DE1102973B - Verfahren zur Herstellung von hoch gereinigten Kallikrein-Praeparaten - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von hoch gereinigten Kallikrein-Praeparaten

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DE1102973B
DE1102973B DEF30830A DEF0030830A DE1102973B DE 1102973 B DE1102973 B DE 1102973B DE F30830 A DEF30830 A DE F30830A DE F0030830 A DEF0030830 A DE F0030830A DE 1102973 B DE1102973 B DE 1102973B
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kallikrein
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highly purified
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Dr Eugen Werle
Dipl-Chem Dr Ivar Trautschold
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Bayer AG
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6445—Kallikreins (3.4.21.34; 3.4.21.35)

Description

DEUTSCHES
Das Kreislaufhormon Kallikrein wird seit Jahren bei Durchblutungsstörungen therapeutisch angewandt. Es wird vornehmlich aus Pankreas, Submaxillaris und Harn gewonnen.
Bei den gebräuchlichen Reinigungsmethoden des Kallikreins treten Schwierigkeiten auf, weil sich der Wirkstoff schlecht von den begleitenden Eiweißstoffen abtrennen läßt.
Eiweißhaltige Kallikrein-Produkte haben jedoch den Nachteil, daß bei ihrer therapeutischen Anwendung unerwünschte Nebenerscheinungen auftreten können.
Es wurde nun gefunden, daß man hoch gereinigte Kallikrein-Präparate dadurch herstellen kann, daß man Kallikrein aus seinen Lösungen an basisch substituierte Zellulose adsorbiert, das Adsorbat mit einer stark verdünnten, gepufferten Elektrolytlösung so lange wäscht, bis ein nahezu eiweißes Filtrat erhalten wird, und den Wirkstoff aus dem Adsorbat mit einer mindestens l°/oigen gepufferten Elektrolytlösung eluiert.
Unter den basisch substituierten Zellulosen sind die Diäthylaminoäthyl-Zelhilose (DEAE-Zellulose) und die Triäthylaminoäthyl-Zellulose (TEAE-Zellulose) besonders gut geeignet. Gute Ergebnisse werden aber auch mit p-Aminobenzyl-Zellulose (PAB-Zellulose) und mit Ecteola (Reaktionsprodukt aus Epichlorhydrin, Triäthanolamin und Na-Zellulose) erzielt.
Die genannten basisch substituierten Zellulosen werden zweckmäßig mit Pufferlösungen, vorzugsweise Phosphatpufferlösungen, vorbehandelt, wobei die Konzentration dieser Pufferlösungen M/50 nicht übersteigen soll.
Die Adsorption an die genannten basisch substituierten Zellulosen kann in einem sehr weiten pH-Bereich geschehen. Lediglich pH-Bereiche unter 3 und über 10 sind nicht anwendbar, weil in ihnen das Kallikrein ganz oder teilweise zerstört würde. Am zweckmäßigsten arbeitet man im physiologischen pH-Bereich, d. h. bei 6,0 bis 7,5.
Gelegentlich kann es sich als zweckmäßig erweisen, die zu reinigenden Lösungen einer Vorreinigung mit Hilfe sauer substituierter Zellulosen zu unterwerfen.
Nach der Adsorption wird das Adsorbat mit stark verdünnten, gepufferten Elektrolytlösungen, vorzugsweise Kochsalz-Posphatpuffer-Lösungen, so lange gewaschen, bis ein nahezu eiweißfreies Filtrat erhalten wird.
Für die anschließende Elution sind Lösungen sämtlicher Electrolyte geeignet. Hier seien vor allem genannt Lösungen von Kochsalz, Kaliumchlorid, Ammonium-Verfahren zur Herstellung
von hoch gereinigten
Kallikrein-Präparaten
Anmelder:
Farbenfabriken Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen-Bayerwerk
Dr. Eugen Werle
und Dipl.-Chem. Dr. Ivar Trautschold, München,
sind als Erfinder genannt worden
chlorid, Ammoniumsulfat sowie die gebräuchlichen Phosphatpufferlösungen. Für die Elution müssen Lösungen verwendet werden, deren Konzentration mindestens 1 % beträgt. Mit 5°/oigen Lösungen erzielt man quantitative Elution. Aber auch mit höher konzentrierten Lösungen werden gute Ausbeuten erreicht.
Das erfmdungsgemäße Verfahren ermöglicht es, einen guten Reinigungseffekt zu erreichen und das Kallikrein weitgehend vom begleitenden Eiweiß zu trennen. Führt man die Adsorption lediglich durch Verrühren der vorbereiteten basisch substituierten Zellulose mit der Kallikreinlösung durch und arbeitet im übrigen wie angegeben, so kann eine Reinigung auf ungefähr 10 bis 2Oy Protein/KE erreicht werden. Führt man dagegen die Adsorption an Säulen durch, so werden Präparate von 10 bis 3γ Protein/KE erhalten, je nachdem eine einfache Elution oder eine Gradientenelution durchgeführt wird.
Beispiel 1
182 ml einer Submaxillaris -Kallikreinlösung mit 125 KE/ml und 11,2 mg Protein/ml haben eine spezifische Aktivität von 89 γ Protein/KE. 25 g DEAE-Zellulose-Trockenmasse werden in der Hydrochloridform mit M/100-Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert und in die Kallikreinlösung eingerührt. Nach einigem Stehen wird die Zellulose abzentrifugiert und 4mal mit je 200 ml Puffer gewaschen. Die Elution mit 5°/0iger NaCl-Lösung in M/20-Phosphatpuffer (pH 7,0) erfolgt in drei Fraktionen.
Fraktion ml KE/ml mg Protein/ml Protein/KE Gesamt-KE ^-fache Reinigung
1
2
3		 95
100
100		 150
53
30		 3,53
0,85
0,30		 23,6
16
10		 14250
5 300
3 000		 3,8
5,6
8,9
Ausbeute: 99%.
109-537/507
Beispiel 2
2 g Pankreas-Kallikrein-Trockenpulver mit 21 200 KE und 1228 mg Protein (57,7y Protein/KE) werden mit M/100-Phosphatpuffer (pH 7,0) ad 100 ml gelöst und dazu 30 g mit M/100-Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibrierte DEAE-Zellulose (21,7 g Trockenpulver) eingerührt und nach 15 Minuten auf einer Glasfritte mit geringem Unterdruck abgesaugt. Die Zellulose wird zuerst mit 200 ml Puffer gewaschen und dann mit 0,4°/0iger NaCl-Lösung in M/100-Phosphatpuffer (pH 7,0) so lange eluiert, bis der Proteingehalt im Durchlauf mindestens unter 1Oy Protein/ml absinkt. Dabei werden ungefähr 75 % des aufgezogenen Proteins ohne Kallikreinverlust ausgewaschen. Zur Elution wird mit 5°/oiger NaCl-Lösung in M/20-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
Extrakt ml KE/ml mg Protein/ml Protein/KE Gesamt-KE «-fache Reinigung
1
2		 80
45		 207
69		 2,475
0,511		 12
7,4		 16 560
3100		 4,8
7,8
Ausbeute: 92,6°/0.
Beispiel 3
100 ml einer Pankreas-Kallikrein-Lösungmit210 KE/ml und einem Reinheitsgrad von 56,8 γ Protein/KE werden auf eine Säule mit 25 mm lichter Weite gegeben, in die 22 g DEAE-Zellulosepulver mit Puffer verrührt sorgfältig eingeschlämmt und mit Puffer äquilibriert wurden. Die Kallikreinlösung wird mit etwa 2 ml/Min, aufgezogen, anfangs mit Puffer gewaschen und dann mit 0,5°/0iger NaCl-Lösung in M/100-Phosphatpuffer (pH 7,0) so lange eluiert, bis der Durchlauf unter 1Oy Protein/ml liegt. Dabei werden etwa 80 °/0 des aufgezogenen Proteins ohne Kallikreinverlust ausgewaschen. Zur Elution wird mit 5°/0iger NaCl-Lösung in M/20-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
Fraktion ml KE/ml mg Protein/ml Protein/KE Gesamt-KE «-fache Reinigung
1
2
3		 13
14
50		 800
350
50		 8,25
1,51
0,31		 10,3
4,3
6,2		 10 400
4 900
2 500		 5,5
13,2
9,2
Ausbeute: 85%.
Eine Gradientenelution mit einer NaCl-Lösung steigender Konzentration ergibt Kallikrein-Präparate mit 2 bis 3 y Protein/KE.

Claims (3)

PATENTANSPRÜCHE:
1. Verfahren zur Herstellung von hoch gereinigten Kallikrein-Präparaten, dadutch gekennzeichnet, daß man in bekannter Weise gewonnenes Kallikrein aus seinen Lösungen bei pH-Werten von 3 bis 10, besonders 6,0 bis 7,5, an basisch substituierte Zellulosen ad-
35
40 sorbiert, das Adsorbat mit einer stark verdünnten, gepufferten Elektrolytlösung so lange wäscht, bis ein nahezu eiweißfreies Filtrat erhalten wird, und den Wirkstoff aus dem Adsorbat mit einer mindestens l°/0igen,vorzugsweise50/0igenElektrolytlösung eluiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Diäthylaminoäthyl-Zellulose (DEAE-Zellulose) als Adsorptionsmittel verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Triäthylaminoäthyl-Zellulose (TEAE-Zellulose) als Adsorptionsmittel verwendet wird.
© 109 537/507 3.61
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