JPS59137417A - 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 - Google Patents
人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法Info
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- JPS59137417A JPS59137417A JP58011317A JP1131783A JPS59137417A JP S59137417 A JPS59137417 A JP S59137417A JP 58011317 A JP58011317 A JP 58011317A JP 1131783 A JP1131783 A JP 1131783A JP S59137417 A JPS59137417 A JP S59137417A
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- kallikrein
- human urine
- buffer
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- urine
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6445—Kallikreins (3.4.21.34; 3.4.21.35)
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/834—Urine; urinary system
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、人尿由来コロニー形成刺激因子（ｃｏ］、ｏ
ｎｙ ｒ＋ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、以下
Ｃ８Ｆと略記する）及びカリクレインの製造法に関する
。
ｎｙ ｒ＋ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、以下
Ｃ８Ｆと略記する）及びカリクレインの製造法に関する
。
更に詳しくは、生理活性物質であるところのＣ８Ｐ及び
カリクレインを健康人の尿又はＣ８Ｆとカリクレインと
を含有する溶液（以下人尿等と記載する）から高い回収
率で分離精製し、医薬品として使用し得るカリクレイン
不含のＣ８Ｆ及びカリクレインを同時に製造する方法に
関するものである。
カリクレインを健康人の尿又はＣ８Ｆとカリクレインと
を含有する溶液（以下人尿等と記載する）から高い回収
率で分離精製し、医薬品として使用し得るカリクレイン
不含のＣ８Ｆ及びカリクレインを同時に製造する方法に
関するものである。
Ｃ８Ｆ及びカリクレインは人尿中に極めて微量に存在す
る高分子の生理活性物質である。Ｃ８Ｆは、マウス及び
人の骨髄中の顆粒球系前駆細胞に作用して白血球構成細
胞であるところの顆粒球及び単球−マクロファージの分
化・増殖を促進テろ糖蛋白質である（ Ｋ、Ｍｏｔｏｙ
ｏｓｈｉ 、 ｅｔａｌ、、Ｂｌｏｏｄ 、 ５２巻、
１０１２頁〜１０２０頁、１９７８年； ｓ、ｘ。
る高分子の生理活性物質である。Ｃ８Ｆは、マウス及び
人の骨髄中の顆粒球系前駆細胞に作用して白血球構成細
胞であるところの顆粒球及び単球−マクロファージの分
化・増殖を促進テろ糖蛋白質である（ Ｋ、Ｍｏｔｏｙ
ｏｓｈｉ 、 ｅｔａｌ、、Ｂｌｏｏｄ 、 ５２巻、
１０１２頁〜１０２０頁、１９７８年； ｓ、ｘ。
ろ生体内Ｃ８Ｆの産生をも刺激ｊろ作用を有しており、
制癌剤及びＸ線照射等の治療により、著しい白血球減少
症に陥った癌患者へ投与すると、顆粒球を主体とする白
面球数の回復増加を促進することが知られている（ Ｋ
、Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ 、 ｅｔａｌ、。
制癌剤及びＸ線照射等の治療により、著しい白血球減少
症に陥った癌患者へ投与すると、顆粒球を主体とする白
面球数の回復増加を促進することが知られている（ Ｋ
、Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ 、 ｅｔａｌ、。
Ｊａｐａｎｅ８ｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ 、 ２ ’１巻、１８７頁〜１９１頁、１９８
２年）。
ｉｎｅ 、 ２ ’１巻、１８７頁〜１９１頁、１９８
２年）。
一方、カリクレインは哨乳動物血漿中のキニノージエン
からの生理活性ペゾタイトであるキニン類の生成及び血
液凝固系に関与する一種の蛋白分解酵素である。カリク
レインが生成するキニン類は、末梢血管拡張作用、血管
透過性の光通等の生理作用を有し、カリクレインはこれ
らの作用を調節１−る機能を果している。現在、動物膵
臓から抽として市販されている。人尿由来のカリクレイ
ンは、これら動物由来カリクレインと同等の生理作用を
有しており、人由来であることから、異種蛋白質に起因
する副作用、例えばアレルギー性ショック反応等を起こ
しｔＷ＜、反復投与が可能であるので、医薬としての価
値は、むしろ動物由来カリクレイン製剤よりも高い。
からの生理活性ペゾタイトであるキニン類の生成及び血
液凝固系に関与する一種の蛋白分解酵素である。カリク
レインが生成するキニン類は、末梢血管拡張作用、血管
透過性の光通等の生理作用を有し、カリクレインはこれ
らの作用を調節１−る機能を果している。現在、動物膵
臓から抽として市販されている。人尿由来のカリクレイ
ンは、これら動物由来カリクレインと同等の生理作用を
有しており、人由来であることから、異種蛋白質に起因
する副作用、例えばアレルギー性ショック反応等を起こ
しｔＷ＜、反復投与が可能であるので、医薬としての価
値は、むしろ動物由来カリクレイン製剤よりも高い。
一方、医薬品として人尿からＣ８Ｆとカリクレインとを
分別して医薬品を製造する場合、一方の製剤中に他方の
物質が混入していることは医薬品の品勿及び安全性の点
から望ましいことではない。
分別して医薬品を製造する場合、一方の製剤中に他方の
物質が混入していることは医薬品の品勿及び安全性の点
から望ましいことではない。
特に顆粒球減少症治ガフ剤としてのＣ８Ｆは、静脈内適
用が効果的であり、従ってカリクレインの混入は絶対に
許容し得ない問題である。なぜならばカリクレインは、
例え微量であっても、静脈内へ投与すると、その末梢血
管拡張作用により著しい血圧降下作用を発揮するので、
Ｃ８Ｆの投与量に応じて、大量のカリクレインが静脈内
へ導入された場合、急激な血圧降下によるショック状態
を患者に惹起せしめる可能性があるからである。
用が効果的であり、従ってカリクレインの混入は絶対に
許容し得ない問題である。なぜならばカリクレインは、
例え微量であっても、静脈内へ投与すると、その末梢血
管拡張作用により著しい血圧降下作用を発揮するので、
Ｃ８Ｆの投与量に応じて、大量のカリクレインが静脈内
へ導入された場合、急激な血圧降下によるショック状態
を患者に惹起せしめる可能性があるからである。
人尿由来のＣ８Ｆもカリクレインもともに、前記のよう
に医薬品としての価値が極めて高く、従ってこれらを人
尿等から有効に回収し、かつ完全に分離された状態で製
造することは、安全性が高く安価な医薬品として提供す
る目的の上で、極めて有益なことである。しかしながら
従来人尿等からＣ３Ｆ及びカリクレインの両者を効果的
に分別取得する方法に関する知見は極めて少なかった。
に医薬品としての価値が極めて高く、従ってこれらを人
尿等から有効に回収し、かつ完全に分離された状態で製
造することは、安全性が高く安価な医薬品として提供す
る目的の上で、極めて有益なことである。しかしながら
従来人尿等からＣ３Ｆ及びカリクレインの両者を効果的
に分別取得する方法に関する知見は極めて少なかった。
その理由は、Ｃ３ｌＩ′とカリクレインとがその生理作
用及び起源を必ずしも共通にしているわけではないにも
かかわらず、極めて類似した性質を有しているからであ
る。例えば、Ｃ８Ｆもカリクレインも糖鎖を結合した蛋
白質であり、その等電点は両者ともＰＨ３，０〜４．５
の酸性側領域にあり、電気的性状の差違を利用してこれ
らを分別することは困難であった。更に、人尿中に存在
する場合、Ｃ８Ｆの分子量は６０．０００〜１００，０
００ダルトンであり、一方カリクレインのそれは５ ［
１，０００〜８０，０００ダルトンであるから、両者は
極めて接近した分子量を有している。
用及び起源を必ずしも共通にしているわけではないにも
かかわらず、極めて類似した性質を有しているからであ
る。例えば、Ｃ８Ｆもカリクレインも糖鎖を結合した蛋
白質であり、その等電点は両者ともＰＨ３，０〜４．５
の酸性側領域にあり、電気的性状の差違を利用してこれ
らを分別することは困難であった。更に、人尿中に存在
する場合、Ｃ８Ｆの分子量は６０．０００〜１００，０
００ダルトンであり、一方カリクレインのそれは５ ［
１，０００〜８０，０００ダルトンであるから、両者は
極めて接近した分子量を有している。
従来、人尿からＣ８Ｆやカリクレインを分離・精製する
方法ば、その他の生理活性物質と同様に、そ才１．それ
個々の物質を対象として研究がなされてきており、これ
らの方法をＣ８Ｆとカリクレインの効果的な同時精製へ
応用することは不可能であった。従って、カリクレイン
非含有のＣ８Ｆを精製する場合には、カリクレインの回
収率は著しく損なわれ、他方、カリクレインの分別を目
的とした場合には、Ｃ８Ｆの回収は不可能であった。人
尿からＣ１ＥＦとカリクレインとを高い回収率でかつ完
全に分Ｖ：（しされた状態で同時に卵製する方法に関し
ては、既に本発明者らが親和体クロマトグラフィー及び
イオン交換体クロマトグラフィーによる方法を発明し、
特許出願した（特願昭５５−１３３２６２号。以下先願
の方法と記載する）。
方法ば、その他の生理活性物質と同様に、そ才１．それ
個々の物質を対象として研究がなされてきており、これ
らの方法をＣ８Ｆとカリクレインの効果的な同時精製へ
応用することは不可能であった。従って、カリクレイン
非含有のＣ８Ｆを精製する場合には、カリクレインの回
収率は著しく損なわれ、他方、カリクレインの分別を目
的とした場合には、Ｃ８Ｆの回収は不可能であった。人
尿からＣ１ＥＦとカリクレインとを高い回収率でかつ完
全に分Ｖ：（しされた状態で同時に卵製する方法に関し
ては、既に本発明者らが親和体クロマトグラフィー及び
イオン交換体クロマトグラフィーによる方法を発明し、
特許出願した（特願昭５５−１３３２６２号。以下先願
の方法と記載する）。
しかしながら先願の方法も理Ｍ的方法とは必ずしもいえ
ない面があり、例えば、親和体クロマトグラフィーは分
離特性の点で極めて優れている反面、処理量当りの設備
、担体のコストが高価であリ、また、イオン交換体では
、経済性の面ですこぶるイＪ利ではあるが、作業性に短
所があり、特に精密分画′？目的とする６度勾配溶出法
にあってしま細心の注意と長時間を要す緩徐な処理が必
要であった。Ｃ８Ｆとカリクレインを同時に分離精製す
る第６の方法としては、分子量により分別するデル濾過
クロマトグラフィーがある。しかし従来広く利用されて
いる多糖体或いは各種フ０ラスチツクスを主成分とした
軟性ケゞル担体では、人尿中に存在するＣＢＦとカリク
レインの分子量が極めて近接しているために、これらを
完全に分離することは不可能であった。
ない面があり、例えば、親和体クロマトグラフィーは分
離特性の点で極めて優れている反面、処理量当りの設備
、担体のコストが高価であリ、また、イオン交換体では
、経済性の面ですこぶるイＪ利ではあるが、作業性に短
所があり、特に精密分画′？目的とする６度勾配溶出法
にあってしま細心の注意と長時間を要す緩徐な処理が必
要であった。Ｃ８Ｆとカリクレインを同時に分離精製す
る第６の方法としては、分子量により分別するデル濾過
クロマトグラフィーがある。しかし従来広く利用されて
いる多糖体或いは各種フ０ラスチツクスを主成分とした
軟性ケゞル担体では、人尿中に存在するＣＢＦとカリク
レインの分子量が極めて近接しているために、これらを
完全に分離することは不可能であった。
高速液体クロマトグラフィーは、近年、広く有機化合物
の分離・同定を目的とした各種クロマトグラフィーを更
に発展向上させるために開発されて来た技術であり、そ
の特徴は、高圧高速下に各種化合物を極めて高精度に、
かつ短時間でクロマトグラフィー分画を可能ならしめる
ことにある。
の分離・同定を目的とした各種クロマトグラフィーを更
に発展向上させるために開発されて来た技術であり、そ
の特徴は、高圧高速下に各種化合物を極めて高精度に、
かつ短時間でクロマトグラフィー分画を可能ならしめる
ことにある。
特に、ケゞル濾過クロマトグラフィーの分野にあっては
、従来の軟質ｒル担体に代わり、耐圧性の優れた微粒子
ゲル汲過担体の開発に伴って、高分子物質の分子量によ
る分別を飛躍的に改善し？る方法を提供することになっ
た。
、従来の軟質ｒル担体に代わり、耐圧性の優れた微粒子
ゲル汲過担体の開発に伴って、高分子物質の分子量によ
る分別を飛躍的に改善し？る方法を提供することになっ
た。
本発明者らは、この高速液体クロマトグラフィーによる
ｒルｒ過の高い分別特性に着目し、人尿由来σ）Ｃ８Ｆ
とカリクレインとの同時精製法を行なった。そしてシリ
カゲルを主成分とする耐圧性ゲル′０−ｉ過担体による
高速液体クロマトグラフィーでイー、Ｃ８Ｆとカリクレ
インとが極めて良好に分離されろことを見い出した。し
かし、高速液体クロマトグラフィー用の市販の担体は、
Ｃ３Ｆ及びカリクレインの非特異的吸着現象を起し、Ｃ
８Ｆとカリクレインの１部が担体上に残留した。このｒ
ル濾過相体への非特異的吸着現象は、市販の担体一般に
ついて認められた現象であったが、これはクロ曾１・液
相のイオン強度を高めることにより防止することが可能
であった。しかし、液相のイオン強度を高めると、今度
はＣ８Ｆの生物学的活性（以下単に活性と略記する）は
、逆に不安定になり、回収活性量の低下という事態を招
いた。
ｒルｒ過の高い分別特性に着目し、人尿由来σ）Ｃ８Ｆ
とカリクレインとの同時精製法を行なった。そしてシリ
カゲルを主成分とする耐圧性ゲル′０−ｉ過担体による
高速液体クロマトグラフィーでイー、Ｃ８Ｆとカリクレ
インとが極めて良好に分離されろことを見い出した。し
かし、高速液体クロマトグラフィー用の市販の担体は、
Ｃ３Ｆ及びカリクレインの非特異的吸着現象を起し、Ｃ
８Ｆとカリクレインの１部が担体上に残留した。このｒ
ル濾過相体への非特異的吸着現象は、市販の担体一般に
ついて認められた現象であったが、これはクロ曾１・液
相のイオン強度を高めることにより防止することが可能
であった。しかし、液相のイオン強度を高めると、今度
はＣ８Ｆの生物学的活性（以下単に活性と略記する）は
、逆に不安定になり、回収活性量の低下という事態を招
いた。
本発明者らは、担体への非特異的吸着ｈ″−なく、かつ
Ｃ８′Ｆ″活性の低下を防止して、効果的にｃｓｖ’と
カリクレインとを分離・精製せしめる高速゛液体ゲル濾
過クロマトグラフィー〇）条件につし・て更に検討を重
ねたところ、Ｃ８Ｆ活４生安定斉１１とし、て’ｆＣ１
られろポリエチＶングリコーノ１／又（まオクチル−フ
ェノキシポリエトキシエタノール する）が、この目的に合致することを見見・１３３シ、
その結果、本発明を完成するに至ったσ）である。
Ｃ８′Ｆ″活性の低下を防止して、効果的にｃｓｖ’と
カリクレインとを分離・精製せしめる高速゛液体ゲル濾
過クロマトグラフィー〇）条件につし・て更に検討を重
ねたところ、Ｃ８Ｆ活４生安定斉１１とし、て’ｆＣ１
られろポリエチＶングリコーノ１／又（まオクチル−フ
ェノキシポリエトキシエタノール する）が、この目的に合致することを見見・１３３シ、
その結果、本発明を完成するに至ったσ）である。
本発明の目的は人尿等からＯＳＦと力１ｊクレインとを
同時に、完全にしかも高（・踊］収率で分男１」シ、製
造する方法を提供することにある。
同時に、完全にしかも高（・踊］収率で分男１」シ、製
造する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は人尿等力・ら分力１１シた力１）フ
レインを含まないＣＳＦ及びｃｓｙを含１ハ・力１）フ
レインを提供することにおる。
レインを含まないＣＳＦ及びｃｓｙを含１ハ・力１）フ
レインを提供することにおる。
本発明は、人尿等を濃縮し、安定斉１を含有する緩衝液
とＩＩ液を平衡させ、分子量排除内艮界ｈ＼球状蛋白質
で測定した時１０５〜５ｘＩＤ５りゞルトンの分子篩効
果を有する担体を充填し、力＼つ予め該緩衝液を通液し
たカラムへ注入し、高速液体ゲル？Ｊ 迎クロマトグラ
フィーを行な（・％’ ＯＳＦと力１Ｊクレインとを分
離し、のちそれらをイ固５３＋１に回収すルコトを特徴
とするＯＥｔＦと力ＩＪクレインの’Ｊ 進法に関する
。
とＩＩ液を平衡させ、分子量排除内艮界ｈ＼球状蛋白質
で測定した時１０５〜５ｘＩＤ５りゞルトンの分子篩効
果を有する担体を充填し、力＼つ予め該緩衝液を通液し
たカラムへ注入し、高速液体ゲル？Ｊ 迎クロマトグラ
フィーを行な（・％’ ＯＳＦと力１Ｊクレインとを分
離し、のちそれらをイ固５３＋１に回収すルコトを特徴
とするＯＥｔＦと力ＩＪクレインの’Ｊ 進法に関する
。
人尿等を、酸又はアルカ１）溶液でＰＨ６〜Ｂに調整し
、適当な公知σ）蛋白質濃縮法、ｆｉｌえシヅシＩＪカ
ゲル等σ）無機物吸着体又はイオン交換体などの吸着法
、イ〆［安等の中性塩を用（・た塩析法、限外Ｆ：Ｉ尚
法或いはこれらの組み合わせによる濃縮法によって（１
没給する。／／畏縮された人尿＃０）蛋白質含量ｋま１
０ｔｆｌ）（’％）り下が望ましく・。
、適当な公知σ）蛋白質濃縮法、ｆｉｌえシヅシＩＪカ
ゲル等σ）無機物吸着体又はイオン交換体などの吸着法
、イ〆［安等の中性塩を用（・た塩析法、限外Ｆ：Ｉ尚
法或いはこれらの組み合わせによる濃縮法によって（１
没給する。／／畏縮された人尿＃０）蛋白質含量ｋま１
０ｔｆｌ）（’％）り下が望ましく・。
本発明を更に有利に実施するためにし家、この濃縮工程
で、ＣＳＦ及びカリフレ４フ０〕回収率を損わない範囲
で、猥雑高分子物質を可會ヒな限り除去する公知の方法
を用いても良（・０該濃縮液を、イオン強度が０，０５
以上０．５未満，好ましくをま０．１〜０、 ３ テｈ
’） 、 ｐ”が６．’０ 〜ｓ．ｏ テアルＨ衝液
、ψｕえばリン酸す） ＋１ウム緩衝液等と平衡させ、
更に安定剤として分子ｘ １．ｏ ｏ ｏ〜１０，００
０のポリエチレングリコール又は０ＰＰＥ 、例えばＴ
ｒｉｔＯｎ７ｘ−１００（商品名。ローム＆ハース社製
）、をり、０１〜０．１係（、Ｑ）の濃度で加える。次
に、球状蛋白質により測定した時に、分子量排除限界が
１０５〜５×１０５ダルトンの分子篩効果を有する高速
液体クロマトグラフィー用ゲル濾過担体、例えば市販（
７） ＴＳＫ −Ｇｅ１ろｏ ｏ ｏ ｓｗ ＜東洋ソ
ーダ社製）、ｚｏＲＢＡｘ ＰＳＭ −１０００（商品
名。デュポン社製）、Ｓｈｉｍ−ｐａｃ、ｋ Ｈ２Ｃ−
４０（商品名。
で、ＣＳＦ及びカリフレ４フ０〕回収率を損わない範囲
で、猥雑高分子物質を可會ヒな限り除去する公知の方法
を用いても良（・０該濃縮液を、イオン強度が０，０５
以上０．５未満，好ましくをま０．１〜０、 ３ テｈ
’） 、 ｐ”が６．’０ 〜ｓ．ｏ テアルＨ衝液
、ψｕえばリン酸す） ＋１ウム緩衝液等と平衡させ、
更に安定剤として分子ｘ １．ｏ ｏ ｏ〜１０，００
０のポリエチレングリコール又は０ＰＰＥ 、例えばＴ
ｒｉｔＯｎ７ｘ−１００（商品名。ローム＆ハース社製
）、をり、０１〜０．１係（、Ｑ）の濃度で加える。次
に、球状蛋白質により測定した時に、分子量排除限界が
１０５〜５×１０５ダルトンの分子篩効果を有する高速
液体クロマトグラフィー用ゲル濾過担体、例えば市販（
７） ＴＳＫ −Ｇｅ１ろｏ ｏ ｏ ｓｗ ＜東洋ソ
ーダ社製）、ｚｏＲＢＡｘ ＰＳＭ −１０００（商品
名。デュポン社製）、Ｓｈｉｍ−ｐａｃ、ｋ Ｈ２Ｃ−
４０（商品名。
高滓製作所製）等を充填し、そして安定剤を加えた上記
緩衝液を予め通液して平衡化したカラムへ該ａ給液を注
入し、流速１〜５ ｍ１３− ａｍ−２・ｍｉｎ ”で
該緩衝液を高圧畝ンプにより前記カラムに通液し、高速
ケゞル濾過クロマト〃”ラフイーを行う。緩衝液の通液
圧力は、カラムの半径によって変動するが、通常半径５
ルで’Ｉ Ｏｋｌｉ’ ／ Ｃ１ｎ、 ”以上が望まし
い。
緩衝液を予め通液して平衡化したカラムへ該ａ給液を注
入し、流速１〜５ ｍ１３− ａｍ−２・ｍｉｎ ”で
該緩衝液を高圧畝ンプにより前記カラムに通液し、高速
ケゞル濾過クロマト〃”ラフイーを行う。緩衝液の通液
圧力は、カラムの半径によって変動するが、通常半径５
ルで’Ｉ Ｏｋｌｉ’ ／ Ｃ１ｎ、 ”以上が望まし
い。
前記の操作により（’ＳＦは分子量８５，０００ダルト
ンの単一ピークとして、またカリクレインは分子！ ６
０，０００ダルトンのピークとしてカラムから溶出され
るので、それぞれ個別に回収する。次いで得られたＣ６
Ｆ及びカリクレインを、それぞれ必要に応じて透析、脱
塩処理し、医薬として許容し得るＰＨ調整塩、溶解補助
剤又は賦形剤を添加してｄｌ！１．菌濾過充填又は無菌
凍結乾燥等の処理を行ない、医菓品を製造する。前記の
ようにして分別されたＣ８Ｆ及びカリクレインを更に公
知の方法で個別に精製することもできる。
ンの単一ピークとして、またカリクレインは分子！ ６
０，０００ダルトンのピークとしてカラムから溶出され
るので、それぞれ個別に回収する。次いで得られたＣ６
Ｆ及びカリクレインを、それぞれ必要に応じて透析、脱
塩処理し、医薬として許容し得るＰＨ調整塩、溶解補助
剤又は賦形剤を添加してｄｌ！１．菌濾過充填又は無菌
凍結乾燥等の処理を行ない、医菓品を製造する。前記の
ようにして分別されたＣ８Ｆ及びカリクレインを更に公
知の方法で個別に精製することもできる。
以上のようにしてＣ８Ｆ及びカリクレインが同時に製造
される。
される。
次に試験例及び実施例により更に具体的に本発明の詳細
な説明する。
な説明する。
（試験１）従来法と本発明によるデル濾過クロマトグラ
フィーの比較試験 実施例１と同一の方法によシ調製した人尿の濃縮液を従
来法のデル沖適用担体として５ｅｐｈａｃｒｙｌｓ−６
００（ファルマシア社製）及び本発明の方法の高速液体
クロマトグラフィー用担体としてＴＳＫ −Ｇｅｌ ３
０００ ｓｗ （東洋曹達製）金柑いてゲル濾過クロマ
トグラフィーを行ない、その分離特性を比較した。５ｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −３０Ｄカラム（φ２ＤＸ１２０
０ｍｍ）には該濃縮液１．４ｍｌ！、ＴＳＫ −、Ｇｅ
ｌ ３０００ ＳＷカラム（φ７．５ Ｘ １２００ｍ
ｍ）にはＣＪ、２ｍ１ｋ注入し、前者はペリスタポンプ
で５ ｍｌ ／ ｃｎｔ２／ ｈｒの流速で、後者は高
圧送液ポンプＬＣ−３Ａ （高滓製作所）を用いて２−
Ｏｍｌ／ｃｒｒＬ２／ ｍｉｎの流速で実施例１と同
一の緩衝液を通液し、クロマトグラフィーを行なった１
、１分画５ｍ１（前者）及び２ｍ１（後者）ずつを分取
し”ｔ Ｃ８Ｆ及びカリクレイン活性を次の方法にょシ
測定して試験した。
フィーの比較試験 実施例１と同一の方法によシ調製した人尿の濃縮液を従
来法のデル沖適用担体として５ｅｐｈａｃｒｙｌｓ−６
００（ファルマシア社製）及び本発明の方法の高速液体
クロマトグラフィー用担体としてＴＳＫ −Ｇｅｌ ３
０００ ｓｗ （東洋曹達製）金柑いてゲル濾過クロマ
トグラフィーを行ない、その分離特性を比較した。５ｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −３０Ｄカラム（φ２ＤＸ１２０
０ｍｍ）には該濃縮液１．４ｍｌ！、ＴＳＫ −、Ｇｅ
ｌ ３０００ ＳＷカラム（φ７．５ Ｘ １２００ｍ
ｍ）にはＣＪ、２ｍ１ｋ注入し、前者はペリスタポンプ
で５ ｍｌ ／ ｃｎｔ２／ ｈｒの流速で、後者は高
圧送液ポンプＬＣ−３Ａ （高滓製作所）を用いて２−
Ｏｍｌ／ｃｒｒＬ２／ ｍｉｎの流速で実施例１と同
一の緩衝液を通液し、クロマトグラフィーを行なった１
、１分画５ｍ１（前者）及び２ｍ１（後者）ずつを分取
し”ｔ Ｃ８Ｆ及びカリクレイン活性を次の方法にょシ
測定して試験した。
Ｃ８Ｆ活性は、Ｃ５７ＢＬ ／ ６ Ｎマウス骨髄細胞
を用いる単層軟寒天平板法によるコロニー形成法で測定
した。即ち、各分画試料を２％（′￥Ｖ）牛血清を含有
する蒸留水で適宜希釈して濾過除菌（０，４５μフイル
ター）した後、６枚のシャーレへ０．１ｍｌずつ分注し
、これに０．６％（％）寒天、２０％（％）牛胎児血清
及びＣ５７ＢＬ ／ ６ Ｎマウス骨髄細胞１×１０”
個全含有するＭｃＣｏｙ’ｓ ５ Ａ培地１ｄ’に加え
て十分混第１ルだ後、６７°Ｃ，７，５％（冬）炭酸ガ
ス通気下のフラン器で７日間培養した。培養後、顕微鏡
視野下で５０個以上の細胞から成る集塊をコロニーとし
て、形成はれたコロニー数を計測し、形成されたコロニ
ー数（単位）でＣ３Ｅｉ“活性を表わした。、１単位ば
１形成コロニーとして、得られたＣ８Ｆ標品の純度を、
標品の蛋白質１１ｎｇ当シのコロニー形成数を示す比活
性で表わした。
を用いる単層軟寒天平板法によるコロニー形成法で測定
した。即ち、各分画試料を２％（′￥Ｖ）牛血清を含有
する蒸留水で適宜希釈して濾過除菌（０，４５μフイル
ター）した後、６枚のシャーレへ０．１ｍｌずつ分注し
、これに０．６％（％）寒天、２０％（％）牛胎児血清
及びＣ５７ＢＬ ／ ６ Ｎマウス骨髄細胞１×１０”
個全含有するＭｃＣｏｙ’ｓ ５ Ａ培地１ｄ’に加え
て十分混第１ルだ後、６７°Ｃ，７，５％（冬）炭酸ガ
ス通気下のフラン器で７日間培養した。培養後、顕微鏡
視野下で５０個以上の細胞から成る集塊をコロニーとし
て、形成はれたコロニー数を計測し、形成されたコロニ
ー数（単位）でＣ３Ｅｉ“活性を表わした。、１単位ば
１形成コロニーとして、得られたＣ８Ｆ標品の純度を、
標品の蛋白質１１ｎｇ当シのコロニー形成数を示す比活
性で表わした。
カリクレイン活性は、カリクレインの合成基質であるＨ
−Ｄ −Ｖａｉ −Ｌｅｕ −Ａｒｇ−バラニトロア
ニリン（以下ペノチドーＰＮＡと略記する）を用いる酵
素化学的方法で測定した。すなわち、試料Ｑ、’（ｍｌ
’ｚ ０．２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液ｐＨ８，０、２
ｍｌへ加え、６７℃、５分間ブレインキュベートした後
、０．２ｍＭペプチド−ＰＮＡ溶液０．２ ｍｌ ｋ加
え、６７゛Ｃで６０分間反応させ、５０％（％）酢酸溶
液０．２ｍｌで反応を停止させた後、４０５ｎｍの波長
で遊離ＰＮＡ量ヲ量定測定。カリクレインの阻害剤アプ
ロチニンを含むもの全対照として、６７℃で１分間に生
成されるＰＮＡ量でカリクレイン活性を表わした。
−Ｄ −Ｖａｉ −Ｌｅｕ −Ａｒｇ−バラニトロア
ニリン（以下ペノチドーＰＮＡと略記する）を用いる酵
素化学的方法で測定した。すなわち、試料Ｑ、’（ｍｌ
’ｚ ０．２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液ｐＨ８，０、２
ｍｌへ加え、６７℃、５分間ブレインキュベートした後
、０．２ｍＭペプチド−ＰＮＡ溶液０．２ ｍｌ ｋ加
え、６７゛Ｃで６０分間反応させ、５０％（％）酢酸溶
液０．２ｍｌで反応を停止させた後、４０５ｎｍの波長
で遊離ＰＮＡ量ヲ量定測定。カリクレインの阻害剤アプ
ロチニンを含むもの全対照として、６７℃で１分間に生
成されるＰＮＡ量でカリクレイン活性を表わした。
すなわち、１分間に生成されるＰＮＡ １μｍｏｌｅ
ｋｉ ＰＮＡ単位とした。。
ｋｉ ＰＮＡ単位とした。。
従来法及び本発明の方法による高速液体クロマトグラフ
ィーの分離パターンは、それぞれ図１及び図２に示すと
お９であった。
ィーの分離パターンは、それぞれ図１及び図２に示すと
お９であった。
図１及び図２はそれぞれ従来法及び本発明の方法による
Ｃ８Ｆとカリクレインの分別状況全示し、両図において
左縦軸はＣ３Ｆ活性と２８０ ｎｍにおける光学密度と
を、右縦軸はカリクレイン活性金、横軸は分画査号を、
−は光学密度’ｋ、−Ｑ−はＣ’ＳＦ活性を、そして」
トはカリクレイン活性をそれぞれ示す。
Ｃ８Ｆとカリクレインの分別状況全示し、両図において
左縦軸はＣ３Ｆ活性と２８０ ｎｍにおける光学密度と
を、右縦軸はカリクレイン活性金、横軸は分画査号を、
−は光学密度’ｋ、−Ｑ−はＣ’ＳＦ活性を、そして」
トはカリクレイン活性をそれぞれ示す。
従来法による５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ −５００デ／Ｌ
、（ｐ過りロマトグラフィーでは、ｃｓＦとカリクレイ
ンと完全に分別されず、カリクレイン不含のＣ８Ｆ分画
の回収率は６０％以下であった。これに対して、本発明
の方法による高速液体クロマトグラフィーでは、Ｃ３Ｆ
とカリクレインとがほぼ完全に分別されておシ、カリク
レイン不含のＣ３Ｆの回収率は９０％以上であり、カリ
クレインは実質的に混入していなかった。これらの両方
法によるＣ３Ｆとカリクレインの回収率及びＣ８Ｆ中の
カリクレイン混入量全測定した結果は表１に示すとおり
である１゜表１従来法と本づに明の方法とによるＣ８Ｆ
及びカリクレイン回収率 蒼この方法の検出限界以下であることを意味する。
、（ｐ過りロマトグラフィーでは、ｃｓＦとカリクレイ
ンと完全に分別されず、カリクレイン不含のＣ８Ｆ分画
の回収率は６０％以下であった。これに対して、本発明
の方法による高速液体クロマトグラフィーでは、Ｃ３Ｆ
とカリクレインとがほぼ完全に分別されておシ、カリク
レイン不含のＣ３Ｆの回収率は９０％以上であり、カリ
クレインは実質的に混入していなかった。これらの両方
法によるＣ３Ｆとカリクレインの回収率及びＣ８Ｆ中の
カリクレイン混入量全測定した結果は表１に示すとおり
である１゜表１従来法と本づに明の方法とによるＣ８Ｆ
及びカリクレイン回収率 蒼この方法の検出限界以下であることを意味する。
（試験２）各稚緩衝液イオン強度と安定剤濃度による回
収率の比較 高速液体クロマトグラフィー用デル濾過担体へのＣ８Ｆ
及びカリクレインの吸着現象と緩衝液のイオン強度及び
安定剤の添加濃度全検討するために異なった条件下で高
速液体クロマトグラフィーヲ実施し、試験１と同一の方
法でＣ８Ｆ及びカリクレイン活性を測定し、回収率全比
較して試験した。
収率の比較 高速液体クロマトグラフィー用デル濾過担体へのＣ８Ｆ
及びカリクレインの吸着現象と緩衝液のイオン強度及び
安定剤の添加濃度全検討するために異なった条件下で高
速液体クロマトグラフィーヲ実施し、試験１と同一の方
法でＣ８Ｆ及びカリクレイン活性を測定し、回収率全比
較して試験した。
試験に用いた人尿濃縮液は、実施例１と同一の方法で・
調製し、高速液体クロマトグラフィーは、ＴＳＫ −（
）ｅｌ ３００’Ｏｓｗ （φ７．５ Ｘ １２０ Ｄ
ａｍ）カラム及びＬＣ−３Ａポンプを用い、室温で１ｍ
ｌ／ｍｉｎの流速で実施した。１ 安定剤として、ポリエチレングリコール（シグマ社製。
調製し、高速液体クロマトグラフィーは、ＴＳＫ −（
）ｅｌ ３００’Ｏｓｗ （φ７．５ Ｘ １２０ Ｄ
ａｍ）カラム及びＬＣ−３Ａポンプを用い、室温で１ｍ
ｌ／ｍｉｎの流速で実施した。１ 安定剤として、ポリエチレングリコール（シグマ社製。
平均分子量６，０００ダルトン）、緩衝液こして、０゜
０１Ｍ〜０．５ Ｍリン酸ナトリウム、ＰＨ７，０（イ
オ７［ｆｌｌｉｆ約０．０２〜１．１４ ） 音用イ＊
。
０１Ｍ〜０．５ Ｍリン酸ナトリウム、ＰＨ７，０（イ
オ７［ｆｌｌｉｆ約０．０２〜１．１４ ） 音用イ＊
。
試験結果は表２及び表６に示すとおシであった。
安定剤全含有しない各濃度の緩衝液でクロマトグラフィ
ーを行なった場合、ｃｓＦＦｉ、いずれの濃度の緩衝液
でも回収率は低かった。特に、イオン強度が低い場合は
、ｃｓＦとカリクレイン両者とも回収率は低下した。
ーを行なった場合、ｃｓＦＦｉ、いずれの濃度の緩衝液
でも回収率は低かった。特に、イオン強度が低い場合は
、ｃｓＦとカリクレイン両者とも回収率は低下した。
表２．安定剤全含有しない緩衝液の濃度とＣ８Ｆ及びカ
リクレインの回収率” 衣乙に示す各種濃度でポリエチレングリコール及びＴｒ
ｉｔｏ’ｎ Ｘ −ｌ Ｑ Ｑ ＠含有する０、１ Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（イオン強度０．２０ ） 全
使用したときのＣ３Ｆの回収率を比戟検討した結果、安
定剤としてそれぞれポリエチレングリコール及びＴｒｉ
ｔｏｌｌＸ −１０口ｗ ０．０１〜０．１％濃度で使
用した場合、Ｃ８Ｆの回収率が著しく改善されることが
、判明した。また、安定剤は低礫度で用いる方が好１し
く、べろに示すように、Ｏ，ＣＩ １％（％）で、はぼ
寸分な効果が得られた。安定剤演朋全必吸以上に高くす
れば Ｃ８Ｆとカリクレインとが分別されず、′まだ試
料粘度を垢′加せしめるので、０．１％（％ ）以上の
濃度は好ましくなかった。
リクレインの回収率” 衣乙に示す各種濃度でポリエチレングリコール及びＴｒ
ｉｔｏ’ｎ Ｘ −ｌ Ｑ Ｑ ＠含有する０、１ Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（イオン強度０．２０ ） 全
使用したときのＣ３Ｆの回収率を比戟検討した結果、安
定剤としてそれぞれポリエチレングリコール及びＴｒｉ
ｔｏｌｌＸ −１０口ｗ ０．０１〜０．１％濃度で使
用した場合、Ｃ８Ｆの回収率が著しく改善されることが
、判明した。また、安定剤は低礫度で用いる方が好１し
く、べろに示すように、Ｏ，ＣＩ １％（％）で、はぼ
寸分な効果が得られた。安定剤演朋全必吸以上に高くす
れば Ｃ８Ｆとカリクレインとが分別されず、′まだ試
料粘度を垢′加せしめるので、０．１％（％ ）以上の
濃度は好ましくなかった。
表３．安定剤濃度の異なる緩衝液によるＣ８Ｆ回収率表
６に示しだ緩衝液は、０．２ Ｍ ＩＪン酸ナナトリウ
ム緩衝液Ｐｌ−１７，０を用いた結果を示したものであ
るが、食塩等の中性塩を加えてイオン強度を調整しても
、安定剤の存在下では、同様な回収率の改善効果が認め
られた。尚この結果をまとめて表４に示した。表４は、
ポリエチレングリコール０．０１％存在下での各種緩衝
液での回収率を比較したものである。
６に示しだ緩衝液は、０．２ Ｍ ＩＪン酸ナナトリウ
ム緩衝液Ｐｌ−１７，０を用いた結果を示したものであ
るが、食塩等の中性塩を加えてイオン強度を調整しても
、安定剤の存在下では、同様な回収率の改善効果が認め
られた。尚この結果をまとめて表４に示した。表４は、
ポリエチレングリコール０．０１％存在下での各種緩衝
液での回収率を比較したものである。
表４．各種緩衝液でのＣ３Ｆ及びカリクレインの回収率
まだ、クロマトグラフィーに用いる緩衝液のＰＨは、そ
れ自身では、Ｃ８Ｆとカリクレインの分離特性に影響を
及ぼさないが、シリカゲルを主成分とする担体では、ア
ルカリ性になると担体の溶解が起こること、また酸性域
では、カラム等装置の腐蝕が起こり得るので、ｐＨ６゜
０〜８．０の中性付近が至適なＰＨ範囲である。
まだ、クロマトグラフィーに用いる緩衝液のＰＨは、そ
れ自身では、Ｃ８Ｆとカリクレインの分離特性に影響を
及ぼさないが、シリカゲルを主成分とする担体では、ア
ルカリ性になると担体の溶解が起こること、また酸性域
では、カラム等装置の腐蝕が起こり得るので、ｐＨ６゜
０〜８．０の中性付近が至適なＰＨ範囲である。
実施例１
人尿約２０１１ ｆ：１０ ＮＮａＯＨ溶液でＰＨ７，
０に調整し、シリカゲル刀ラム（φ４゜Ｏｘ５０ｃｍ）
へ通液して蛋白質成分を該カラムへ吸着させ、次いで５
００ Ｉｌｌの５％アンモニア水で溶出させた。溶出液
をＩ ＮＨ２Ｓｏ４で中和した後、１０，０００ ｒ、
ｐ、ｍ。
０に調整し、シリカゲル刀ラム（φ４゜Ｏｘ５０ｃｍ）
へ通液して蛋白質成分を該カラムへ吸着させ、次いで５
００ Ｉｌｌの５％アンモニア水で溶出させた。溶出液
をＩ ＮＨ２Ｓｏ４で中和した後、１０，０００ ｒ、
ｐ、ｍ。
６０分間遠心分離して不溶物を除去した。次に、該溶出
液に硫安を加えて７０％飽和とし、沈澱を生成せしめ、
４°Ｃで１０，０００ ｒ’、ｐ、ｍ、 ３０分間遠心
分離して沈澱物を集めた。該沈澱物を、０．０２ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液１００ｍ１に溶解し、更に該緩衝で１０
倍に希釈した。次いで、予め該緩衝液と平衡させたＤＥ
ＡＥ−セルローズ４０ｇ１７１１．ｔ、１時間４°Ｃで
混合させ、混合後、該ＤＥＡＥ−セルローズをｆ過して
集め、０．０２ Ｍ ＩＪン酸緩衝液及び０．１Ｍ、Ｎ
ａＣ２を含む該緩衝液で十分洗浄した後、５００η＋ｌ
の０．４ ＭＮａＣＪ添加０．０２Ｍリン酸緩衝液で溶
出せしめ、溶出液をグラスフィルターで沢過した後、限
外ｆ過膜（旭化成ＨＣ−１）で濃縮すると同時に０．１
ＭＩＪン酸緩衝液と平衡化させ、人尿の濃縮液を得た。
液に硫安を加えて７０％飽和とし、沈澱を生成せしめ、
４°Ｃで１０，０００ ｒ’、ｐ、ｍ、 ３０分間遠心
分離して沈澱物を集めた。該沈澱物を、０．０２ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液１００ｍ１に溶解し、更に該緩衝で１０
倍に希釈した。次いで、予め該緩衝液と平衡させたＤＥ
ＡＥ−セルローズ４０ｇ１７１１．ｔ、１時間４°Ｃで
混合させ、混合後、該ＤＥＡＥ−セルローズをｆ過して
集め、０．０２ Ｍ ＩＪン酸緩衝液及び０．１Ｍ、Ｎ
ａＣ２を含む該緩衝液で十分洗浄した後、５００η＋ｌ
の０．４ ＭＮａＣＪ添加０．０２Ｍリン酸緩衝液で溶
出せしめ、溶出液をグラスフィルターで沢過した後、限
外ｆ過膜（旭化成ＨＣ−１）で濃縮すると同時に０．１
ＭＩＪン酸緩衝液と平衡化させ、人尿の濃縮液を得た。
ここに得られた濃縮液２０７ｒＬｌ〔蛋白質濃度４．２
％（／Ｖ）〕に対して、ポリエチレングリコール６．０
００ （シグマ社製）を０゜０１％（％）の濃度で添加
した後、０．４μのフィルターで濾過した。
％（／Ｖ）〕に対して、ポリエチレングリコール６．０
００ （シグマ社製）を０゜０１％（％）の濃度で添加
した後、０．４μのフィルターで濾過した。
該人尿濃縮液０．２Ｔｎ７！をＴＳＫ −（）ｅｌ ３
０００ ＳＷを充填し、０．０１％（％）のポリエチレ
ングリコールを含有する０、１ＭＩＪＭリン酸緩衝液７
．０）で予め平衡化したカラム（φ７゜５Ｘ１２００ｍ
ｍ、）へ注入し、高圧液送ポンプで該緩衝液を流速’１
．Ｏｍｌ／ｍｉｎで通液して高速液体クロマトグラフィ
ーを行ない、Ｃ８Ｆとカリクレインを分離した。それぞ
れｌＱｉ／！のＣ８Ｆとカリクレイン分画を回収し、透
析して脱塩ｌ−だ後、無菌的に凍結乾燥しＣ３Ｆ約１ｍ
り、カリクレイン約２゜４ ｍ９を得た。得られたｃｓ
ｒ；’の活性回収率は、出発原料（人尿）に対して約９
４％であり、その比活性は、４ Ｘ １０５単位／ｍｙ
蛋白質まで上昇しておシ、カリクレインの混入は全く認
められなかった。一方、得られたカリクレインの活性回
収率は約７８％であり、比活性実施例２ 健康人の尿２０Ａを限外濾過膜（アミコン類、ＨＩＯＰ
ＩＯ）を用いて０゜［１２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
’）と平衡させ、該人尿溶液に対して、あらかじめ上記
緩衝液と平衡化させたＤＥＡＥ−セルローズ４０ｇを加
えて４°Ｃで１時間混合した後、該ＤＥＡＥ−セルロー
ズをシ４過して集めた。ＤＥＡＥ−セルローズを上記緩
衝液で十分洗浄した後、１１の００４１ａａＣＪ添加０
．０２ Ｍリン酸緩衝−ｇ！ｉ、（ｐＨ７，４）で溶出
し、人尿の濃縮液を得た。該濃縮液を更に限外濾過膜で
濃縮し、０．０１％（％） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −１０
０を含有する０、１１Ｖ４リン酸緩衝液（ｐＨ７゜０）
に対して透析し、のち該緩衝液で予め平衡化したＴＳＫ
−Ｇｅ１３０００ ＳＷカラムへ注入し、以下実施例
１と同一の方法で、Ｃ３Ｆ約０．９ｍ９及びカリクレイ
ン約２．５ ｍ９を得た。得られだＣ８Ｆとカリクレイ
ンの活性回収率は、それぞれ９２％及び９４％であった
。
０００ ＳＷを充填し、０．０１％（％）のポリエチレ
ングリコールを含有する０、１ＭＩＪＭリン酸緩衝液７
．０）で予め平衡化したカラム（φ７゜５Ｘ１２００ｍ
ｍ、）へ注入し、高圧液送ポンプで該緩衝液を流速’１
．Ｏｍｌ／ｍｉｎで通液して高速液体クロマトグラフィ
ーを行ない、Ｃ８Ｆとカリクレインを分離した。それぞ
れｌＱｉ／！のＣ８Ｆとカリクレイン分画を回収し、透
析して脱塩ｌ−だ後、無菌的に凍結乾燥しＣ３Ｆ約１ｍ
り、カリクレイン約２゜４ ｍ９を得た。得られたｃｓ
ｒ；’の活性回収率は、出発原料（人尿）に対して約９
４％であり、その比活性は、４ Ｘ １０５単位／ｍｙ
蛋白質まで上昇しておシ、カリクレインの混入は全く認
められなかった。一方、得られたカリクレインの活性回
収率は約７８％であり、比活性実施例２ 健康人の尿２０Ａを限外濾過膜（アミコン類、ＨＩＯＰ
ＩＯ）を用いて０゜［１２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
’）と平衡させ、該人尿溶液に対して、あらかじめ上記
緩衝液と平衡化させたＤＥＡＥ−セルローズ４０ｇを加
えて４°Ｃで１時間混合した後、該ＤＥＡＥ−セルロー
ズをシ４過して集めた。ＤＥＡＥ−セルローズを上記緩
衝液で十分洗浄した後、１１の００４１ａａＣＪ添加０
．０２ Ｍリン酸緩衝−ｇ！ｉ、（ｐＨ７，４）で溶出
し、人尿の濃縮液を得た。該濃縮液を更に限外濾過膜で
濃縮し、０．０１％（％） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −１０
０を含有する０、１１Ｖ４リン酸緩衝液（ｐＨ７゜０）
に対して透析し、のち該緩衝液で予め平衡化したＴＳＫ
−Ｇｅ１３０００ ＳＷカラムへ注入し、以下実施例
１と同一の方法で、Ｃ３Ｆ約０．９ｍ９及びカリクレイ
ン約２．５ ｍ９を得た。得られだＣ８Ｆとカリクレイ
ンの活性回収率は、それぞれ９２％及び９４％であった
。
〔発明の効果〕
本発明の方法によって奏せられる効果は次のとおりであ
る。
る。
■Ｃ３Ｆ及びカリクレインの回収率が従来法に比してそ
れぞれ約６．５倍及び約２．４倍である。
れぞれ約６．５倍及び約２．４倍である。
■Ｃ８Ｆ及びカリクレインを同時に製造し得る。
■Ｃ３Ｆへのカリクレインの混入量が実質的にない。
■従来法に比して極めて短時間でＣ８Ｆ及びカリクレイ
ンを製造し得る。
ンを製造し得る。
図１及び図２は、それぞれ従来法によるゲル沢過及び本
発明の方法の高速ゲル濾過によるＣ８Ｆとカリクレイン
の分別パターンを示す。両図において左縦軸はＣ８Ｆ活
性と２８０７１ｍにおける光学密度とを、右縦軸はカリ
クレイン活性を、横軸は分画番号を、−は光学密度を、
−Ｏ−ばＣ８Ｆ活性を、そして−〇−はカリクレイン活
性をそれぞれ示す。 代理人 浅 村 皓 外４名
発明の方法の高速ゲル濾過によるＣ８Ｆとカリクレイン
の分別パターンを示す。両図において左縦軸はＣ８Ｆ活
性と２８０７１ｍにおける光学密度とを、右縦軸はカリ
クレイン活性を、横軸は分画番号を、−は光学密度を、
−Ｏ−ばＣ８Ｆ活性を、そして−〇−はカリクレイン活
性をそれぞれ示す。 代理人 浅 村 皓 外４名
Claims (3)
- （１）健康人の尿、又は人尿由来コロニー形成刺激因子
とカリクレインを含有する溶液を蛋白質につき濃縮し、
安定剤を含有する緩衝液と該濃縮液を平衡させ、分子量
排除限界が球状蛋白質で測定した時１０５〜５×１０５
ダルトンの分子篩効果を有する担体を充填しかつ予め該
緩衝液を通液したカラムへ注入し、高速液体ゲル瀘過ク
ロマトグラフィーを行ない、人尿由来コロニー形成刺激
因子とカリクレインとを分離し、のちそれらを個別に回
収し、製造′１″ろことを特徴とする人尿由来コロニー
形成刺激因子及びカリクレインの製造法。 - （２）緩衝液がイオン強度０．０５〜０．５、ｐＨ６，
０〜８．０であり、０．０１〜０．１％（′Ｗ／ｖ）の
安定剤を含有することを特徴とする特許請求の範囲第（
１）項に記載の製造法。 - （３）安定剤が分子量１，０００〜１０，０００ダルト
ンノ、、ｌｅ ＩＪエチレングリコール又はオクチルー
フエノキシホリエトキシエタノールであることを特徴と
する特許請求の範囲第（１）項又は第（２）項に記載の
製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58011317A JPS59137417A (ja) | 1983-01-28 | 1983-01-28 | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 |
| GB08334220A GB2134528B (en) | 1983-01-28 | 1983-12-22 | Method of isolation of colony-stimulating factor and kallikrein originating from human urine |
| CA000444114A CA1200489A (en) | 1983-01-28 | 1983-12-22 | Method of preparation of human urine origin colony- stimulating factor and kallikrein |
| AU22806/83A AU545411B2 (en) | 1983-01-28 | 1983-12-22 | Method of isolating human urine origin colony-stimulating factor and kallikrein from urine |
| US06/568,259 US4482485A (en) | 1983-01-28 | 1984-01-04 | Method of preparation of human urine origin colony-stimulating factor and kallikrein |
| FR8401202A FR2540121B1 (fr) | 1983-01-28 | 1984-01-26 | Procede de preparation d'un facteur stimulant des colonies et de kallikreine provenant de l'urine humaine |
| DE3402647A DE3402647C2 (de) | 1983-01-28 | 1984-01-26 | Verfahren zur Gewinnung von koloniestimulierendem Faktor und Kallikrein aus menschlichem Urin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58011317A JPS59137417A (ja) | 1983-01-28 | 1983-01-28 | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59137417A true JPS59137417A (ja) | 1984-08-07 |
| JPS6160049B2 JPS6160049B2 (ja) | 1986-12-19 |
Family
ID=11774637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58011317A Granted JPS59137417A (ja) | 1983-01-28 | 1983-01-28 | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4482485A (ja) |
| JP (1) | JPS59137417A (ja) |
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