DE2502095C3 - Verfahren zur Reinigung von Urokinase - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von UrokinaseInfo
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Description
Dii Erfindung belriflt ein \ erfahren zur Reinigung
von Urokinase, mit dem sich aus wäßrigen, rohen
Urokinaselösungen, wie menschlichem Urin, hochgereinigte Urokinase in hohen Ausbeuten erhalten
läßt.
Die im menschlichen Urin auftretende Urokinase ■">
katalysiert die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin, welches zur Auflösung von Fibringerinnseln in
der Lage ist. Gereinigte Urokinase wird klinisch in großem Umfang zur Therapie von peripheren arteriellen
und venösen Thrombosen und Myokardinfark-'< > ten, die auf die Bildung von Fibringerinnseln in Blutgefäßen
zurückzuführen sind, verwendet.
Zur Anreicherung und Reinigung von Urokinase aus menschlichem Urin wurden bisher verschiedene
Absorptionsmaterialien, wie Schwermetallverbin-" > düngen, Bariumsulfat. Kieselsäure und ihre Salze sowie
Ionenaustauscher verwendet; vgl. US-PSen 3542646 und 2983647. Die herkömmlichen Verfahren,
bei denen die genannten Adsorptionsmittel in Kombination miteinander verwendet werden, sind
-<| nicht nur sehr langwierig, sondern ermöglichen auch nur geringe Ausbeuten.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren zur Gewinnung von hochgereinigter Urokinase
zur Verfügung zu stellen, das in guten Ausbeuten ver- 2ϊ läuft. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Die Erfindung betrifft somit die in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstände.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß wasserunlösliche Polysaccharide, die Agarose und Agariii
opectin als Hauptbestandteil enthalten, sich ausgezeichnet als selektive Adsorptionsmittel für Urokinase
eignen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können als Urokinasequellen
menschlicher Urin oder Präparate, die Γι nach den erfindungsgemäßen Verfahren oder nach einem
herkömmlichen Verfahren teilweise gereinigt sind, verwendet werden. Wasserunlösliche Polysaccharide,
die Agarose und Agaropectin als Hauptbestandteile enthalten, weisen einen Agaroseanteil von
ι» mindestens 50% auf. In der Praxis ist es zweckmäßig,
billiges Agar bzw. handelsübliche Sepharosearten, die hauptsächlich aus Agarose bestehen und bisher als
Molekularsiebe eingesetzt wurden, zu verwenden. Agar besteht zu etwa 70% aus Agarose und etwa 30%
■π Agaropectin und ist bekanntlich sehr stabil und billig.
Da Agar zu guten Ergebnissen bei der Reinigung von Urokinase führt, ist dessen Verwendung im erfindungsgemäßen
Verfahren empfehlenswert. Pulverförmiges Agar wird als solches eingesetzt, während
in schwammiges Agar in Form von kleinen Stücken verwendet
wird, um die Adsorptionsfähigkeit zu steigern.
Im erfindungsgemäßen Verfahren entfalten die
eingesetzten Sepharosepräparate eine spezifische Ad-Vi
Sorptionswirkung, die von der vorgenannten Molekularsiebwirkung vollkommen verschieden ist.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Agar und Sepharosepräparate Urokinase bei einem
schwach sauren bis neutralen pH-Wert selektiv adsorwi
bieren. Urokinase wird bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 7,0 vorzugsweise 5,0 bis 6,0 selektiv an den
vorgenannten wasserunlöslichen Polysacchariden adsorbiert.
Bei der Durchführung des eifindungsgemäßen
l·,-, Verfahrens wird eine wäßrige Urokinasclösung, wie
menschlicher Urin, vorzugsweise mil puffernd wirkenden Salzen auf den vorgenannten pH-Bereich eingestellt
und anschließend mit Agar, einem Sepharose-
präparat oder einem ähnlichen wasserunlöslichen Polysacchand, das Agarose und Agaropectin als
Hauptbestandteile enthält und vorher beim gleichen pH-Wert vorzugsweise mit einer Pufferlösung vom
vorgenannten pH-Wert äquilibriert worden ist, in Kontakt gebracht. Dies kann so durchgeführt werden,
daß die Urokinaselösung über eine mit dem Polysaccharid
beschickte Säule gegeben wird oder ein Gemisch aus dem Polysaccharid und der Urokinaselösung
einfach gerührt wird. Die Salzkonzentration liegt dabei bei etwa 0,03 bis 0,15 m. Die Aufnahme der
Uvokinase bei derartig geringen Konzentrationen erleichtert die anschließende Elution mit einer höher
konzentrierten Salzlösung.
Das Polysaccharid mit der adsorbierten Urokinase wird anschließend mit einer wäßrigen alkalischen Lösung
oder einer wäßrigen, höher konzentrierten Lösung eines Neutralsalzes oder einer neutralen Aminosäure
in Kontakt gebracht, wobei die Urokinase selektiv eluiert wird. Es können dabei wäßrige alkalisehe
Lösungen mit einem pH-Wert von etwa 8,0 bis 11,0, vorzugsweise 8,0 bis 10,5 verwendet werden.
Bevorzugt sind etwa 2- bis 4prozentige wäßrige Ammoniaklösungen oder wäßrige Alkalilösungen, deren
Gehalt an einem anorganischen Salz, wie Ammoniumsulfat,
Natriumphosphat oder Natriumchlorid, etwa 0,01 bis 0,15 m oder an einer Aminosäure, wie
Glycin, Arginin oder Histidin, etwa 0,05 bis 2% (Gew./Vol.) beträgt. Als höherkonzentrierte wäßrige
Salzlösung können 0,2 bis 2 m Lösungen eines anorganischen Salzes verwendet werden. Bevorzugt sind
beispielsweise Natriumchloridlösungen mit einer Konzentration von etwa I m, Ammoniumsulfatlösungen
mit einer Konzentration von etwa 0,5 m und Lösungen von neutralen Aminosäuren mit einer Kon-/entrution
von etwa 5 bis 10% (Gew./Vol.).
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Rcinigungs-
und Anreicherungseffekt durch das Auswaschen von Verunreinigungen aus dem mit Urokinase
beladenen Adsorptionsmittel verstärkt.
Als Waschlösung kann Wasser vom pH-Wert unter 7 verwendet werden. Im allgemeinen wird aber die
gleiche neutrale oder se iwach saure Lösung, die zur
Adsorption der Urokinase eingesetzt wird, verwendet. Beispielsweise kann eine 0,05 m Natriumchlorid- oder ■
Natriumphosphatlösung mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 verwendet werden. Es wurde festgestellt, daß
die selektive Entfernung von Verunreinigungen noch weiter durch Zugabe von bestimmten Aminosäuren
oder Salzen von Aminosäuren zur Waschflüssigkeit erhöht wird. In dieser Richtung wirkt beispielsweise
eine Lösung eines anorganischen Salzes vom pH-Wert 5,5 bis 6,5, die 0,05 bis 0,1 m an Lysin, e-Aminocapronsäure,
Glycin, Serin, Cystein, Histidin oder Arginin ist. Unter diesen Aminosäuren wird Lysin besonders
bevorzugt, da seine Wirkung bereits bei niedrigen Konzentrationen eintritt.
Die Adsorptions-, Elulions- und Waschvorgänge des erfindungsgemäßen Verfahrens können auf übliche
Weise durchgeführt werden. Vorzugsweise wird dabei die zu behandelnde wäßrige Lösung über eine
mit einem Adsorptionsmittel beschickte Säule gegeben. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
cluierte Urokinaselösung wird gegebenenfalls gegen Wasser oder eine isotone Lösung dialysiert und dann
in entsprechender Reihenfolge eingeengt und steril filtriert, wodurch man zu physiologisch verträglichen
Urokinasepräparalen gelangt. Diese Präparate können
in gefriergetrocknetem Zustand gelagert werden und vor ihrer Verwendung zu Lösungen verarbeitet
werden.
Die Reinheit der Urokinase wird durch Messung der enzymatischen Aktivität der eluierten Urokinaselösung
gemäß dem von Ploug angegebenen Verfahren berechnet; vgl. Biochem. Biophys. Acta., Bd. 24
(195 7), S. 278. Dabei erhält man Ploug-Einheiten pro
mg Protein. Diese Einheiten werden im folgenden als »spezifische Aktivität« bezeichnet. Das Verhältnis der
spezifischen Aktivitäten von gereinigter Urokinase und dem Ausgangsmaterial ergibt den erreichten Reinigungsfaktor.
Die Ausbeute kann ebenfalls auf diese Weise unter Zugrundelegung der Gesamtenzymeinheiten
berechnet werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man aus menschlichem Urin in
einem Reinigungsschritt Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 7000 bis 10000 Einheiten/mg.
Dementsprechend gelangt man aus teilweise gereinigten Urokinasepräparaten mit einer spezifischen Aktivität
von 300 bis 500 Einheiten/mg zu hochgereinigten Urokinasepräparaten mit spezifischen Aktivitäten
von 20000 bis 3(K)OO Einheiten/mg und Reinigungsfaktoren von mehr als 30, wobei der Reinigungsfaktor
von der Reinheit der als Ausgangslösung verwendeten Urokinaselösüng abhängt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Inssen sich leicht zur Injektion geeignete Präparate erhalten,
wenn man nacheinander menschlichen Urin und gereinigte Urokinasepräparate einsetzt.
Die Agarose und Agaropectin als Hauptbestandteile enthaltenden wasserunlöslichen Polysaccharide,
die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, können ohne Verlust ihrer Adsorptionseigenschaften
nach Waschen mit einer verdünnten und leicht alkalischen oder neutralen Lösung, wie 0,05 m
Natriumchloridlösung vom pH-Wert 7,2 wiederverwendet werden.
Unter dem Ausdruck »%« (Gew./Vol.) sind Gewichtsteile des gelösten Stoffs in 100 Volumteilen Lösung
zu verstehen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Urokinase-Einheiten werden gemäß Ploug bestimmt; vgl.
Biochem. Biophys. Acta. Bd. 24 (1957), S. 278.
Eine Suspension von 10 g pulverförmigem Agar in
1000 ml kaltem Wasser wird 30 Minuten stehengelassen.
Anschließend wird der Überstand abdtkantiert und verworfen. Der Niederschlag wird in eine Säule
der Abmessungen 3 X 15 cm gegeben. Über die Säule werden 200 ml einer 0,15 m Phosphatpufferlösung
vom pH-Wert 5,0 gegeben. Anschließend werden 50 ml einer teilweise gereinigten Urokinase aus frischem
menschlichem Urin (550 Einheiten/mg, 250 Einheiten/ml) im vorgenannten Phosphatpuffer auf
die Säule aufgesetzt. Die Urokinase wird dabei adsorbiert, während Verunreinigungen die Säule ohne Adsorption
passieren. Sodann wird die Säule mit etwa 100 ml Wasser gewaschen. Schließlich wird die Urokinase
mit 100 ml einer 1 η Natriumchlortdlösung eluiert. Die die Urokinase enthaltenden Fraktionen werden
vereinigt und über Nacht gegen eine isotone Kochsalzlösung dialysiert.
Die aul diese Weise erhaltene Urokinase weist eine spezifische Aktivität von 17000 Einheiten/mg auf.
Der Reinigungsfuktor beträgt 3 I und die Ausbeute 82%.
Eine Suspension von 5 g Agarpulver in 250 ml heißem Wasser wird durch 20minütiges mißiges Erhitzen
in eine Lösung verwandelt. Nach dem Abfiltrieren unlöslicher Bestandteile unter Verwendung von Filterpapier
wird das Filtrat in einem anderen Gefäß abgekühlt und sodann bei — 30° C vollständig eingefroren.
Das gefrorene Agar wird allmählich in warmem Wasser geschmolzen, wodurch man poröses, schwammiges
Agar erhält, das in Stücke von 0,1 bis 1 era1 geschnitten
wird.
Menschlicher Urin wird auf den pH-Wert 9,0 eingestellt und von unlöslichen Bestandteilen abzentrifugiert.
Anschließend wird das vorgenannte schwammige Agar in i 000 ml des geklärten Urins gegeben.
Der pH-Wert des Gemisches wird mit der entsprechenden Menge Salzsäure auf 6,0 eingestellt. Anschließend
wird 1 Stunde bei Raumtemperatur mäßig gerührt. Dabei wird die im Urin enthaltene Urokinase
am schwammigen Agar adsorbiert. Während dieser Zeit wird das schwammige Agar gelegentlich zusammengedrückt,
um die Absorption der Urokinase zu fördern. Mit Hilfe von Gaze wird sodann das schwammige Agar abfiltriert. Anschließend wird mit ->
etwa 500 ml einer 0,05 m Natriumchloridlösung vom pH-Wert 5,0, die 0,1 m an Lysin ist, und sodann mit
etwa 1000 ml kaltem destilliertem Wasser gewaschen. Hierauf wird die adsorbierte Urokinase mit 200 ml
einer 0,5 m Ammoniumsulfatlösung eluiert. Das Eluat s"
wird aufgefangen und gegen 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Man erhält 200 ml dialysierte
Urokinaselösung. Die spezifische Aktivität der auf diese Weise erhaltenen Urokinase beträgt 9000
Einheiten/mg. *'>
Das in Beispiel 2 verwendete schwammige Agar wird in eine Säule der Abmessungen 3 X 15 cm gefüllt,
mit etwa 1000 ml einer 0,05 m Natriumchlorid- -t»
lösung vom pH-Wert 7,2 und sodann mit etwa 100 ml 0,03 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 gewaschen.
Anschließend wird eint; Losung von 55 mg roher, aus menschlichem Urin gewonnener Urokinase
(spezifische Aktivität 370 Einheiten/mg) in 20 ml kai- 4ί
tem Wasser auf die Säule aufgesetzt, wobei die Urokinase am Agar adsorbiert wird. Sodann wird die Säule
mit etwa 500 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 mit einem Gehalt an 0,05 m t-Aminocapronsäurc
und hierauf mit 500 ml 0,1 m Phosphatpuffer gewä- >»
sehen. Schließlich wird die Urokinase mit 0,1 m Natriumphosphatlösung
vom pH-Wert 9,0 eluiert, und die die Urokinase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt.
Man erhält auf diese Weise Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 24 000 Einheiten/mg. >5
Der Reinigungsfaktor beträgt 65 und die Ausbeute 82 %.
Be ispiel 4
Eine Suspension von 100 ml Sepharose in kaltem ωι
Wasser wird 1 -Stunde stehengelassen. Anschließend wird der Überstand zusammen mit noch suspendierter
feiner Sepharose abdekantiert. Der Niederschlag wird in eine Säule der Abmessungen 3 x 15 cm gefüllt.
Diese Säule wird mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH- » Wert 6,0 äquilibriert. Anschließend werden 3 Liter
frischer Urin von erwachsenen männlichen Personen mit 0,5 η Salzsäure auf den pH-Wert 6.0 eingestellt
und sodann über die Säule gegeben. Dabei wird die Urokinase selektiv adsorbiert, während der Hauptanteil
der Verunreinigungen die Säule passiert. Die auf der Säule verbliebenen Verunreinigungen lassen sich
'> durch Waschen mit 200 ml 0.05 m Natriumchloridiösungmit
einem Gehalt an 0,05 m Lysin-hydrochlürid
im wesentlichen entfernen. Anschließend wird die Urokinase mit 100 ml 2prozentiger Ammoniaklösung
vom pH-Wert 10.5 eluiert. Die erhaltenen L'roki-1(1
nase-Fraktionen werden gefriergetrocknet. Man erhält 0,5 mg Urokinase mit einer spezifischen Aktivität
von 9400 Einheiten mg.
Beispie! 5
i'i 700 ml Sepharose werden mit 2000 ml kaltem destilliertem
Wasser gewaschen. 30 Liter frischer Urin wird von männlichen erwachsenen Personen gesammelt
und mit 10 Liter kaltem Wasser (praktisch neutral) verdünnt. Der verdünnte Urin wird mit der Se-
-" pharose vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt, wobei die Urokinase an der Sephaio.se adsorbiert wird. Nach dem Abfiltrieren der Sepharose
mit Hilfe von Filterpapier wird sie mit 1000 ml kaltem
destilliertem Wasser und anschließend mit 1000 ml
-j 0,1 m Naltriumchloridlösung vom pH-Wert 6, die 0.1 m an Glycin ist. gewaschen.
Sodann werden 500 ml 0,01 m Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 10 zugegeben. Nach 20- bis 30minütigem
Stehen bei Raumtemperatur wird die von der
«ι Sepharose in die Lösung desorbierte Urokinase durch
Vakuumfiltration abgetrennt. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wird mit Salzsäure auf 7.2 eingestellt.
Nach dem Gefriertrocknen erhall man etwa 5 mg Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 8700
i) Einheiten/mg.
Die Gesamtmenge der in Beispiel 5 verwendeten Sepharose wird in eine Säule gefüllt, durch Waschen
mit einer 0,05 in NatriumchloridUisung icgeneriert
und anschließend mit 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 äquilibriert. Sodann werden 1000 ml einer
Urokinaselösung vom pi i-Wert 6 mit 4 g roher Urokinase
(spezifische Aktivität 430 Einheiten/mg) über die Säule gegeben. Dabei wird die Urokinase spezifisch
an der Sepharose adsorbiert, während der Hauptteil der Verunreinigungen die Säule passiert
Sodann wird die Säule mit 500 ml einer 0.05 m Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 6 uiid anschließend
mit 1400 ml einer 0,05 m Natriumchloridlösung vom pH-Wert 6, die 0,05 m an Lysin-hydrochlorid ist, gewaschen,
wobei die Verunreinigungen praktisch vollständig entfernt werden.
Schließlich wird die Urokinase mit etwa 1500 ml einer 0,01 m Natriumchloridlösung, die mit 1 η Natriumhydroxid
auf den pH-Wert 9,5 eingestellt ist, eluiert. Die auf diese Weise erhaltene Urokinase weist
eine spezifische Aktivität von 32000 Einheiten/mg auf. Der Reinigungsfaktor beträgt 74. bezogen auf die
als Ausgangsmaterial eingesetzte rohe Urokinase. Die Ausbeute beträgt 96%.
Beispiel 2 wird wiederholt mti der Abänderung,
daß 30 Liter Urin verwendet werde; \iuii erhält 100!'
ml einer dialysierten Urokinase!ösur>g mit einer s,;ie/i
fischen Aktivität von TfiOO Linheiten'mg.
Diese Lösung wird iiemäß Beispiel 6 weiter behan-
dolt. Etwa 1500 ml der erhaltenen Lösung werden gegen isotone Natriumchloridlösung dialysiert. Sodann
wird gefriergetrocknet. Man erhält 3,5 mg Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 37OUU
Einheiten/mg.
Der technische Fortschritt des erfindungsgeniäßen
Veii'ahrcns gegenüber dem Verfahren der DT-OS
2 143 816 ergibt sich aus dem Vergleich der Ergebnisse, insbesondere der eingesetzten Produkte und der
erhaltenen spezifischen Aktivitäten der gereinigten Urokinase. Wird Urokinase aus menschlichem Urin
isoliert (vgl. Beispiel 2, 4 und 5 des erfindungsgemäßen
Verfahrens und Beispiel 1 des Verfahrens der DT-OS), so liegt die mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren erhaltene spezifische Aktivität der Urol;i
nase in einen· Bereich von 8700 bis 9400 E/mg, v,äh
rcnd mit dem Verfahren der DT-OS lediglich eim
Aktivität von 4000 E/mg en eicht wird. Bei Verwen dung einer angereicherten, rohen Urokinase (vgl
Lieispiei 1. 3, 6 und 7 des erfindungsgemäben Vcriah
rens und Beispiel 2 und 3 des Verfahrens der DT-OS wird je nach Behandlungsmethode im crlindungsge
mäßen Verfahren eine Aktivität von 17 000 bis 37 ()()( r; mg, i.ii Verfahren der DT-OS eine Aktivität vor
10 000 bis 13 000 (Anreicherungsfaktor des Beispiel»
2:3,25) erhalten. Der im erfir.dungsgemäßen Verfahren erhaltene Anreicherungsfaktor liegt dagegen in
einem Bereich von -1 7 bis 74,4.
Claims (7)
1. Verfahren zur Reinigung von Urokinase durch Adsorption der Urokinase an einem wasserunlöslichen
Adsorptionsmittel und Elution der adsorbierten Urokinase, dadurch gekennzeichnet,
daß man
(A) bei einem schwach sauren bis neutralen pH-Wert, wobei die Salzkonzentration bei etwa
0,03 bis 0,15 m liegt, aus einer Verunreinigungen enthaltenden wäßrigen Urokinaselösung
die Urokinase an einem Agarose und Agaropiectin als Hauptbestandteile enthaltenden
wasserunlöslichen Polysaccharid adsorbiert und anschließend die adsorbierte Urokinase mit einer wäßrigen alkalischen
Lösung oder einer konzentrierten wäßrigen Salzlösung eluiert, oder
(B) daß man das nach (A) erhaltene Agarose und Agaropectin als Hauptbestandteile enthaltende
wasserunlösliche Polysaccharid, an dem die Urokinase adsorbiert ist, mit Wasser oder einer wäßrigen Natriumchlorid- oder
Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 5,5 bis 6,5 und einer Konzentration von 0,03 bis
0,15 m wäscht und anschließend die adsorbierte Urokinase mit einer wäßrigen alkalischen
Lösung oder einer konzentrierten wäßrigen Salzlösung eluiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution eine wäßrige
alkalische Lösung mit einem pH-Wert von 8,0 bis 11,0 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution eine wäßrige
alkalische Lösung verwendet, die Ammoniumsulfat, Natriumphosphat oder Natriumchlorid in einer
Konzentration von etwa 0,01 bis 0,15 m enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Elution eine wäßrige alkalische Lösung verwendet, die Glycin, Arginin
oder Histidin in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 2% (Gew./Vol.) enthalt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution eine wäßrige
alkalische Lösung verwendet, die etwa 2 bis 4% (Gew./Voi.) einer wäßrigen Ammoniaklösung
enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution als konzentrierte
wäßrige Salzlösung eine 1 m wäßrige Natriumchloridlösung, eine 0,5 m wäßrige Ammoniumsulfatlösung
odereine etwa 5- bis lOprozentige (Gew./Vol.) Lösung einer neutralen Aminosäure
verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Waschlösung verwendet, die zusätzlich 0,05 bis 0,1 m an Lysin, f-Aminocapronsäure. Glycin, Serin oder Cystein
ist.
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