DE102006009833A1

DE102006009833A1 - Verfahren und Mikroskop zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben

Info

Publication number: DE102006009833A1
Application number: DE102006009833A
Authority: DE
Inventors: Marcus Dr. Dyba; Hilmar Dr. Gugel
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2006-03-01
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2026-03-02
Also published as: DE102006062823B4; US20090303474A1; DE102006009833B4; US7646481B2; US7903247B2; US20070268583A1

Abstract

Ein Verfahren und ein Mikroskop, insbesondere Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskop, zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe (1) eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand (Z1, A) in einen zweiten Zustand (Z2, B) überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände (Z1, A; 72, B) in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich (P) zunächst in den ersten Zustand (Z1, A) gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals (4) der zweite Zustand (Z2, B) induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs (P) räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, sind dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (4) derart bereitgestellt wird, dass sich in dem zu erfassenden Probenbereich (P) eine Stehwelle mit definierten Intensitäts-Nullstellen (5) ausbildet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mikroskop, insbesondere Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskop, zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in den ersten Zustand gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals der zweite Zustand induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden.
Verfahren und Mikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt. Grundsätzlich ist gemäß dem Abbe'schen Gesetz der räumlichen Auflösung abbildender optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische Grenze gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des verwendeten Lichts abhängt. Mit den hier in Rede stehenden Verfahren und Mikroskopen lassen sich allerdings räumliche Auflösungen erzielen, die über die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert sind.
Bei den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar sind, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um einen nicht fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals in räumlich begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluoreszenzmolekülen erzeugt. Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.
Entscheidend ist, dass der durch ein optisches Signal induzierte Übergang von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen gesättigt, d.h. vollständig, stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer Intensitätsnullstelle des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand (im Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A) erhalten bleibt. Eine Sättigung des Übergangs A → B durch das optische Signal führt in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu) vollständigen Transfer in den Zustand B. Je stärker der Prozess in die Sättigung getrieben wird, d.h. je mehr Energie durch das optische Signal in die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto kleiner wird der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen im fluoreszenzfähigen Zustand A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen" Zustand. In Abhängigkeit vom Sättigungsgrad in der unmittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten aufgrund der Beugungsgrenze möglichen Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich des Zustands A anschließend ausgelesen, z.B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal aus einem definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die Beugungsgrenze zulässt. Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht ein Bild mit einer Auflösung die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.
Verfahren, der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei Zuständen die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt wird, sind bspw. aus der DE 103 25 459 A1 und der DE 103 25 460 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe eines optischen Signals von einem Zustand A (fluoreszenzfähig) in einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang A → B die Sättigung erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden Intensitätsminimum des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt durch Verschiebung der Intensitätsminima des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung der interferierenden Strahlen bewirkt wird.
Bei den bekannten Verfahren ist nachteilig, dass das durch die interferierenden Strahlen erzeugte Interferenzmuster mit lokalen punktförmigen Intensitätsminima nur sehr schwierig über einen hinreichend langen Zeitraum in einem zur Erzielung höchster Auflösungen hinreichend stabilen Zustand gehalten werden kann. Dies gilt insbesondere beim Einsatz hochnumerischer Optiken. Diese können die sie passierenden Lichtstrahlen depolarisieren und unter Umständen auch Phasenverschiebungen zur Folge haben, was sich negativ auf das Interferenzmuster auswirken und im Extremfall sogar zu einer völligen Zerstörung der Interferenzstruktur führen kann.
Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie ein Mikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, wonach mit konstruktiv einfachen und kostengünstigen Mitteln eine hohe Auflösung erreicht ist, die auch beim Einsatz hochnumerischer Optiken über einen hinreichend langen Zeitraum stabil gehalten werden kann.
Die voranstehende Aufgabe ist durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet und weitergebildet, dass das optische Signal derart bereitgestellt wird, dass sich in dem zu erfassenden Probenbereich eine Stehwelle mit definierten Intensitäts-Nullstellen ausbildet.
Die voranstehende Aufgabe ist des Weiteren durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 20 gelöst. Danach ist das Mikroskop derart ausgestaltet und weitergebildet, dass das optische Signal derart bereitstellbar ist, dass sich in dem zu erfassenden Probenbereich eine Stehwelle mit definierten Intensitäts-Nullstellen ausbildet.
Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Mikroskop lassen sich in besonders vorteilhafter Weise in Verbindung mit sehr langlebigen oder zeitlich sogar dauerhaft stabilen ersten und zweiten Zuständen einsetzen. In diesem Fall kann für die Sättigung des Übergangs vom ersten in den zweiten Zustand ein vergleichsweise langer Zeitraum gewählt werden, innerhalb dessen die zur Sättigung notwendige Energie des optischen Signals eingestrahlt wird. Die lokalen Intensitäten zur Übergangssättigung können dadurch sehr gering gewählt werden. Vor allem kann die von einer Strahlquelle des optischen Signal zur Verfügung stehende Gesamtenergie auf großräumige Bereiche im Probenraum verteilt und mehrere Intensitätsnullstellen oder eine ausgedehnte Nullstelle erzeugt werden. Trotz der daraus resultierenden geringen lokalen Intensitäten in der Umgebung der Nullstelle(n) im Vergleich zur Auftragung des Gesamtsignals um nur eine punktförmige Nullstelle herum kann die Sättigung erreicht werden. Dazu muss das Signal nur genügend lange eingestrahlt werden, bis schließlich alle Moleküle in Umgebung der Nullstellen im zweiten Zustand sind. Dies ist ein entscheidender Unterschied zum Fall eines kurzlebigen Zustandes (z.B. im STED-Verfahren mit typischen Lebenszeit von ~ 1 ns für einen fluoreszenzfähigen Zustand A), wo die zur Sättigung notwendige Energie in so kurzer Zeit eingestrahlt werden muss (deutlich schneller als die Rate A → B), dass die Gesamtleistung der Strahlquelle nur für die Erzeugung einer (oder maximal einiger weniger) lokalen Nullstellen ausreicht. Es lässt sich für konkrete Systeme zeigen, dass im Falle stabiler Zustände (z.B. photochrome Farbstoffe) oder langlebiger Zustände (z.B. Transfer in das Tripletsystem beim GSD-Verfahren, GSD = Ground State Depletion = Grundzustandsentvölkerung) die Leistung preiswerter und kommerzieller Lasersysteme auf so große Bereiche verteilt werden kann, dass mehrere punktförmige Intensitäts-Nullstellen (>> 10) oder ganze Streifen verschwindender Intensität in der Probe erzeugt werden können, in deren unmittelbarer Umgebung nach wie vor die Sättigung erreicht werden kann. Dies ermöglicht eine parallelisierte Bildaufnahme, wenn die Probe mit der Vielzahl von Punkt-Nullstellen oder mit Nullstellen-Linien gleichzeitig abgerastert wird und die Signale gleichzeitig für jede Nullstelle getrennt von einem Detektor erfasst werden. Auf diese Weise lassen sich Mikroskope mit Auflösungen unterhalb der klassischen Beugungsgrenze konstruieren, deren Bildaufnahmegeschwindigkeit im Bereich STED basierten Verfahren liegt und im Vergleich zu Systemen mit einer einzigen lokalen Nullstelle deutlich erhöht ist.
Im Rahmen einer konkreten Ausführungsform, bei der die Probe durch ein Objektiv beleuchtet wird, ist vorgesehen, dass zur Erzeugung einer Stehwelle mindestens zwei kohärente Lichtstrahlen in die Pupille des Objektivs fokussiert werden. Dabei lassen sich beispielsweise Stehwellen in einer Richtung erzeugen, indem genau zwei kohärente Lichtstrahlen in die Pupille des Objektivs fokussiert werden. Eine Überlagerung der Stehwellen in zwei Richtungen kann erreicht werden, indem vier paarweise kohärente Lichtstrahlen in die Pupille des Objektivs fokussiert werden. Durch die Überlagerung bildet sich ein 2D-Gittermuster, wobei im Hinblick auf eine leichte Auswertbarkeit eine orthogonale Überlagerung der Stehwellen bevorzugt wird, so dass ein Schachbrettmuster entsteht.
Im Hinblick auf eine besonders einfache Konstruktion ist vorgesehen, dass die kohärenten Lichtstrahlen mit mindestens einer Linse in ein Zwischenbild der Eintrittspupille des Objektivs fokussiert werden.
Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform ist der Einsatz von Lichtleitfasern vorgesehen, über die die kohärenten Lichtstrahlen bereitgestellt werden. Im einfachsten Fall kann es sich dabei beispielsweise um Glasfasern handeln. Die kohärenten Lichtstrahlen lassen sich besonders einfach in die Eintritspupille des Objektivs fokussieren, wenn die Austrittsflächen der Lichtleitfasern beispielsweise in einem Zwischenbild der Eintrittspupille des Objektivs positioniert sind. In besonders vorteilhafter Weise werden polarisationserhaltende Lichtleitfasern eingesetzt, wobei die Vorteile einer derartigen Ausführung weiter unten im Detail erläutert werden.
Alternativ können die kohärenten Lichtstrahlen mittels eines im Strahlengang angeordneten vorzugsweise holographischen Gitters oder mittels eines im Strahlengang angeordneten vorzugsweise programmierbaren Phasenmodulators erzeugt werden. Zur Erzeugung von höchstauflösenden Bildern wird als Objektiv in idealer Weise eine hochnumerische Optik verwendet, die von vornherein kleinstmögliche Lichtstrukturen im Rahmen der Beugungsgrenze erzeugt. In Verbindung mit hochnumerischen Systemen lässt sich ein Maximum an Auflösung erreichen.
Im Rahmen einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform sind die kohärenten Lichtstrahlen nur in Tangentialrichtung der Pupille des Objektivs polarisiert. Durch diese Maßnahme können unerwünschte Veränderungen des Polarisationszustandes des Lichts verhindert werden, die auftreten können, wenn (linear) polarisiertes Licht durch eine Optik hoher numerischer Apertur fokussiert wird. Wenn x- und y-Richtungen die Ebene der Eintrittspupille und z die optische Achse definieren, so kann ein im Allgemeinen ursprünglich zum Beispiel in x-Richtung polarisierter Lichtstrahl nach Durchlaufen der Optik auch Polarisationskomponenten in y- und z-Richtung aufweisen. Dies gilt im Allgemeinen auch für Nullstellen einer Stehwelle im Fokusraum. Ein ursprünglich in x-Richtung polarisierter Lichtstrahl wird daher an den Positionen der Nullstellen der x-Komponente des Lichts unter Umständen Licht in y- und z-Richtung aufweisen. Dies hängt unter anderem von der Position, der relativen Phase und vom Polarisationszustand der in die Eintrittspupille fokussierten Lichtstrahlen ab. Mittels einer Polarisation der Lichtstrahlen ausschließlich in Tangentialrichtung der Pupille des Objektivs werden die Nullstellen der Stehwelle auch durch die beschriebenen Depolarisationseffekte hochnumerischer Objektive nicht oder nur unbedeutend beeinflusst, so dass die Nullstellen der Stehwellen auch beim Abrastern der Probe ständig erhalten bleiben.
Zum Abrastern des gesamten zu erfassenden Probenbereichs kann vorgesehen sein, dass die Intensitäts-Nullstellen der Stehwelle schrittweise verschoben werden. Eine derartige Verschiebung kann insbesondere durch Veränderungen der relativen Phasenlagen der einzelnen kohärenten Lichtstrahlen zueinander erreicht werden. In besonders einfach zu handhabender Weise können die Änderungen der relativen Phasen der einzelnen kohärenten Lichtstrahlen realisiert werden, indem die optische Weglänge in mindestens einem der kohärenten Lichtstrahlen verändert wird. Zum Nachweis des von der Probe ausgehenden Messsignals ist ein Detektor vorgesehen, der beispielsweise als CCD-Detektor, als EMCCD-Detektor oder als APD-Array (Avalanche Photodiode) ausgeführt ist. Der Auslesevorgang des Detektors ist in vorteilhafter Weise mit dem Rastervorgang synchronisiert, beispielsweise derart, dass der Detektor nach jedem Rasterschritt ausgelesen wird.
Zur Erzeugung der Lichtstrahlen können beispielsweise Laserlichtquellen eingesetzt werden. Alternativ ist der Einsatz von Weißlichtquellen denkbar, wobei in diesem Fall die Kohärenzlänge der Lichtquelle hinreichend kurz sein muss. Im Falle von Weißlichtquellen werden in vorteilhafter Weise verstellbare Retroreflektoren eingesetzt, mit denen ein Wellenlängenabgleich zwischen paarweise kohärenten Lichtstrahlen durchgeführt werden kann.
Im Hinblick auf ein hohes Maß an Flexibilität ist der Einsatz zusätzlicher Lichtquellen vorgesehen, deren Licht einerseits zum Rückschalten der Substanz aus dem zweiten Zustand in den ersten Zustand und/oder zum Auslesen der ersten Zuständen in den Strahlengang einkoppelbar ist. Im Gegensatz zu der punktförmigen Ausleuchtung, die bei dem optischen Signal zur Realisierung einer Stehwelle gewählt wird, werden die zusätzlichen Lichtquellen bevorzugt so eingesetzt, dass sie das Gesichtsfeld großräumig ausleuchten.
Im Rahmen konkreter Anwendungen, beispielsweise bei der Untersuchung lebender Zellen, die der Abbildung biologischer Vorgänge in der Nähe der Zellmembran dienen, kann das Auslesen der ersten Zustände im TIRF-Modus (Total Internal Reflectance Fluorescence) erfolgen. Dazu können die Stehwellen als evaneszente Felder ausgebildet werden, so dass aufgrund der in Folge von Totalreflexion begrenzten Eindringtiefe die Stehwelle nur in einer sehr dünnen Schicht der Probe wirksam ist. Auf diese Weise lassen sich Prozesse in der Nähe der Zellmembran lebender Zelle mit höchster räumlicher Auflösung visualisieren.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mikroskops zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Probe zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen der bevorzugten Ausführungsbeispiele anhand der Zeichnungen werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
1 in einer schematischen Darstellung ein zyklisches Beleuchtungsschema eines Verfahrens zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben,
2 in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops und
3 in einer schematischen Darstellung unterschiedliche Varianten der Fokussierung kohärenter Lichtstrahlen in die Eintrittspupille des Objektivs zusammen mit verschiedenen Polarisationszuständen und
4 in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel mit insgesamt vier paarweise kohärenten Lichtstrahlen.
1 zeigt schematisch einen zyklischen Beleuchtungsvorgang, wie er zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird. Gemäß 1a wird zunächst im gesamten zu erfassenden Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte Substanz, die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten Zustand Z2 überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. Im konkret dargestellten Ausführungsbeispiel handelt es bei dem ersten Zustand Z1 um einen fluoreszierenden Zustand A und bei dem zweiten Zustand Z2 um einen nicht fluoreszierenden Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten Substanz handelt es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um eine photochrome Substanz, deren Moleküle durch Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge, dem Schaltsignal 2, in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht werden. Dies geschieht in idealer Weise, indem die Probe 1 im gesamten Probenraum P durch Beleuchtung durch ein Objektiv 3 mit dem Schaltsignal 2 bestrahlt wird.
Im Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich somit in diesem Fall, es müssen lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 μs (teilweise auch ein wenig länger) berücksichtigt werden.
In einem nächsten Schritt – dargestellt in 1b – wird Licht einer anderen Wellenlänge, das sogenannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden Probenbereich P aufgebracht. Dies geschieht in Form einer Lichtstruktur mit definierten Intensitäts-Nullstellen 5. Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A → B in allen mit Licht des optischen Signals 4 beleuchteten Bereichen 6. Mit anderen Worten verbleiben lediglich in unmittelbarer Umgebung der Intensitäts-Nullstellen 5 eng definierte Bereiche der Substanz im Zustand A. Die verbleibenden Bereiche A₁, A₂, A₃, ... der Substanz in Zustand A können viel kleiner sein als die Dimensionen der Lichtstruktur des optischen Signals 4 selbst, d.h. konkret viel kleiner als beugungslimitierte Strukturen. Die Größe der im Zustand A verbleibenden Bereiche A₁, A₂, A₃, ... der Substanz hängt ganz maßgeblich von der Qualität der Intensitätsminima 5 und damit vom erreichten Sättigungsgrad des Übergangs A → B ab.
In 1c ist schematisch der Auslesevorgang des Zustands A dargestellt. Dazu wird ein optisches Testsignal 7 so in den zu erfassenden Probebereich P eingestrahlt, dass diejenigen gemäß 1b präparierten Bereiche, in denen die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst werden. Eventuell noch existierende Bereiche der Substanz im Zustand A, die außerhalb des zu erfassenden Probenbereichs P liegen, dürfen dabei nicht erfasst werden. Das von der Substanz im Zustand A ausgehende Fluoreszenzlicht wird als Messsignal 8 von einem Detektor (nicht gezeigt) erfasst, wobei eine eindeutige Zuordnung der detektierten Messsignale 8 zu den Einzelbereichen A₁, A₂, A₃, ... vorgenommen wird.
Der in den 1a bis c dargestellte Zyklus wird wiederholt, wobei das Stehwellenmuster bei jeder Wiederholung etwas weiter geschoben wird. Auf diese Weise lässt sich der gesamte zu erfassende Probenbereich mit einer Auflösung im Subdiffraktionsbereich abbilden.
2 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit einer Stehwelle 9 im Probenbereich P. Gemäß der Darstellung in 2a werden dazu zwei kohärente Lichtstrahlen 10, 11 mittels einer Linse 12 in ein Zwischenbild ZB der Eintrittspupille EP des Objektivs 13 fokussiert. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist einer der beiden kohärenten Lichtstrahlen 10 mit einer durchgezogenen Linie und der andere Lichtstrahl 11 mit einer gestrichelten Linie dargestellt. Mit anderen Worten ist in dem dargestellten Ausführungsbeispiel die Fokussierung der kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 so gewählt, dass im Zwischenbild ZB die Brennpunkte P1', P2' gebildet sind. Prinzipiell kann die Fokussierung nicht nur in das Zwischenbild ZB, sondern auch unmittelbar in das Bild oder in eine beliebige dazu konjugierte Ebene erfolgen. Über einen Strahlteiler 14 werden die beiden kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 in den Strahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Über das Scann-Okular 15 und die Tubuslinse 16 werden die beiden Strahlen 10, 11 in die Eintrittspupille EP abgebildet, so dass dort die beiden Brennpunkte P1, P2 entstehen.
Wie in 2a angedeutet, kann über den Strahlteiler 14 das Licht weiterer Lichtquellen eingekoppelt werden, bspw. das Schaltsignal 2 oder das Testsignal 7. Auch die Messsignale 8 können über den Strahlteiler 14 zu einem nicht gezeigten Detektor geführt werden.
Wie in 2b im Detail dargestellt, hat die beschriebene Fokussierung der beiden kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 in der Eintrittspupille EP des Objektivs 13 zur Folge, dass sich im Probenbereich P zwei ebene Wellen 17, 18 ausbilden. Durch Interferenz der beiden ebenen Wellen 17, 18 bildet sich in der Fokalebene FE die in 2b dargestellte Stehwelle 9 mit definierten Intensitäts-Nullstellen aus.
3 zeigt schematisch unterschiedliche Polarisationszustände der in die Pupillenebene PE fokussierten kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 sowie die daraus jeweils resultierenden Polarisationszustände der Stehwellen 9 im Probenbereich P. Wie bereits ausgeführt wird ein Rastern der Probe 1 durch ein Verschieben der Stehwelle 9 senkrecht zu ihrer Verlaufsrichtung dadurch erreicht, dass die relative Phase der beiden Lichtstrahlen 10, 11 in den Brennpunkten P1 und P2 variiert wird. In den 3a und b ist der Fall linear polarisierten Lichts in y-Richtung dargestellt, wobei die Punkte P1 und P2 in y-Richtung versetzt sind. 3c und d zeigen den Fall linear polarisierten Lichts in x-Richtung, wobei die Punkte P1 und P2 in y-Richtung versetzt sind. Dabei sind jeweils die gleichphasigen Fälle (3a und c), in denen die Wellenpakete im gleichen Takt schwingen, und die gegenphasigen Fälle (3b und d) dargestellt, in denen die Wellenpakete im Gegentakt schwingen. Die unterschiedlichen Polarisationszustände werden im Folgenden nur am Beispiel dieser beiden konkreten Phasenlagen beschrieben. Für ein kontinuierliches Verschieben der Intensitäts-Nullstellen der Stehwelle 9 in der Fokusebene FE müssen dagegen in diskreten Schritten auch weitere Phasenlagen dazwischen generiert werden.
Beim Durchlaufen der kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 durch stark fokussierende Objektive/Linsen 13 werden die Polarisationsrichtungen der Lichtwellen gekippt. Dies ist jeweils in den rechten Teilbildern der 3 dargestellt. Im Falle des in y-Richtung polarisierten Lichts (3a, b) entstehen Polarisationskomponenten in z-Richtung. Diese sind in dem in 3a gezeigten Fall gegenphasig, d.h. sie interferieren negativ, und es entsteht effektiv kein Licht mit z-Polarisation. Für Strahlen, die nicht auf der optischen Achse liegen, entsteht im Allgemeinen aber bereits hier eine z-Komponente. Das bedeutet, dass die Intensitäts-Nullstellen zwar bezüglich der ursprünglichen Polarisation (in y-Richtung) eine Nullstelle aufweisen, im Allgemeinen aber einen endlichen Anteil an z-polarisiertem Licht enthalten.
Deutlicher wird dies in dem in 3b dargestellten Fall. Hier führt das Kippen der Polarisationsvektoren und die gegenphasige Lage der kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 zu einer Depolarisation in z-Richtung, wobei die kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 in z-Richtung positiv interferieren und daher eine deutlich ausgeprägte z-Komponente haben. Diese ist umso stärker, je größer der Fokussierwinkel des Objektivs 13 ist. Da die Lichtstrahlen 10, 11 zur Erzeugung einer Stehwelle 9 mit engen Minima unter möglichst großem Winkel abgelenkt werden sollen, ist diese Anordnung unbrauchbar.
Zu bevorzugen ist eine Anordnung, wie sie in den 3c und d dargestellt ist. In diesen Fällen sind die Brennpunkte P1 und P2 in y-Richtung versetzt, und die Polarisation ist in x-Richtung gewählt. Beim Fokussieren – selbst mittels einer hochnumerischen Optik 13 – findet hier keine Depolarisation statt, d.h. auch im Fokusraum ist das Licht weiterhin in x-Richtung polarisiert. Eine Zerstörung der Intensitäts-Nullstellen der Stehwelle 9 durch andere Polarisationen findet nicht statt. Dies gilt für alle Phasenlagen und damit für eine beliebige Position der Nullstellen im Fokusraum. Demzufolge sind die in den 3c und d dargestellten Verhältnisse ganz besonders geeignet, als optisches Signal 4 für den gesättigten Übergang von dem ersten Zustand A in den zweiten Zustand B zu dienen. Entscheidend ist jedenfalls, dass in der Eintrittspupille EP nur Polarisationsvektoren mit reiner Tangentialkomponente auftreten und Radialkomponenten, die stark in z-Richtung depolarisieren, vermieden werden. Die Intensitäts-Nullstellen bleiben dann in allen Polarisationsrichtungen erhalten, auch wenn das Stehwellenmuster 9 beliebig durch die Probe 1 gerastert wird.
Für Lichtstrahlen, die nicht auf der optischen Achse liegen, sind die Verhältnisse demgegenüber etwas komplizierter. In diesen Fällen treten auch bei reiner Tangential-Polarisation leichte Depolarisationseffekte auf. Es lässt sich jedoch durch Rechnungen für realistische Verhältnisse zeigen, dass der Anteil des depolarisierten Lichts in derartigen Fällen bei einer Anordnung gemäß den 3c und d in der Größenordnung 10^–3 bis 10^–2 liegt, was ausreichend gering ist. Im Falle einer Anordnung gemäß der 3a und b liegt demgegenüber insbesondere der z-Anteil der Polarisation typischerweise in der gleichen Größenordnung wie die ursprüngliche Polarisation und ist teilweise sogar größer, wodurch die Nullstellen vollständig zerstört würden.
4 zeigt ein Ausführungsbeispiel mit insgesamt vier Lichtstrahlen, von denen jeweils zwei paarweise kohärent sind. Konkret gezeigt ist die Eintrittspupille EP mit den vier Brennpunkten P1 bis P4. Die Lichtstrahlen 19–22 weisen ausschließlich Polarisationsvektoren mit Tangentialkomponenten auf, was durch die dargestellten Pfeile angedeutet ist. Die beiden in x-Richtung versetzten Brennpunkte P1 und P3, d.h. die Lichtstrahlen 19 und 21, sind zueinander kohärent und weisen eine Polarisation in y-Richtung auf. Daraus resultiert ein 2D-Linienmuster in der Fokalebene FE mit gut erhaltenen Intensitäts-Nullstellen. Die beiden Lichtstrahlen 20 und 22 mit den Brennpunkten P2 und P4 sind ebenfalls zueinander kohärent und weisen eine Polarisation in x-Richtung auf, so dass das resultierende Linienmuster um 90° gedreht und in x-Richtung polarisiert ist. Dementsprechend interferieren die beiden resultierenden Linienmuster nicht miteinander, vielmehr kommt es zu einer einfachen Addition der Intensitätswerte. Das Resultat ist dementsprechend ein zweidimensionales Gittermuster mit periodisch auftretenden Intensitäts-Nullstellen. Diese können im Rahmen eines Probenscanns in x-Richtung verschoben werden, indem die relativen Phasen der kohärenten Lichtstrahlen 19, 21 mit den Brennpunkten P1 und P3 variiert werden. Eine Verschiebung der Nullstellen in y-Richtung ist durch Variation der relativen Phase der kohärenten Lichtstrahlen 20, 22 mit den Brennpunkten P2 und P4 möglich.
Hinsichtlich weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mikroskops wird zur Vermeidung von Wieder holungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

Claims

Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe (1) eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand (Z1, A) in einen zweiten Zustand (Z2, B) überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände (Z1, A; Z2, B) in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich (P) zunächst in den ersten Zustand (Z1, A) gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals (4) der zweite Zustand (Z2, B) induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs (P) räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (4) derart bereitgestellt wird, dass sich in dem zu erfassenden Probenbereich (P) eine Stehwelle mit definierten Intensitäts-Nullstellen (5) ausbildet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe (1) durch ein Objektiv (13) beleuchtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung einer Stehwelle (9) mindestens zwei kohärente Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) in die Pupille des Objektivs (13) fokussiert werden.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass mittels Fokussieren von zwei kohärenten Lichtstrahlen (10, 11) in die Pupille des Objektivs (13) Stehwellen (9) in einer Richtung erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass mittels Fokussieren von vier paarweise kohärenten Lichtstrahlen (19, 20, 21, 22) in die Pupille des Objektivs (13) Stehwellen in zwei Richtungen überlagert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stehwellen orthogonal zueinander überlagert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) mittels einer Laserlichtquelle erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) mittels einer Weißlichtquelle mit kurzer Kohärenzlänge erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) mit mindestens einer Linse (12) in ein Zwischenbild (ZB) der Eintrittspupille (EP) des Objektivs (13) fokussiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) mittels Lichtleitfasern, insbesondere Glasfasern, bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Austrittsflächen der Lichtleitfasern in einem Zwischenbild (ZB) der Eintrittspupille (EP) des Objektivs (13) positioniert werden.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtleitfasern polarisationserhaltend sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) mittels eines vorzugsweise holographischen Gitters im Strahlengang erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) mittels eines im Strahlengang angeordneten, vorzugsweise programmierbaren Phasenmodulators erzeugt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Objektiv (13) eine hochnumerische Optik eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) nur in Tangentialrichtung der Pupille des Objektivs (13) polarisiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitäts-Nullstellen (5) durch Veränderung der relativen Phasen der kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) zueinander verschoben werden.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass zur Änderung der relativen Phasen der kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) zueinander die optische Weglänge in mindestes einem der Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektor zum Nachweis des von der Probe (1) ausgehenden Messsignals (8) nach jedem Rasterschritt ausgelesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass Licht mindestens einer zusätzlichen Lichtquelle zum Rückschalten der Substanz aus dem zweiten Zustand (Z2, B) in den ersten Zustand (Z1, A) und/oder zum Auslesen der ersten Zustände (Z1, A) bereitgestellt wird.
Mikroskop, insbesondere Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskop, zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben und insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die zu untersuchende Probe (1) eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand (Z1, A) in einen zweiten Zustand (Z2, B) überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände (Z1, A; Z2, B) in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich (P) zunächst in den ersten Zustand (Z1, A) gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals (4) der zweite Zustand (Z2, B) induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs (P) räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Signal (4) derart bereitstellbar ist, dass sich in dem zu erfassenden Probenbereich (P) eine Stehwelle (9) mit definierten Intensitäts-Nullstellen (5) ausbildet.
Mikroskop nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei kohärente Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) in die Pupille des Mikroskopobjektivs (13) fokussierbar sind.
Mikroskop nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskopobjektiv (13) eine hohe numerische Apertur aufweist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungslichtquelle zur Erzeugung der kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) als Laserlichtquelle ausgeführt ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungslichtquelle zur Erzeugung der kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) als Weißlichtquelle mit kurzer Kohärenzlänge ausgeführt ist.
Mikroskop nach Anspruch 24, gekennzeichnet durch verstellbare Retroreflektoren zur Durchführung eines Weglängenabgleichs zwischen paarweise kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22).
Mikroskop nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass zum Fokussieren der kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) in ein Zwischenbild (ZB) der Eintrittspupille (EP) des Mikroskops (13) mindestens eine Linse (12) im Strahlengang angeordnet ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) über vorzugsweise polarisationserhaltende Lichtleitfasern bereitstellbar sind, wobei die Austrittsflächen der Lichtleitfasern in einem Zwischenbild (ZB) der Eintrittspupille (EP) des Mikroskopobjektivs (13) angeordnet sind.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung der kohärenten Lichtstrahlen (10, 11; 19, 20, 21, 22) ein vorzugsweise programmierbarer Phasenmodulator im Strahlengang angeordnet ist.
Mikroskop nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Phasenmodulator als Flüssigkeitskristall ausgeführt ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass Licht mindestens einer zusätzlichen Lichtquelle zum Rückschalten der Substanz aus dem zweiten Zustand (Z2, B) in den ersten Zustand (Z1, A) und/oder zum Auslesen der ersten Zustände (Z1, A) bereitstellbar ist.
Mikroskop nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzlichen Lichtquellen das Gesichtsfeld großräumig ausleuchten.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektor zum Nachweis eines von der Probe ausgehenden Messsignals (8) als CCD-Detektor, als EMCCD-Detektor oder als APD-Array ausgeführt ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslesen der ersten Zustände (Z1, A) im TIRF-Modus erfolgt, wobei die Stehwellen als evaneszente Felder ausgebildet werden.