as chromogen. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich Substanzen der allgemeinen Formel II4. The method according to claim 1, characterized in that one additionally Substances of the general formula II (II),(II), in welcherin which Ar einen Benzol- oder Naphtha linkem,Ar a benzene or naphtha on the left, V eine Hydroxyl- oder Aminogruppe,V is a hydroxyl or amino group, V Wasserstoff oder eine gegebenenfalls alkylierte oder arylierte Hydroxyl- oder Aminogruppe,V hydrogen or an optionally alkylated or arylated hydroxyl or amino group, W eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe undW is an amino, alkoxy, alkyl, aryl, carboxy or sulfonic acid group and V/1 Wasserstoff oder eine Amino-, Alkoxy-, Alkyl-, Aryl-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppe bedeuten, sowie gegebenenfalls deren Alkali'salze, verwendet.V / 1 denotes hydrogen or an amino, alkoxy, alkyl, aryl, carboxy or sulfonic acid group, and optionally their alkali metal salts are used. 009842/0791009842/0791 BAD ORiGiNALBAD ORiGiNAL 5. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chromogen ein Gemisch von Substanzen der Formel I1 und der Formel II. enthalten.5. Diagnostic agents for the determination of hydroperoxides or substances that react with the release of hydroperoxide, consisting of peroxidase or a peroxidatically active substance and a chromogen, characterized in that they are a mixture of substances of formula I 1 and formula II as the chromogen . contain. 6. Diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chronogen ein Gemisch von Substanzen der Formel I' und der Formel II enthalten.6. Diagnostic means for determining hemoglobin or others peroxidatically active substances consisting of hydroperoxide or Hydroperoxide-forming substances and a chromogen, characterized in that they are a mixture of substances of the chronogen Formula I 'and Formula II included. 009842/0791009842/0791 BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
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