DE2309440A1

DE2309440A1 - Verfahren zum isolieren von lysozym

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Publication number: DE2309440A1
Application number: DE19732309440
Authority: DE
Inventors: Friedrich Katz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1973-02-26
Filing date: 1973-02-26
Publication date: 1974-09-05
Also published as: US3940317A

Description

2309A40

Dipl. Ing ^; · 23. Februar

Pot— ' Da./Li.

506 Ffci:. ■ ■"■

Friedrich Katz, Louis Fishman und Milton Levy,

New York, New York (V.St.A.) Verfahren zum Isolieren von Lysozym

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren reinen Lysozyms.

Lysozym ist ein hochaktives Enzym, das ursprünglich von Fleming während seiner ersten Arbeiten zur Schaffung von Penizillin isoliert worden ist. Lysozym findet man in dem Gewebe und in

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Körperflüssigkeiten wie Blut, Tränen und Milch von Säugetieren einschließlich Menschen sowie in Vogelprodukten, beispielsweise Vogeleiweiß, und Pflanzenprodukten. Es ist in Bakterien und Bakteriengeschwüren gefunden worden. Die Hauptausgangsstoffe für Lysozym sind bisher Vogeleier gewesen, und es sind die verschiedensten Methoden bekannt, um es in einigermaßen erträglichen Reinheitsgraden zu isolieren. Diese Verfahren sind jedoch zeitraubend, mühselig und teuer und eignen sich nicht ohne weiteres für die Isolierung von Lysozym im Produktionsmaßstab. Lysozym aus Vogelmaterial kann als Konservierungsmittel für Nahrungsmittel verwendet werden. Es wird schon seit langem als ein sehr erwünschtes Konservierungsmittel angesehen, da es in das menschliche Verdauungssystem ohne schädliche Effekte darauf eingeführt werden kann und ihm kein Problem chemischer Reststoffe anhaftet, die viele künstliche Konservierungsmittel beeinflussen. Bisher hat jedoch der Kostenfaktor, der bei der Herstellung großer Mengen reinem Lysozyms auftritt, im Endeffekt dessen verbreitete Anwendung für diesen sehr erwünschten Zweck verhindert.

Da Lysozym als ein bakteriolytisohes Mittel arbeitet, hat es gute Möglichkeiten als ein Potentiator für Arzneimittel wie Antibiotika und dergleichen. Es gibt bisher aber bestimmte immunologische Barrieren für seine Anwendung für diesen Zweck. Während Lysozym aus Vogelmaterial und nicht aus humanem Ausgangsmaterial

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von Menschen ohne nachteilige immunologische Effekte verdaut werden kann, baut nichtmenschliohes Lysozym Antikörperreaktionen auf, wenn es in den menschlichen Kreislauf injiziert wird. Wenn Lysozym vom menschlichen Ursprung in den menschlichen Kreislauf injiziert wird, erhält man mitunter eine Antikörperreaktion, mitunter auch nicht. Die einzige Art und Weise, wie absolut sichergestellt werden kann, daß keine Antikörperreaktion entsteht, ist, Lysozym zu injizieren, das von der injizierten Person selbst stammt, zusammen mit der gewünschten Arznei. Es ist also wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, um effektiv Lysozym von einer Person in einer solchen Weise zu trennen, daß die liefernden Stoffe dieser Person nicht in sonstiger Weise beeinträchtigt werden. Da es entsprechend bekannte Tests fiir die Antikörperreaktion gibt, ist es relativ einfach, zu prüfen, ob eine Person eine Antikörperreaktion zeigt oder nicht, indem nämlich fremdes menschliches Lysozym in den betreffenden menschlichen Kreislauf injiziert wird.

Die bekannten Verfahren zum Isolieren von Lysozym aus menschlichem Ausgangsmaterial sind nicht ausreichend wirksam, um eine angemessene Menge Lysozym in einer solchen Reinheit zu liefern, daß sichergestellt wird, daß keine Antikörperreaktion als Folge von anderen proteinischen Ausgangsmaterialien auftritt, oder die

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bekannten Verfahren für die Lieferung von reinem Lysozym sind so teuer, daß sie für praktische Zwecke, das heißt nichtakademische Zwecke, wertlos sind.

Chitin ist ein bekanntes Material, das aus verschiedenen maritimen Quellen erhältlich ist, beispielsweise Krebsen und dergleichen. Chitin von Krebsen ist in Verfahren für die Isolierung von Lysozym verwendet worden, jedoch nicht für die Reinigung desselben.

Es ist festgestellt worden, daß aus Tintenfischen (Loligo vulgaris) isoliertes Chitin nach einer Entaminisierung ein absorptives Medium liefert, das spezifisch Lysozym aus wässrigen, leicht sauren Suspensionen entfernt, die dasselbe enthalten. Das Lysozym kann dann ohne weiteres aus dem Chitin entfernt werden, indem ein Waschen mit wässriger verdünnter Säure erfolgt, aus der das Lysozym selbst nach bekannten Verfahren isoliert werden kann. Es ist ein spezifischer Vorteil dieser Reaktion, daß in einem Isolierungsschritt die Konzentration von Lysozym von dem etwa Zehnfachen bis auf das etwa Zehntausendfache erhöht werden kann.

Ein weiterer Vorteil dieses Verfahren ist, daß es funktioniert, gleichgültig, welchen Ursprung das Lysozym hat, d.h. ob es von

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Säugetieren abstammt (menschlichen oder tierischen), von Vögeln oder von Pflanzen.

Das Lysozym, das durch die bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung isoliert wird, hat eine hohe Reinheit.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zweckmäßigerweise in zwei Teile geteilt werden. Der erste Teil besteht in der Herstellung des Absorptionsmaterials, der zweite Teil im Absorptionsverfahren selbst.

Die chemische Substanz, Chitin, die als das absorbierende Material verwendet wird, findet man in vielen Formen maritimen Lebens, beispielsweise in den Gerüsten von Gliederfüssem, Ringelwürmern, Weichtieren, medusenartigen Hohltieren, in Padenwürmern und Aohantooephalanen. Nur Chitin, das aus den Kielfedern des Tintenfisches (Loligo vulgaris) isoliert wird, eignet sich zur Verwendung als selektives Absorptionsmittel für Lysozym. Diese wünschenswerte Eigenschaft dürfte auf die antiparallele Orientierung der Chitinketten in der physikalischen Form zurückzuführen sein, in der sie vorliegen. Antiparallel bedeutet, daß die Struktureinheiten parallel zueinander orientiert sind, die Richtungsfolge der Atome in jeder Struktureinheit sich jedoch von einer Kette zur nächstfolgenden Kette ändert. Die Kielfedern

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Tintenfisches werden vom Tier entfernt und vom Fleisch freigespült, zweokmäßigerweise mit laufendem Leitungswasser. Das Material wird dann über Nacht bei mäßig erhöhter Temperatur getrocknet. Temperaturen über 70° C, jedoch unter 100° C, sind geeignet, wobei 95° C besonders zweckmäßig ist. Das Material wird dann in kleine Stücke geschnitten, die geeigneterweise Abmessungen in allen Richtungen von 1 cm oder weniger haben, und dann wird Salzlösung zugesetzt. Der Zweck der Salzlösung ist es, ein geeignetes Homogenisierungsmittel zu bilden. Die Menge und die Konzentration der Salzlösung ist nioht kritisch, es ist jedoch festgestellt worden, daß es zweckmäßig ist, mit etwa 5 bis etwa 20, geeigneterweise mit etwa 10 Volumen 0,1-5 normalemwässrigem Natriumchlorid zu arbeiten, zweckmäßigerweise etwa 1 normalem Natriumchlorid. Das Gemisch wird dann in einem geeigneten rotierenden Messermahlwerk mit der höchstmöglichen Tourenzahl homogenisiert. Die Homogenisierung wird etwa 30 Minuten bis 2 Stunden lang weitergeführt, zweckmäßigerweise etwa 1 Stunde lang, das Gemisch wird dann aus dem Homogaiisierungsapparat entnommen, die oben schwimmende Flüssigkeit wird entfernt und abgeschieden, und dann erfolgt ein Auffüllen mit weiterer Salzlösung bis auf das ursprüngliche Volumen. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die Flügel des Homogenisierungsapparates zwischen jedem Homogenisierungsschritt zu schärfen. Dieser Vorgang wird einmal bis etwa fünfmal wiederholt, zweckmäßigerweise dreimal.

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Nachdem die letzten obenschwimmende Flüssigkeit abgeführt worden ist, entfernt man zweckmäßigerweise alle störenden Reststoffe. Während irgendeine verdünnte, in Wasser lösliche Säure für diesen Schritt verwendet werden kann, hat es sich als besonders zweckmäßig erwiesen, in- Wasser lösliche organische Säuren zu verwenden, insbesondere Essigsäure in einer Stärke von etwa 0,5 bis 2, zweckmäßigerweise etwa 1 Mol. Das Restchitin wird in etwa 10 Volumen Säure wieder in Suspension gebracht und erneut etwa 1 Stunde lang in dem gleichen oder einem ähnlichen Apparat homogenisiert. Nach der Homogenisierung wird die obenschwimmende Flüssigkeit erneut ausgeschieden, und das Restchitin wird zunächst getrocknet, zweckmäßigerweise über etwa 70° C, jedoch unter 100° C, vorzugsweise beietwa 95° C, und zwar mehrere Stunden lang, vorzugsweise über Nacht und dann erfolgt eine Umformung in Pulver, insbesondere in einer Kugelmühle, um ein Pulver zu erhalten, das eine Maschenzahl von 100 bis 400 erreicht. Während jede Maschenzahl in diesem Bereich geeignet ist, ist festgadbellt worden, daß Chitin mit einer Körnigkeit von etwa 100 Maschen die zweckmäßigste Kombination an zur Verfügung stehender Oberfläche hat, gekoppelt mit einer ausreichend großen Partikelgröße, um einen guten Durchfluß zu ermöglichen, wenn eine Verwendung in einer chromatographischen Säule erfolgt.

Das Chitin wird dann durch irgendeine bekannte Entaminisierungsraethode entaminisiert, wobei es sich als besonders zweckmäßig

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erweist, die Entaminisierung nach dem Van-Slyke-Verfahren durchzuführen. Das Chitin wird mit Salpetersäure behandelt, um die Aminogruppen daran in Hydroxylgruppen umzuwandeln, um Desaminopolyhydroxyl-Tintenfisch-rChitin zu erhalten. Es kann jede geeignete Quelle für Salpetersäure verwendet werden, im bevorzugten Ausführungsbeispiel werden ein Teil Chitin, drei Teile Eisessigsäure und neun Teile 30 prozentigen wässrigen Natrium nitrits etwa 24 Stunden lang umgerührt. Das in dieser Weise behandelte Material wird dann gewaschen. Im bevorzugten Waschverfahren wird das entaminisierte Chitin in ein gesintertes Glasfilter gegeben und mit Destillwasser gewaschen, wobei ein Absaugen erfolgt, bis der pH-Wert des Ausflusses etwa 5,5 beträgt. Zwar können beliebige Mittel eingesetzt werden, um den UB^rung des Iflrsozyms mit dem Tintenfischchitin in Kontakt zu bringen, es hat sich jedoch als am wirkungsvollsten erwiesen, das Chitin in eine chromatographische Säule zu packen. Vorzugsweise werden solche ohromatographischen Säulen durch einen Eigenstem hergestellt, dem sich vorzugsweise ein Spülen mit Essigsäure anschließt, geeigneterweise etwa 100 Säulenvolumen Essigsäure, dem sich ein Durchfluß von Destillwasser anschließt, bis der pH-Wert des Ausflusses erneut 5,5 beträgt.

Während das bevorzugte Verfahren zum Extrahieren von Lysozym aus einem Ausgangsmaterial durch Chromatographie durch eine

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Chifcinsäule vorgenommen wird, versteht es sich, daß als Folge der Verschiedenheit der Lysozymursprünge verschiedene Verfahren der Vorbereitung eingesetzt werden müssen. Es versteht sich, daß Lysozym einen sehr kleinen Anteil seines Ausgangsmaterials bildet, das im größeren oder kleineren Maße fasrige, partikelförmige oder fettige Substanzen aufweist. Es versteht sich, daß diese und andere Substanzen, die den Hauptteil des SJoffes bilden, der Lysozym enthält, die chromatographische Extraktion von Lysozym schwer beeinträchtigen und deshalb entfernt werden müssen. Das Grundprinzip in den folgenden Reinigungssohritten besteht darin, festzustellen, daß die maximale wässrige Löslichkeit von lysozym zwischen einem pH-Wert von 3,8 und 4,6 auftritt, und dabei ist ein pH-Wert von 4,5 die bevorzugte Zahl. Die Verfahren der Trennung hängen natürlich von der Art des Ausgangsmaterials ab.

Wenn das Ausgangsmaterial Gewebematerial ist, zu dem Lungengewebe, Hautgewebe, und am besten Placenta-Gewebe gehören, wird das Gewebe in kleine Stücke geschnitten und in azidischer Lösung homogenisiert, vorzugsweise in einer in Wasser löslichen organischen Säure, am besten O,001-M Essigsäure in einem herkömmlichen Mischapparat mit hoher Tourenzahl, bis eine vollständige Trennung der Zellen erfolgt ist, dem sich ein Rühren im Kalten (zwischen etwa 0° G und etwa 5° C) von etwa 5 bis etwa 20 Tagen,

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zweckmäßigerweise etwa 10 bis etwa 21 Tagen, anschließt.

Im Falle von Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Speichel oder Tränen ist eine Homogenisierung nicht erforderlich. Diese Flüssigkeiten werden im Verhältnis von 1:1 mit wässriger Säure verdünnt, wie vorstehend erwähnt, zweckmäßigerweise mit 0,001-M-Essigsäure und es erfolgt in gleicher Weise ein Umrühren im Kalten etwa 5 bis etwa 20 Tage lang, zweckmäßigerweise etwa 10 Tage lang. Bestimmte Körperflüssigkeiten,wie Milch und Colostrum, haben einen hohen Lipidgehalt, der entfernt werden muß. In diesem Fall wird die Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 4,5 versäuert, zweokmäßigerweise mit 0,001-M-Essigsäure, und es erfolgt ein Schleudern in einer Zentrifuge. Es entstehen drei Schichten, nämlich eine obere Lipidschicht, eine mittlere wässrige Schicht und ein Reststoff, der denaturierte Proteine und Kasein enthält. Nur die mittlere wässrige Schicht wird verwendet. Wenn die lysozym-Quelle pflanzlichen Ursprungs ist, beispielsweise von Zwiebeln, Radieschen, Papaya und der-gleichen abstammt, erfolgt eine Verarbeitung in der gleichen Weise wie Gewebe. Ausgangssubstanzen wie Bakteriengeschwülste und bestimmte Bakterien, beispielsweise Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans und Streptococcus faecalis, die zellenförmiges Material enthalten, werden in der gleichen Weise wie Gewebe behandelt.

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Vogelausgangsstoffe, beispielsweise die Eiweise von Hühnern, Enten, Truthähnen und allgemein Vögel, werden im Verhältnis von 1:3 oder 1:4 mit 0,01-M-Essigsäure unter mäßigen Umrühren verdünnt, der pH-Wert wird gegebenenfalls auf 4,5 eingestellt, es erfolgt ein Stehen über Nacht im Kalten, und dann wird ein Schleudern in einer Zentrifuge, mit hoher Tourenzahl vorgenommen, um Partikelsubstanzen zu entfernen.

Die wässrigen sauren Schichten aus jeder der vorstehenden Quellen enthalten das lysozym in Auflösung darin, sie enthalten jedooh ferner feines Partikelmaterial oder pseudocolloidales Material, das sehr schnell das Chitin-Absorptionsmittel inaktivieren kann. Diese wässrigen Schichten werden dann in einer Zentrifuge geschleudert. Das Schleudern kann etwa 1 Stunde lang bei 8.000 g bis 3 Stunden lang bei 50.000 g erfolgen. Es ist jedoch festgestellt worden, daß man ohne weiteres zufriedenstellende Ergebnisse durch Schleudern 2 Stunden lang bei 30.000 g erreicht.

Die wässrige, obm schwimmende Flüssigkeit aus dieser Zentrifugierung wird dann mit dem Tintenfisch-Chitin in Kontakt gebracht. Man kann zwar mit jeder beliebigen Methode arbeiten, um das Chitin mit der Iysozym-lösung in Kontakt zu bringen, dem sich die Entfernung des Iysozyms aus dem Chitin anschließt, das einfachste und effektivste Verfahren besteht jedoch in der Säulenchromato-

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graphie, bei der die wässrige Essigsäurelösung des Lysozyms durch eine Säule Tintenfisch-Chitin geleitet wird, wobei das Lysozym mit einem geeigneten Entziehungsmittel daraus entzogen wird.

Bei dem bevorzugten Verfahren zur Vornahme der Chromotographie wird die das Lysozym enthaltende Lösung in die Tintenfisch-Chitin-Säule durch ein Zugabebehälter mit kontrollierter Durchflußmenge gegeben. Die optimale Durchflußmenge hängt natürlich von verschiedenen Paktoren ab, hauptsächlich der Körnung des Chitins. Es ist jedoch festgestellt worden, daß beim Arbeiten mit einer Chitinkörnung von 100 Mesh eine Durchflußgeschwindigkeit von

ρ zwischen 10 und 50 und zweckmäßigerweise 15 bis 25 ml pro cm Säulenquerschnittsfläche pro Stunde zu geeigneten Ergebnissen führt. Naoh Durchgang der das Lysozym enthaltende Lösung durch die Säule wird die Säule gründlich mit Destillwasser gespa?ült. Das Maß der Spülung ist nicht kritisch. Es ist jedoch festgestellt worden, daß etwa 80 bis etwa 150, zweckmäßigerweise etwa 120 Säulenvolumen Destillwasser geeignet sind.

Das Lysozym wird dann mit wässriger Säure entzogen. Man kann mit Mineraleäuren oder in wasserlöslichen organischen Säuren arbeiten. Beispielsweise kann man mit verdünnter wässriger Salzsäure arbeiten, die zweckmäßigerweise eine Stärke von 2N hat,

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oder mit verdünnter wässriger Schwefelsäure, die eine 0,001-Norraalstärke hat. Man kann auch in Wasser lösliche organische Säuren verwenden, bei denen es sich entweder um Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl-Garboxylsäuren handeln kann. Besonders bevorzugt werden jedoch im wesentlichen flüchtige, in Wasser lösliche organische Säuren verwendet, beispielsweise niedere Alkanoinsäuren mit zwischen 1 und 5 Kohlenstoffatomen. Es hat sich als besonders zweckmäßig erwiesen, mit 0,01-M-Essigsäure zu arbeiten, da nicht nur Lysozym ohne weiteres in dieser Säure bei dieser Stärke löslich ist, sondern auch die Säure selbst hoohgradig flüchtig ist, um durch Verdampfung oder lyophilisation ohne weiteres entfernt zu werden.

Andere Säuren sind zwar brauchbar, es ist jedooh festgestellt worden, daß man die höchsten Ausbeuten mit der höchsten Reinheit beim Arbeiten mit Essigsäure erhält. Es ist festgestellt worden, daß das Lysozym in etwa 7 Säulenvolumen entzogen wird, wobei der Hauptteil im zweiten bis vierten Säulenvolumen entzogen wird.

Item Verlauf der Entziehung schließt sich eine UV-Absorption bei 280 nm an.

Die Lysozymaktivität jeder Fraktion wird durch eine Modifikation

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der Methode nach Shugar (1951, Bull.Soc. Chim.Biol. 33 710), ittdem die Geschwindigkeit der lyse einer Suspension von in Wärme getöteten Micrococcus lysodeikticus (Sigma) aufgezeichnet wird (o,o3o mg./100 ml. in O,1M-Natriumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,00). Eine Abnahme im Absorptionsvermögen von 0,001 pro Minute wird als ete Einheit für die Lysozymaktivität angesetzt.

Die Proteinmenge wird nach dem Verfahren nach Lowry, Rosebrough, Parr und Randall geschätzt (1951, J. Biol.Chem., 193, 265).

In einer ordnungsgemäß durchgeführten Isolierung zeigt ein Test der Lysozymaktivität im Ausfluß oder in der Waschflüssigkeit eine biologische Aktivität von null bezogen auf die Mikrokokken-Suspension. Mit dem Waschmittel wird das Lysozym mit einer Ausbeute von mehr als 99 # entzogen.

Das eluierte Lysozym wird zunächst durch Schnellverdampfen konzentriert, gegebenenfalls auch unter Unterdruck. Wenn das Elüat noch nicht homogen ist, wird es 1 bis 2 Minuten lang bei 100° C in einem Wasserbad erhitzt, 1 bis 2 Stunden lang unter hoher . Tourenzahl zentrifugiert, um das denaturierte Material zu entfernen, und das Supernat wird durch Sohnellverdampfen unter Unterdruck oder durch Lyophylisation getrocknet. Die Reinheit dieses

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Produktes wurde durch Scheibengel-Elektrophorese sowie durch isoelektrische Bündelung getestet. Diese Tests zeigten alle ein einziges Band Protein, das sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie gereinigtes Hühnereiweißlysozym bewegte, das als Kontrolle verwendet wurde.

Es wurde eine immunologische Analyse mit dem gereinigten Lysozym durchgeführt, das von verschiedenen menschlichen Geweben von verschiedenen Personen erhalten wurde, indem das lysozym in verschiedene Kaninchen injiziert wurde und die damit entstandenen Antikörper geprüft wurden. Die Ergebnisse,, die erzielt wurden, zeigen prima facie, daß immunologisch, obgleich nicht notwendigerweise chemisch, alle menschlichen Lysozyme, die geprüft worden sind, anscheinend identisch sind.

Die in der Isolierung von Itfsozym von verschiedenen Ursprüngen erzielten Ergebnisse mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind in den nachstehend zusammengefaßten Tabellen angegeben.

Beispiel I

Chitin Struktureinheit

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■ο

ο

\ H C^OH H λ///

O Jk-

Lungenlysozym vom Menschen

Isolierung durch' Affinitätschromotographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durchmesser 12 mm; Höhe 295 mm; Bettvolumen 33,3 ml; Körnung 200-400 Mesh. Absorptionsspülungen und Elution mit konstanter Durchflußgesohwindigkeit 20 om'/Stunde.

Spülung mit Destillwasser mit einem pH-Wert von 6,5; Entziehung mit 0,01-M-Essigsäure.

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Fraktion ml Lysozym- Protein

Einheiten ng

spezif. Reinigung Aktivität Sp.Act pro Sp-Einheiten Act in\ Homogenat /ng

Lungenhomo- genat	100 3.	700	3.250.000	0,001138	1	1
Piltrat Spülung 1	100 .050	0 0	3.180.000 66.050		1
Ausbeute in	lysozym				1
inaktive Fraktionen 1	.150	0	3.246.050		1
Prozent		0	99,89		1
Eluat Nr. 1	10	200	160	1,250000	1	.098
2	10	370	300	1,233333	1	.084
3	10	540	430	1,255814	1	.106
4	10	690	550	1.254545		.102
5	10	840	680	1.235529		.086
6	10	610	480	1.270833		.117
7	10	320	250	1.280000	.125
8	10	120	120	1.200000	.054
Ausbeute in aktive Fraktionen	Lysozym 80 3.	690	2.960
Prozent	99	,73	0,0009
Durchschnittliche Anreicherung in Iysozym χ 1,097

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Beispiel II Lysozym aua menschlicher Haut

Isolierung durch Affinitätsohromatographie mit entaminisiertem

Chitin.

Säule: Durchmesser 12 mm; Betthöhe 425 mm; Bettvolumen 48,0 ml, Körnung des entaminisierten Chitins 200 bis 400 Mesh.

Absorption, Spülung und Entziehung mit konstantem Durchfluß von 16 cm /Stunde.

Spülung mit Destillwasser (pH-Wert 6,4). Entziehungsmittel 0,001-M-AcOH

Fraktion ml Lysozym- Protein

Einheiten ng

spezif. Reinigung
Aktivität Sp.Act pro Sp-Einheiten -Act im Homoge-/ng na t

Haut- homogenat	1	400	VJl	2.000	12	.800.000	0,000156	8.	1
Filtrat	2	400	5	0	12	.400.000		8.
Spülung	3	1.020	VJl	0		350.020		8.
Eluat Hr.	4	12,	5	375		275	1,363636	8.	741
	5	12,	VJl	750		538	1,395349	9.	94
		12,		500		575	1,333333		947
		12,	inaktive	250		188	1,333333		547
		12,	•	125		125	1,428571		158
Ausbeute:
In Lysozym Fraktionen		0	12	.750.020
				(99,61Jl)

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In Lysozym aktive
Fraktionen

2.000

1,501

doofl)

Durchschnittliche Anreicherung in Lysozym χ 8788

Beispiel III
lysozym aus menschlichem Plasma

Isolierung durch Affinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durchmesser 12 mm; Höhe des entaminisiertem Chitins 275 mm. Bettvolumen 31,1 ml; Körnung des entaminisiertem Chitins:

200 bis 400 Mesh.

Absorption, Spülungen und Entziehung mit konstantem Durchfluß von 18 cm /Stunde.

Spülungen mit Destillwasser, pH-Wert 6,6; Entziehung mit 0,01-M-

AoOH	ml	250	Lysozym- Einheiten	Protein spezif. ng Aktivität Einheiten /ng	Reinigung Sp.Act pro Sp- Act imHomoge nat
Fraktion		250	9.000	13.
Plasma Homogenat		,260	0	13.
Fi!trat	1.	15	0
Spülungen	1	15	1.650
Eluat Nr.	2	15	4.350
	3	15	2.100
	4	15	750
	VJl		150
		,725.000 0,000650	1
		,700.000
	12.600
1.500 1,500000	2.308
3.750 1,380950	2.125
1.400 1,400000	2.154
600 1,250000	1.923
110 1,363636	2.098

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Ausbeute:

In Lysozym inaktive

Fraktionen 0 U 13.721.000 n/g

	9.000 U	(99,	9196)	2	,1	22
In Lysozym aktive Fraktionen	(100Si)		6.860 ng
	Anreicherung	(Ot	OO596)
Durchschnittliche	in	Lysozym χ

Beispiel IV Lysozym aus menschlichem Serum

Isolierung durch. Äffinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durchmesser 10 mm; Höhe 135 mm; Bettvolumen 10,9 ml.

Körnung: 200 bis 400 Mesh.

Adsorption, Spülung und Entziehung bei konstantem Durchfluß von 18 onr/Stunde.

Spülung mit Destillwasser (pH 6,5), Entziehung mit 0,01-M-Essigsäure.

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	al	Lysozym- Protein Einheiten ng	5.732.000	spezif. Aktivität Einheiten /ng	Beispiel V	2309440
Fraktion ι	100	1.200	5.62Ο.ΟΟΟ	0,000209		Reinigung Sp.Act. pro Sp-Act im Homogenat
Homogenat	100	0	98.100		menschlicher Placenta	1
Filtrat	.100	0	5.718.100
Spülung 1,	lysozym 1.200	0	99,76
Ausbeute in inaktive Fra«ktionen		0	80
Prozent	10	90	240	1,125000
Eluat Nr. 1	10	300	380	1,250000	5.372
2	10	500	220	1,315779	5.969
3	' 10	260	40	1,181818	6.296
4	10	50		1,250000	5.644
5	lysozym		960		5.969
Ausbeute in	50	1.200	0,'
aktive Fraktionen		100		02
Prozent		Durohschnittliche Anreicherung in lysozym χ 5,850


lyaozym aus

Isolierung durch Affinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durchmesser 12 mm; Höhe 435 mm; Bettvolumen 49,2 ml* Körnung: 200 bis 400 Mesh.

Adsorption, Spülungen und Entziehung mit konstantem Durchfluß von 20 cm /Stunde.

Spülung mit Destillwasser, Entziehung mit 0,01-M-Essigsäure.

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Fraktion	1	1	ml	Lysozym- Einheiten	Protein ng	.840.000	spezif. Aktivität Einheiten /ng	Reinigung Sp.Act. pro Sp-Act im Homogenat	1 .
Homogenai	Ausbeute in inaktive Fraktionen	2	200 .	3.000	11,	.760.000	0,000253
Filtrat	Prozent	3	200	0	11,	975.000
Spülung	Eluat Nr.	4	.000	p		.835.000
		5	Lysozym 1.200	0	11,	99,96
		6		0		210			.705
		7	10	250		550	1,190476	4	.031
	in	10	700		700	1,272727	5	.082
	aktive Fraktionen	10	900		550	1,285714	5	.031
	Prozent	10	700		240	1,272727	5	.941
Ausbeute		10	300		80	1,250000	4	.941
	10	100		30 .	1,250000	4	.270
10	.40			1,333333	5
Lysozym			2.360
70	2.990		0,02
	99,67		ι Lysozym
Durchschnittliche Anreicherung	ir	VI	χ 5.000
	Beispiel	Human-Monocytic-Lysοzym

Isolierung durch Affinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durchmesser 12 mm; Höhe 425mm ; Bettvolumen 48,0 ml; Körnung: 200 bis 400 Mesh.

Adsorption, Spülung und Entziehung mit konstantem Durchfluß

•z

von 16 cm /Stunde.

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- 23 - 2309UQ

Spülung mit Destillwasser (pH-Wert 6,5), Entziehung mit 0,01-M-Essigsäure.

5 ml Humanmonooyten, die nach den Verfahren naoh Archer und Kooptzoff (1958) anfielen, wurden durch Sonikation in 45 ml Essigsäure, 0,001M homogenisiert, dann bei 4° C 12 Tage lang vor der Eingabe in die Säule gerührt.

Fraktion	in	, 1	ml	iQTsozym- Einheiten	Protein ng	196.00	spezif· Aktivität Einheiten /ng	Reinigung Sp.Act. pro Sp-Act im Homogenat
Homogenat	inaktive Fraktionen	2	50	600	1.	192.000	0,000501	1
Filtrat	Prozent	3	50	0	1.	3.604
Spülung	Eluat Nr.	4	204	0
Ausbeute		5	Lysozym			195.604
		6	254	0	1.	99,98
		7		0		32
		in	4	44		68	1.375000	2.739
		aktive Fraktionen	4	88		92	1.294110	2.578
	Prozent	4	128		130	1.391304	2.772
Ausbeute		4	180		76	1.384615	2.764
	4	108		32	1.421053	2.831
4	44		15	1.375000	2.739
4	8			1.333333	2.656
Lysozym			432
28	600		0,0004
	100		Iysozym χ
Durchschnittliche Anreicherung	in	2.726

- 24 -

409836/0 557

Beispiel VII

2309U0

Human-Mlloh-Lysozym

Isolierung durch Affinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durohmesser 14 mm; Höhe 444 mm; Bettvolumen68,3 ml; Körnung: 200 bis 400 Mesh.

Adsorption, Spülungen und Entziehung mit konstantem Durchfluß von 20 οΌΓ/Stunde.

Spülung mit Destillwasser (pH 6,6), Entziehung mit 0,01-M-Essigsäure.

Fraktion	in	, 1	ml	Lysozyra- Einheiten	Protein ng	spezif. Aktivität Einheiten /ng	Reinigung Sp.Act. pro Sp-Act in? Homogenat
Molke	inaktive Fraktionen	2	100	7.600	3.32O.OOO	0,002289	1
PiItrat	Prozent	3	100	0	3.3OO.OOO
Spülung	Eluat Nr.	4	1.000	0	13.600
Ausbeute		5	lysozym
		6	1.100	0	3.313.600
		in		0	99,81
		aktive Fraktionen	10	480	400	1,200000	524
		Prozent	10	1.590	1.200	1.325000	579
Ausbeute		10	2.400	1.800	1.333333	582
	10	2.040	1.500	1.36ΟΟΟΟ	594
10	720	520	1.384615	605
10	370	280	1.321429	577
lysozym
60	7.600	5.700
	100	0,002
Durchschnittliche Anreicherung	in Lysozym χ	577	- 25 -

409836/0557

- 25 Beispiel VIII

2309U0

Human-Speiohel-Lyaozym

Isolierung durch Affinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durchmesser 10mm; Höhe 252mm; Bettvolumen 19,8 ml; Körnung 200 bis 400 Mesh.

Adsorption, Spülungen und Einziehung mit konstantem Durchfluß von 16 cm /Stunde.

Spülung mit Destillwasser (pH 6,6), Entziehung mit 0,01-M-Essigsäure.

Fraktion

ml

Lysozym- Protein Einheiten ng

spezif. Reinigung Aktivität Sp.Act. Einheiten pro Sp-Aot /ng im Homogenat

Speichel- homogenat	50	2.600	184.000	0,001413	1
Filtrat	50	0	180.000
Spülung	520	0	2.520
Ausbeute in	Lysozym
inaktive Fraktionen	570	0	182.520
Prozent		0	99,2
Eluat Nr. 1	10	700	520	1,296296	917
2	10	1.100	810	1,358024	961
3	10	510	400	1,275000	902
4	10	200	160	1,250000	885
5	10	80	60	1,333333	944
Ausbeute in	Lysozym
aktive Fraktionen	50	2.590	1.950
Prozent		99,62	0,01
Durchschnittliche Anreicherung	in Lysozym	χ 922

-26-

A09836/0557

- 26 -. Beispiel IX

2309U0

Human-Eosinophyl-Lysozym

Isolierung durch Affinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durchmesser 12 mm; Höhe 425 mm; Bettvolumen 48,0 ml; Körnung 200 bis 400 Mesh.

Adsorption, Spülung und Entziehung mit konstantem Durchfluß von 16 cm /Stunde.

Spülung mit Destillwasser (pH 6,5), Entziehung mit 0,01-M-Essigsäure.

5 ml Eosynophyle, die dem menschlichen Blut nach dem Verfahren nach Lindgreen (1958) entnommen worden sind, wurden durch Sonikation in 25 ml. Essigsäure 0,001 M homogenisiert, 10 Tage lang bei 4⁰C gerührt, geschleudert und in die Säule gegeben.

Fraktion

ml

Lysozym- Protein Einheiten rig

spezif. Reinigung Aktivität Sp.Act.
Einheiten pro Sp-Act /ng im Homogenat

Homogenat	In Ijysozym aktive Fraktionen	30	180	1.	050.000	0,000171	7	1
Filtrat	30	0	1.	047.000		7
Spülung	100	O		2.700		7
lysozym inaktive Fraktionen	130	0	1.	049.700	(99,97%)	7
Eluat Nr. 1	5	45		35	1,285714		.519
CNJ	5	100		75	1,333333		.797
3	5	25 ■		20	1,250000	.310
4	5	10		75	1,333333	.797
20	180(1i	00%)	1.375	(0,008%)
Durchschnittliche	Anreicherung in	Lysozym χ	7.606

- 27 -

409836/0557

- 27 Beispiel X

Human-Nieren-Itysozym

Isolierung durch Affinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durchmesser 12 mm; Höhe 295 mm; Bettvolumen 33,3 ml; Körnung 200 bis 400 Mesh.

Adsorption, Spülungen und Entziehung mit konstantem Durchfluß von 18 cm /Stunde.

Spülung mit Destillwasser (pH 6,6), Entziehung mit 0,01-M-Essigsäure.

Fraktion

ml

I<ysozym- Protein Einheiten ng

spezif. Reinigung Aktivität Sp.Act. Einheiten pro Sp-Act /ng im Homogerat

Nieren- homogenat	r	in	1	100	4.200	4.	355.000	0,000964	1	1
Filtrat		inaktive Fraktionen	2	100	0	4.	310.000		1
Spülung		Prozent	3	1.020	0		40.020		1
Ausbeute	Eluat Nr.	4	Iysozym					1
	5	1.120	0	4.	350.020		1
	6	100	0		99,89		1
	7	10	450		320	1,437500	1	.491
	Ausbeute in aktive Fraktionen	10	810		570	1,421053		.474
	Prozent	10	900		640	1,406250		.459
		10	830		590	1,406780		.459
	10	670		460	1.456622	.511
10	360		250	1.44OOOO	.494
10	160		120	1.333333	.383
70	4.190		2.950
100	99,76		0,068
Durchschnittliche Anreicherung	in	I^ysozym	χ 1467

- 28 -

409836/0557

Beispiel XI

Isolierung von Kaninohen-lungen-Iysozym durch Affinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durohmesser 12 mm; Betthöhe 160/180 mm; Bettvolumen 22 ml; Körnung 100 Mesh

Adsorption, Spülungen und Entziehung mit konstantem Durchfluß von 16 om /Stunde.

Spülung mit Destillwasser (pH 6,5), Entziehung mit 0,1-M-Essigsäure.

fraktion	ml	Iysozym- Einheiten	Protein ng	XII	740	spezif. Aktivität	Reinigung
Kaninchen- lungen- Homogenat	298	6.450	5.849.	420	0,000110	1
Piltrat	298	0	5.807.	600	0
Spülung	3.400	0	41.	580	0
Eluierung mit 0,1- Essigsäure	450	6.430			11.086207	10,078- fach
Prozent	99,7
		Beispiel

Isolierung von Kühlungen-Lysοzym durch Affinitätschromatographie mit entaminisiertem Chitin.

Säule: Durchmesser 12 mm; Betthöhe 16E/18O mm; Bettvolumen 22 ml;

Körnung 100 Mesh.

Adsorption, Spülungen und Entziehung mit konstantem Durchfluß von 16 onr/Stunde.

Spülung mit Destillwasser (pH 6,5), Entziehung mit O,1-M-Essigsäure.

- 29 -

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Fraktion

ml

- 29 -

Iysozym- Protein Einheiten ng

2309U0

spezif. Reinigung Aktivität

Kuh-Lungen- 195 Homogenat

Filtrat 195

Spülung 2.250

Entziehung 350 Ausbeute %

4.350

8.405.720 0,000518

	0	8.225.	000	0
	0	180.	500	0
4.	340		220	19.727273 3.808
99	,77
	Beispiel	XIII

Isolierung von Salat-Lysozym duroh Affinitätsohromatographie mit entaminisertem Chitin.

Säule: Durohmesser 12 mm; Betthöhe 160/180 mm; Bettvolumen 20 ml;

Körnung 100 Mesh.

Adsorption, Spülungen und Entziehung mit konstantem Durchfluß

von 16 onr/Stunde.

Spülung mit Destillwasser (pH 6,5), Entziehung mit O,1-M-Essig-

säure.

Fraktion	ml	Lysozym-	Protein	spezif.	Reinigung
		Einheiten	ng	Aktivität
Homogenat	250	750	352.000	0.002131	1
Filtrat	250	0	341.000	0
Spülung	1.500	0	10.750	0
Eluat	250	745	250	1.000.000	470
Ausbeute f>	99,33

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Claims

-30- 2309UQ

Patentansprüche

. 1. Verfahren zum Isolieren von lysozym aus lysozymhaltiger Aus*- gangssubstanz, dadurch gekennzeichnet, daß ein wässriges Homogenat des lysozymhaltigen Ausgangsmaterials mit entaminisiertem Chitin behandelt wird, dessen Molekularketten eine antiparallele räumliche Orientierung haben, dann das Chitin von dem Homogenat getrennt und mit wässriger Säure gewaschen und schließlich die wässrige Säure von dem Chitin getrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß eine wässrige Suspension des lysozymhaltigen Ausgangsmaterials mit entaminisiertem Tintenfisch-Chitin behandelt wird, dann d^s Chitin von d?r Suspension getrennt und mit wässriger Säure gewaschen und schließlich die wässrige Säure von dem Chitin getrennt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß anschließend das Lysozym von der sauren Wasohflüssigkeit abgetrennt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet , daß man zur Gewinnung des Chitins getrock-

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nete, fleischfreie innere Schalen des Tintenfisches (Loligo vulgaris) in wässriger Salzlösung homogenisiert, dann die wässrige Phase dekantiert, dann den Rückstand erneut in verdünnter wässriger, organischer Säure aufnimmt und erneut homogenisiert, dann die wässrige Phase dekantiert, den als Chitin bezeichneten Rest trooknet sodann dieses Chitin in Pulverform bringt, derart, daß seine Korngröße einer Siebmasohenzahl von 100 bis 400 (Mesh 100 bis 400) entspricht, und daß schließlich das Chitin mit Salpetersäure reaktiviert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle der Salpetersäure Natriumnitrit in Gegenwart einer Säure verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruoh 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Säure Eisessig verwendet wird.

7· Verfahren nach Anspruoh 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet., daß das lysozymhaltige Material in einer wässrigen Lösung mit einem pH-Wert zwischen 3,8 und 4*6 aufgenommen wir und daraus die wasserunlösliche Substanz abgetrennt wird, bevor die Lysozymdispension mit Chitin behandelt wird.

- 32 -409836/0557

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß die Aufnahme dadurch erfolgt, daß das lysozymhaltige Material in verdünnter wässriger Säure homogenisiert wird, dann die wässrige Lösung von den anderen vorhandenen Fraktionen abgetrennt wird und die wässrige Fraktion aufbewahrt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Abtrennen durch Zentrifugieren der wässrigen Fraktion erfolgt.

10. Verfahren naoh Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß zunächst das entaminisierte Chitin in eine ohromatographische Säule gegeben wird, dann die lysozymhaltige wässrige lösung in diese Säule gegeben und schließlich die Säule mit wässriger Säure elulert wird.

11. Verfahren naoh Anspruch 10, dadurch gekenn-

z e ic h η e t , daß die Säule mit Wasser vorgewaschen wird, bevor die Eluierung mit wässriger Säure erfolgt.

12. Verfahren naoh Anspruoh 10, dadurch gekennzeichnet , daß das Itysozym von dem sauren Eluat abgetrennt wird.

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2309A40

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch 'g e k e η η zeiohnet,daßals Säure eine verhältnismäßig flüchtige, wasserlösliche organische Säure verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 10, daduroh gekennzeichnet , daß als lysozymhaltiges Ausgangsmaterial Humangewebe verwendet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß als lysozymhaltiges Ausgangsmaterial Humanplacenta verwendet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzei chnet, daß als lysozymhaltiges Ausgangsmaterial Humanplasma verwendet wird.

17. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß als lysozamhaltiges Ausgangsmaterial Vogeleiweiß verwendet wird.

18. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß als lysozymhaltiges Ausgangsmaterial Milch vom Menschen oder von Säugetieren verwendet wird.

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2309U0

19. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß als lysozymhaltigea Ausgangsmaterial Blut vom Menschen oder von Säugetieren verwendet wird..

20. Verfahren nach Anspruoh 10, dadurch gekennzeichnet, daß als lysozymhaltiges Ausgangsmaterial Pflanzen verwendet werden.

21. Desaminopolyhydroxy chitin , dessen Molekularketten eine antiparallele räumliche Orientierung haben.

2Ί. Chitin nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch die Behandlung von Tintenfisch-Chitin mit einer ausreichenden Menge Salpetersäure zur Umwandlung der ursprünglich vorhandenen Aminogruppen in Hydroxygruppen.

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