DE69720693T2

DE69720693T2 - Fsh und lh trennungs- und reinigungsverfahren

Info

Publication number: DE69720693T2
Application number: DE69720693T
Authority: DE
Inventors: Paolo Lualdi; Elisabetta Donati; Irina Rapaport
Original assignee: IBSA Institut Biochimique SA
Current assignee: IBSA Institut Biochimique SA
Priority date: 1996-11-07
Filing date: 1997-11-03
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2017-11-04
Also published as: EP0882064A1; EP0882064B1; IT1287138B1; IL125225A; CA2242325C; ES2196380T3; IL125225A0; PT882064E; WO1998020039A1; ITMI962313A0; ATE236931T1; DE69720693D1; CA2242325A1; AU719560B2; AU5316298A; ITMI962313A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren, das besonders einfach und ökonomisch zur Trennung von FSH und LH geeignet ist und auf ein Reinigungsverfahren für rohes HMG vor allem aus Urinextrakten menopausaler und postmenopausaler Frauen.
AKTUELLER WISSENSSTAND
Das follikelstimulierende Hormon (FSH) und das lutenisierende Hormone (LH) sind im Allgemeinen bekannt unter dem Begriff gonadotrope Hormone oder humane Fertilitätshormone. Solche Verbindungen, deren primärer physiologischer Effekt sich auf die Stimulation der Gametogenese und/oder der Produktion von an diesen biologischen Prozessen beteiligten Steroiden bezieht, sind von Natur aus in großen Mengen in der Hypophyse sowie im humanen und tierischen Plasma als auch im Urin menopausaler und postmenopausaler Frauen verfügbar.
FSH und LH werden aus diesen natürlichen Quellen in Form einer Mischung gewonnen, die üblicherweise unter dem Begriff HMG (Humanes Menopausengonadotropin) bekannt ist, das auch als Rohextrakt kommerziell erhältlich ist; diese Mischung besteht aus FSH und LH in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 in Verbindung mit anderen Proteinen im Urin. Trotzdem haben diese Extrakte nur einen geringen Reinheitsgrad, weshalb sie zur Verabreichung für therapeutische Zwecke nicht geeignet sind und zwar in erster Linie wegen der Kontamination mit Fremdproteinen.
Es wurden bereits mehrere FSH und LH-Reinigungsverfahren gemäß dem neuesten Stand der Technik entwickelt mit dem Ziel, die zuvor erwähnten kontaminierenden Proteine zu reduzieren. Als Ausgangssubstanz wird hierbei ein Produkt aus einer natürlichen Quelle (Hypophyse, Plasma oder Urin) genommen und im Wesentlichen mit Hilfe von Zentrifugations-, Präzipitations-, Chromatographie- und Filtrationstechniken aufgereinigt.
Das US-Patent No. 3,674,865 beschreibt eine FSH-Reinigung aus Urinextrakten, wobei dieser Prozess insgesamt aus 21 verschiedenen Schritten besteht und immer noch zu einer Mischung von FSH und LH im Verhältnis von 3 : 1 und 6 : 1 führt.
Das US-Patent No. 3,973,004 (Derwent abstract) beschreibt eine FSH-Isolierung aus der Hypophyse mittels selektiver Präzipitation mit Ammoniumsulfat, wohingegen das USP 4,115,375 (Ansprüche U.S. Patent abstract) Polyethylenglycol als präzipitierendes Agens verwendet.
Diese zuvor erwähnten Prozesse haben allerdings den Nachteil, dass sie zur Gewinnung von Produkten führen, die keine zufriedenstellende spezifische Aktivität und Reinheit aufweisen. Insbesondere löst das Vorhandensein von verunreinigenden Proteinen allergische Reaktionen aus, so dass die oben erwähnten Hormone nur über bestimmte Verabreichungswege gegeben werden können, wie beispielsweise eine intramuskuläre Injektion, die mit beträchtlichen Probleme bei der Applikation verbunden ist.
In der jüngsten Vergangenheit wurden einige Reinigungsprozesse unter Einsatz der Immuno-Affinitätschromatographie und spezifischer monoklonaler Antikörper (Europäisches Patent EP 0 322 438 ; Europäischer Patentantrag EPA 0 328 248, Derwent-Abstract) oder rekombinante DNA-Techniken (internationaler Patentantrag WO 85/01958) eingeführt. Obwohl durch diese Prozesse Produkte mit hoher spezifischer Aktivität gewonnen werden, gibt es hierbei schwerwiegende Probleme aufgrund möglicher Verunreinigungen mit Viren, heterologen Proteinen und DNA-Bruchstücken aus den Wirtszellen; aus diesem Grund müssen aus solchen Prozessen stammende Produkte sorgfältig gereinigt und getestet werden, um potenzielle Verunreinigungen auszuschließen, bevor sie therapeutisch eingesetzt werden.
Es ergibt sich daraus die offensichtliche Notwendigkeit für ein Verfahren zur Herstellung von Produkten mit höherer Reinheit und höherer spezifischer Aktivität ohne die Nachteile der oben erwähnten Verfahrensweisen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein FSH und LH-Trennungs- und Reinigungsverfahren bei dem rohes HMG eingesetzt wird, um daraus diese Hormone mit hoher Reinheit und spezifischer Aktivität zu gewinnen. Das besagte Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Optionale Elimination der Virenverunreinigungen aus dem besagten rohen HMG in einer 80-90 Vol.%igen EtOH-Wasserlösung;
das Ausbringen des in Schritt (1) erhaltenen Produktes auf eine Ionenaustauscher-Chromatographiesäule mit schwach basischem Anionenaustauscherharz vom Typ DEAE, mittels derer LH und FSH mit 5-15 Vol.%iger EtOH-Wasserlösung in einem 10-50 mM Phosphatpuffer, der NaCl mit steigender Ionenstärke von 0-70 mM enthält und einen pH-Wert von 7,0 bis 8,0 hat, selektiv eluiert werden;
aufbringen des LH und FSH enthaltenden Eluates aus Schritt (2) auf eine Affinitätschromatographiesäule mit einem Liganden aus Antrachinonderivat an einem inerten Träger zur selektiven Elution von kontaminierenden Proteinen und FSH oder LH mit alkalischen Pufferlösungen mit einer zunehmenden Ionenstärke von 0 bis 0,3 M KCl;
optionales Ausbringen des in Schritt (3) gewonnenen FSH auf eine Ionenaustausch-Chromatographiesäule mit einem streng basischen Anionenaustauscherharz, welches quartäre Ammoniumgruppen besitzt zur selektiven Elution von kontaminierenden Proteinen und FSH mithilfe von NaCl-Lösungen mit steigender Ionenstärke von 0-400 M und einem alkalischen pH-Wert.
Danach können die in den zuvor beschriebenen Methoden unter Schritt (3) und (4) gewonnenen Hormone FSH und LH depyrogenisiert und lyophilisiert oder eingefroren werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Charakteristika und Vorteile des Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden in der nachfolgenden detaillierten Beschreibung weiter ausgeführt.
Mittels einer einfachen Extraktion und einfach durchzuführenden Reinigungsschritten auf Ionenaustausch- und Affinitätsharzen ermöglicht das Verfahren dieser Erfindung die Gewinnung von FSH und LH mit hoher spezifischer Aktivität und Reinheit und somit deren nachfolgende Verabreichung an Menschen zu therapeutischen Zwecken ohne Notwendigkeit weiterer Reinigungsverfahren. Dieses Verfahren ist daher sehr einfach in der Durchführung und zudem ökonomisch. Es hat zudem noch den Vorteil, dass es mit sehr geringen Mengen an organischen Lösungsmittels auskommt, da hauptsächlich wässrige Lösungen zum Einsatz kommen.
Das rohe HMG-Ausgangsmaterial stammt vorzugsweise aus einem Urinkonzentrat, das aus dem Urin von menopausalen oder postmenopausalen Frauen gewonnen wird. Gemäß einer bevorzugten Form der Umsetzung der Erfindung hat das Ausgangs-HMG eine spezifische Aktivität an FSH von unter 10 I.U./mg und liegt besser noch im Bereich von 2 bis 10 I.E./mg und die spezifische Aktivität von LH im Bereich von 0,5 bis 5 I.E./mg.
In Schritt (1) des Verfahrens der Erfindung wird das besagte rohe HMG für einen Zeitraum von 1 bis 4 Stunden in einer 90 Vol.%igen EtOH-Wasserlösung suspendiert bei einer Temperatur, die vorzugsweise im Bereich zwischen –20°C und 5°C liegt. Diese Behandlung wird durchgeführt, um so das rohe HMG von Virenverunreinigungen zu befreien. Dies ist ein zur Nutzung im pharmazeutischen Umfeld nach der Reinigung notwendiger Schritt.
In Schritt (2) des Verfahrens der Erfindung wird der feste Rückstand, der optional von Virenverunreinigugnen in Schritt (1) befreit wurde, in einer 5–15 Vol.%igen EtOH-Wasserlösung in einem 5–50 mM Phophatpuffer gelöst, der vorzugsweise 10–30 mM Natriumphosphat enthält in einem pH-Bereich von 7,3 bis 7,6 bei einer Temperatur von 0°C bis 8°C, vorzugsweise von 0°C bis 6°C.
Die so gewonnene Lösung wird auf eine Ionenaustausch-Chromatographiesäule mit schwach basischem Anionenaustauscherharz vom Typ DEAE aufgegeben bei einer Temperatur vorzugsweise im Bereich von 0°C bis 8°C; bevorzugt wird der Einsatz eines Konditionierungspuffers bestehend aus 5–15 Vol.%iger EtOH-Wasserlösung mit 5–50 mM Phosphatpuffer, der vorzugsweise 10–30 mM Natriumphosphat enthält in einem pH-Bereich von 7,3 bis 7,6. Das besagte Anionenaustauscherharz besitzt vorzugsweise tertiäre Aminogruppen, optional quartäre Ammoniumgruppen an Cellulosematrix und besser noch DEAE-Cellulose (zum Beispiel DE52 Whatman).
Die bevorzugte Flussrate liegt im Bereich von 10 bis 30 ml/cm²h bei einem Verhältnis von Säulendurchmesser/Säulenlänge von 0,3 bis 0,6 und mit einer Gesamtproteinbeladung von 20 bis 50 mg/ml des Harzes.
Das an das Harz gebundenen LH wird bevorzugt mit einer 5–15 Vol.%igen EtOH-Wasserlösung in einem 10–50 mM Phosphatpuffer, der vorzugsweise 10–30 mM Natriumphosphat enthält, in einem pH-Bereich von 7,3 bis 7,6 eluiert. Die besagte Elution, die nur zur Gewinnung von LH führt, wird vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 0°C–8°C durchgeführt.
Das an das Harz gebundenen FSH wird nachfolgend mit einer 5–15 Vol.%igen EtOH-Wasserlösung in einem 10–50 mM Phosphatpuffer, der vorzugsweise 10–30 mM Natriumphosphat enthält, in einem pH-Bereich von 7,3 bis 7,6 und unter Zusatz von NaCl in einer Konzentration von 30 bis 50 mM eluiert. Die besagte Elution wird vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 0°C–8°C durchgeführt. Das in der eluierenden Pufferlösung enthaltene EtOH spielt in diesem Schritt eine entscheidende Rolle, da es zu einer besseren Trennung von LH und FSH führt sowie zu einer höheren Ausbeute der beiden Hormone.
In Schritt (3) des Verfahrens der Erfindung werden die LH beziehungsweise FSH enthaltenden Eluate, die in Schritt (2) gewonnen wurden, jeweils separat einem weiteren Reinigungsverfahren unterzogen unter Einsatz der Affinitätschromatographie mit einem Antrachinonderivat als Ligand, vorzugsweise Cibacron Blue, kovalent gebunden an einen inerten Träger, vorzugsweise Agarose, vorzugsweise wird eine Affinitätssäule mit Agarose Blue gewählt.
Die besagten Eluate werden vorzugsweise angesäuert bis zu einem pH-Bereich von 5,5 bis 7,5 und dann auf die oben erwähnte Säule aufgegeben, die zuvor mit einem 10–30 mM Acetatpuffer vorbereitet wurde, der bevorzugt aus Natriumacetat angesetzt wird, mit einem pH von 5,5 bis 7,5 in einem Temperaturbereich von 0°C bis 8°C.
Die bevorzugte Flussrate liegt im Bereich von 7 bis 14 ml/cm²h bei einem Verhältnis von Säulendurchmesser/Säulenlänge von 0,5 bis 0,9 mit einer Gesamtproteinbeladung von 5 bis 15 mg/ml des Harzes.
Die an die Säulenmatrix gebundenen Hormone FSH oder LH werden dann selektiv von den kontaminierenden Proteinen getrennt durch Elution mit einem oder mehreren 40-60 mM Glycin-NaOH-Puffern, die KCl in Konzentrationen von 0 bis 3 M, optional mit steigender Ionenstärke enthalten und einem veränderlichen pH-Wert von 8,5 bis 11.
Die so gewonnenen Hormone können dann aufkonzentriert, entsalzt und anschließend eingefroren oder mit Verfahren, die dem aktuellen Stand der Technik entsprechen, lyophilisiert werden.
Gemäß einer bevorzugten Umsetzungsform des Prozesses der Erfindung wird das entsalzte LH lyophilisiert und anschließend einer Depyrogenisierung mit Verfahren unterzogen, die dem aktuellen Stand der Technik entsprechen.
Gemäß dem Schritt (4) wird das in Schritt (3) gewonnene und entsalzte FSH einem weiteren Reinigungsschritt unterworfen, der mithilfe einer Inonenautauschchromatographie mit einem streng basischen Anionenaustauscherharz durchgeführt wird; dieses Harz besitzt quartäre Ammoniumgruppen, optional in Verbindung mit tertiären Aminogruppen an einer Cellulosematrix. Vorzugsweise handelt es sich dabei um DE53 Whatman.
FSH wird bevorzugt durch eine Dialyse in einem 10–50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 9,0–9,5 äquilibriert und auf die besagte Säule aufgegeben, die mit dem gleichen Puffer vorkonditioniert wurde.
Die zu bevorzugende Flussrate liegt im Bereich von 20 bis 40 ml/cm²h bei einem Verhältnis von Säulendurchmesser/Säulenlänge von 0,08 bis 0,3 mit einer Gesamtproteinbeladung von 0,5 bis 10 mg/ml des Harzes.
Die Säule wird anfänglich mit 10–50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 9,0–9,5, der NaCl in einer bevorzugten Konzentration von 40 bis 80 mM enthält, gespült, wodurch die Proteinverunreinigungen eluiert werden.
Das an das Harz gebundene FSH wird anschließend mit einem linearen NaCl-Gradienten, vorzugsweise im Bereich von 70–100 mM bis zu 140–400 mM in einem 10-50 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0–9,5 eluiert.
Das so gewonnene gereinigte FSH wird dann mittels Ultrafiltration entsalzt, lyophilisiert und depyrogenisiert mit Verfahren, die nach dem aktuellen Stand der Technik bekannt sind.
Gemäß einer bevorzugten Umsetzung der Erfindung wird das Depyrogenisierungsverfahren vom in den Schritten (3) und (4) gewonnenen FSH und LH wie folgt durchgeführt: das gereinigte in lyophilisierter Form vorliegende Hormon wird bei einer Temperatur von –15°C bis 0°C in einer 30–50 Vol.%igen EtOH-Lösung mit 5-15 % w/v Ammoniumacetet aufgelöst.
Zu dieser Lösung werden dann 3–8 mM tribasisches Natriumphosphat und 3–8 mM Calciumacetat zugegeben; der pH-Wert wird dann durch Zugabe von Natriumhydroxid auf Werte zwischen 8–10 gebracht. Zu dem nach der Zentrifugation gewonnenen Überstand wird das 1,5–2,5-fache Volumen an absolutem EtOH pro Volumenüberstand bei einer Temperatur zwischen –20°C und 0°C zugegeben. Nach Durchführung einer weiteren Zentrifugation wird das erhaltene Präzipitat erneut in Wasser gelöst und gemäß den bekannten Methoden des aktuellen Stands der Technik dialysiert.
Schließlich kann die Lösung, die das gereinigte FSH oder LH enthält, eingefroren oder lyophilisiert werden gemäß den Methoden des aktuellen Stands der Technik und die Hormonaktivität auf diese Weise während einer Langzeitlagerung aufrecht erhalten werden.
Das Verfahren dieser Erfindung ermöglicht die Gewinnung von FSH und LH mit einer sehr hohen Reinheit. FH-freies FSH hat hierbei eine spezifische Aktivität von über 6.000 I.E./mg und FH verfügt über eine spezifische Aktivität von über 5.00 I.E./mg.
Die folgenden Beispiele der vorliegenden Erfindung werden zur Veranschaulichung gegeben und nicht um Einschränkungen darzulegen.
BEIPIEL 1: FSH-Reinigung aus rohem HMG aus Urin
Eliminierung der Virenverunreinigung des rohen HMG in wässrigem EtOH
Alle nachfolgend aufgeführten Vorgänge wurden, falls nicht anders angegeben, in einem Temperaturbereich von 0°C bis 6°C durchgeführt.
200 g des rohen HMG aus Urin von menopausalen oder postmenopausalen Frauen wurden in 10 leiner Mischung aus Ethanol/Wasser (85 : 15 v/v) suspendiert bei einer Temperatur von –10°C; die so erhaltene Suspension wurde durch Rühren über 3 Stunden bei einer Temperatur von -10°C aufrecht erhalten und anschließend bei 7.000 rpm für 20 Minuten unter Einsatz eines GS3 Sorvall-Rotors zentrifugiert; nach Entfernen des Überstandes konnte das Präzipitat gewonnen werden.
Ionenaustausch-Chromatographie auf DE52
Das in Schritt 1.1 erhaltene Präzipitat wurde in 2 l einer 10%igen EtOH-Lösung mit 20 mM Natriumphosphat mit einem pH von 7,3 aufgelöst. Die so entstandene Lösung wurde bei 7.000 rpm für 30 Minuten unter Einsatz eines GS3 Sorvall-Rotors zentrifugiert und der gewonnenen Überstand auf eine DE52 Whatman Ionenaustauschsäule (1995 Katalogreferenz 4057910), basierend auf einer Diethylaminoethylcellulosematrix mit einem Durchmesser von 14 cm und einer Länge von 36 cm, äquilibriert in einem 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,3, der 10 Vol.% EtOH enthält. Im Chromatographieverlauf wurde die Säule mit einer Flussrate von 3 l/h betrieben und das Eluat in Fraktionen von 700 ml aufgefangen.
Nach der Probenaufgabe wurde die Säule in dieser Reihenfolge eluiert: 101 10 Vol.% EtOH mit 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH = 7,3 40 1 10 Vol.% EtOH mit 20 mM Natriumphosphatpuffer und 40 mM Natriumchlorid, pH = 7,3.
Nach der Chromatographie wurde die optische Dichte bei 280 nm (OD280) für jede einzelne Fraktion bestimmt sowie die Aktivitäten von LH und FSH. 1 zeigt das erhaltene Chromatogramm, auf dem die spezifischen Aktivitäten (I.E./ml) von LH und FSH und die optische Dichte der Eluatfraktionen angegeben sind.
Das Chromatogramm zeigt deutlich, dass das LH durch die Pufferlösung (a) eluiert wurde, während FSH mit einer 40 mM NaCl enthaltenden Pufferlösung (b) eluiert wurde. Hauptsächlich wurden die Fraktionen 6 bis 20, die LH enthielten, gesammelt und weiter aufgereinigt wie in Beispiel 2 beschrieben; die Fraktionen 28 bis 41, die FSH enthielten, wurden gesammelt und gereinigt wie unten beschrieben.
FSH-Reinigung mithilfe der Affinitätschromatographie auf Agarose Blue
Benutztes Harz: Agarose Blue 3 GA Affinitätsharz (Sigma Chemical Co., St. Lous, Mo, 1995 Katalog Ref. C1410); dieses Harz wurde vor dem Packen in die Chromatographiesäule mit den folgenden Reagenzien gewaschen:
10 l einer 2,5 M KCl-Lösung in 0,5% Na₂CO₃ für eine Stunde
10 l einer 0,5%igen Na₂CO₃-Lösung für 30 Minuten
10 l einer 6 M Harnstofflösung für 2 Stunden
10 l H₂O für 30 Minuten
10 l einer 0,5%igen Na₂CO₃-Lösung für 30 Minuten
10 l H₂O für 30 Minuten
10 l eines 50 mM Natrimacetatpuffers, pH = 6,5, für 30 Minuten
10 l eines 20 mM Natriumacetetpuffers, pH = 6,5, für 30 Minuten
Das in 20 mM Natriumacetatpuffer mit pH = 6,5 konditionierte Harz wurde in eine Chromatographiesäule gepackt, so dass ein Harzbett von 11 cm Durchmesser und einer Höhe von 16 cm entstand.
Der pH-Wert der FSH enthaltenden Probe aus Schritt 1.2 wurde auf 6,5 gebracht durch Zugabe von 1,7 M Essigsäure und dann auf die Säule gegeben.
Die Probenaufgabe auf die Säule und die weiteren Elutionen wurden bei einer Flussrate von 1 l/h durchgeführt. Das während der Probenaufgabe gewonnene Eluat wurde in einer einzigen Fraktion gesammelt, während das nachfolgende Eluat in 700 ml Portionen fraktioniert wurde.
Nach Beendigung der Probenaufgabe wurde die Säule zuerst in dieser Reihenfolge eluiert:
11 eines 20 mM Natriumacetatpuffers, pH = 6,5;
51 eines 50 mM Glycin-NaOH-Puffers, pH = 10;
31 eines 50 mM Glycin-NaOH, 0,2 M KCl-Puffers, pH = 9;
und dann mit einem linearen KCl-Gradienten in einem Glycin-NaOH-Puffer, der wie folgt angesetzt wurde:
Kammer 1) 910,3 M KCl in 50 mM Glycin-NaOH-Puffer, pH = 9;
Kammer 2) 912,5 M KCl in 50 mM Glycin-NaOH-Puffer, pH = 9;
Nach der Chromatographie wurde die optische Dichte bei 280 nm (OD280) für jede einzelne Fraktion bestimmt sowie die spezifische Aktivität von FSH (I.E./ml). 2 zeigt das erhaltene Chromatogramm.
Während der Probenbeladung (in der Grafik nicht angegeben) wurde das FSH in der Säule zurückgehalten, während der größte Teil der Proteinverunreinigungen im Eluat gefunden wurde. Viele der verunreinigenden Proteine, die vom Harz zurückgehalten wurden, wurden bei den ersten Waschungen eluiert und durch den 0,3 M KCl enthaltenden Puffer. Unter diesen Bedingungen wurde allerdings kein FSH eluiert.
Die nachfolgende Elution (beginnend mit Fraktion 14) mit einem KCl-Gradienten führte zuerst zur Abtrennung der anderen verunreinigenden Proteine (etwa von Fraktion 15 bis Fraktion 20). Die FSH-Elution erfolgte mit einem symmetrischen Peak bei höheren KCl-Konzentrationen (von Fraktion 22 bis 29).
Danach wurden die Fraktionen von 23 bis 28 zusammen gesammelt; der pH-Wert des gewonnenen Produktes wurde mit 1,5 M Essigsäure auf 7,5 erhöht und dann das Produkt selbst aufkonzentriert und durch Utrafiltration unter Einsatz einer Amicon-Zelle, ausgestattet mit einer Amicon PM10 Membran, entsalzt.
Ionenaustauscher-Chromatographie auf DE53
Die zuvor wie in Schritt 1.3 aufkonzentrierte und entsalzte FSH-Probe wurde für 18 Stunden dialysiert gegen 5 1 eines 25 mM Tris-HCl-Puffers, pH = 9,3. Danach wurde die Probe auf eine DE53 Whatman Ionenaustausch-Chromatographiesäule aufgegeben (1995 Katalog Ref. 4058910) mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Länge von 18 cm, äquilibriert in einem 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH = 9,3. Die Säule wurde mit einer Flussrate von 100 ml/h eluiert und das Eluat in 18 ml Proben fraktioniert.
Nach Beladen der Säule wurde diese zuerst mit 450 ml eines 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH = 9,3 eluiert, der 80 mM NaCl enthielt und anschließend mit einem linearen NaCl-Gradienten wie folgt vorkonditioniert:
Kammer 1) 600 ml 90 mM NaCl in 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH = 9,3;
Kammer 2) 600 ml 160 mM NaCl in Tris-HCl-Puffer, pH = 9,3;
3 zeigt das erhaltene Chromatogramm, worauf die optische Dichte bei 280 nm (OD280) und die spezifische FSH-Aktivität (I.E./ml) für jede Eluatfraktion angegeben ist.
Das Chromatogramm zeigt eindeutig, dass die erste Elution mit 80 mM NaCl zur Abtrennung einiger kontaminierender Proteine führt, wohingegen das FSH in der Säule bleibt. Im Gegensatz dazu wird das FSH mithilfe eines NaCl-Gradienten, der ab Fraktion 30 eingesetzt wurde, selektiv von den kontaminierenden Proteinen getrennt. Die Fraktionen 31 bis 40 wurden zusammen gesammelt, aufkonzentriert, mithilfe einer Amicon-Zelle., ausgestattet mit einer Amicon PM10 Membran entsalzt und schließlich lyophilisiert.
FSH-Depyrogenisierung
109 mg des lyophilisierten FSH, das im vorigen Verfahrensschritt gewonnen wurde, wurden in 55 ml einer kalten Lösung von 10% w/v Ammoniumacetet in 40 Vol.% Ethanol aufgelöst. Zu dieser Lösung, die unter Rühren auf einem Magnetrührer unter Einsatz eines Eisbades mit Salzzusatz bei einer Temperatur von etwa –10°C aufrecht erhalten wurde, wurden die folgenden Substanzen beigemischt:
1,2 ml einer 7,6 %igen tribasischen Natriumphosphatdodecahydrat-Wasserlösung;
1,4 ml einer 4,9 %igen Calciumacetat-Wasserlösung.
Nach Erhöhen des pH-Wertes auf etwa 8,5 durch Zugabe von 20% w/v NaOH wurde die Lösung unter Rühren für 30 Minuten aufrecht erhalten, immer noch bei einer Temperatur von –10°C, und anschließend bei 8000 rpm in einem Sorvall SS34 Rotor für 30 Minuten zentrifugiert. Das Präzipitat wurde verworfen und der gesammelte Überstand (57 mm) unter Rühren auf etwa –10°C in einem Eis-Salzgemisch herunter gekühlt.
Nach der Zugabe von 114 ml 95 Vol.% EtOH, das zuvor auf –20°C gekühlt wurde, wurde die Lösung unter Rühren für 30 Minuten aufrecht erhalten und dann für 12 Stunden bei einer Temperatur von –20°C Ruhen gelassen.
Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 8000 rpm in einer auf 0°C–4°C gekühlten Zentrifuge wurde der Überstand verworfen und das Präzipitat wieder in apyrogenem Wasser (80 ml) aufgelöst. Die so erhaltene Lösung wurde für 18 Stunden gegen 10 l apyrogenes Wasser dialysiert und danach lyophilisiert.
4 zeigt das Absorptionsspektrum einer Lösung, die 1,1 mg/ml FSH enthält, welches gemäß dem oben angegebenen Verfahren gereinigt wurde. Die Aktivität des so gereinigten FSH entspricht 6,870 I.E./mg Protein und wurde mit einer immunoradiometrischen Methode unter Einsatz des Serono FSH Maiclone Kit (Katalog Ref. 13101) bestimmt.
Die Proteinkonzentration im gereinigten FSH wurde berechnet bezugnehmend darauf, dass eine Wasserlösung mit 1 mg/ml FSH eine optische Dichte von 0,62 bei 177 nm in einer Quartzküvette mit einem optischen Durchgang von 1 cm hat. Dieser Koeffizient wurde experimentell im Verlauf der Vorbereitungen festgelegt zur Bestimmung der Absorption von Lösungen bei 277 nm, die eingewogene Mengen an zuvor lyophilisiertem, salzfreiem Hormon enthielten. Dieser Koeffizient erwies sich als zuverlässiger als andere Proteinbestimmungsmethoden in gereinigten Hormonproben mit einer spezifischen Aktivität von FSH im Bereich von 4.000 bis 10.000 I.E./mg. Die Proteinkonzentration von Fraktionen mit geringerer Reinheit (zum Beispiel diejenigen aus Schritt 1.2) wurden mit dem BCA Protein Assay Pierce (Pierce Katalog Ref. 23223 und 23224) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.
Die Daten bezüglich der FSH-Reinigung, die wie in den Schritten 1.1–1.5 beschrieben durchgeführt wurde, sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 2 zeigt die in den weiteren FSH-Reinigungstests gefundenen Ergebnisse, die gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Methode durchgeführt wurden.
BEISPIEL 2: LH-Reinigung aus rohem HMG aus Urin
Die Schritte 2.1 und 2.2, die sich mit der Entfernung viraler Verunreinigungen aus dem rohen HMG in einer wässrigen EtOH-Lösung und der Ionenaustausch-Chromatographie auf DE52 befassen, sind allgemein üblich sowohl für FSH als auch für LH und wurden, wie in den Punkten 1.1 und 1.2 des Beispiels 1 beschrieben, durchgeführt.
LH-Reinigung mittels Affinitätschromatographie auf Agarose Blue
Das Agarose Blue 3 GA Affinitätsharz wurde hergestellt wie in Punkt 1.3 beschrieben. Es wurde anschließend mit 20 mM Natriumacetatpuffer, pH 6,5 äquilibriert und in eine Chromatographiesäule gepackt, um ein Harzbett mit einem Durchmesser von 11 cm und einer Höhe von 16 cm zu erhalten.
Der pH-Wert der LH enthaltenden Probe, die wie in 1.2 beschrieben, gewonnen wurde, wurde mit 1,7 M Essigsäure auf pH 6,5 gebracht und die besagte Probe auf die Säule mit einer Flussrate von 1 l/h aufgegeben. Das während der Probenbeladung gewonnene Eluat wurde in einer einzigen Fraktion gesammelt, während die nachfolgenden Fraktionen in 600 ml Portionen fraktioniert wurden.
Nach der Probenaufgabe wurde die Säule zuerst in der folgenden Reihenfolge eluiert:
1 l 20 mM Natriumacetatpuffer, pH = 6,5;
5 l 50 mM Glycin-NaOH-Puffer, pH = 10;
2 l 50 mM Glycin-NaOH, 0,15 M KCl-Puffer, pH = 10
und anschließend mit einem linearen KCl-Gradienten in einem Glycin-NaOH-Puffer, der wie folgt angesetzt wurde:
Kammer 1) 810,15 M KCl in einem 50 mM Glycin-NaOH-Puffer, pH = 10;
Kammer 2) 81 1,7 M KCl in einem 50 mM Glycin-NaOH-Puffer, pH = 10.
Nach der Chromatographie wurde die optische Dichte bei 280 nm (OD280) für jede einzelne Fraktion bestimmt sowie die spezifische Aktivität von LH (I.E./ml).
5 zeigt das wie oben beschrieben erhaltene Chromatogramm. Während der Probenaufgabe wurde das LH in der Säule zurückgehalten, während sich der größte Teil der kontaminierenden Proteine im Eluat wiederfand (in der Grafik nicht angegeben). Viele der verunreinigenden Proteine, die durch das Harz zurückgehalten wurden, wurden durch Waschen der Säule mit den beiden Puffern bei pH 10 eluiert, bevor die Gradientenelution gestartet wurde.
LH wurde mit dem KCl-Gradienten eluiert: niedrige KCl-Konzentrationen führten zur Elution weiterer kontaminierender Proteine, während die eigentliche LH-Elution bei höheren Ionenkonzentrationen auftrat.
Die Fraktionen 17 bis 25 wurden dann zusammen gesammelt und der pH-Wert mit 1,7 M Essigsäure auf pH 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde dann aufkonzentriert, entsalzt durch Ultrafiltration über eine Amicon PM 10 Membran und zum Schluss lyophilisiert.
LH-Depyrogenisierungs
205 mg lyophilisiertes LH aus dem vorangehenden Schritt wurde in 102 ml einer Lösung mit 40 Vol.% EtOH und 10% w/v Ammoniumacetat gelöst. Zu der Lösung, die unter Rühren bei einer Temperatur von –10°C in einem Eis-Salzbad aufrecht erhalten wurde, wurden die folgenden Substanzen zugegeben: 2,25 ml einer 7,5%igen wässrigen tribasischen Natriumphosphatdodecahydrat-Lösung; 2,7 ml einer wässrigen 4,9 %igen Kalziumacetatlösung.
Nach Erhöhen des pH-Wertes auf über 8,5 mit 20% w/v NaOH, wurde die Mischung unter Rühren für 30 Minuten bei einer Temperatur von etwa –10°C in Lösung gehalten und anschließend bei 8.000 rpm in einem Sorvall SS34 Rotor für 30 Minuten zentrifugiert. Das Präzipitat wurde verworfen, während der gesammelte Überstand (107 ml) bei einer Temperatur von etwa –10°C in einem Eis-Salzbad gerührt wurde.
Nach Zugabe von 214 ml von zuvor auf –20° C gekühltem 95%igem EtOH wurde die Lösung für 30 Minuten aufrecht erhalten und dann für 12 Stunden bei einer Temperatur von –20°C stehen gelassen.
Nach einer Zentrifugation bei 8.000 rpm für 30 Minuten in einer auf 0°C bis 4°C vorgekühlten Zentrifuge wurde der Überstand entfernt und das Präzipitat nochmals in apyrogenem Wasser (125 ml) gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde für 18 Stunden gegen 101 apyrogenes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert.
6 zeigt das UV-Spektrum einer wässrigen Lösung mit 2,8 mg/ml LH, das gemäß dem oben dargelegten Prozess gereinigt wurde. Die spezifische Aktivität des gereinigten LH entsprechend einer Proteinaktivität von 521 I.E./mg wurde mit immunoradiographischer Methode unter Einsatz des Serono LH Maiclone Kit (Kat. Ref. 13201) bestimmt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Protein Assay Pierce (Pierce Katalog Ref. 23223 und 23224) unter Einsatz von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.
Die entsprechenden Daten zur LH-Reinigung, die gemäß der oben erwähnten Schritte durchgeführt wurde, sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse, die in weiteren LH-Reinigungsstudien gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Methoden erzielt wurden.

Claims

Ein Verfahren zur Trennung und Reinigung von FSH und LH, ausgehend von rohem HMG unter Anwendung der folgenden Schritte 1) Beladung einer Ionenaustauscher-Chromatographiesäule, die schwach basisches anionisches Harz vom Typ DEAE enthält, mit rohem HMG; danach selektive Elution von LH und FSH mit EtOH-Wassergemischen von 5-15 Vol% in einem 10–50 mM Phosphatpuffer, dem 0-70 mM NaCl mit zunehmender Ionenstärke zugesetzt sind und der einen pH-Wert von 7,0–8,0 hat und 2) Weitere Aufreinigung des in Schritt (1) gewonnenen LH oder FSH enthaltenden Eluats über eine Affinitätschromatographiesäule, die als Ligand ein Antrachinonderivat enthält und selektiv die verunreinigenden Proteine und FSH oder LH mit einem alkalischen Fließmittel mit zunehmender Ionenstärke von 0 bis zu 3 M KCl eluiert.
Das Verfahren unter Anspruch 1 umfasst weiterhin den Schritt zur Entfernung viraler Kontaminationen des besagten rohen HMG in einer 80–90 Vol% EtOH-Wasserlösung vor Durchführung von Schritt (1).
Das Verfahren unter Anspruch 1 oder Anspruch 2 beinhaltet des weiteren den Schritt der Beladung einer Ionenaustauscher-Chromatographiesäule mit FSH, das in Schritt (2) gewonnen wird. Die Säule enthält ein streng basisches Anionenaustauscherharz, welches selektiv die kontaminierenden Proteine und FSH mit eines Gradienten von 0-400 mM NaCl Lösung mit zunehmender Ionenstärke bei einem basischen pH-Wert eluiert.
Das Verfahren gemäß der Ansprüche 1–3 ist dadurch charakterisiert, dass besagtes rohes HMG aus dem Urin menopausaler oder postmenopausaler Frauen stammt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2 ist dadurch charakterisiert, dass das besagte rohe HMG mit besagtem EtOH-Wassergemisch mit einer Temperatur im Bereich von 20° bis 5°C über einen Zeitraum von 1 bis 4 Stunden behandelt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 ist dadurch charakterisiert, dass es sich bei dem in Schritt (1) genannten schwach basischen Anionenaustauscherharz um DEAE-Zellulose handelt.
Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–3 oder 6 ist dadurch charakterisiert, dass die in Schritt (1) unter Anspruch 1 genannte Ionenaustauscher-Chromatographiesäule zuvor mit einer 5–15 Vol% EtOH-Wasserlösung in einem 5–50 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,3–7,6 und in einem Temperaturbereich von 0°C bis 8°C vorkonditioniert wurde.
Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–3, 6 und/oder 7 ist dadurch charakterisiert, dass das in Schritt (1) unter Anspruch 1 genannte LH über die bereits erwähnte Säule mit einer 5–15 Vol% EtOH-Wasserlösung, die 10–30 mM Natriumphosphat enthält, in einem pH-Bereich von 7,3–7,6 und in einem Temperaturbereich von 0°C bis 8°C eluiert wird.
Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–3,6 und/oder 7 ist dadurch charakterisiert, dass das in Schritt (2) unter Anspruch 1 genannte FSH über die bereits erwähnte Säule mit einer 5-15 Vol% EtOH-Wasserlösung, die 10–30 mM Natriumphosphat und 30-50 mM Natriumchlorid enthält, bei einem pH-Wert von 7,3–7,6 und in einem Temperaturbereich von 0°C bis 8°C eluiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 ist dadurch charakterisiert, dass es sich bei dem in Schritt (2) genannten Antrachinonderivat um Cibracron Blue handelt.
Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–3 und 10 ist dadurch charakterisiert, dass die in Schritt (2) unter Anspruch 1 besagte Affinitätschromatographiesäule als Trägermaterial Agarose Blue enthält.
Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–3, 10 und/oder 11, ist dadurch charakterisiert, dass die in Schritt (2) unter Anspruch 1 genannte Affinitätschromatographiesäule mit einem 10–30 mM Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5–7,5 vorkonditioniert wurde.
Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 1–3, 10, 11 und/oder 12 ist dadurch charakterisiert, dass das in Schritt (2) unter Anspruch 1 erwähnte LH oder FSH selektiv eluiert wird mit einer oder mehreren 40–60 mM Glycin-NaOH-Pufferlösungen, die KCl in Konzentrationsbereichen von 0 bis 3 M enthalten und einen entsprechend schwankenden pH-Wert von 8,5 bis 11 haben.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3 ist dadurch charakterisiert, dass das besagte stark basische Anionenaustauscherharz an eine Zellulosematrix gebundene quartäre Ammoniumgruppen besitzt.
Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 3 oder 14 ist dadurch charakterisiert, dass die erwähnte Ionenaustauschersäule für die Chromatographie mit einem 10–50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert von 9–9,5, vorkonditioniert wird.
Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 3, 14 und/oder 15 ist dadurch charakterisiert, dass die erwähnten kontaminierenden Proteine mit einem 10–50 mM Tris-HCl-Puffer, der 40–80 mM NaCl enthält und einen pH-Wert von 9,0–9,5 hat, eluiert werden und dass das erwähnte FSH selektiv von den kontaminierenden Proteinen während der Elution getrennt wird unter Einsatz eines NaCl-Gradienten, dessen Konzentration im Bereich von 70 bis 400 mM liegt, gepuffert in 10–50 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 9,0 bis 9,5.
Das Verfahren gemäß eines der Ansprüche von 1 bis 16 ist dadurch charakterisiert, dass das erwähnte FSH oder LH, welches in Schritt (2) unter Anspruch 1 gewonnen wird, nachfolgend lyophilisiert oder eingefroren und depyrogeniert wird.