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Verfahren zur Herstellung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin auf biologischem
Wege Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 7-Chlor-6-desmethyltetracvclin
durch aerobe Kultivierung 7-Chlortetracyclin bildender Stämme von Strepto:nyces
in wäßrigen Nährmedien.
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Es ist bekannt, zur biologischen Herstellung von 6-Desmethyltetracyclin
bzw. 7-Chlor-6-de3methyltetracyclin durch aerobe Fermentation eines wäßrigen Nährmediums
bestimmte Mutanten des Stammes Streptomyces aureofaciens A-377 (hinterlegt unter
der Nr. NRRL 2209 in derAgriculture Culture Collection, Northern Utilization Research
and Development Division in Peoria, Illinois, USA), z. B. S-604, ATCC 12551, 12552,
12553 und 12554, zu verwenden.
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Es ist ferner bekannt, daß man die Bildung von 7-Chlor- bzw. 7-Bro:n-6-desmethyltetracyclin
durch ein Chloridionen bzw. Bromidionen enthaltendes Nährmedium steuern kann. Gewöhnlich
bildet sich während der Fermentation als Nebenprodukt von Tetracyclin Chlortetracyclin
und/oder Bromtetracyclin. Die Mengenverhältnisse dieser Verbindungen hängen dabei
vom Chlorid- und/oder Bromidionengehalt des Nährmediums und dem verwendeten Stamm
des Mikroorganismus ab. Nur durch sorgfältige Selektion des Stammes von Streptomyces
aureofaciens war es bisher möglich, die Bildung dieser bekannten Tetracyclin-Antibiotica
nahezu völlig auszuschalten.
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Es ist ferner bereits vorgeschlagen worden, zur Steigerung der Produktion
von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin durch aerobe Fermentation eines wäßrigen Nährmediumsmiteinem7-Chlor-6-d-.smethyltetracyclin
produzierenden Stamm von Streptomyces aureofaciens dem Nährmedium zusätzlich Kupfer
zuzusetzen.
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Die auf diese Weise hergestellten Desmethyltetracyclin-Antibiotica
zeichnen sich durch eine extreme chemische Beständigkeit, vor allem in stark sauren
und alkalischen Lösungen, und durch ihre erhöhte Retention im menschlichen Kreislauf
aus.
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Somit steht die therapeutische Bedeutung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin
außer Frage. Man versucht daher, möglichst einfache und leistungsfähige Verfahren
zur Herstellung dieser Antibiotica zur Verfügung zu stellen. Dies bedeutet, daß
es äußerst erwünscht ist, die Herstellung der 6-Desmethyltetracyclin-Verbindungen
mit einer möglichst geringen Beschränkung hinsichtlich der als Ausgangsmaterial
verwendeten Mikroorganismen durchzuführen und ohne die Last, bestimmte Stämme des
Mikroorganismus zur Verwendung beim Fermentationsverfahren auswählen zu müssen.
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Die Erfindung betrifft nun ein neues Verfahren zur Herstellung von
7-Chlor-6-desmethyltetracyclin in guter Ausbeute auf biologischem Wege, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man an sich nur 7-Chlortetracyclin bildende Stämme von Streptomyces
in einem üblichen, Chloridionen enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen
in Gegenwart von 4-Aminopteroylglutaminsäure oder deren Salz kultiviert und das
Antibioticum aus der Gärmaische isoliert. Die 4-Aminopteroylglutaminsäure liegt
in einer hemmenden Konzentration vor, die vorzugsweise zwischen etwa 100
und 1000 mg/1 und zur Erzielung bester Ergebnisse zwischen etwa 400 und 800
mg/1 beträgt.
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Zu den Tetracyclin erzeugenden Stämmen von Streptomyces, die bei der
Herstellung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin nach dem neuen Verfahren der Erfindung
verwendet werden können, gehören S. aureofaciens ATCC 13899, S. aureofaciens ATCC
13900, S. aureofaciens ATCC 12416a, S. aureofaciens ATCC 12416b, S. aureofaciens
ATCC 124l 6c, S. aureofaciens NRRLB 1288, S. aureofaciens NRRL 2209, S. aureofaciens
NRRLB 1286, S. aureofaciens NRRL B 1287 und S. viridifaciens ATCC 11989.
Die
im erfindungsgemärea Verfahren angewandte Fermentation kann unter den allgemein
bei der Herstellung von Tetracyclin angewandten Bedingungen durchgeführt werden.
Das Nährmedium, die Zeit-und Temperaturbedingungen, die pH-Kontrolle, die Belüftung
u. dgl. entsprechen daher den bei der Herstellung von Tetracyclin verwendeten Bedingungen.
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Wenn das Nährmedium nur einen geringen Gehalt an biologisch verwertbarem
Chlorid aufweist, d. h. ein Medium verwendet wird, das nur solches Chlorid enthält,
welches normalerweise als Bestandteil eines der Komponenten des Mediums zugegen
ist, werden neben dem gewünschten 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin noch Tetracyclin
und 7-Chlortetracyclin in unterschiedlichen Mengen gebildet. Gibt man dem 4-Aminopteroylglutaminsäure
enthaltenden Nährmedium zusätzlich biologisch verwertbares Chlorid zu, so wird unter
nahezu vollständigem Ausschluß von Tetracyclin nur 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin
und 7-Chlortetracyclin gebildet.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel l Eine Kultur
von Streptomyces aureofaciens (ATCC 13 900) wi rd in etwa 50m1 eines wäßrigen Medi
ums gezüchtet, das in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben enthalten ist und
je 1000m1 Lösung, 30g
extrahiertes Sojabohnenmehl, 50 g Glucose und 7 g Calciumcarbonat
enthält. Der Kolben wird auf einer Rotationsschüttelmaschine (280 U/min) in einem
auf 25'C gehaltenen Raum 72 Stunden geschüttelt. 10°/o des erhaltenen Inoculums
werden dann in einen 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben übergeführt, der 50 ml des
vorgenanntep Nährmediums enthält und der dann 72 Stunden unter den gleichen Bedingungen
geschüttelt wird. 1 ml des erhaltenen lnoculums wird dann zum Animpfen von 10 ml
eines wäßrigen Nährmediums verwendet, das in einem Reagenzglas der Größe 2,5 ;x
15 cm enthalten ist und das je 1000 ml Lösung 30 g extrahiertes Sojabohnenmehl,
50 g Glucose und 7 g Calciumcarbonat enthält. In das Reagenzglas werden dann 5 mg
sterile 4-Aminopteroylglutaminsäure gegeben, und das Reagenzglas wird auf einer
Rotationsschüttelmaschine mit 280 U/min 7 Tage bei 25°C geschüttelt. Der Inhalt
des Reagenzglases wird durch Zugabe von Schwefelsäure bis auf einen pH-Wert von
2 angesäuert und zentrifugiert. Die papierchromatographische Untersuchung der überstehenden
Flüssigkeit zeigt das Vorliegen von 7-Chlor-6-desniethyltetracyclin, 7-Chlortetracyclin
und Tetracyclin. Beispiel 2 Beispiel 1 wird wiederholt. Nach den beiden jeweils
72 Stunden dauernden lnkubationsperioden wird 1 ml des erhaltenen Inoculums zum
Animpfen von 10 ml eines wäßrigen Nährmediums verwendet, das in einem Reagenzglas
der Größe 2.,5 X 15 cm enthalten ist und das je 1000 ml Lösung 30 g extrahiertes
Sojabohnenmehl, 50 g Glucose, 7 g Calciumcarbonat sowie noch I g Natriumchlorid
enthält. Die weitere Verarbeitwig erfolgt gemäß Beispiel 1. Die papierchromatographische
Untersuchung des Proluktes ergibt das Vorliegen von 7-Chlor-F-desmethyltetraeyclin
und 7-Chlt@rtcti-zic#clin. Tetracyclin liegt nur in Spuren vor.
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ßeispiel3 Ein 2501111 fassender Er leiinieycrkolben, der
50m1
eines wäßrigen Nährmediums enthält. das je 1000 ml 30 g extrahiertes
Sojabohnenmehl. 50 g Glucose, 7 g Calciumcarbonat und 1 g Natriumchlorid enthält,
wird mit 25 mg steriler 4-Aniinopteroylglutaminsäure und 1 ml des nach dem im Beispiel
1 beschriebenen Verfahren hergestellten Inoculums von Streptomyces aureoraciens
(ATCC 13900) beschickt. Der Kolben wird 7 Tage bei 25C auf einer Rotationsschüttelmaschine
mit 280 U;min geschüttelt. Der Inhalt des Kolbens wird dann mit Schwefelsäure auf
einen pH-Wert von 2 angesäuert. Das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und dann mit
einem Filtrierhilfsmittel auf Basis Diatomeenerde filtriert. Das Filtrat wird mit
Natriumhydroxyd auf einen PH-Wert von 9,0 eingestellt und dann mit drei Anteilen
von je 350 ml n-Butanol extrahiert. Die Lösungsmittelphase wird mit Schwefelsäure
auf einen pH-Wert von 2,2 angesäuert und im Kühlraum 65 Stunden stehengelassen.
Anschließend wird die Lösungsmittelphase filtriert. Nach dem im Beispiel 1 beschriebenen
papierchromatographischen Verfahren wird die Gegenwart von 7-Chlor-6-desniethyltetracyclin,
7-Chlortetracyclin und Tetracyclin nachgewiesen.
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Das n-Butanol wird dann bei 50- C im Hochvakuum abgetrennt. Der braune
viskose Rückstand wird in einem Gemisch aus 100 ml destilliertem Wasser und 10 ml
konzentrierter Salzsäure suspendiert und 30 Minuten auf 75-C erwärmt. Nach dem Abkühlen
wird das Gemisch mit Kaliumhvdroxyd auf einen PH-Wert von 1,8 eingestellt und filtriert.
Das Filtrat wird mit 22 ml Chloroform extrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht
wird mit 100 ml n-Biitanol extrahiert. Bei der chromatographischen Untersuchung
des Butanolauszugs nach dem im Beispiel 1 angewandten Verfahren wird die Gegenwart
von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin nachgewiesen. Andere biologisch wirksame Substanzen
liegen nur in geringsten Spuren vor. Bei spiel4 Das im Beispiel l beschriebene Verfahren
wird wiederholt, jedoch werden an Stelle von 5 mg steriler 4-Aminopteroylglutaniinsäure
deren Natriumsalz, das durch Lösen von 5 mg 4-Aminopteroylglutaminsäure in 1 ml
einer 0,1°/"igen Natriumcarbonatlösung erhalten worden ist, dem Reagenzglas zugesetzt,
welches das Inoculum und das Nährmedium enthält. Der Reagenzglasinhalt wird nach
beendeter Fermentation durch Zugabe von Schwefelsäure auf einen PH-Wert von 2,0
eingestellt und zentrifugiert. Durch papierchromatographische Untersuchung der überstehenden
Flüssigkeit wird die Gegenwart von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin, 7-Chlortetracyclin
und von Tetracyclin nachgewiesen.
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Wenn in den vorgenannten Beispielen andere Stämme von Streptomyces
aureofaciens, z. B. Streptomyces aureofaciens ATCC 12416a, oder ein Stamm von Streptomyces
viridifaciens, z. B. S. viriuifaciens ATCC 11989, an Stelle von S. aureofaciens
ATCC 13900 verwendet werden, erhält man ebenfalls 7-Chlor-6-desmthyltetracyclin.