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Die
Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit einem Anregungslichtstrahl
zum optischen Anregen eines ersten Probenbereichs, mit einem Stimulationslichtstrahl
zum Auslösen
einer stimulierten Emission in einem weiteren, zumindest teilweise
mit dem ersten Probenbereich überlappenden
Probenbereich, mit zumindest einem Objektiv zum Fokussieren des
Anregungslichtstrahls und des Stimulationslichtstrahls und mit einem
optischen Bauteil zur Beeinflussung der Form des Fokus des Anregungslichtstrahls
und/oder des Stimulationslichtstrahls.
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In
der Rastermikroskopie (Scanmikroskopie) wird eine Probe mit einem
Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions-
oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles
wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen
durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei
die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein
Spiegel in x- und
der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird
beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt.
Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichts wird in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet. Neben
diesen sogenannten strahlscannenden Methoden sind auch Scanmikroskope
mit räumlich
feststehendem Beleuchtungslichtstrahl bekannt, bei denen die Probe
zur Abtastung mit Hilfe eines Feinpositioniertisches verfahren wird.
Diese Scanmikroskope werden objektscannend genannt.
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Speziell
in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus
eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
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Ein
konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle,
eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog.
Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatenaufnahme
erzielt.
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Eine
Anordnung zur Steigerung des Auflösungsvermögens für Fluoreszenzanwendungen ist aus
der
DE 44 16 558 bekannt.
Hierbei werden die lateralen Randbereiche des Fokusvolumens des
Anregungslichtstrahls mit einem Lichtstrahl einer anderen Wellenlänge, dem
sog. Stimulationslichtstrahl, der von einem zweiten Laser emittiert
wird, beleuchtet, um dort die vom Licht des ersten Lasers angeregten Probenbereiche
stimuliert in den Grundzustand zurück zu bringen. Detektiert wird
dann nur das spontan emittierte Licht aus den nicht vom zweiten
Laser beleuchteten Bereichen, so dass insgesamt eine Auflösungsverbesserung
erreicht wird. Für
dieses Verfahren hat sich die Bezeichnung STED (Stimulated Emission
Depletion) eingebürgert.
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Aus
DE 100 12 462 A1 ist
eine Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts vorzugsweise bei
der konfokalen Fluoreszenzrastermikroskopie mit einem Beleuchtungsstrahlengang
einer Lichtquelle und mindestens einem weiteren Beleuchtungsstrahlengang
einer weiteren Lichtquelle, wobei die Beleuchtungsstrahlengänge zumindest
teilweise einander überlagerbar
sind, bekannt. Die Vorrichtung ist zur Vereinfachung der Justierung
sowie zur Reduktion der optischen Bauteile im Beleuchtungsstrahlengang dadurch
gekennzeichnet, dass mindestens in einem der Beleuchtungsstrahlengänge mindestens
ein optisches Bauteil angeordnet ist, wobei die optischen Eigenschaften
des Bauteils derart beeinflussbar bzw. veränderbar sind, dass sich das
Beleuchtungsmuster des Beleuchtungsstrahlengangs im Objektbereich
in seiner Form verändert.
Das optische Bauteil kann hierbei beispielsweise als runde Phasenverzögerungsplatte,
die in ihrem Durchmesser kleiner als der Strahldurchmesser ist und
folglich überleuchtet
wird, ausgebildet sein. Als Phasenverzögerungsplatte wird ein optisches
Bauteil bezeichnet, das eine ortsabhängige Phasenverzögerung des
die Phasenverzögerungsplatte
durchtretenden Lichts bewirkt. Die Phasenverzögerungsplatte ist im Strahlengang
des eine stimulierte Emission auslösenden Beleuchtungsstrahls
angeordnet und erzeugt bei geeigneter Struktur einen hohlen Fokus,
der eine Auflösungsverbesserung
sowohl lateral als auch axial ermöglicht. Eine bevorzugte Ausgestaltung
einer Phasenverzögerungsplatte
besteht aus einem Substrat, auf das lokal in bestimmten Bereichen
eine oder mehrere Schichten eines phasenverzögernd wirkenden Materials (beispielsweise
MgF
2) aufgebracht sind. Sind die Dicken
der Schichten und die Größen der Schichtbereiche
so gewählt,
dass die Hälfte
der gesamten Lichtamplitude in der Pupille der Mikroskopoptik eine
Phasenverzögerung
von λ/2
gegenüber der
anderen Hälfte
der Lichtamplitude besitzt, dann erzeugt die fokussierte Wellenfront
im Fokus der Mikroskopoptik (Objektiv) destruktive Interferenz.
Die resultierende PSF (Point Spread Function) besitzt somit ein
Minimum der Fokusmitte.
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Die
Verwendung von Phasenverzögerungsplatten
in der STED-Mikroskopie wird beispielsweise auch in den folgenden
Veröffentlichungen
erwähnt: Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 97, p. 8206-8210, 2000; Appl. Phys.
Lett., Vol. 82, No. 18, p. 3125-3127, 2003; Phys. Rev. Lett., Vol.
88, p. 163901-1 – 163901-4, 2002; Phys. Rev.
E, Vo1.64, p. 066613-1 – 066613-9,
2001.
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Anstelle
von herkömmlichen
Phasenverzögerungsplatten
können
auch LCDs oder programmierbare Lichtmodulatoren verwendet werden.
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Eine
Auflösungssteigerung
in Richtung der optischen Achse lässt sich, wie in der Europäischen Patentschrift
EP 0 491 289 mit dem Titel: „Doppelkonfokales
Rastermikroskop" beschrieben
ist, durch eine Doppelobjektivanordnung (4Pi-Anordnung) erreichen.
Das vom Beleuchtungssystem kommende Anregungslicht wird in zwei
Teilstrahlen aufgespalten, die die Probe einander entgegenlaufend
durch zwei spiegelsymmetrisch angeordnete Objektive gleichzeitig
beleuchten. Die beiden Objektive sind auf verschiedenen Seiten der
ihnen gemeinsamen Objektebene angeordnet. Im Objektpunkt bildet
sich durch diese interferometrische Beleuchtung ein Interferenzmuster
aus, das bei konstruktiver Interferenz ein Hauptmaximum und mehrere
Nebenmaxima aufweist. Interferiert nur das Licht der Anregung, spricht man
von 4Pi-Mikroskopie
des Typs A, bei gleichzeitiger Interferenz des Detektionslichts
von Typ C. Mit diesem doppelkonfokalen Rastermikroskop kann im Vergleich
zum konventionellen Rastermikroskop durch die interferometrische
Beleuchtung eine erhöhte
axiale Auflösung
erzielt werden.
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Durch
eine Kombination von STED und doppelkonfokaler Anordnung lässt sich
sowohl lateral, als auch axial eine Auflösungssteigerung erreichen.
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In
einer besonderen Kombination von einer STED- und einer doppelkonfokalen
Anordnung, dem STED-4Pi-Mikroskop, wird mit Hilfe einer doppelkonfokalen
Anordnung des Stimulationslichtstrahls eine destruktive Interferenz
in der Fokusmitte erzeugt. Eine stimulierte Abregung ist somit auf
den axialen Fokusrand beschränkt
(Phys. Rev. Lett., vol. 88, p. 163901-1 – 163901-4, 2002).
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Es
hat sich gezeigt, dass zur Erzielung eines bestmöglichen Auflösungsvermögens das
optische Bauteil vorzugsweise im Strahlengang des Stimulationslichtstrahles
sehr exakt positioniert und justiert werden muss. Nachteiligerweise
ist aufgrund dieses Umstandes nach jedem Objektivwechsel eine aufwendige
Nachjustierung und Anpassung des optischen Bauteils auf die baulichen
und optischen Eigenschaften des neuen Objektivs erforderlich.
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Es
ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Rastermikroskop
anzugeben, mit dem bei wesentlich reduziertem Justieraufwand der
theoretisch mögliche
Auflösungsgrad
erreichbar ist, und das gleichzeitig eine vereinfachte Anpassbarkeit
an wechselnde Untersuchungsbedingungen – beispielsweise Objektivwechsel – bietet.
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Die
Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass eine Optik zum Abbilden des optischen Bauteils in die
Pupille des Objektivs vorgesehen ist, wobei die Größe des Abbildes
des optischen Bauteils einstellbar ist.
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Die
Erfindung hat den Vorteil, dass zumindest eine Optik vorgesehen
ist, die das optische Bauteil in die Pupille des Objektivs abbildet,
wobei die Größe des Abbildes
des optischen Bauteils einstellbar ist.
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Erfindungsgemäß wurde
erkannt, dass zur Erzielung einer exakten Manipulation der Wellenfront des
Anregungslichtstrahls bzw. des Stimulationslichtstrahls das optische
Bauteil in der Pupille des Objektivs oder in einer dazu konjugierten
Ebene angeordnet sein muss. Vorzugsweise wirkt das optische Bauteil
ausschließlich
auf den Stimulationslichtstrahl und nicht auf den Anregungslichtstrahl.
Da der Stimulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl in der
Regel vor dem Objektiv, beispielsweise durch einen dichroitischen
Strahlteiler vereinigt werden, ist das optische Bauteil vorzugsweise
vor dem Strahlvereiniger im Strahlengang des Stimulationslichtstrahls
angeordnet.
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Als
optisches Bauteil ist beispielsweise eine Verzögerungsplatte, die als Phasenverzögerungsplatte
ausgeführt
ist, verwendbar. In der Praxis weisen Phasenverzögerungsplatten aufgrund von
Fertigungstoleranzen Abweichungen von der geometrischen Idealform
auf. Beispielsweise werden die Radien einer λ/2-Platte, wie sie in der bereits
erwähnten Veröffentlichung
(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 97, p. 8206-8210, 2000) verwendet
werden, nicht mit den nominellen Radien übereinstimmen. Um dennoch die gewünschte Wellenfront
in der Pupille zu erreichen, wird erfindungsgemäß die Größe des Abbildes des optischen
Bauteils in der Pupille angepasst.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltungsform weist die Optik, die das optische
Bauteil in die Pupille des Objektivs abbildet, verschiebbare Fokussiermittel,
wie beispielsweise Linsen oder Hohlspiegel, auf. In einer anderen
Variante ist das Bauteil selbst vorzugsweise entlang der optischen
Achse verschiebbar angeordnet. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsform
weist die Optik verschiebbare Fokussiermittel auf und das Bauteil
selbst kann vorzugsweise entlang der optischen Achse verschiebbar
angeordnet sein. Zum Verschieben der Optik bzw. des optischen Bauteils
ist vorteilhafterweise ein motorischer Antrieb vorgesehen. Das Verschieben
der Fokussiermittel und/oder des optischen Bauteils erfolgt vorzugsweise
derart, dass das Abbild des optischen Bauteils stets in der Pupille
des Objektivs verbleibt und dass der Anregungslichtstrahl bzw. der
Stimulationslichtstrahl das Objektiv als paralleles Lichtbündel beleuchtet.
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In
einer anderen bevorzugten Variante ist die Optik als vorzugsweise
motorisch einstellbare Variooptik ausgebildet. Diese kann einerseits
zum Justieren des Systems oder andererseits zur Anpassung der Größe des Abbildes
des optischen Bauteils auf verschiedene Pupillendurchmesser, beispielsweise unterschiedlicher
Objektive, verwendet werden.
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Die
Variooptik ist vorzugsweise so ausgestaltet, dass bei einer Veränderung
ihrer Brennweite der Brennpunkt, der sich auf dem in die Pupille
abzubildenden Bauteils gegenüberliegenden
Seite der Variooptik befindet, ortsfest bleibt. In einer ganz bevorzugten
Ausgestaltung der Variooptik bleiben bei einer Brennweitenveränderung
beide Brennpunkte der Variooptik ortsfest.
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Anstelle
der bereits erwähnten
Möglichkeiten zum
Einstellen der Größe des Abbildes
des optischen Bauteils kann auch vorgesehen sein, die Optik gegen
eine Optik mit anderen optischen Eigenschaften auszutauschen. Hierzu
ist vorzugsweise ein als Revolver oder Schiebeschlitten ausgebildetes
Vorratsmittel vorgesehen, in dem unterschiedliche Optiken bevorratet
sind, die vorzugsweise durch einfaches Drehen bzw. Schieben des
Vorratsmittels in den Strahlengang des Anregungs- bzw. Stimulationslichtstrahls
eingebracht werden können.
Vorzugsweise ist das Vorratsmittel motorisch angetrieben.
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In
einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsvariante erfolgt die
Einstellung der Größe des Abbildes
des optischen Bauteils automatisch. Vorzugsweise ist ein Mittel
zum automatischen Erkennen des in den Strahlengang eingebrachten
Objektivs vorgesehen, das es einem Steuerrechner ermöglicht,
die für
dieses Objektiv optimale, gegebenenfalls vorgespeicherte Einstellung
vorzunehmen. Vorzugsweise erfolgt die Einstellung der Größe des Abbildes
des optischen Bauteils in Abhängigkeit
vom Durchmesser der Pupille des gewählten Objektivs.
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In
einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante ist das
Rastermikroskop als konfokales oder als doppelkonfokales Rastermikroskop ausgebildet.
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Die
Pupillenebene ist eine Fournierebene zur Fokusebene des Objektivs
und die Optik erzeugt eine weitere Fourierebene, in der das optische
Bauteil angeordnet ist.????
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In
der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt
und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
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1 ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
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2 eine schematische Darstellung
der Abbildung des optischen Bauteils in die Pupille des Objektivs,
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1 zeigt ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
das als konfokales Rastermikroskop ausgebildet ist. Das Rastermikroskop
beinhaltet eine erste Lichtquelle 1, die einen Anregungslichtstrahl 3 zum
optischen Anregen eines ersten Probenbereichs einer Probe 5 emittiert.
Der Anregungslichtstrahl 3 wird mit der Optik 7 auf
die Beleuchtungslochblende 9 fokussiert, passiert diese
und wird anschließend von
der weiteren Optik 11 kollimiert. Das Rastermikroskop umfasst
eine weitere Lichtquelle 13, die einen Stimulationslichtstrahl 15 erzeugt,
der mit der Linse 17 auf die Stimulationslochblende 19 fokussiert
wird. Der durch die Stimulationslochblende 19 tretende Stimulationslichtstrahl 15 wird
von der weiteren Linse 21 kollimiert und durchläuft anschließend ein
optisches Bauteil 23 zur Beeinflussung der Form des Fokus
des Stimulationslichtstrahls 15. Das optische Bauteil 23 besteht
aus einem Substrat 25, auf das eine PhasenverzögerungsPlatte 27,
die als λ/2-
Platte ausgestaltet ist und die einen kleineren Durchmesser als
den Durchmesser des Stimulationslichtstrahls 15 aufweist,
angebracht ist. Eine Variooptik 29 fokussiert den durch
das optische Bauteil 23 tretende Stimulationslichtstrahl 15 zu
einem Fokus 31. Die Variooptik 29 ist so ausgestaltet,
dass der Ort des Fokus 31 konstant bleibt, so dass gegebenenfalls
nur das optische Bauteil nachjustiert werden muss. Die Variooptik 29 ist
bei diesem Rastermikroskop derart ausgebildet, dass die Lage ihrer
vorderen Brennebene, in der sich der Fokus 31 befindet,
und die Lage der hinteren Brennebene, in der das optische Bauteil
angeordnet ist, stets konstant bleiben, um ein Nachjustieren des
optischen Bauteils in axialer Richtung zu vermeiden. Der Anregungslichtstrahl 3 und
der Stimulationslichtstrahl 15 werden mit Hilfe eines dichroitischen
Strahlteilers 33 vereinigt und über den Hauptstrahlteiler 35 zu
einer Strahlablenkeinrichtung 37, die einen kardanisch
aufgehängten
Scanspiegel 39 beinhaltet, gelenkt. Die Strahlablenkeinrichtung 37 führt den
Anregungslichtstrahl 3 und den Stimulationslichtstrahl 15 gemeinsam
durch die Scanoptik 41, die Tubusoptik 43 und
durch das Objektiv 45 über bzw.
durch die Probe. Im Probenbereich überlappen die Fokusse des Anregungslichtstrahls
und des Stimulationslichtstrahls zur Erzielung des STED-Effektes
teilweise. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 47 gelangt
durch das Objektiv 45, die Tubusoptik 43, die
Scanoptik 41 und über
die Strahlablenkeinrichtung 37 zurück zum Hauptstrahlteiler 35, passiert
diesen und trifft nach Passieren der Detektionslochblende 49 auf
den als Photomultiplier 51 ausgebildeten Detektor 53.
Zum Fokussieren des Detektionslichts 47 auf die Detektionslochblende 49 ist
eine Fokussier-Optik 55 vorgesehen. Die zwischen dem optischen
Bauteil 23 und und dem Fokus 31 angeordnete Variooptik 29 und
die zwischen dem Fokus 31 und dem dichroitischen Strahlteiler 33 angeordnete Linse 57 bilden
gemeinsam mit der Scanoptik 41 und der Tubus-Optik 43 eine
Optik, die das optische Bauteil 23 in die Pupille 59 des
Objektivs 45 abbildet. Mit Hilfe der Variooptik 29 kann
die Größe des Abbildes des
optischen Bauteils eingestellt werden. Dem Fachmann ist hierbei
klar, dass im Normalbetrieb des Rastermikroskops in der Pupille 59 des
Objektivs 45 kein reales sichtbares Abbild des optischen
Bauteils existiert.
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2 illustriert, wie die aus
der Variooptik 29 der Linse 57, der Scanoptik 41 und
der Tubus-Optik 43 gebildete Optik das optische Bauteil
in die Pupille des Objektivs abbildet. Hierbei handelt es sich um eine
schematische Illustration eines Strahlenganges (durchgezogene Linien),
der im Normalbetrieb des Rastermikroskops nicht vorhanden ist. Vielmehr
handelt es sich um einen Fourier-Strahlengang, wie er beispielsweise
auch zur Illustration der Köhler'schen Beleuchtung
fachüblicherweise
eingezeichnet wird.
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Die
Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es
ist jedoch selbstverständlich,
dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- Anregungslichtstrahl
- 5
- Probe
- 7
- Optik
- 9
- Beleuchtungslochblende
- 11
- weitere
Optik
- 13
- weitere
Lichtquelle
- 15
- Stimulationslichtstrahl
- 17
- Linse
- 19
- Stimulationslochblende
- 21
- Linse
- 23
- optisches
Bauteil
- 25
- Substrat
- 27
- Phasenverzögerungsplatte
- 29
- Variooptik
- 31
- Fokus
- 33
- Strahlteilers
- 35
- Hauptstrahlteiler
- 37
- Strahlablenkeinrichtung
- 39
- Scanspiegel
- 41
- Scanoptik
- 43
- Tubusoptik
- 45
- Objektiv
- 47
- Detektionslicht
- 49
- Detektionslochblende
- 51
- Photomultiplier
- 53
- Detektor
- 55
- Fokussieroptik
- 57
- Linse
- 59
- Pupille