DE2323981A1 - Antikoagulansisolierung - Google Patents
AntikoagulansisolierungInfo
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Description
Antikoagulansisolierung
Es ist seit einigen Jahren bekannt, daß das Gift bestimmter Grubenottern,
beispielsweise von Agkistrodon rhodostoraa, einen als Antikoagulans geeigneten Bestandteil enthält. In jüngerer Zeit
wurde gefunden, daß dieser Bestandteil tatsächlich ein Blutkoagulans darstellt. Der thrombinähnliche Stoff, auf den sich die
vorliegende Erfindung bezieht, bewirkt die Bildung eines nichtvernetzten Fibrinpolymeren, welches durch das körpereigene retikuloendotheliale
und/oder fibrinolytische System rasch beseitigt wird. Dadurch wird der Fibrinogengehalt des Blutes herabgesetzt
bzw. erschöpft. Der vorgenannte Stoff besitzt daher eine gerinnungshemmende Wirkung (Antikoagulanseffekt).
Die bisher bekannten Verfahren zur Isolierung des vorgenannten Bestandteils sind sehr unbefriedigend. Bei einer dieser Methoden
handelt es sich um eine zweistufige chromatographische Arbeitsweise. Diese erfordert in den beiden Stufen zwei Säulen mit verschiedenen
Füllmaterialien sowie zwei unterschiedlich gepufferte Lösun-
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ORKBtNAL INSPECTBD
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gen, welche als Extraktionslösungsmittel verschiedenartigen Anforderungen
genügen müssen. In der ersten Stufe dieser chromatographischen
Methode wird als Träger zumeist Triäthylaminoäthylcellulose
verwendet, mit welcher sich jedoch keine verlässlichen öder leicht reproduzierbaren Ergebnisse erzielen lassen. Der gravierendste
Nachteil besteht jedoch darin, daß die auf die genannte Weiss gereinigte Giftlösung zuweilen noch den hämorrhagisehen Faktor
enthält, welcher den gefährlichsten Bestandteil des Otterngifts darstellt. Gemäß einer weiteren, in jüngerer Zeit beschriebenen
Methode wird die Affinitätschromatographie angewendet. Bei diesem Verfahren sind jedoch Ausbeute und Qualität des isolierten thrombinähnlichen
Produkts nicht optimal.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfacheres
Verfahren zur Herstellung des reinen thrombinähnlichen Stoffes aus dem Gift der malaiischen Grubenotter zur Verfugung
zu stellen. Ferner ist es die Aufgabe der Erfindung, ein reproduzierbares Verfahren zur Isolierung der thrombinähnlichen Fraktion
des Gifts der malaiischen Grubenotter zu schaffen. Die erfindungsgemäße Aufgabe besteht weiterhin darin, ein Verfahren
zur Isolierung des thrombinähnlichen Wirkstoffs aus dem Gift der
malaiischen Grubenotter zur Verfugung zu stellen, welches den eine hohe spezifische Aktivität aufweisenden Stoff in hervorragender
Ausbeute liefert. Im besonderen ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Verbesserung der auf Affinitätschromatographie beruhenden Methode zur Isolierung des thrombinähnlichen
Wirkstoffs aus Schlangengiften zu schaffen.
Die vorgenannte Aufgabe wird gelöst, indem man eine klare, verdünnte, wässrige Lösung des nativen Gifts von Agkistrodon rhodostoma,
welches eine thrombinähnlich wirkende Komponente enthält? auf
einen Ρττ-Wert von 7,5 bis 8,3 abpuffert, diese Lösung auf eine
mit agmatingekoppelten Agaroseperlen gefüllte Säule gibt, die
Säule bei Raumtemperatur mit 0,25 m wässriger Salzlösung eines ρττ-Werts von 7,5 bis 8,3 wäscht und schließlich den thrombinähnlichen
Wirkstoff aus der Säule eluiert.
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unter "agmatingekoppelter Agarose" sind hier Agaroseperlen zu
verstehen, an die 4-Aminobutylguanidin (Agmatin) kovalent gebunden
ist. Es wurde gefunden, daß Agmatin ein konkurrierender Inhibitor des thrombinähnlichen Wirkstoffs des Grubenotterngifts
ist; es verhindert die Elution des Wirkstoffs aus der Säule so lange, bis nahezu alle anderen Proteinstoffe eluiert sind. Das
"Koppeln" des Agmatins an die Agarose wird in bekannter Weise
unter Verwendung aktivierter Agaroseperlen vorgenommen. Die Perlen besitzen vorzugsweise einen Durchmesser von 40 bis 190 χ 10 cm (im
nassen Zustand). Eine agmatingekoppelte Agarose mit einem Agmatingehalt
von 60 bis 120 Mikromol pro g Trockengewicht ist für das
vorgenannte Verfahren geeignet. Bevorzugt wird ein Agmat ingehalt von 100 bis 120 Mikromol/g oder von etwa 1,2 bis 1,5 Gew.-#, wie durch
Analyse nach 20stündiger Hydrolyse in 5,7 η Salzsäure bei 1100C
bestimmt wird.
Um im erfindungsgeraäßen Verfahren eine gute Reproduzierbarkeit sowie einen reinen thrombinähnlichen Wirkstoff zu erzielen, soll
das Bettvolumen der Agmatin-Agarose mindestens 20 bis 25 ml/g
Gift betragen. Natürlich kann man auch größere Bettvolumina anwenden, ohne jedoch durch eine solche Volumerhöhung zusätzliche
Vorteile zu erzielen. Die optimale Eluiergeschwindigkeit beträgt 15 bis 30 ml/Std./cm Querschnitt.
Der in der vorliegenden Anmeldung in bezug auf das Gift verwendete
Ausdruck "nativ" soll ein Gift bezeichnen, welches nicht zuvor nach anderen chromatographischen oder chemischen Methoden behandelt
wurde. Das Gift enthält dementsprechend andere Proteinstoffe, welche zuvor als "Fraktionen I bis VIII" bezeichnet wurden. Zu diesen
Fraktionen gehört auch der hämorrhagische Faktor sowie die Fraktionen V und VII, welche ähnliche physikochemische Eigenschaften
wie der Koagulierungsfaktor' aufweisen, mit dem das erfindungsgemäße
Isolierverfahren befaßt ist.· Diese unerwünschten Fraktionen und Bestandteile werden durch das Verfahren der Erfindung vollständig
aus dem nativen Gift entfernt. Eine vorangehende Ionenaustauscherbehandlung ist nicht erforderlich. Andererseits sei festgestellt,
daß der vorstehend definierte Ausdruck "nativ" nicht be-
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deutet, daß das Gift so gut wie unberührt sein muß, bevor es der
erfindungsgemäßen einstufigen Trennmethode unterworfen wird· Das Gift kann zur Beseitigung von Sedimenten zentrifugiert und zur
Stabilitätsverbesserung lyophilisiert werden; es muß ferner natürlich gelöst sein, damit man es anforderungsgemäß als klare, verdünnte
wässrige Lösung einsetzen kann. Gewünschtenfalls kann die
Giftlösung zur Befreiung von bestimmten unerwünschten Proteinen mit Ammoniumsulfat vorbehandelt werden· Eine solche Behandlung
ist jedoch nicht zwingend, wie nachstehend erläutert wird.
Die wässrige 0,25 m Natriumchloridlösung des nativen Gifts kann im richtig abgepufferten p^-Bereich 0,5 bis etwa 3 Gew.-# Gift
enthalten. Der für diese Lösung bevorzugte Puffer ist ein nicht- -toxisehes Salz von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; anstelle dessen
kann man jedoch auch andere Puffersubstanzen verwenden. Die Bevorzugung von nicht-toxischen Puffersubstanzen beruht darauf,
daß man nach dieser Methode Tris-(hydroxymethyl)—aminomethan
später als Puffer für die Lösung verwendet, mit welcher man die den thrombinähnlichen Wirkstoff enthaltende isolierte Proteinfiaktion
eluiert.
Das vorgenannte Eluat liegt in hochreiner Form vor. Es muß jedoch
in eine medizinisch geeignete Form übergeführt werden, was gewöhnlich durch Filtrieren in dem gewünschten Puffer erreicht
wird. Auch diese abschließend erhaltene Lösung kann eine Verdünnung erfordern. Eine brauchbare injizierbare Lösung enthält
im allgemeinen 50 bis 200 Einheiten (gemäß der Definition von Owren in "Acta Medica Scandinavia", Suppl. 194 /"194V) des thrombinähnlichen
Wirkstoffs pro ml, während das vorgenannte Eluat 1400 bis 1900 Einheiten/ml enthält.
Gemäß einer allgemeinen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das native Gift in 0,25 m Natriumchloridlösung, die auf einen
Pjj-Wert von 7,5 bis 8,3 abgepuffert ist, gelöst. Die Lösung wird
auf mit Agmatin vorbehandelte Agaroseperlen gegeben. Anschließend wäscht man die Säule mit 0,25 m wässriger Natriumchlor idlösung,
welche mit Tris-ChydroxymethylJ-aminomethan-hydrochlorid
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oder einem anderen nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Puffer auf einen Pg-Wert von 7,5 bis 8,3 abgepuffert wurde. Man
sammelt das Eluat in Form von Fraktionen und bestimmt deren Absorptionsvermögen
bei 280 nnu Mit dem vorgenannten Puffer wird ein
ausgeprägtes Maximum von bei 280 nm absorbierendem Material eluiert. Man setzt die Elution so lange fort, bis die Absorption auf einen
Wert von 0,04 oder darunter absinkt. Zu diesem Zeitpunkt ersetzt man die Waschflüssigkeit durch das Elutionsmittel, welches vor-,
zugsweise in der gleichen Weise wie die Waschflüssigkeit, abgepuffert
wurde, jedoch anstelle von Natriumchlorid 0,1 bis 0,25 m Guanidin-hydrochlorid enthält. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fraktionen bei Raumtemperatur mit einer Fließgeschwindigkeit
von 15 bis 30 ml/Std./cm Säulenquerschnitt gesammelt.
Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Konzentration des Guanidin-hydrochlorids etwa 0,15 molar ist und die Säule bei
einer Temperatur von 20 bis 250C gehalten wird.
Die agmatingekoppelten Agaroseperlen werden in bekannter Weise aus einer handelsüblichen, in Perlenform vorliegenden Agarose
hergestellt. Die Perlen werden dann in eine Säule gegeben, in welcher sie als Affinitätschromatogramm-Füllmaterial fungieren.
Sie besitzen eine extrem starke Zurückhaltewirkung gegenüber dem aktiven Giftprotein, während sie die anderen Proteine mit wesentlich
geringerer Affinität oder überhaupt nicht zurückhalten. Während des Waschens mit der vorstehend beschriebenen abgepufferten
Natriumchloridlösung werden diese anderen Komponenten leicht aus der Säule ausgewaschen, während der auf der Säule zurückbleibende
thrombinähnliche Bestandteil nahezu quantitativ mit der abgepufferten Guanidin-hydrochloridlösung eluiert wird. Dadurch erhält
man einen extrem reinen isolierten thrombinähnlichen Wirkstoff. Man kann diesen Stoff gewünschtenfalls nach einer Gel-Filtration
und Einstellung seiner Konzentration auf das gewünschte Niveau medizinisch verwenden. Geeignete Verdünnungsmittel sind Wasser,
physiologische Kochsalzlösung oder eine verdünnte Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid. Die letztere Substanz
kann auch dann zugesetzt werden, wenn das erhaltene vereinigte Eluat einen für intravenöse Injektionen ungeeigneten pjj-
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aufweist. Der für diesen Zweck bevorzugte pH-Bereich liegt nahe
bei 7.
Das neue Verfahren unterscheidet sich von den zuvor vorgeschlagenen
Isoliermethoden in den folgenden neuartigen Merkmalen:
1) der aktive Bestandteil wird mit Guanidin-hydro Chlorid, das
einen speziellen Konzentrationsbereich aufweist und auf ein&n
zweckmäßigen engen pH~Bereich abgepuffert ist, eluiert;
2) das Elutionsmittel enthält den Wirkstoff mit einer wesentlich
höheren spezifischen.Aktivität, als bisher für ein einfaches Einstufenverfahren für möglich erachtet wurde?
3) der Wirkstoff wird in einer Ausbeute von etwa 90 % oder darüber
(bezogen auf den Wirkstoffgehalt im nativen Gift) erhaltenj und
4) das in diesem neuen Isolierverfahren eingesetzte Agmatin-Agarose-
-Bett kann für nachfolgende Giftchargen wiederverwendet werden, wobei lediglich ein einfaches und rasches Regenerierverfahren erforderlich ist. Bei dieser Regenerierung wäscht man die Perlen
- gewünschtenfalls in der Säule - mit 4 bis 10 Volumteilen 0,5 η
Essigsäure und bringt die Säule dann mit Hilfe der vorstehend beschriebenen abgepufferten 0,25 m Natriumchloridlösung wieder in
den Gleichgewichtszustand.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das nachstehende Beispiel
erläutert; dieses soll die Erfindung jedoch in keiner Weise beschränken.
Agmatin wird an Sepharose 4B (Handelsprodukt von Pharmacia, Ltd«, Schweden; perlförmiges Agarosematerial mit einer nassen Perlengröße
von 40 bis 190 Mikron und einem Agarosegehalt von etwa 4 ?«v
welches Proteine mit Molekulargewichten oberhalb 20 χ 10 zurückhält) nach der Methode von Cuatrecasas et al. (beschrieben
in Proc. Natl. Acad. Sei., U.S. 61 /Ϊ968/, Seite 636) gekoppelt.
Dabei wird der p„-Wert jedoch während der CNBr-Aktivierung äsr
Agarose 30 Minuten bei 11,0 gehalten und die Kopplungsreaktiosi
wird in einem 0,1 η NaHCO .,/NaOH-Puff er bei einem Pg-Wert von 10,0
unter Verwendung von 22,9 mg Agmatinsulfat pro ml abgesetztes
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Agarosevolumen vorgenommen. Der Agmatingehalt der auf diese Weise
hergestellten Agmatin-Agarose beträgt 115 Mikromol/g Trockengewicht.
Eine Lösung von 1 g lyophilisiertem nativem Gift der malaiischen
Grubenotter in 50 ml 0,25 m wässriger Natriumchloridlösung, welche
mit 0,01 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid auf einen p„-Wert von 8,1 abgepuffert wurde und 0,1 Gew.-# Chlorbutanol
als Konservierungsmittel enthält, wird auf eine Chromatographiesäule gegeben, welche einen Durchmesser von 1,9 cm aufweist
und bis zu einer Höhe von 14 cm mit den vorgenannten Agmatin-Agarose-Perlen
gefüllt ist. Durch die Säule wird dann bei Raumtemperatur 0,25 m wässrige Natriumchloridlösung, welche 0,1 ?£ Chlorbutanol
enthält und mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid
auf einen p„-Wert von 8,1 abgepuffert wurde, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 70 bis 90 ml/Std. perkoliert. Das
Eluat wird automatisch in Form von Fraktionen von 10 bis 11 ml
aufgefangen und die Absorption (^nQOrm) ^es Ausflusses bestimmt.
Man fährt mit dem Perkolieren bzw. Waschen fort, bis ein großes "Durchbruch11-Maximum von bei 280 nm absorbierendem Material eluiert
ist und der ApgQjjjj.-Wert ^es Säulenausflusses auf 0,04 abgesunken
ist. Dazu sind etwa 300 ml der vorgenannten Waschlösung erforderlich. Die gesammelten Fraktionen sind nahezu frei von
der gewünschten thrombinähnlichen Substanz und werden verworfen.
Die Waschflüssigkeit wird dann durch das Elutionsmittel, welches
zur Eluierung des thrombinähnlichen Bestandteils bestimmt ist, ersetzt. Man verwendet für diesen Zweck eine wässrige 0,15 m
Lösung von Guanidin-hydro Chlorid, welche mit 0,01 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid
auf einen pH~Wert von 8,1 abgepuffert wurde und 0,1 $>
Chlorbutanol enthält. Der thrombinähnliche Bestandteil wird in Form eines ziemlich scharfen Maximums
eluiert, wobei die dem Maximum entsprechende Konzentration bei einem Säulen-Leervolumen nach Elutionsbeginn erreicht wird. Die
Säule wird mit insgesamt 200 ml der vorgenannten abgepufferten Guanidinlösung eluiert. Der thrombinähnliche Stoff wird in etwa
90prozentiger Ausbeute in einem Volumen von 100 bis 120 ml gewonnen.
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Das den thrombinähnlichen Stoff enthaltende Eluat wird anschließend
durch Ultrafiltration zehnfach konzentriert. Man gibt das erhaltene Konzentrat auf eine Chromatographiesäule, die mit
Sephadex G-100 in Perlenform (Handelsprodukt von Pharmacia, Uppsala, Schweden) gefüllt ist. Das Sephadex G-100 wurde mit
0,1 m Natriumchlorid in 0,1 m Natriumphosphat, welches einen
Pjj-Wert von 6,8 aufweist und 0,1 $>
Chlorbutanol enthält, in den Gleichgewichtszustand versetzt. Die Füllung besitzt eine Höhe
von 95 cm und einen Durchmesser von 2,5 cm. Mit Hilfe dieser Säule werden das Guanidin-hydrochlorid und der im vorgenannten
Konzentrat enthaltene Puffer entfernt.
Die auf diese Weise erhaltene isolierte thrombinähnliche Substanz
wird mit einer zuvor identifizierten, hochreinen Probe des aus dem Grubenotterngift isolierten thrombinähnlichen Materials verglichen.
Die beiden Proben erweisen sich aufgrund der nachstehenden Tests als identisch. Die unter Verwendung von 7prozentigen
Gelen bei einem Pjr-Wert von 8,9 durchgeführte Gel-Elektrophoresemethode
(beschrieben von Ornstein in "Annals of N.Y. Acad. of Science, 121 /19647, Seite 321) ergibt identische elektrophoretische
Beweglichkeiten. Die Gel-Filtration auf Sephadex G-100 (ein teilweise vernetztes und regellos angeordnete Ätherbindungen aufweisendes
Dextran-Gel, welches Substanzen mit Molekulargewichten
von weniger als 10* abtrennt) ergibt dasselbe Molekulargewicht
und die gleiche Spezifität, jedoch eine höhere Wirksamkeit (spezifische Aktivität). Beide Proben sind vollständig frei vom
hämorrhagischen Faktor und bewirken die Gerinnung von gereinigtem Plasmafibrinogen.
Die spezifische Aktivität des nach dem vorliegenden neuen Verfahren
erhaltenen thrombinähnlichen Stoffes liegt im gerinnungshemmenden Wirkungsbereich zwischen 1800 und 2000 Einheiten/ml/
A280nm* Die Hom°geneität wird mi-fc Hilfe identifizierender Kriterien,
z.B. durch Gel-Filtration und anhand des Verhaltens in der Ultrazentrifuge, durch SDS-Scheiben-Gel-Elektrophorese
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(SDS disc gel electrophoresis) und Immunodiffusion, festgestellt.
Bei einer im größeren Maßstab durchgeführten Wiederholung der vorgenannten Arbeitsweise wird eine 20 g-Giftprobe auf ein entsprechend
größeres Säulenbett (6,5 x 14 cm) gegeben. Die Giftprobe ist dabei in 1000 ml der vorgenannten Natriumchloridlösung
gelöst. Durch die Säule werden in der vorstehend beschriebenen Weise 4 bis 6 Liter der vorgenannten Waschflüssigkeit und anschließend
2 bis 2,5 Liter der beschriebenen abgepuffer^x Guanidin-hydrochloridlösung
perkoliert. Die thrombinähnliche Substanz wird im genannten Puffer in einem Volumen von 1,4 bis 1,8 Liter
eluiert. Nachdem die gewünschte Substanz auf diese Weise aus der Säule ausgezogen wurde, wird das Agarosebett in der vorstehend
beschriebenen Weise regeneriert. Die Säule wird für eine neue Giftcharge verwendet. Auf diese Weise wird die gewünschte Substanz
bei jeder von vier Chargen, welche durch dieselbe, Agraatin- -Agarose enthaltende Säule geführt werden, in der vorgenannten
hohen Reinheit und Ausbeute aufgefangen. Die Gel-Filtration wird in diesem Falle mit einer einen Durchmesser von 9»5 cm aufweisenden
und bis zu einer Höhe von 115 cm mit Sephadex G-100 gefüllten Säule unter Verwendung des vorgenannten Puffers durchgeführt.
Wenn man die bei der vorgenannten Arbeitsweise eingesetzte Sepharose
durch Bio-Gel A-15 m mit einer nassen Korngröße von 149 bis
297 Mikron (50 bis 100 mesh) (eine von Bio-Rad Laboratories, Richmond, CaI. gehandelte Agarosej 11A" bedeutet, daß das Harz
Agarose ist und "15 m" zeigt an, daß Substanzen eines Molekulargewichts
von mehr als 15 x 10 vom Gel zurückgehalten werden) ersetzt, zeigen die erhaltenen vereinigten Fraktionen dieselbe Wirksamkeit
und denselben Reinheitsgrad wie vorstehend angegeben ist.
Man erkennt, daß das erfindungsgemäße Verfahren die Isolierung des aktiven Koagulansbestandteils aus Schlangengift stark vereinfacht.
Insbesondere sei festgestellt, daß erfLndungsgemäß ein einziges Affinitätschromatοgramm für die Erzielung eines Produkts von höchster
Reinheit ausreicht. Dieses Ziel konnte zuvor lediglich mit Hilfe von Methoden erreicht werden, die zweistufig und damit komplizier-
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•Ό
ter waren, ein weniger wirksames Produkt ergaben oder mit einer beträchtlichen Einbuße an wertvoller Aktivität verbunden waren.
Das neue Verfahren liefert ein Produkt von höchster Wirksamkeit» welches dieselbe Molekülgröße und gerinnungshemmende Aktivität
wie ein nach älteren Methoden erhaltenes, aufwendiger raffiniertes Produkt aufweist und diesem Produkt auöh hinsichtlich anderer
physikalischer und chemischer Identifikationsmerkmale gleichkommt« Es ist besonders bemerkenswert und überraschend, daß ein einfaches
Affinitätschromatogramm das einzige Erfordernis für die Isolierung eines gereinigten, hochwirksamen thrombinähnlichen Stoffes aus
vorher nicht behandeltem Schlangengift darstellt und daß dieses Chromatogramm die genannte wertvolle Fraktion in nahezu theoretischer
Ausbeute liefert.
Im Hinblick auf die überraschende Wirksamkeit der erfindungsgemäßen
Reinigungs- und Isoliermethode soll die Puffer- und SaIskonzentration
der Giftlösung mit pyrogenfreien Substanzen erreicht werden. Gewünschtenfalls kann man der Giftlösung von Beginn
an ein Konservierungsmittel zusetzen oder aber ein solches Mittel später der gereinigten, isolierten Koagulansfraktion einverleiben,
wenn die Lösung lagerfähig oder langzeitig gebrauchsfähig sein soll. Es sind zahlreiche Konservierungsmittel für diesen
Zweck geeignet, beispielsweise Benzylalkohol, Methyl- und/oder Propyl-p-hydroxybenzoat und Chlorbutanol. Im allgemeinen werden
sämtliche Anforderungen, die eine normale Lagerung mit sichbringtj
mit Hilfe von 0,05 bis 1 $> eines solchen Konservierungsmittels
erfüllt.
Die aus der Affinitätschromatographiestufe erhaltene abgepufferte
Lösung wird vorzugsweise durch Ultrafiltration konzentriert und durch eine Gel-Filtrations-Säule in einem physiologisch geeigneten
Puffer hindurchgeführt, welcher dann mit der gewünschten gereinigten,
isolierten Substanz vereint bleibt. Diese Substanz besitzt nunmehr einen genügenden Reinheitsgrad, um Warmblütern sur
Verhinderung der Blutgerinnung oder zur Auflösung von bereits gebildeten Blutklumpen verabfolgt zu' werden. Molekularsiebe wie
Sephadex G-100 stellen hervorragende, den richtigen Vernet-•
' - 10 -
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zungsgrad aufweisende Materialien für die Gel-Filtration dar. Anstelle von Sephadex G-100 kann man auch andere vernetzte
Dextran-Gele, wie Sephadex G-25, G-75 und G-200, vernetzte
Polyacrylamide, wie Bio-Gel 10 und Bio-Gel 300, sowie andere
Produkte verwenden. Weitere Methoden zur Entfernung des Guanidin-hydroChlorids
und des Puffers der Elutionsstufe beruhen auf einer einfachen Dialyse gegen das gewünschte Puffer- und Lösungsini ttelsyst em.
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Claims (5)
- Pa t entansprüche1· Verfahren zur Isolierung des thrombinähnlich wirkenden Bestandteils aus dem Gift der Otter Agcistrodon rhodostoma, dadurch gekennzeichnet, daß man eine klare Lösung des nativen Gifts in einer auf'einen pg-Wert von 7,5 "bis 8,3 abgepufferten 0,25 molaren wässrigen Natriumchloridlösung herstellt, diese lösung auf ein mit agmatingekoppelten Agaroseperlen gefülltes Säulenbett gibt, die Säule so lange mit einer auf einen ρττ-Wert von 7,5 bis 8,3 abgepufferten 0,25 molaren wässrigen Natriumchloridlösung wäscht, bis die Menge des bei 280 nm absorbierenden Materials auf einen Wert von 0,04 oder darunter abgesunken ist, und die aktive thrombinähnliche Substanz mit einer auf einen p„-Wert von 7,5 bis 8,3 abgepufferten 0,1 bis 0,25 molaren wässrigen Lösung von Guanidin-hydrochlorid aus der genannten Säule eluiert.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Guanidin-hydrochlorid-Lösung etwa 0,15 molar ist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Guanidin-hydrochlorid-Lösung mit 0,01 molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid auf einen Ρττ-Wert von 8,1 ±0,1 abgepuffert ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Agaroseperlen 60 bis 120 Mikromol Agmatin pro Gramm Trockengewi cht enthalt en.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die klare Giftlösung 0,5 bis 3 Gew.-^ Gift enthält.- 12 -3098U/11b9
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