DE1617661A1

DE1617661A1 - Verfahren zur Herstellung hochreiner Gonadotropine auf chromatographischem Wege

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Publication number: DE1617661A1
Application number: DE19661617661
Authority: DE
Inventors: Hell Hans Van
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1965-01-15
Filing date: 1966-01-13
Publication date: 1971-03-25
Also published as: DK114215B; CH481146A; US3457346A; BE675093A; ES321509A1; FR1465014A; NL6500460A; GB1133071A

Description

"Verfahren zur Herstellung hochreiner Gonadot-ropine auf Chromatograph!sehern ¥ege".

Die Erfindung "betrifft ein Yerfahren zur Herstellung hochreiner Gonadotropine aus weniger reinen Eonzentraten auf chromatographischem Wege.

Unter Gonadotropinen oder gonadotropen Hormonen sind Hormone zu verstehen, die ursprünglich in dem Hypophysen-•vorderlappen und im Harn nachgewiesen wurden, lerner wurden diese im Serum und in der Placenta und dem Harn schwangerer !rauen und in dem Endometrium-Gewebe und Serum trächtiger Stuten aufgefunden. Gonadotropine können Ovarien und Testes stimulieren und in diesen morphologische und funktioneile Veränderungen hervorrufen. Diese Substanzen sind proteinartig und wasserlöslich. Sie unterscheiden sich entsprechend ihrer Herkunft und ehemischen Vorbehandlung.

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Man kann nachstehende 2 Gruppen von Gonadotropinen unterscheiden:

a) G-onadotropine, die im Hypophysenvorderlappen vorkommen. Diese Gruppe umfaßt das Pollikelreifungshormon (PSH), den Interstitiumfaktor (IGSH) und das Prolactin oder lactogene Hormon.

t>) Gonadotropine, die aus anderem Rohmaterial, als dem Hypo-

physenvorderlappen isoliert werden. Diese Gruppe umfasst ' hauptsächlich:

1) das Ghorion- oder placentare menschliche Gonadotropin (HCG), das aus der Placenta und dem Harn schwangerer Frauen isoliert werden kann.

2) Gonadotropine aus dem Harn von Kastraten und von Frauen in der Menopause (HMG).

3) Serumgonadotropine, die in dem Harn trächtiger Stuten vorkommen (EMSG).

Das aus menschlichem Harn isolierte, PSH enthaltende HMG ist ein therapeutisch wertvolles Präparat. Das aus dem Harn schwangerer Frauen erhältliche HCG wird in der Therapie verwendet und ist auch gegenwärtig für immunochemische Bestimmungen dieses Hormons, z. B, bei Schwangerschaftsprtifungen und der Diagnose von Tumoren, die dieses Hormon ausscheiden, wichtig. Das Serumgonadotropin (EMSG), das aus dem Serum

hergestellt werden kann tmd worin

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Aktivität überwiegt, stimuliert die Pollikelreifung, die Spermatogenese und das Interstitium der Ovarien und der Testes und ist daher ebenfalls therapeutisch wichtig. Es ist klar, daß der Reinigung dieser Hormone, die der "Vermeidung unerwünschter Hebenreaktionen dient, große Bedeutung sowohl für die Therapie, als auch für immunochemische Bestimmungsmethoden zukommt.

¥. R. Butt und Mitarbeiter, Biochem. J., Bd. 81, 1961, Seite 596, beschreiben die Reinigung von Gonadotropinen aus menschlichem Harn und Hypophysen durch Chromatographie, unter Verwendung von Carboxymethyl-(GM)-Zellulose und Diäthylaminoäthyl-(DEAE)-Zellulose und Calciumphosphat. Diese Substanzen besitzen nicht die Eigenschaften von Molekularsieben und sind zur Herstellung von Präparaten mit hoher Aktivität minder geeignet. Auf diese Weise stellten Butt und Mitarbeiter HMG-Präparate mit einer 3?SH-Aktivität von höchstens 350 E/mg her.-Die Verwendung von DEAE-Zellulose, deren Eigenschaften von Charge zu Charge sehr verschieden sein kann, hat gewöhnlich den Nachteil, daß die Ergebnisse schlecht reproduzierbar sind. Perner ist die Kapazität dieses oberflächlichen Adsorbens verhältnismäßig klein, wodurch insbesondere bei der Trennung hochmolekularer Substanzen von annähernd gleicher Molekülgröße schlechtere Ergebnisse durch überlappen der Komponenten erhalten werden.

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G. Bettendorf und Mitarbeiter, Acta Endocrinol, Bd. 4.1, 1962, Seite 1, beschreiben die Anwendung von DEAE-Sephadex zur Reinigung einer Fraktion eines Gonadotropinpräparates aus menschlichen Hypophysen. Sie fanden jedoch, daß eine geringe Aktivitätszunähme durch große "Verluste an aktiver Substanz erkauft wird, so daß dieses Verfahren als ungeeignet für die Gewinnung hochgereinigter Gonadotropine zu betrachten ißt.

Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß hochgereinigte Gonadotropine in hohen Ausbeuten erhalten werden können, wenn man eine wässrige Lösung eines unreinen Konzentrats mit einem lonenaustauschermaterial zusammenbringt, das auch die Eigenschaften eines Molekularsiebs aufweist und anschließend die aktive Substanz hieraus mit einer oder mehreren Pufferlösungen eluiert, die Substanzen aus den erhaltenen Fraktionen abtrennt und anschließend weiter reinigt, gegebenenfalls unter Anwendung von Gelfiltration.

Es ist so z. B. möglich, Präparate mit einer Aktivität von 5500 bis 11000 I.E./mg, ausgehend von einem HCG-Präparat mit einer Aktivität von 2700 bis 6500 I.E./mfe durch bloße Chromatographie über ein Molekularsieb mit Ionenaustauscherkapazität herzustellen, worauf man gegebenenfalls eine weitere Aktivitätssteigerung, z. B. von IO5OO I.E./mg auf 19000 I.E./mg, durch Gelfiltration erzielen kann. HMG-Präparate mii^feinigen Hundert mg-Äquivalenten IRP/mg können auf diese Weise leicht auf über 2000 mg-Äquivalente IRP/mg konzentriert werden. . _:r 109813/1602

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Die Ausbeuten an aktivem Material sind sehr gut. So konnte man aus einem HGG-Präparat von 3000 I.E./mg z.B. eine Konzentration von 7000 I.E./mg, mit 70 fo der ursprünglich anwesenden Einheiten und aus einem HCG--Präparat mit 5000 I.E./mg z. B. eine Konzentration mit einer Aktivität von 10500 I.E./mg in einer Ausbeute von 77 $ der ursprünglich anwesenden Einheiten erhalten. Das erfindungsgemäße, sehr selektive Verfahren stellt daher eine wichtige Entwicklung für die Herstellung hochreiner Gonadotropine in technischem Maßstab dar.

Vorzugsweise geht man von nicht zu unreinen Hormonpräparaten aus, z. B. solchen, die durch Fällung nach der niederländischen Patentanmeldung 6 500 460 erhalten werden, !fach diesem Verfahren fügt man eine oder mehrere geeignete Säuren einer klaren Lösung eines rohen Gonadotropinpräparates mit einem Alkoholgehalt, als Molenbruch ausgedrückt, von zumindest 0,33 und einem pH-Wert von 6 bis 9 und ferner ein oder mehrere in Wasser-Alkoholgemisehen lösliche Salze zu, derart, daß diese Salze in einer Menge, als Molenbruch ausgedrückt, von höchstens 0,016 vorliegen und Wasser in einer Menge, als Molenbruch ausgedrückt, von 0,50 bis 0,65 anwesend ist, bis der gemessene pH-Wert etwa 3 bis etwa 6 erreicht hat, wobei man gleichzeitig die Alkoholkonzentration zur Fällung des Hormons erhöht.

Zur Reinigung von HGG-Präparaten nach dem erfindungsgeraäßen Verfahren geht man vorzugsweise von Konzentrationen

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mit zumindest etwa 2000 I.E./mg aus. Selbstverständlich kann man Endprodukte höherer Aktivität erhalten, wenn das Ausgangsmaterial in höherem Reinheitsgrad vorliegt.

Ferner wurde gefunden, daß Gele von Polysacchariden, z.B. Dextran, in welchen durch chemische Behandlung sogenannte Seitenketten erzeugt und Oarboxymethylgruppen eingeführt wurden, z.B. die unter dem Handelsnamen CM-Sephadex bekannten und von der A. B. Pharmacia, Schweden, vertriebenen, z. B. die Typen G 25 und 0 50, zur Trennung von Hormonen der Gruppe der Cycloproteine und der hierin auftretenden natürlichen Verunreinigungen hochwirksam sind. Auch andere Substanzen mit der Wirkung eines Molekularsiebs und ionenaustauschenden Eigenschaften, wie "DEAE-Sephadex", z. B. die Typen A 25 und A 50, die aus einem vernetzten Polyäextran bestehen, worin Biäthylaminoäthylgruppen eingeführt wurden, können erfolgreich angewendet werden. Diese Molekularfilter mit ionenaustauschenden Eigenschaften wurden vnn P. Flodin, Dissertation, Uppsala, 1962, beschrieben.

Zur Elution der aktigven Substanz von dem Ionenaustauschermaterial können Puffersysteme, z. B. ITatriumacetat,-Essigsäure, Ammoniumacetat-Essigsäure, Pyridin-Essigsäure, Trimethylamin-Essigsäure, Triäthylamin-Essigsäure und Salze von Tri.s-(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) verwendet werden. Vorzugsweise erfolgt die Elution mit einem in Äthanol löslichen Puffer, der "bei der Fällung des Hormons aus den eluierten Fraktionen in Ijca^ng bleibt, öl'fd^ß^liß^ne..^eitere Trennung des Gonadotropins von dem Puffer erforderlich ist.

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Zweckmäßig erfolgt die Chromatographie über eine Säule des IonenauRtauschermaterials, wobei man die Säule vor dem Aufbringen der Hormonlösung mit einer Pufferlösung so niederer Konzentration äquilibriert, daß durch diese kein aktives Material eluiert werden kann. Meist wird die Elution mit verschiedenen Pufferlösungen steigender Molarität durchgeführt. Es wurde gefunden, daß Gonadotropine der höchsten Aktivität mit Puffern einer Konzentration von 0,1 "bis 0,5 m und insbesondere von 0,2 bis 0,3 m in Bezug auf die Base eluiert werden, ferner erwiesen sich Ammoniumacetat und Iris als Puffer für die erfindungsgetnäße Reinigung als sehr geeignet.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß für jedes Ionenaustauscher material ein gewisser pH-Bereich aufgefunden werden kann, innerhalb dessen eine ausgezeichnete Trennung der aktiven Substanz erzielt werden kann. Bei OM-Sephadex C 25 wird ein pH-Wert von 4,5 bis 5,2, vorzugsweise von etwa 5,0 angewendet, bei CK-Sephadex G 50 ist dieser pH-Wert 6,8 bis 7,2, vorzugsweise etwa 7,0, bei DEAE-Sephadex A 25 ist dieser pH-Wert 7,5 bis 8,4, vorzugsweise etwa 8,0 und bei DEAE-Sephadex A 50 betragt er 6,8 bis 7,2, vorzugsweise etwa 7,0.

Es erwies sich als vorteilhaft, das zu verwendende Ionenaustauschermaterial vor seiner Verwendung in destilliertem Wasser quellen zu lassen, anschließend mit verdünnter Säure,

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ζ. Β. Chlorwasserstoffsäure, hierauf mit destilliertem Wasser zur Entfernung der Säure und anschließend mit der zu verwendenden Pufferlösung zu waschen. Hierauf wird das Material mit dem zunächst anzuwendenden Puffer äquilibriert. Dies erfolgt vorzugsweise,nachdem das Material bereits in die Säule gebracht wurde. Es ist jedoch auch möglich, die erfindungsgemäße Reinigung portionenweise durchzuführen, indem man das Xonenaustauschermaterial gründlich mit der Hormonlösung vermengt und hierauf die aktive Substanz nach der Absorption des Materials mit einer geeigneten Pufferlösung eluiert. Selbstverständlich wird die Verwendung einer Säule zur Durchführimg einer fraktionierten Elution bevorzugt.

Soll die Aktivität der erfindungsgemäß durch Chromatographie erhaltenen Präparate weiter gesteigert werden, so kann dies gut erfolgen, indem man die Präparate einer Gelfiltration durch Material mit den Eigenschaften eines Molekularsiebs, z. B. die bekannten Arten von Sephadex G- 100, G und G 150 in Form einer Säule, wie von J. Porath und P.

Nature. Bd. 183, 1959, S. 1657

Flodin/und in der niederländischen Patentanmeldung 6 402 beschrieben, unterwirft« Hiezu wird die zu reinigende Substanz in destilliertem Wasser gelöst, auf die Kolonne gebracht und mit destilliertem Wasser eluiert. Vorzugsweise wird eine Elutionsgeschwindigkeit von etwa 3 bis etwa 6 ml/h angewendet. Anhand der Extinktion der eluierten Fraktionen, z, B. bei 280 m/u, wird die Elution verfolgt und werden die das Hormon enthaltenden Fraktionen festgestellt. Aus den wässrigen Eluaten wird"das Hormon schließlieh in sehr reinem Zustand,

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ζ. B. durch Fällung mit Alkohol oder durch Gefriertrocknung, gegebenenfalls nach vorheriger Entfernung der Salze, abgetrennt. Die Abtrennung der aktiven Substanz aus dem Eluat durch G-efriertrocknung wird bevorzugt, weil hlebei keine Inaktivierung der Substanz erfolgt,

Die biologischen Aktivitäten, der erfindungsgemäß hergestellten Präparate wurden, wie folgt, bestimmt: HGG oder IGSH wurden durch Vergleich mit dem internationalen Standard für Choriongonadotropin nach dem Samenblasentest, der analog dem Prostata-Test nach J. A. HJoraine, J. Endocrinol., Band 6, 1950, Seite 319, ist, und sich nur darin von diesem unterscheidet, daß den zu untersuchenden Lösungen auch etwa 0,1 Gew.-^ Albumin zur Stabilisierung des Hormons hinzugefügt wird, bestimmt. Der Samenblasentest ist spezifisch für IGSH. DagHMG wurde durch Vergleich mit dem internationalen Bezugspräparat (IRPjlnach dem sogenannten Zunahmetest (augmentation t4st) nachS. L. Steelman und F. M. Pohley, Endocrinology, Bd. 53» 1953, Seite 604, bestimmt, wobei die Aktivität in mg-Äquivalenten IRP ausgedrückt wird. Der Zunahmetest ist spezifisch für FSH.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand nachstehender Beispiele näher erläutert:

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Yor"behandlung des Ionenaustauschermaterials

GM-Sephadex G 25 ließ man über Nacht in destilliertem Wasser quellen. Durch Dekantieren von dem abgesetzten Material wurden kleine, in der Flüssigkeit suspendierte, Teilchen von dem Rest getrennt. Hierauf wurde das Material mit 5 VoI.-Teilen 0,1 m Chlorwasserstoffsäurelösung und anschließend mit destilliertem Wasser "bis zu einem pH-Wert von etwa 4 gewaschen. Dann wurde das Material mit der zum lösen des zu reinigenden Hormonpräparates bestimmten Pufferlösung gewaschen. Anschliessend wurde der Ionenaustauscher in eine Säule als dicke, frei fließende Masse gegossen. Nach dem Absetzen des Materials wurde schließlich die Säule mit dem zunächst zu verwendenden Puffer äquilibriert. Auch die anderen verwendeten Ionenaus~ tauschersubstanzen wurden auf diese Weise vorbehandelt.

Beispiel 1

2000 mg eines HGG-Präparates mit einer Aktivität von 5000 I.E./mg, erhalten durch Fällung mit Alkohol in einem sauren Medium, wurden in 50 ml einer 0,1 m Ammoniumacetatlösung des pH-Wertes 5 gelöst und auf eine Säule aus CM-Sephadex 0 25 gebracht, die mit einer wässrigen 0,1 m-Ammoniumacetatlösung des pH-Wertes 5 äquilibriert worden war. Hierauf wurde von der Säule mit dem genannten Puffer eine 1. Fraktion eluiert, die das Material enthielt, welches das 1. Extinktlonsmaximum verursachte. Die eluierte Substanz wurde mit 4 Teilen Äthanol gefällt und nach Stehen über Nacht durch Zentrifugieren

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abgetrennt, 2-mal rait absolutem Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck über Silikagel getrocknet. Ausbeute: 263>4 mg. Die biologische Aktivität dieses Präparates im Samenblasentest betrug unter 100 I.E./mg.

Eine aktive !Fraktion wurde mit einer 0,3 m-Ammoniumacetatlösung des pH-Wertes 5 eluiert. Das Material dieser Fraktion wurde in der oben beschriebenen Weise gefällt und isoliert. Ausbeute: 746 mg. Biologische Aktivität: 10500 I.E./mg,, entsprechend einer Ausbeute an Einheiten von 77 $. Mit demselben Eluens wurde ferner ein etwas weniger aktives Material in einer Ausbeute von 68 mg und mit einer Aktivität von 7600 I.E./mg, entsprechend 5,5 7& der ursprünglich anwesenden Einheiten, erhalten.

Durch eine letzte Elution mit einer 0,5 m-Ammoniumacetat· lösung des pH-Wertes 5 wurden weitere 280 mg eines Materials mit der niedrigen Aktivität von 3400 I.E./mg von der Säule eluiert. Die Ausbeute an Einheiten betrug in dieser letzten Fraktion 9,5 5*.

Beispiel 2

2500 mg eines HGG-Präparates mit einer Aktivität von 3000 I.E./mg, erhalten aus einem rohen Präparat durch fraktionierte Fällung mit einer Säure und einem Alkohol nach der niederländischen Patentanmeldung 6 500 350, wurden in

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einer 0,05 m-Lösung von Tris-HCl des pH-Wertes 7 gelöst und auf eine mit CM-Sephadex 0 50 gefüllte Säule gebracht, die mit einer wässrigen, 0,05 m-Tris-HCl-Lösung des pH-Wertes 7 äquilibriert war. Mit diesem .3?uffer wurde zunächst inaktives Material von der Kolonne eluiert. Ausbeute: 810 mg. Aktivität in dem Samenblasentest: Unter 200 I.E./mg₀

Hierauf wurde aktive Substanz mit einer 0,2 m-Iris-Höllösung mit dem pH-Wert 7 eluiert. Das Material wurde mit 4 YoI.-Teilen Alkohol gefällt, 2-mal mit absolutem Alkohol gewaschen und über Silikagel unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 750 mg. Aktivität des Präparates: Etwa 7000 I.E./mg, entsprechend 70 fo der in dem Au.sgangsmaterial enthaltenen Einheiten.

Durch eine 3. Elution mit einer 0,4 m-Tris-HCl-lösung des pH-Wertes 7 wurden weitere 200 mg einer Substanz mit der niedrigen Aktivität von 2000 I.E./mg von der Säule eluiert. Alle Arbeitsvorgänge wurden bei einer Temperatur von 0 bis 10° G durchgeführt.

Beispiel 3

2000 mg eines HOG-Präparates mit einer Aktivität von · 4500 I.E./mg wurden in einer 0,1 m-Tris-HCl-Lösung des pH-Wertes

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8 gelöst und auf eine mit DEAE-Sephadex A 25 gefüllte und mit einer wässrigen, 0,1 m-Tris-HCl-lösung des pH-Wertes 8 äquilibrierte Säule gebracht. Mit diesem Puffer wurde nur inaktives Material von der Säule eluiert. Dieses Material wurde in üblicher Weise isoliert, gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 210 mg. Biologische Aktivität im Samenblasentest: Unter 200 I.E./mg.

Mit einer 0,3 m-Iris-HCl-Pufferlösung des pH-Wertes 8 wurde aktives Material eluiert, das nach üblicher Isolierung in einer Ausbeute von 819 mg, mit einer Aktivität von etwa 9000 I.E./mg, gewonnen wurde. Die Ausbeute betrug 82 $, auf die Menge Einheiten in dem Ausgangsmaterial bezogen.

Durch eine 3. Elution mit einer 0,6 m-Iris-HCT-lösung des pH-Wertes 8 wurden weitere 553 mg einer praktisch inaktiven Substanz, mit einer biologischen Aktivität von unter 200 I.E./mg, von der Säule eluiert. Alle Arbeitsvorgänge wurden bei einer Temperatur von 0 bis 10° 0 durchgeführt.

Beispiel 4

2500 mg eines HCG-Präparates, mit einer Aktivität von 6500 I.E./mg,wurden in einer 0,05 m-Tris-HCl-Pufferlösung des pH-Wertes 7 gelöst. Mit einer Pufferlösung gleicher Zusammensetzung wurden 242 mg Substanz von der Säule gewaschen, Diese^Substanz zeigte bei der biologischen Prüfung eine Aktivität von xmte&Sl00 I.E./mg. ORIGINAL INSPECTED

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Mit einer 0,1 m-Iris-HCl-Pufferlösung des pH-¥ertes 7 wurde aktives Material eluiert, das nach der Isolierung in einer Ausbeute von 520 mg erhalten wurde. Die biologische Aktivität "betrug etwa 4OOO I.E./mg. Mit demselben Eluens wurde eine weitere Fraktion erhalten, die sich nach der Isolierung als Material von höherer Aktivität erwies. Ausbeute: 350 mg. Aktivität: IO5OO I.E./mg, entsprechend einer Ausbeute an Einheiten von 24 $.

Mit einer 0,15 m-Tris-HCl-PufferlÖsung des pH-Wertes 7 wurde hochaktives Material eluiert, das nach seiner Isolierung eine biologische Aktivität von 15500 I.E./mg aufwies und in einer Ausbeute von 225 mg (21 $ der Einheiten)¹ anfiel. Schließlich wurden 310 mg Substanz mit einer 0,3 m-Tris-HCl-Pufferlösung des pH-Wertes 7 eluiert. Die Aktivität dieser fraktion betrug 85O I.E./mg. Die Elutionsgeschwindigkeit bei dieser Chromatographie betrug 50 ml/h. Die Temperatur wurde auf 0 bis 10° C gehalten.

Beispiel 5: Gelfiltration rait Sephadex G 200

500 mg eines HCG-Präparates mit einer Aktivität von IO5OO I.E./mg, erhalten durch Chromatographie mit CM-Sephadex C 25 nach Beispiel 1, wurden in destilliertem Wasser gelöst und auf eine mit Sephadex G 200 gefüllte und mit destilliertem Wasser äquilibrierte Säule gebracht. Die Säule wurde Mt

JSAIl. ¹JZQ

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destilliertem Wasser eluiert. Die Em ti on wurde stufenweise durch Messung der Extinktion der erhaltenen Fraktionen verfolgt, Die aktive Substanz wurde in Fraktionen eluiert, deren Extinktionen ein unregelmäßig geformtes. Maximum ergaben, wenn die Extinktion gegen die- Fraktionsnummer graphisch aufgetragen wurde. Die den 1. Seil des Extinktionsmaximums "bildenden Fraktionen wurden vereinigt. Die aktive Substanz wurde durch Gefriertrocknung erhalten. Man erhielt 177 mg eines Präparates mit einer "biologischen Aktivität von 14400 I.E./mg. Aus den den 2. Teil des Extinktionsmaximums bildenden Fraktionen wurden 114 mg Substanz mit einer biologischen Aktivität von 11300 I.E./mg-erhalten. Die Ausbeute an Einheiten in der 1. Fraktion betrug 49 $ und in den letzten Fraktionen 25 /£.

Beispiel 6: Gelfiltration mit Sephadex C100

200 mg eines HCG-Präparates, mit einer Aktivität von 8700 I.E./mg, wurden in destilliertem Wasser gelöst und auf eine mit Sephadex G 100 gefüllte und mit destilliertem Wasser äquilibj^rierte Säule gebracht.

Durch Elution mit destilliertem Wasser erzielte man eine Trennung des ursprünglichen Präparates in 6 Fraktionen, nämlich 18 mg mit einer Potenz von 18800 I.E./mg, 16 mg mit einer Potenz von 11800 I.E./mg, 11,5 mg mit einer Potenz von 11000 I.E./mg, 19 mg mit einer Potenz von 8600 I.E./mg, 17 mg mit einer Potenz von 7500 I.E./mg und 25 mg mit einer Potenz von 4100 I.E./mg.

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Beispiel 7

Auf eine mit einer O,.05 m-Ammoniumacetat-Pufferlösung des pH-Wertes 5 äquilibrierte CM-Sephadex 0 25-Säule wurden 290 mg eines HMG-Präparates* mit einer FSH-Aktivität im Zunahmetest von 350 mg-Äquivalent IRP/mg und einer ICSH-Aktivität von 15 I.E./mg, gelöst in der genannten Pufferlösung, gebracht, Die 1. Elution erfolgte mit dem genannten Puffer, worauf man durch Fällung mit 4 Vol.-Teilen absolutem Alkohol in dem Eluat einen Hiederschlag erhielt. Dieser wurde 2-mal mit Äthanol gewaschen und hierauf unter vermindertem Druck über PpOc getrocknet. Ausbeute: 170 mg Substanz mit einer FSH-Aktivität im Zunahmetest von 7 mg-Äquivalent IRP/mg.

Hierauf wurde mit einer 0,2 m-Ammoniumacetat-Pufferlösung des pH-Wertes 5 ein Eluat erhalten, das nach der Isolierung in der oben beschriebenen Weise 8 mg eines Präparates mit einer FSH-Aktivität von 160 mg-Äquivalent IEP/mg ergab.

Dann erhielt man mit einer 0,4 m-Ammoniumacetat-Pufferlösung des pH-Wertes 5 23 mg einer sehr aktiven Fraktion mit einer FSH-Aktivität von 2400 mg-Äquivalent IRP/mg.

Mit einer 1 m-Pufferlösung konnten 36 mg Substanz mit einer Potenz von 300 mg-Äquivalent IRP/mg isoliert werden.

Patentansprüche

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Claims

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Pat enta η Sprüche

1. Verfahren zur Herstellung hochreiner G-onadotropine auf Chromatograph!sehern Wege, dadurch gekennzeichnet , daß man eine v/ässrige lösung eines Gonadotropinkonzentrats mit einem Ionenaustauschermaterial, das auch die Eigenschaften eines Molekularsiebs aufweist, in Eontakt "bringt, die aktive Substanz von dem Material mit zumindest einer Pufferlösung eluiert und die G-onadotropine aus den erhaltenen Fraktionen abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als Ionenaustauschermaterial Carboxymethyl-Sephadex verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauschermaterial Garboxymethyl-Sephadex G 25 verwendet und die Elution bei einem pH-Wert von etwa 4>5 bis etwa 5,2 durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial ein HGG-Präparat mit zumindest etwa 2000 I.E./mg verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich n e t:', däß-rnajn-äa^. Ionenauatauschermaterial mit einem in ' Xthanol löeliohen »«er eluiert.

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Sr Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferlösung verwendet, die Ammoniumacetat oder ein Salz -von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in einer Konzentration von 0,1 "bis 0,5 m enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial ein Gonadotropinkonzentrat verwendet, das aus einem rohen Konzentrat desselben durch Fällung mit einem Alkohol in einem sauren Medium und in Gegenwart eines in Wasser-Alkoholgemischen löslichen Salzes hergestellt wurde.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ionenaustauschermaterial zunächst in destilliertem Wasser quellen läßt und anschließend mit verdünnter Säure und hierauf mit destilliertem Wasser wäscht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gonadotropine durch Gelfiltration weiter reinigt.

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