WO2020114930A1 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis von fluoreszenzsignalen in einer dreidimensionalen region einer probe - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum nachweis von fluoreszenzsignalen in einer dreidimensionalen region einer probe Download PDF

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WO2020114930A1
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Thomas Kalkbrenner
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Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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    • G02B5/3083—Birefringent or phase retarding elements

Definitions

  • the invention relates to a detection method of light signals, in particular in a biological sample.
  • Microscopy methods such as, for example, PALM (photoactivated localization microscopy), STORM (stochastic optical reconstruction microscopy), or dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy).
  • Molecules provided with fluorescent markers are localized by successively activating and / or exciting these fluorescent markers (henceforth also referred to briefly as markers).
  • the excited markers emit one
  • Fluorescence radiation that can be detected and the position of the marker in question can be located.
  • the sequential or successive activation and / or excitation of individual markers can also be seen as a process of isolation, in which fluorescence signals of individual molecules can be recorded, even if they are below the resolution limit to one another.
  • Localizing subsets of e.g. B. markers coupled to antibodies This means that the fluorophores and thus also the antibodies can be quantified with sensitivity on the level of individual molecules.
  • Samples mostly have a 3D structure and this 3D structure generally means that it can only be captured in its entirety by stack of focuses. For this purpose, a large number of individual images must be recorded for each level of the focus stack in order to be able to record the molecules to be quantified with the desired accuracy.
  • the photoswitchable markers can only be captured in the focal plane or depth of field of the microscope objective.
  • the markers are spatially present in the biological samples and are also partially activated and / or bleached above and below a current focus level. For example, markers which have bleached prematurely are no longer recorded if the data is recorded in the focus plane in which the marker in question actually exists.
  • Illumination beam path 2 (see FIGS. 3 to 8) illuminating radiation directed onto a sample 7 by means of an objective 5 through a sample carrier 6.
  • the sample 7 is a cell modified with photoswitchable markers 8.
  • the markers are 8 for example bound to antigens 9 (not shown) which are located on the cell membrane of sample 7.
  • the focal plane set in each case by means of the objective 5 has a small extent in the direction of the Z axis due to optical and technical framework conditions, which is also referred to as DOF (depht of focus) and is exemplified by a double arrow.
  • This focal plane corresponds nominally to the depth of field of the objective 5.
  • the excited and fluorescent radiation present in the respective focal plane DOF are recorded as
  • Marker 8 emitting detection radiation by means of a detector 13,
  • a tube lens 10 may be present.
  • the stack of images is obtained by moving the focal plane DOF in the direction of the Z-axis Z (Z direction), for example by moving the objective 5 (or the sample carrier 6, not shown), and capturing images at suitable intervals of the focal planes DOF.
  • the different focal levels DOF and positions of the focal planes DOF are obtained by moving the focal plane DOF in the direction of the Z-axis Z (Z direction), for example by moving the objective 5 (or the sample carrier 6, not shown), and capturing images at suitable intervals of the focal planes DOF.
  • the point image washing function PSF in the direction of the Z axis Z is shown schematically.
  • the invention is based on the object of proposing a possibility for determining a number of fluorescence signals in a three-dimensional region of a sample, with which the disadvantages of the prior art are reduced.
  • the detection method of fluorescence signals in a three-dimensional region of a sample includes capturing image data of the three-dimensional region using an optical device, the image data being imaged and captured in a two-dimensional image plane.
  • the number of fluorescence signals in the image plane is determined, assigned to the region of the sample and stored. The numbers assigned and stored in this way are made available for retrieval.
  • the fluorescence signals are detected by enlarging the extent of a focal plane in the direction of the optical axis of the optical device, in particular in the direction of a detection axis of the optical device, and forming a focus area.
  • a focal plane is the nominal depth of field of a lens used.
  • An increased depth of field can be composed of several focal planes or of several focal areas, one focal area already representing an increased depth of field compared to the original depth of field of the objective.
  • Fluorescence signals in a given 3D volume of the sample, e.g. B. a cell, on at least one detector.
  • the volume to be imaged in the Z direction is recorded using suitable EDOF optics. It has been recognized that a significant improvement in the quantitative detection accuracy is achieved if the advantage of the three-dimensional resolution of the captured image data and
  • Fluorescence signals is dispensed with. This achieves a technical improvement in one area, the counting of signals, by taking measures in another area, high-resolution acquisition.
  • the information about the position of a marker emitting a fluorescence signal in the direction of the Z axis is deliberately abandoned.
  • the precision of the lateral localization can also be reduced, since no structural high resolution should be achieved with the method according to the invention.
  • the invention therefore does not concern the acquisition of structural information below the diffraction limit (“super resolution”), but rather a highly sensitive counting of fluorescence signals. Any additional super-resolved 2D location information can of course still be used, for example, to research antibody distributions on cell membranes in more detail.
  • the detection of the fluorescence signals using the EDOF approach or EDOF method described here is based on known display methods, for example the maximum intensity projection (maximum intensity projection;
  • Phase gradient methods occur negative image values (pixel values) for whose
  • Antigens can be detected on biological surfaces.
  • Detection methods include incubating the biological surface with at least one antibody that binds to the antigen to be detected and that is provided with a marker.
  • the marker is for the emission of light signals, for example to emit excited fluorescence radiation and therefore from
  • Fluorescence signals suitable.
  • a biological surface incubated with such a labeled antibody is used.
  • the antibodies, which are preferably bound to an antigen, are used to emit light signals,
  • Carbohydrates, lipids, DNA molecules, saccharides and heavy metals understood that can specifically bind the antibodies.
  • a specific binding takes place to epitopes of the antigens, whereby an antigen can have several epitopes.
  • the captured image data are evaluated with regard to the presence of captured fluorescence signals and a number of the captured light signals is determined, stored and made available.
  • photoswitchable molecules can be used as markers. While capturing the
  • Fluorescence signals are excited a subset of the number of markers for the emission of light signals (fluorescence signals) per period. The emitted
  • Light signals are recorded in a time series.
  • the number of such markers that are spatially very close to one another or that lie one behind the other in the direction of the Z axis and would otherwise be imaged in a common point of the image plane can also be recorded.
  • the markers are created by capturing them in a time series with regard to the
  • the origin of a respective fluorescence signal is carried out as a function of the marker or markers used.
  • the point spread function (PSF) modified by the EDOF method is taken into account and taken into account when evaluating the image data.
  • the markers used can be dyes in the sense of WO 2006/127 692 A2 (PTOL, phototransformable optical labels). examples for this are
  • photoconvertible or photoswitchable fluorescent proteins such as Dronpa, EOS etc. as well as their derivatives.
  • Synthetic dyes such as Alexa 647 can also be used as markers, which can be brought into long-lived dark states by light and / or (chemical) modification of the environmental conditions.
  • Cage dyes such as caged Rhodamine can also be used (Grimm, Jonathan B., et al .; 2013: Carbofluoresceins and carborhodamines as scaffolds for high-contrast fluorogenic probes; ACS Chemical biology; 8.6:
  • the detection method according to the invention can be used to detect several different markers or several antigens provided with different markers.
  • the increased depth of field and / or further optical parameters can be adjusted depending on the particular sample.
  • the increased depth of field and / or further optical parameters can be adjusted depending on the particular sample. In one possible embodiment, the increased
  • Depth of field can be set yourself.
  • at least two focal planes can be created. If at least two of the focal planes overlap or adjoin each other, at least one focal area with an increased depth of field can also be generated in this way. In the sense of this description, there is also an increased depth of field if two or more focus areas are generated which do not overlap in the direction of the detection axis (Z direction) but which sharply image a region which is larger overall than the original depth of field in the direction of the detection axis.
  • an increased depth of field can be generated by generating at least two focal planes with an original depth of field or at least two focal areas with an increased depth of field or at least one focal plane with an original depth of field and at least one focal area with an increased depth of field.
  • Such images which are also referred to as bifocal or multifocal images, can, for example, be set so that only a lower and an upper cell membrane of the sample are detected at the same time by means of a bifocal image.
  • the advantage is a reduction of the image data to those of interest
  • ROI Areas of the sample (region of interest; ROI).
  • Fluorescence photons used more efficiently.
  • the entire volume of the sample can be recorded, for example, using multifocal imaging. Subsequent is an independent evaluation of the individual focus levels respectively
  • double detection of fluorescence signals must be avoided. This can be done, for example, by comparing the detected signals in the different areas of the detector. If a signal from a marker or labeled antibody is detected in different areas of the detector, this is counted only once. Such double acquisitions of the same signal can be detected, for example, by comparing and evaluating the location coordinates in the detector areas. A correlation of the detected signals of the picture elements or pixels of the detector can also be carried out before an evaluation.
  • the sample can be illuminated with a light sheet. This can be created in a thickness that corresponds to an EDOF range.
  • the EDOF function can be generated using an axicon. In such a case, a Bessel function can be selected, which results in a Bessel PSF.
  • the localization step is preceded by the detection of the fluorescence signals, in particular in the form of “spots” in the detector frame (raw data). To do this
  • Threshold values exceeding at least one pixel are assigned to the respective pixel with a fixed radius.
  • a radius can be defined, for example, as a 2.5 * PSF width of the FWHM (full width at half maximum).
  • the pixel and radius data are then included in the localization step.
  • the radius can be chosen larger when carrying out the method according to the invention, since the PSF, despite EDOF, is dependent on the Z direction and can be larger in this direction.
  • the radius can also be adjusted for each intensity peak, e.g. B. the radial drop in intensity in the detector plane is analyzed via the neighboring pixels.
  • a multi-emitter algorithm can be used for localization, as described, for example, in Holden et al.,
  • DAOSTORM an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nature methods 8.4: 279).
  • the method configurations according to the invention can be supplemented by determining, for example, the size of the cell using a non-fluorescent contrast method.
  • Parameters of the cell and its scope can be used as a reference value, with respect to which, for example, the determined number of markers or antigens is specified.
  • the number per unit of length can also be used
  • Cell size can be determined, saved and / or specified.
  • the extent and / or contour of a cell can be determined, for example.
  • Non-fluorescent contrast methods are, for example, DIC (differential interference contrast), transmitted light contrast, phase contrast or the use of oblique illumination (angular illumination microscopy).
  • the densities of the emitters that is to say the markers or the marked antigens, can be set in advantageous configurations, taking into account the selected projection and the PSF used.
  • system PSF is understood in particular to mean a measured PSF which, in contrast to a theoretical PSF, contains the actual properties of the optical system (aberrations, etc.).
  • the system PSF thus corresponds to the EDOF PSF of the optical system.
  • the object is further achieved with a device for the detection of
  • the device has one
  • Detection beam path There is a along the detection beam path
  • the original depth of field is understood to mean the nominal depth of field of the lens, as it would be available and usable without the EDOF approach described below.
  • a device according to the invention also has an optical element in the
  • Detection beam path This has such an optical effect that an increased depth of field compared to the original depth of field is generated by means of the optical element. This increase in the depth of field is achieved by extending the focus (extension of focus) in the direction of the detection axis.
  • the optical element is preferably in a pupil of the
  • the device has a detector for detecting individual image data
  • Fluorescence events / signals wherein the detection of the fluorescence signals (also briefly: signals) takes place in a two-dimensional and / or temporally resolved manner
  • an evaluation unit in which the image data read from the detector are evaluated and a number of the fluorescence signals are determined, assigned to an image region and
  • the device according to the invention which can be used in particular for carrying out the detection methods according to the invention, is essentially based on a microscope setup for fluorescence wide-field microscopy with laser-based excitation, as is known, for example, in the PALM, STORM and dSTORM methods.
  • the additional EDOF function is in
  • the optical element can be a phase mask.
  • a phase mask can be static and e.g. B. be prepared lithographically.
  • the device can be dynamic and can be implemented by spatial light modulators (SLM), this being possible either in transmission or in reflection.
  • SLM spatial light modulators
  • Phase mask advantageously reduces the necessary control steps, while a dynamic phase mask advantageously gives the device greater flexibility.
  • an axicon or an axicon phase mask can be arranged as an optical element in the detection beam path.
  • the detection radiation is converted into a Bessel beam by the action of such an optical element.
  • the advantage of the Bessel beam for the present problem lies in its high depth of field, simple generation, a defined Bessel PSF and a large EDOF range.
  • a disadvantage of its extensive ring system is that a lot of energy or many of the fluorescence photons go into this ring system, so localization is not available or is only available to a limited extent.
  • phase mask can be used, for example, a ring phase mask.
  • the phase mask can optionally be subjected to a so-called phase wrapping) and can thus be implemented, for example, with a spatial light modulator.
  • Phase wrapping is understood to mean the generation of a phase distribution, which must be generated, for example, by means of the spatial light modulator in order to bring about a desired phase distribution in the result.
  • a spatial light modulator can usually implement a phase shift of 0 to 2p (2Pi)
  • a number of local phase shifts up to 2p are generated to generate large phase shifts of N * 2p.
  • a desired phase distribution with phase strokes of, for example, N * 2p is set as a result.
  • an axicon with a phase shift of N * 2p can be implemented as a phase function.
  • a cubic phase mask is arranged in the detection beam path as the optical element. This can be symmetrical or asymmetrical.
  • phase mask can either be in the objective pupil or in another, by means of an intermediate image
  • phase mask Excitation radiation is not affected by the phase mask. If the optical element is realized by a ring phase mask, so-called phase rings can be brought about as optical effects. If the phase rings are binary and they have a phase jump of p / 2 between the phase rings, the resulting point spread function (PSF) has two maxima. Such a phase mask and PSF can, for example, for a targeted detection of z. B. upper and lower cell membrane or other different areas of the sample can be used.
  • the shape of the maxima can be influenced by further ring elements. For example, phase delays between 0 and p / 2 to one
  • Detection beam path is arranged.
  • Detection beam path uses the fact that the signals of the markers are isotropically polarized on average.
  • the birefringent element points to orthogonal
  • Polarizations have different refractive indices and thus different optical path lengths. This results in bifocal imaging for the isotropically polarized fluorescence radiation.
  • the two focus areas can also merge and form a coherent EDOF area.
  • the birefringent element does not take up the entire cross section of the beam path. In such a case, a third image plane results, for example. H. a third focus area in the sense of a third depth of field is generated along the detection axis.
  • phase masks can also be iteratively determined and represented algorithmically.
  • a quality function can be defined that describes the desired EDOF property of the PSF, e.g. Length of the PSF, width (x / y)
  • a start phase function is then specified, which is changed iteratively and the changes are only adopted if the quality function increases. In this way, the quality function can be maximized iteratively.
  • the iterative change can be done stochastically ("random walk").
  • IFTA Inverse Fourier Transform Algorithm
  • Gerchberg-Saxton algorithm Gerchberg, RW and Saxton (1972): A practical algorithm for the determination of the phase from image and diffraction plane pictures; Optik 35: 237- 46). In the present case, this must be expanded to 3D (e.g. Whyte, G. and Courtial, J. (2005): Experimental demonstration of holographic three-dimensional light shaping using a Gerchberg-Saxton
  • a target function is also specified here, in this case the desired EDOF-PSF intensity distribution, and this is then iteratively approximated by the IFTA algorithm. With such iterative algorithms, the target EDOF behavior can be set appropriately and the resulting phase mask can then be produced for the present optical system.
  • phase-shaping element such as an SLM (spatial light modulator) or a deformable mirror
  • SLM spatial light modulator
  • deformable mirror a variable, phase-shaping element
  • iterative optimizations also between individual experiments, e.g. B. for different sample classes.
  • the device according to the invention can have at least one adaptive optical element in the detection beam path.
  • optical elements are in particular a variable lens, an adaptive,
  • the adaptive mirrors are used in reflection.
  • a liquid lens is used as a variable lens for the dynamic EDOF approach, this can be one in the infinity space, for example
  • Variable lenses are often configured so that they have no or only a very small amount in an uncontrolled state
  • a static correction lens can therefore optionally be present.
  • a so-called dynamic EDOF method can be carried out by means of such an embodiment with an adaptive optical element.
  • a quick focus shift can be effected, such a focus shift occurring within a detection period of the detector, for example within a camera exposure time.
  • the functionality of the EDOF process can be flexibly adapted to the sample.
  • the increased depth of field can be adapted to an average extension of the cells to be examined in the direction of the detection axis (Z direction).
  • Focus shift also targeted z. B. on the upper and lower cell membrane instead of continuously running through the entire volume.
  • the lower cell membrane is, for example, the cell membrane coming from the objective that is first virtually penetrated by the detection axis.
  • the upper is accordingly
  • Sample positions are used that are not of interest.
  • the respective positions of the cell membranes of a sample can vary in the direction of the detection axis. It is therefore advantageous if a bifocal or multifocal image is combined with another EDOF method or can optionally be combined with one. In this way, a two-stage effect is achieved: with the bi- or multifocal imaging of the detection radiation, roughly two areas of the sample to be imaged are predefined (e.g. upper and lower cell membrane). Using the additional EDOF method (e.g. using a cubic phase mask as an optical element), all molecules within the respective rough range are then detected. The two rough Areas are expediently mapped to separate detector areas or detectors.
  • the detection radiation coming from a plurality of focal planes or focal areas can be divided, for example, by means of a suitable image splitter device, through the effect of which several focal planes or focal areas are simultaneously imaged on a correspondingly large number of sub-areas of a detector and / or on a plurality of detectors.
  • image splitter devices are arrangements with a second detector at a slightly different distance from a first detector (e.g.
  • Focus stacks can be adjusted to the extent in the Z direction of the sample.
  • the focal planes are adjusted so that they capture the upper and lower cell membranes.
  • the (additional) EDOF element around the focus planes then increases the corresponding
  • the optical element causes both
  • the device according to the invention can advantageously be used to determine a number of signals, in particular fluorescence signals, of a biological cell, a region of a biological cell or a biological structure. It can also be used in a method for the detection of fluorescence-labeled biological cells, biological structures and for the detection of labeled antibodies and of the binding of labeled antibodies to antigens.
  • Fig. 1 is a schematic representation of a detection method using a
  • optical device and a focal plane corresponding to one original depth of field of a lens according to the prior art
  • Fig. 2 is a schematic representation of an inventive
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of a second exemplary embodiment of a device according to the invention.
  • FIG. 4 shows a schematic illustration of a third exemplary embodiment of a device according to the invention.
  • FIG. 5 shows a schematic illustration of a fourth exemplary embodiment of a device according to the invention.
  • FIG. 6 shows a schematic illustration of a fifth exemplary embodiment of a device according to the invention.
  • FIG. 7 shows a schematic illustration of a sixth exemplary embodiment of a device according to the invention.
  • FIG. 8 shows a schematic illustration of a seventh exemplary embodiment of a device according to the invention.
  • FIG. 9 shows a schematic representation of a phase distribution in a pupil of a
  • Detection beam path through the action of a symmetrical cubic phase mask in each case as a) simplified black and white sketch, b) as a grayscale image and c) a simplified representation of the associated point spread function (point spread function);
  • Fig. 10 is a schematic representation of a phase distribution in a pupil of a
  • Detection beam path through the action of an axicon in each case as a) simplified black and white sketch, b) as a grayscale image and c) a simplified representation of the associated point spread function (point spread function);
  • Fig. 11 is a schematic representation of a phase distribution in a pupil of a
  • Detection beam path without the effect of an optical element a) simplified black and white sketch, b) as a grayscale image and c) a simplified representation of the associated point spread function (point spread function);
  • Fig. 12 is a schematic representation a) of a phase distribution of a first
  • Ring phase mask in a pupil plane of a detection beam path and b) a greatly simplified representation of an associated simulated point spread function (point spread function);
  • Fig. 13 is a schematic representation a) of a phase distribution of a second
  • Ring phase mask in a pupil plane of a detection beam path and b) a greatly simplified representation of an associated simulated point spread function (point spread function);
  • Embodiments of the method according to the invention are shown schematically.
  • the same reference numerals designate the same technical elements.
  • FIG. 2 The principle of the invention is shown in FIG. 2 and contrasted with the prior art illustrated in FIG. 1.
  • the detection beam path 3 one
  • An optical element 14 is arranged through the effect of which the depth of field of the objective 5 is increased.
  • the point image washing function PSF (also: point image transfer function) is stretched in the direction of the Z axis Z.
  • this increased depth of field EDOF (illustrated with a double arrow) enables the detection of the entire sample 7 in the direction of the Z axis Z with only a single focus position of the objective 5. Accordingly, all markers 8 bound to the sample 7 can be detected by detecting their respective ( Fluorescence) signals 12 are imaged simultaneously by means of the detector 13. The information about the position of the origin (marker 8) of a respectively detected signal 12 in the direction of the Z axis Z is lost. It is only possible to locate a marker 8 in the detection plane along the X and Y axes.
  • FIG. 3 A first exemplary embodiment of a device according to the invention is shown in FIG. 3 as part of a microscope 1 (not shown in more detail).
  • Illumination radiation is generated and provided in a laser light source 16.
  • the illuminating radiation passes along the illuminating radiation path 2, in which there are optical lenses 17, via a beam splitter 18 in reflection to the objective 5.
  • An optical is in or near a Fourier plane of the objective 5
  • Element 14 arranged in the form of a phase element.
  • a point is transformed into a plane wave and vice versa a plane wave is transformed into a point.
  • the phase element present in each case has the same effect on all object points, it should be in the Fourier plane or be arranged as close as possible to a Fourier plane.
  • the illuminating radiation causes a detection radiation 4 in the sample 7 which is directed along the detection beam path 3
  • Beam splitter 18 hits.
  • the detection radiation 4 differs in its optical
  • the detection radiation 4 is formed by radiation of at least two wavelengths, these can be separated from one another and detected separately. In the exemplary embodiment shown, such a separation takes place by means of a further beam splitter 18 which is transparent for one wavelength and for one other wavelength is reflective. Detection radiation 4 divided in this way reaches detector 13 or a further detector 20 along partial beam paths.
  • the detectors 13 and 20 are connected to an evaluation unit 23, by means of which the detected signals 12 are processed and evaluated as image data.
  • a control unit 24 is also present, by means of which control commands for
  • Control of, for example, the laser light source 16, the optical element 14, the tube lens 11 and / or the optical lenses 17 can be generated and output.
  • the image data and information on generated control commands and / or on the current configuration of the device can be shown on a display 25.
  • the arrangement of the optical element 14 in a plane conjugate to the pupil (Fourier plane) can be selected so that the illuminating radiation does not pass through the optical element 14.
  • the illumination beam path 2 and the detection beam path 3 or the illumination radiation and the detection radiation 4 are separated from one another by means of a beam splitter 18.
  • the detection radiation 4 is directed onto the optical element 14 and the detector 13 by means of a mirror 19.
  • FIG. 5 Another possible exemplary embodiment of a device according to the invention (FIG. 5) is suitable for achieving an increased depth of field EDOF by means of a rapid displacement of the respective focus plane DOF.
  • lenses 17.1 and 17.2 can also represent more complex imaging optics.
  • a varifocal lens 21 is present between the lenses 17.1 and 17.2, by means of which a displacement of a current one
  • the varifocal lens 21 can additionally have a compensation lens 21.1, as is shown schematically in FIG. 5.
  • the varifocal lens 21 can be controlled by means of the control unit 24. In particular, control can take place so quickly that at least two current focus planes DOF are set within a detection period of the detector 13 and a resulting increased depth of field EDOF is thus generated.
  • the detection radiation 4 is recorded with the (resulting) increased depth of field EDOF.
  • an axicon is arranged as an optical element 14 in the detection beam path 3 (FIG. 6).
  • the optical element 14 is arranged near the lens 17.1, which in turn
  • a further possible embodiment of the device according to the invention enables the increased depth of field EDOF to be generated dynamically using an adaptive mirror or a microlens array as the optical element 14 (FIG. 7).
  • the lenses 17.1 and 17.2 in the detection beam path 3 form a first intermediate image on the detector 13.
  • the optical is in a pupil 15 (pupil plane)
  • Element 14 present.
  • Depth of field EDOF is illustrated in FIG. 8.
  • the lenses 17.1 and 17.2 image the intermediate image on the detector 13 and at the same time create a further conjugate pupil 15.
  • the optical element 14 is arranged in this.
  • a so-called relay optic is provided by the lenses 17.1 and 17.2.
  • the detection radiation 4 is different from one another
  • Focus planes each with a depth of field DOF recorded, with an increased depth of field due to the action of the optical element 14 around each of the focus planes
  • EDOF 1 or EDOF2 is generated, as is shown schematically in the enlarged partial view.
  • the increased depth of field EDOF 1 allows the imaging of signals 12 from markers 8, antigens 9 linked to labeled antibodies 10 and / or labeled antibodies 10 of the upper ones
  • An image splitter unit 26 is also arranged in the detection beam path 3. By means of this, the proportions of the detection radiation 4 are different
  • Phase masks are made. Phase distributions in a pupil of a
  • FIGS. 9 to 11 Detection beam path through the action of different phase masks are shown in FIGS. 9 to 11.
  • Each of the partial figures 9a, 10a and 11a are a simplified black and white sketch of the one in FIGS. 9b, 10b and 11b
  • grayscale images with corresponding phase distributions in an x-y plane 9c, 10c and 11c, respectively, illustrate the simplified point image washing functions PSF as a section in an x-z plane.
  • 9a to 9c show the sketch, the grayscale image and the PSF of a symmetrical cubic phase mask.
  • 10a to 10c show the corresponding phase distributions and the PSF of an axicon.
  • Detection beam path 3 are shown by way of example in FIGS. 11 a to 11 c.
  • Figs. 12 to 14 Dot image blurring functions are shown in Figs. 12 to 14. 12a, 13a and 14a is schematically one generated in each case Ring phase mask shown. The associated point image washing functions PSF are shown in simplified form in FIGS. 12b to 14b.
  • the 12 relates to a ring phase mask with a phase shift of p between the differently hatched areas.
  • the resulting PSF shows two separate maxima in the direction of the Z axis Z.
  • the associated point image washing function PSF is pulled apart in the direction of the Z axis Z.
  • Ring phase masks with more than the areas shown and phase jumps allow additional maxima and thus focus levels DOF and / or increased
  • the dot image washing function PSF can be adapted to the sample 7 to be imaged and / or the intended aim of the image.
  • a sample 7 is provided, from which the emission of
  • Such samples 7 are, for example, biological surfaces with at least one antibody 10 which is compatible with an antigen 9 to be detected and which is provided with a marker 8 which is suitable for emitting light signals. It can also be a biological one incubated with such an antibody 10
  • An increased depth of field EDOF is selected, with which the sample 7 in question is to be examined for the presence of fluorescence signals 12. If a current setting or configuration of the device, for example a currently set phase ramp, permits the detection of the signals 12 with the desired increased depth of field EDOF, the measurements are carried out with this configuration.
  • the sample 7 is illuminated with the illuminating radiation, which enables and / or potentially trigger the emission of the signals 12. If the illuminating radiation acts as excitation radiation, markers 8 which are present in the illuminated area of the sample and which are receptive to the illuminating radiation are excited to emit signals 12.
  • the emitted signals 12 are updated by means of the device and the
  • Detection beam path 3 arranged detector 13, 20 mapped and recorded by this as image data (measurement).
  • the spatial resolution of the detector 13, 20 enables a two-dimensional assignment (2D localization) of the origin of the respective signal 12 in an XY plane.
  • a localization in the direction of the Z axis Z is at most possible in such a way that the origin of the signal 12 is known from the area of increased depth of field EDOF and thus a position A correspondingly coarse area in the direction of the Z axis Z can be assigned in the XY plane.
  • the localization supports the checking of possible double recordings of signals 12 and a possibly necessary correction of the detection and / or counting results of the method.
  • the captured image data are combined, for example by means of the evaluation unit 23, to form a resulting overall image, which is also referred to as image synthesis or rendering.
  • the selected increased depth of field EDOF cannot be achieved with the current configuration of the device, in particular with the current phase ramp.
  • the increased depth of field EDOF is to be generated by several focus planes DOF which are sufficiently close together in the direction of the Z axis Z.
  • the optimum distances between the focus planes DOF and their overlap are therefore set for the desired increased depth of field EDOF.
  • the measurement and the localization of the respectively detected signal 12 take place either in the respective focus planes DOF and / or in the area of the increased depth of field EDOF.
  • the known distances and / or overlaps of the focus planes DOF can be used. Additionally or alternatively, structures of the sample 7 contained and recognized in the image data can be used to verify determined localization data by correlating the structure data. The total data set thus obtained and possibly verified is combined to form the resulting overall picture.
  • a value of a level spacing can be provided and can be incorporated into the method step of merging into an overall data set. This optional value is advantageous, for example, if several objects, such as cells, are present one above the other or image data are acquired in tissues.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis von Fluoreszenzsignalen (12) in einer dreidimensionalen Region einer Probe (7), insbesondere ein Verfahren zum Nachweis von fluoreszenzmarkierten Antikörpern und/oder Antigenen auf einer biologischen Oberfläche, z. B. einer Zelloberfläche. Dabei werden von der Probe emittierte Fluoreszenzsignale (12) mittels eines Detektors (13) zweidimensional aufgelöst und mit einer gegenüber einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) eines im Detektionsstrahlengang angeordneten Objektivs (5) erhöhten Schärfentiefe (EDOF) als Bilddaten erfasst. Die Bilddaten werden mittels einer Auswerteeinheit ausgewertet und die Anzahl der einer Bildregion zugeordneten Fluoreszenzsignale wird ermittelt und abgespeichert. Die gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) erhöhte Schärfentiefe (EDOF) wird mittels eines in einer Pupille (15) des Detektionsstrahlengangs angeordneten optischen Elements (14), z. B. eines Axikons, einer kubischen Phasenmaske, einer Ringphasenmaske, eines doppelbrechenden Elements, einer Flüssiglinse, eines adaptiven Spiegels oder eines Mikrolinsenarrays, erzeugt.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUM NACHWEIS VON FLUORESZENZSIGNALEN IN EINER DREIDIMENSIONALEN REGION EINER PROBE
Die Erfindung betrifft ein Nachweisverfahren von Lichtsignalen insbesondere in einer biologischen Probe.
Aus dem Stand der Technik sind eine Reihe von hochauflösenden Verfahren bekannt, mittels derer induzierte Lichtsignale biologischer Proben erfasst und ausgewertet werden können. Dabei seien insbesondere hochauflösende
Mikroskopierverfahren wie beispielsweise PALM (photoactivated localization microscopy), STORM (stochastic optical reconstruction microscopy), oder dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) genannt.
Bei den genannten Verfahren werden einzelne, mit einem schaltbaren
Fluoreszenzmarker (Fluorophore) versehene Moleküle lokalisiert, indem diese Fluoreszenzmarker (fortan auch kurz als Marker bezeichnet) sukzessive aktiviert und/oder angeregt werden. Die angeregten Marker emittieren eine
Fluoreszenzstrahlung, die erfasst und die Position des betreffenden Markers lokalisiert werden kann. Das sequentielle oder sukzessive Aktivieren und/oder Anregen individueller Marker kann auch als ein Vorgang des Vereinzeins angesehen werden, bei dem Fluoreszenzsignale einzelner Moleküle erfasst werden können, selbst wenn diese unterhalb der Auflösungsgrenze zueinander vorliegen.
Das Vereinzeln und Lokalisieren beispielsweise mithilfe des PALM beziehungsweise des dSTORM-Verfahrens (=Einzelmolekül-Lokalisierungsmikrokopie), ist zum
Beispiel in der US 8,988,771 B2 beschrieben. Die Verwendung photoschaltbarer Marker erlaubt dabei das sukzessive Aktivieren/Anregen und anschließende
Lokalisieren von Untermengen der z. B. an Antikörper gekoppelten Marker. Damit können die Fluorophore und damit auch die Antikörper mit einer Empfindlichkeit auf der Ebene von Einzelmolekülen quantifiziert werden.
Nachteilig an den genannten Verfahren des Standes der Technik ist, dass die
Proben zumeist eine 3D-Struktur aufweisen und diese 3D-Struktur im Allgemeinen bedingt, dass sie in Gänze nur durch Fokusstapel zu erfassen ist. Es muss dazu für jede Ebene des Fokusstapels eine Vielzahl von Einzelbildern aufgenommen werden, um die zu quantifizierenden Moleküle in gewünschter Genauigkeit erfassen zu können. Außerdem können die photoschaltbaren Marker nur in der Fokusebene bzw. der Schärfentiefe des Mikroskopobjektivs erfasst werden. Die Marker liegen aber in den biologischen Proben räumlich vor und werden anteilig auch ober- und unterhalb einer aktuellen Fokusebene aktiviert und/oder geblichen. Beispielsweise werden vorzeitig geblichene Marker nicht mehr erfasst, wenn die Datenerfassung in derjenigen Fokusebene erfolgt, in der der betreffende Marker tatsächlich vorliegt.
Dieser nachteilige Effekt ist in Fig. 1 verdeutlicht. In einem lediglich angedeuteten Mikroskop 1 wird entlang eines nicht näher dargestellten
Beleuchtungsstrahlengangs 2 (siehe Fig. 3 bis 8) Beleuchtungsstrahlung mittels eines Objektivs 5 durch einen Probenträger 6 auf eine Probe 7 gerichtet. Die Probe 7 ist eine mit photoschaltbaren Markern 8 modifizierte Zelle. Die Marker 8 sind beispielsweise an Antigene 9 (nicht gezeigt) gebunden, die sich an der Zellmembran der Probe 7 befinden.
Die jeweils mittels des Objektivs 5 eingestellte Fokusebene weist aufgrund optischer und technischer Rahmenbedingungen eine geringe Ausdehnung in Richtung der Z- Achse auf, die auch als DOF (depht of focus) bezeichnet wird und beispielhaft durch einen Doppelpfeil veranschaulicht ist. Diese Fokusebene entspricht nominal der Schärfentiefe des Objektivs 5.
Zu einem Erfassungszeitpunkt werden mittels des Objektivs 5 die in der jeweiligen Fokalebene DOF vorhandenen angeregten und Fluoreszenzstrahlung als
Detektionsstrahlung aussendenden Marker 8 mittels eines Detektors 13,
beispielsweise einer Kamera als Signale 12 erfasst. Im Detektionsstrahlengang 3 können dabei weitere optische Elemente wie z. B. eine Tubuslinse 10 vorhanden sein.
Aus der schematischen Fig. 1 ist gut zu entnehmen, dass zum dargestellten
Zeitpunkt lediglich die zwei innerhalb der Fokalebene DOF befindlichen Marker 8 mit dem Detektor 13 erfasst werden. Um ein Bild der gesamten Probe 7 zu erhalten, muss dieses aus einem Bilderstapel generiert werden. Der Bilderstapel wird erhalten, indem die Fokalebene DOF beispielsweise durch Verschieben des Objektivs 5 (oder des Probenträgers 6, nicht gezeigt) in der Richtung der Z-Achse Z (Z-Richtung) verschoben und in geeigneten Abständen der Fokalebenen DOF jeweils Bilder erfasst werden. Die unterschiedlichen Fokalebenen DOF und Stellungen des
Objektivs 5 sind mit horizontalen Strichlinien symbolisiert. Die
Punktbildverwaschungsfunktion PSF in Richtung der Z-Achse Z ist schematisch dargestellt.
Für einige Anwendungen photoschaltbarer Marker ist es von großer Bedeutung, dass keine Marker einer Erfassung entgehen. Solche falsch-negativen Ergebnisse, bei denen tatsächlich vorhandene Marker nicht nachgewiesen werden, sind
beispielsweise bei der Erforschung von Antigenen auf Zellen und/oder dem
Nachweis von Antikörper-Antigen-Bindungen sehr nachteilig.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zur Ermittlung einer Anzahl von Fluoreszenzsignalen in einer dreidimensionalen Region einer Probe vorzuschlagen, mit der die Nachteile des Standes der Technik verringert werden.
Die Aufgabe wird mit Nachweisverfahren gemäß der Ansprüche 1 und 2 gelöst. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Ausführung der Verfahren ist Gegenstand des Anspruchs 5. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung finden sich in den abhängigen Ansprüchen.
Das Nachweisverfahren von Fluoreszenzsignalen in einer dreidimensionalen Region einer Probe, beinhaltet ein Erfassen von Bilddaten der dreidimensionalen Region mittels einer optischen Vorrichtung, wobei die Bilddaten in einer zweidimensionalen Bildebene abgebildet und erfasst werden. Die Anzahl von Fluoreszenzsignalen in der Bildebene wird ermittelt, der Region der Probe zugeordnet und gespeichert. Die derart zugeordneten und gespeicherten Anzahlen werden zum Abrufen bereitgestellt. Erfindungsgennäß werden die Fluoreszenzsignale erfasst, indem die Ausdehnung einer Fokusebene in Richtung der optischen Achse der optischen Vorrichtung, insbesondere in Richtung einer Detektionsachse der optischen Vorrichtung, vergrößert und ein Fokusbereich gebildet wird. Die mittels dieses EDOF-Ansatzes (EDOF = Extended Depth of Focus) in der dreidimensionalen Region erfassten Fluoreszenzsignale werden in die Bildebene projiziert und als zweidimensionale Abbildung erfasst.
Im Sinne dieser Beschreibung ist eine Fokusebene die nominelle Schärfentiefe eines verwendeten Objektivs. Eine erhöhte Schärfentiefe kann aus mehreren Fokusebenen oder aus mehreren Fokusbereichen zusammengesetzt sein, wobei ein Fokusbereich bereits eine gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe des Objektivs erhöhte Schärfentiefe darstellt.
Die Idee besteht in der 2D-Projektion aller Fluoreszenzereignisse, d.h. aller
Fluoreszenzsignale, in einem gegebenen 3D-Volumen der Probe, z. B. einer Zelle, auf mindestens einen Detektor. Dazu wird das abzubildende Volumen in Z-Richtung mittels einer geeigneten EDOF-Optik erfasst. Es ist erkannt worden, dass eine erhebliche Verbesserung der quantitativen Nachweisgenauigkeit erreicht wird, wenn auf den Vorteil der dreidimensionalen Auflösung der erfassten Bilddaten und
Fluoreszenzsignale verzichtet wird. Damit wird eine technische Verbesserung auf einem Gebiet, dem Zählen von Signalen, erreicht, indem auf einem anderen Gebiet, dem hochauflösenden Erfassen, Maßnahmen ergriffen werden.
Die Information über die Position eines ein Fluoreszenzsignal emittierenden Markers in Richtung der Z-Achse (Z-Richtung, Detektionsachse) wird hierbei bewusst aufgegeben. Auch die Präzision der lateralen Lokalisierung kann nachgelassen werden, da mit den erfindungsgemäßen Verfahren keine strukturelle Hochauflösung erzielt werden soll. Die Erfindung betrifft also nicht das Gewinnen struktureller Information unterhalb der Beugungsgrenze („Superresolution“), sondern ein hochempfindliches Zählen von Fluoreszenzsignalen. Eine zusätzlich anfallende superaufgelöste 2D-Ortsinformation kann natürlich dennoch genutzt werden, um beispielsweise Antikörperverteilungen an Zellmembranen genauer zu erforschen.
Die Erfassung der Fluoreszenzsignale unter Verwendung des hier beschriebenen EDOF-Ansatzes oder EDOF-Verfahrens ist von bekannten Darstellungsverfahren, beispielsweise der Maximumintensitätsprojektion (maximum intensity projection;
MIP), zu unterscheiden. Mittels des EDOF-Verfahrens können sowohl positive als auch negative Bildwerte erfasst und abgebildet werden. So können bei
Phasengradientverfahren negative Bildwerte (Pixelwerte) auftreten, für deren
Erfassung die MIP nicht geeignet ist, aber mittels EDOF qualitativ hochwertige Bilddaten erfasst werden können (siehe dazu z. B. Giese et al. (2014): Fast
Volumetrie phase-gradient imaging in thick samples; Optice Express 22:
1152 - 1162).
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können
Antigene auf biologischen Oberflächen nachgewiesen werden. Das
Nachweisverfahren umfasst das Inkubieren der biologischen Oberfläche mit mindestens einem Antikörper, der an das nachzuweisende Antigen bindet und der mit einem Marker versehen ist. Der Marker ist zur Emission von Lichtsignalen, beispielsweise zur Emission angeregter Fluoreszenzstrahlung und daher von
Fluoreszenzsignalen, geeignet. Alternativ wird eine mit einem solchen markierten Antikörper inkubierte biologische Oberfläche verwendet. Die vorzugsweise an einem Antigen gebundenen Antikörper werden zur Emission von Lichtsignalen,
insbesondere von Fluoreszenzsignalen, angeregt. Das kann beispielsweise durch eine Anregungsstrahlung erfolgen. Mittels einer optischen Weitfeldanordnung und einer EDOF-Optik werden Bilddaten erfasst, die emittierte Lichtsignale umfassen können Der Aufbau einer vorteilhaft verwendeten Weitfeldanordnung wird unten ausführlich erläutert.
Als Antigene werden Verbindungen oder Moleküle, beispielsweise Proteine,
Kohlenhydrate, Lipide, DNS-Moleküle, Saccharide und Schwermetalle verstanden, die die Antikörper spezifisch binden können. Eine spezifische Bindung erfolgt an Epitopen der Antigene, wobei ein Antigen mehrere Epitope aufweisen kann.
Die erfassten Bilddaten werden hinsichtlich des Vorhandenseins von erfassten Fluoreszenzsignalen ausgewertet und es wird eine Anzahl der erfassten Lichtsignale ermittelt, gespeichert und bereitgestellt.
Als Marker können in einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren photoschaltbare Moleküle verwendet werden. Während der Erfassung der
Fluoreszenzsignale wird je Zeitraum eine Untermenge der Anzahl von Markern zur Emission von Lichtsignalen (Fluoreszenzsignalen) angeregt. Die emittierten
Lichtsignale werden in einer Zeitserie erfasst. Mit einer derartigen Ausgestaltung des Verfahrens ist auch die Anzahl von solchen Markern erfassbar, die räumlich sehr nah beieinander liegen oder die in Richtung der Z-Achse hintereinander liegen und anderenfalls in einem gemeinsamen Punkt der Bildebene abgebildet werden würden. Die Marker werden durch die Erfassung in einer Zeitserie in Hinblick auf die
Detektion vereinzelt.
Das konkrete Vorgehen beim Vereinzeln und bei einer Lokalisation des
Ursprungsorts eines jeweiligen Fluoreszenzsignals wird in Abhängigkeit von dem verwendeten Marker beziehungsweise den verwendeten Markern ausgeführt. Dabei wird die durch das EDOF-Verfahren modifizierte Punktbildverwaschungsfunktion (Punktbildübertragungsfunktion; point spread function; PSF) beachtet und bei der Auswertung der Bilddaten berücksichtigt.
Die verwendeten Marker können Farbstoffe im Sinne der WO 2006/127 692 A2 (PTOL, phototransformable optical labels) sein. Beispiele hierfür sind
photokonvertierbare oder photoschaltbare fluoreszierende Proteine wie Dronpa, EOS etc. sowie deren Derivate. Es können auch synthetische Farbstoffe wie Alexa 647 als Marker verwendet werden, die durch Licht und/oder (chemische) Modifikation der Umgebungsbedingungen in langlebige Dunkelzustände verbracht werden können. Außerdem ist die Verwendung von Cage-Dyes wie caged Rhodamine möglich (Grimm, Jonathan B., et al.; 2013: Carbofluoresceins and carborhodamines as scaffolds for high-contrast fluorogenic probes; ACS Chemical biology; 8.6:
1303 - 1310). Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann zum Nachweis mehrerer unterschiedlicher Marker beziehungsweise mehrerer mit unterschiedlichen Markern versehener Antigene verwendet werden.
In weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens kann in Abhängigkeit der jeweiligen Probe eine Anpassung der erhöhten Schärfentiefe und/oder weiterer optischer Parameter erfolgen. In einer möglichen Ausgestaltung kann die erhöhte
Schärfentiefe selbst eingestellt werden. Alternativ oder zusätzlich können mindestens zwei Fokusebenen erzeugt werden. Überschneiden sich mindestens zwei der Fokusebenen oder grenzen diese aneinander an, kann auch auf diese Weise mindestens ein Fokusbereich mit einer erhöhten Schärfentiefe erzeugt werden. Im Sinne dieser Beschreibung liegt auch eine erhöhte Schärfentiefe vor, wenn zwei oder mehr Fokusbereiche erzeugt werden, die sich in Richtung der Detektionsachse (Z- Richtung) nicht überschneiden aber in Richtung der Detektionsachse einen gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe insgesamt größeren Bereich scharf abbilden.
Resultierend kann eine erhöhte Schärfentiefe erzeugt werden, indem mindestens zwei Fokusebenen mit einer ursprünglichen Schärfentiefe oder mindestens zwei Fokusbereiche mit einer erhöhten Schärfentiefe oder mindestens eine Fokusebene mit einer ursprünglichen Schärfentiefe und mindestens einem Fokusbereich mit einer erhöhten Schärfentiefe erzeugt werden.
Solche auch als bifokal beziehungsweise multifokal bezeichnete Abbildungen können beispielsweise so eingestellt werden, dass mittels einer bifokalen Abbildung lediglich eine untere und eine obere Zellmembran der Probe zugleich erfasst werden. Der Vorteil liegt dabei in einer Reduzierung der Bilddaten auf die interessierenden
Bereiche der Probe (region of interest; ROI). Zudem werden die
Fluoreszenzphotonen effizienter genutzt. Mittels einer multifokalen Abbildung kann beispielsweise das gesamte Volumen der Probe erfasst werden. Nachträglich ist eine unabhängige Auswertung der einzelnen Fokusebenen beziehungsweise
Fokusbereiche möglich.
In Verfahrensausgestaltungen, in denen unter Nutzung einer multifokalen Abbildung mit EDOF eine Überlappung aller oder wenigstens einiger der Fokusebenen /- bereiche angestrebt ist, muss eine Doppelerfassung von Fluoreszenzsignalen (Signale) vermieden werden. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, dass die erfassten Signale auf den unterschiedlichen Bereichen des Detektors miteinander verglichen werden. Wird ein Signal eines Markers oder markierten Antikörpers auf verschiedenen Bereichen des Detektors erfasst, so wird dieses nur einmal gezählt. Solche doppelten Erfassungen desselben Signals können beispielsweise mittels eines Vergleichs und Auswertung der Ortskoordinaten in den Detektorbereichen nachgewiesen werden. Es kann auch vor einer Auswertung eine Korrelation der erfassten Signale der Bildelemente oder Pixel des Detektors ausgeführt werden.
In weiteren Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt erfolgen. Dieses kann in einer Dicke erzeugt werden, die einem EDOF-Bereich entspricht. Obwohl mit den Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens die Information über eine Z-Position eines Ursprungsorts eines erfassten Signals völlig beziehungsweise im Falle multifokaler Abbildungen weitgehend, aufgegeben wird, kann weiterhin eine zweidimensionale Lokalisierung erfolgen. Ein solche 2D- Lokalisierung der Fluoreszenzsignale wird in Abhängigkeit von dem jeweils
gewählten EDOF-Verfahren und der sich daraus ergebenden PSF vorgenommen. Möglich sind dabei beispielsweise eine Lokalisierung mittels
Schwerpunktbestimmung der PSF sowie Nutzung einer theoretischen PSF oder einer experimentell bestimmten PSF. Außerdem ist eine Lokalisierung mittels Anpassen analytischer Funktionen oder Näherungen, z. B. 2D-Gaussfunktion, möglich. In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens kann die EDOF-Funktion unter Verwendung eines Axikons erzeugt werden. In einem solchen Fall kann eine Besselfunktion gewählt werden, die im Ergebnis zu einer Bessel-PSF führt.
Dem Lokalisierungsschritt geht das Erkennen der Fluoreszenzsignale insbesondere in Form von„Spots“ im Detektorframe (Rohdaten) voraus. Dazu werden
üblicherweise Schwellwerte des Verhältnisses von erfasster Intensität zu erfasstem Hintergrund festgelegt. Erfasste Intensitäten (Intensitäts-Peaks), die diese
Schwellwerte auf mindestens einem Pixel überschreiten, werden mit einem festen Radius dem betreffenden Pixel zugeordnet. Ein solcher Radius kann beispielsweise als 2,5 * PSF-Breite der FWHM (full width at half maximum) definiert sein. Die Daten von Pixel und Radius gehen dann in den Lokalisierungsschritt ein.
Der Radius kann bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens größer gewählt werden, da die PSF, trotz EDOF, eine Abhängigkeit von der Z-Richtung aufweisen und in dieser Richtung größer werden kann. Alternativ kann der Radius auch für jeden Intensitäts-Peak angepasst werden, indem z. B. der radiale Abfall der Intensität in der Detektorebene über die benachbarten Pixel analysiert wird.
Sollte eine Vereinzelung von Markern beziehungsweise von markierten Antigenen nicht oder nicht mit hinreichender Qualität möglich sein, kann zur Lokalisierung ein Multi-Emitter-Algorithmus genutzt werden, wie er beispielsweise in Holden et al .,
2011 beschrieben ist (Holden, S. J.; Uphoff, S., and Kapanidis, A. N., (2011 ):
"DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy." Nature methods 8.4: 279).
Es ist weiterhin möglich, mit den Lokalisierungsdaten eine Clusteranalyse
durchzuführen, um mehrfache Lokalisierungen eines Markers beziehungsweise mehrfach markierte Antikörper einem Zielmolekül (Antigen) zuzuordnen. Ziel einer solchen Zuordnung ist letztendlich die Ermittlung der Anzahl von Antikörpern pro Zelle.
Die erfindungsgemäßen Verfahrensausgestaltungen können ergänzt werden, indem unter Verwendung eines nicht-fluoreszenten Kontrastverfahrens beispielsweise der Umfang der Zelle ermittelt wird. Parameter der Zelle wie dessen Umfang können als Referenzwert verwendet werden, bezüglich dem beispielsweise die ermittelte Anzahl von Markern beziehungsweise Antigenen angegeben wird. Beispielsweise kann neben der totalen Anzahl ermittelter Marker auch die Anzahl pro Längeneinheit Zellumfang ermittelt, gespeichert und/oder angegeben werden. Dazu können beispielsweise die Ausdehnung und/oder Kontur einer Zelle bestimmt werden. Nicht fluoreszente Kontrastverfahren sind beispielsweise DIC (differential interference contrast; Differentialinterferenzkontrast), Durchlichtkontrast, Phasenkontrast oder die Nutzung von Schräglichtbeleuchtung (angular Illumination microscopy).
Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen und um insbesondere das Vereinzeln der Marker zu unterstützen, können in vorteilhaften Ausgestaltungen die Dichten der Emitter, also der Marker beziehungsweise der markierten Antigene, unter Beachtung der gewählten Projektion und der verwendeten PSF eingestellt werden. Zur
Auswertung und Lokalisierung kann eine Entfaltung anhand einer System-PSF vorgenommen werden. Mit dem Begriff System- PSF wird insbesondere eine gemessene PSF verstanden, die im Gegensatz zu einer theoretischen PSF die tatsächlichen Eigenschaften des optischen Systems (Aberrationen etc.) enthält. Die System-PSF entspricht also der EDOF-PSF des optischen Systems.
Die Aufgabe wird ferner mit einer Vorrichtung zum Nachweis von
Fluoreszenzsignalen beziehungsweise induzierten Lichtsignalen in einer
dreidimensionalen Region einer Probe gelöst. Die Vorrichtung weist einen
Detektionsstrahlengang auf. Entlang des Detektionsstrahlengangs ist eine
vorhandene Detektionsstrahlung geführt und kann mit geeigneten Mitteln wie einem Detektor erfasst werden.
In dem Detektionsstrahlengang ist zur Erfassung der Detektionsstrahlung ein
Objektiv mit einer ursprünglichen Schärfentiefe in Richtung einer Detektionsachse vorhanden. Die Detektionsachse verläuft zumindest zwischen Objektiv und Probe entlang des Detektionsstrahlengangs. Als ursprüngliche Schärfentiefe wird in dieser Beschreibung die nominelle Schärfentiefe des Objektivs verstanden, so wie diese ohne den nachfolgend beschriebenen EDOF-Ansatz vorliegen und nutzbar sein würde.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist zudem ein optisches Element im
Detektionsstrahlengang auf. Dieses besitzt eine solche optische Wirkung, dass mittels des optischen Elements eine gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe erhöhte Schärfentiefe erzeugt ist. Diese Erhöhung der Schärfentiefe wird durch eine Verlängerung des Fokus (Fokusverlängerung) in Richtung der Detektionsachse erzielt. Das optische Element ist vorzugsweise in einer Pupille des
Detektionsstrahlengangs angeordnet. Mögliche vorteilhafte Ausführungen des optischen Elements werden weiter unten erläutert.
Die Vorrichtung weist einen Detektor zur Erfassung von Bilddaten einzelner
Fluoreszenzereignisse/-signale auf, wobei die Erfassung der Fluoreszenzsignale (auch kurz: Signale) zweidimensional und/oder zeitlich aufgelöst erfolgt
beziehungsweise erfolgen kann. Außerdem ist eine Auswerteeinheit vorhanden, in der die aus dem Detektor ausgelesenen Bilddaten ausgewertet werden und eine Anzahl der Fluoreszenzsignale ermittelt, einer Bildregion zugeordnet und
abgespeichert wird. Die erfindungsgemäße Vorrichtung, die insbesondere für die Durchführung der erfindungsgemäßen Nachweisverfahren verwendet werden kann, orientiert sich im Wesentlichen an einem Mikroskopaufbau zur Fluoreszenz-Weitfeldmikroskopie mit laserbasierter Anregung, wie dies beispielsweise bei den Verfahren PALM, STORM und dSTORM bekannt ist. Die zusätzliche EDOF-Funktion ist im
Detektionsstrahlengang realisiert.
Das optische Element kann in einer möglichen Ausführung eine Phasenmaske sein. Eine Phasenmaske kann statisch sein und z. B. lithographisch hergestellt werden.
Sie kann in weiteren Ausführungen der Vorrichtung dynamisch sein und durch räumliche Lichtmodulatoren (spatial light modulator; SLM) realisiert werden, wobei dies entweder in Transmission oder in Reflexion möglich ist. Eine statische
Phasenmaske reduziert vorteilhaft die erforderlichen Steuerungsschritte während eine dynamische Phasenmaske der Vorrichtung vorteilhaft eine höhere Flexibilität verleiht.
Als optisches Element kann in weiteren Ausführungen der Vorrichtung ein Axikon oder eine Axikon-Phasenmaske im Detektionsstrahlengang angeordnet sein. Die Detektionsstrahlung wird durch Wirkung eines solchen optischen Elements in einen Besselstrahl überführt.
Der Vorteil des Bessel-Strahls liegt für die vorliegende Problemstellung in seiner hohen Schärfentiefe, einer einfachen Erzeugung, einer definierten Bessel-PSF und einem großen EDOF-Bereich. Nachteilig ist sein ausgedehntes Ringsystem, da viel Energie bzw. viele der Fluoreszenzphotonen in dieses Ringsystem eingehen daher einer Lokalisierung nicht oder nur eingeschränkt zur Verfügung stehen. Als
Phasenmaske kann beispielsweise eine Ringphasenmaske verwendet sein. Die Phasenmaske kann optional einem sogenannten Phasewrapping) unterzogen und damit zum Beispiel mit einem räumlichen Lichtmodulator realisiert sein. Unter
Phasewrapping wird die Erzeugung einer Phasenverteilung verstanden, die beispielsweise mittels des räumlichen Lichtmodulators generiert werden muss, um im Ergebnis eine gewünschte Phasenverteilung zu bewirken. Da in der Regel ein räumlicher Lichtmodulator einen Phasenhub von 0 bis 2p (2Pi) realisieren kann, wird zur Erzeugung großer Phasenhübe von N*2p eine Anzahl von lokalen Phasenhüben bis 2p generiert. Infolge destruktiver und konstruktiver Überlagerungen der mittels des räumlichen Lichtmodulators modulierten Strahlen wird im Ergebnis eine gewünschte Phasenverteilung mit Phasenhüben von beispielsweise N*2p eingestellt. Auf diese Weise kann zum Beispiel ein Axikon mit einem Phasenhub von N*2p als Phasenfunktion realisiert werden.
In einer weiteren Ausführung der Vorrichtung ist als optisches Element eine kubische Phasenmaske im Detektionsstrahlengang angeordnet. Diese kann symmetrisch oder asymmetrisch ausgebildet sein.
Phasenmasken wie die erwähnte kubische Phasenmaske, das Axikon oder die nachfolgende beschriebene Ringphasenmaske sind in einer Fourier-Ebene (=
Pupille) oder in deren Nähe angeordnet. Dazu kann die Phasenmaske entweder in der Objektivpupille oder in einer weiteren, durch eine Zwischenabbildung
zugänglichen Pupille angeordnet sein. Letzteres hat den Vorteil, dass die
Anregungsstrahlung nicht durch die Phasenmaske beeinflusst wird. Wird das optische Element durch eine Ringphasenmaske realisiert, können als optische Effekte sogenannte Phasenringe bewirkt werden. Sind die Phasenringe binär und weisen diese einen Phasensprung von p/2 zwischen den Phasenringen auf, besitzt die resultierende Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function; PSF) zwei Maxima. Ein solche Phasenmaske und PSF können beispielsweise für eine gezielte Erfassung von z. B. oberer und unterer Zellmembran oder anderer unterschiedlicher Bereiche der Probe eingesetzt werden.
Die Ausprägung der Maxima kann durch weitere Ringelemente beeinflusst werden. Beispielsweise können Phasenverzögerungen zwischen 0 und p/2 zu einer
Reduzierung des bifokalen Charakters führen.
Das Konzept der bifokalen Abbildung und der Nutzung einer damit einhergehenden erhöhten Schärfentiefe kann in weiteren Ausführungen der Vorrichtung erreicht werden, indem als optisches Element ein doppelbrechendes Element im
Detektionsstrahlengang angeordnet ist.
Die Wirkungsweise eines solchen doppelbrechenden Elements im
Detektionsstrahlengang nutzt den Umstand, dass die Signale der Marker im Mittel isotrop polarisiert sind. Das doppelbrechende Element weist für orthogonale
Polarisationen unterschiedliche Brechungsindizes und damit unterschiedliche optische Weglängen auf. Für die isotrop polarisierte Fluoreszenzstrahlung ergibt sich damit eine bifokale Abbildung. Die zwei Fokusbereiche können auch ineinander übergehen und so einen zusammenhängenden EDOF-Bereich bilden. In einer weitergehenden Ausführung nimmt das doppelbrechende Element nicht den gesamten Querschnitt des Strahlengangs ein. In einem solchen Fall ergibt sich beispielsweise noch eine dritte Bildebene, d. h. es wird entlang der Detektionsachse ein dritter Fokusbereich im Sinne einer dritten Schärfentiefe erzeugt.
Alternativ zu den oben vorgestellten, analytisch darstellbaren Phasenmasken können Phasenmasken auch iterativ algorithmisch ermittelt und dargestellt werden. Dazu kann beispielsweise eine Gütefunktion definiert werden, die die gewünschte EDOF- Eigenschaft der PSF beschreibt, wie z.B. Länge der PSF, Breite (x/y) an
unterschiedlichen z-Positionen. Anschließend wird eine Start-Phasenfunktion vorgegeben, die iterativ verändert wird und die Änderungen nur dann übernommen werden, wenn die Gütefunktion zunimmt. So kann die Gütefunktion iterativ maximiert werden. Die iterative Veränderung kann stochastisch erfolgen (“random walk“).
Ebenso kann ein sogenannter IFTA (Inverse Fourier Transform Algorithm) eingesetzt werden (Gerchberg-Saxton-Algorithmus; Gerchberg, R W and Saxton(1972): A practical algorithm for the determination of the phase from image and diffraction plane pictures; Optik 35: 237-46). Dieser muss im vorliegenden Fall auf 3D erweitert werden (z.B. Whyte, G. and Courtial, J. (2005): Experimental demonstration of holographic three-dimensional light shaping using a Gerchberg-Saxton
algorithm; New Journal of Physics 7.1 : 117). Auch hier wird eine Zielfunktion vorgegeben, in diesem Fall die gewünschte EDOF-PSF-Intensitätsverteilung, und diese dann iterativ durch den IFTA-Algorithmus approximiert. Mit solchen iterativen Algorithmen kann das Ziel-EDOF-Verhalten geeignet eingestellt werden und die resultierende Phasenmaske für das vorliegende optische System dann gefertigt werden.
Sieht man für das optische System ein variables, phasenformendes Element wie einen SLM (Spatial Light Modulator) oder auch einen deformierbaren Spiegel vor, so lassen sich die o.g. iterativen Optimierungen auch zwischen einzelnen Experimenten, z. B. für unterschiedliche Probenklassen, durchführen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in einer weiteren Ausführung mindestens ein adaptives optisches Element im Detektionsstrahlengang aufweisen. Solche optischen Elemente sind insbesondere eine variable Linse, ein adaptiver,
insbesondere deformierbarer, Spiegel oder ein Mikrolinsenarray (Microlens-Array). Die adaptiven Spiegel werden in Reflexion eingesetzt.
Wird beispielsweise eine Flüssiglinse als variable Linse für den dynamischen EDOF- Ansatz verwendet, kann diese beispielsweise im Unendlich-Raum einer
Zwischenabbildung positioniert sein. Variable Linsen werden oft so konfiguriert, dass sie in einem nicht angesteuerten Zustand keine oder nur eine sehr geringe
Brechkraft aufweist. Optional kann deshalb eine statische Korrekturlinse vorhanden sein.
Mittels einer solchen Ausführung mit einem adaptiven optischen Element ist ein sogenanntes dynamisches EDOF-Verfahren ausführbar. Dabei kann eine schnelle Fokusverlagerung bewirkt werden, wobei eine solche Fokusverlagerung innerhalb eines Erfassungszeitraums des Detektors, beispielsweise innerhalb einer Kamera- Belichtungszeit, erfolgt. Außerdem kann die Funktionalität des EDOF-Verfahrens flexibel an die Probe angepasst werden kann. Beispielsweise kann die erhöhte Schärfentiefe an eine mittlere Ausdehnung der zu untersuchenden Zellen in Richtung der Detektionsachse (Z-Richtung) angepasst werden.
Wenn die Morphologie der zu beobachtenden Probe bekannt ist, kann die
Fokusverlagerung auch gezielt z. B. auf die obere und die untere Zellmembran erfolgen, anstelle kontinuierlich das gesamte Volumen zu durchlaufen. Die untere Zellmembran ist beispielsweise die von dem Objektiv kommend zuerst virtuell von der Detektionsachse durchstoßene Zellmembran. Entsprechend ist die obere
Zellmembran die als Zweites durchstoßene Zellmembran und weiter vom Objektiv entfernt gelegen. Durch eine selektive Auswahl und Einstellung der Fokuslagen wird die Photoneneffizienz erhöht, da keine Integrationszeit des Detektors auf
Probenpositionen verwendet wird, die nicht von Interesse sind.
Die jeweiligen Positionen der Zellmembranen einer Probe können in Richtung der Detektionsachse variieren. Daher ist es von Vorteil, wenn eine bifokale oder multifokale Abbildung mit einem weiteren EDOF-Verfahren kombiniert wird oder optional mit einem solchen kombinierbar ist. Auf diese Weise ist ein zweistufiger Effekt erreicht: mit der bi- oder multifokalen Abbildung der Detektionsstrahlung werden grob zwei abzubildende Bereiche der Probe vordefiniert (z. B. obere und untere Zellmembran). Mittels des zusätzlichen EDOF-Verfahrens (z. B. Verwendung einer kubischen Phasenmaske als optisches Element) werden dann alle Moleküle innerhalb des jeweiligen Grob-Bereichs erfasst. Dabei können die beiden Grob- Bereiche zweckmäßigerweise auf eigene Detektorbereiche oder Detektoren abgebildet werden.
Eine Aufteilung der aus mehreren Fokusebenen oder Fokusbereichen kommenden Detektionsstrahlung kann beispielsweise mittels einer geeigneten Bildteilereinrichtung erfolgen, durch deren Wirkung mehrere Fokusebenen beziehungsweise Fokusbereiche gleichzeitig auf entsprechend viele Teilbereiche eines Detektors und/oder auf mehrere Detektoren abgebildet werden. Beispiele für solche Bildteilereinrichtungen sind Anordnungen mit einem zweiten Detektor in einem gegenüber einem ersten Detektor leicht veränderten Abstand (z. B. Ram, Sripad, et al., 2008: High accuracy 3D quantum dot tracking with multifocal plane microscopy for the study of fast intracellular dynamics in live cells.; Biophysical Journal 95: 6025- 6043), eine variable Ebeneneinstellung auf mehrere Detektorbereiche (DE 10 2009 060 490 A1 ), ein diffraktives Element zur aberrationskorrigierten Abbildung mehrerer Fokusebenen auf mehrere Detektorbereiche (WO 2013/106731 A1 ) oder Prismenanordnungen zur Abbildung mehrerer Fokusebenen auf Teilbereiche mehrerer Detektoren (WO 2015/044819 A1 ).
Die Vorteile der erfindungsgemäßen Verfahren sowie der erfindungsgemäßen
Vorrichtung liegen in der Möglichkeit einer verbesserten Genauigkeit bei der
Ermittlung der Anzahl von Markern und/oder von markierten Antigenen. Mittels des in einer Pupille angeordnetem geeigneten EDOF-Phasenelements kann, insbesondere wenn Teileranordnung und/oder Phasenelement variabel gestaltet sind, ein Zählen von Molekülen in einer 3D-Probe ohne das Erfordernis der Erfassung eines
Fokusstapels an die Ausdehnung in Z-Richtung der Probe angepasst werden.
Beispielsweise können bei adhärenten Zellen bei Nutzung einer variablen
multifokalen Vorrichtung die Fokusebenen so eingestellt werden, dass sie jeweils die obere und die untere Zellmembran erfassen. Um die Fokusebenen herum bewirkt dann das (zusätzliche) EDOF-Element für die entsprechende Erhöhung der
Schärfentiefe und somit für entsprechende Fokusbereiche. In einer vorteilhaften Ausprägung der Erfindung bewirkt das optische Element, dass sich beide
Fokusbereiche leicht überlappen. Auf diese Weise kann die gesamte Zelle erfasst werden. Wird die Erfindung auf Proben angewendet, die in z-Richtung deutlich ausgedehnter als Zellen sind, z.B. Suspensionszellen, und kann die Distanz auch mit Hilfe des optischen Elements nicht überbrückt werden, können optional auch mehr als zwei Fokusbereiche simultan erfasst werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann vorteilhaft zur Ermittlung einer Anzahl von Signalen, insbesondere von Fluoreszenzsignalen, einer biologischen Zelle, eines Bereichs einer biologischen Zelle oder einer biologischen Struktur verwendet werden. Sie kann außerdem in einem Verfahren zum Nachweis von fluoreszenzmarkierten biologischen Zellen, biologischen Strukturen sowie zum Nachweis von markierten Antikörpern und von Bindungen markierter Antikörper an Antigene verwendet werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Nachweisverfahrens mittels einer
optischen Vorrichtung und einer Fokusebene entsprechend einer ursprünglichen Schärfentiefe eines Objektivs gemäß dem Stand der Technik;
Fig. 2 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen
Nachweisverfahrens mittels eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung und eines Fokusbereichs entsprechend einer erhöhten Schärfentiefe eines Objektivs;
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 4 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines vierten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 6 eine schematische Darstellung eines fünften Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 7 eine schematische Darstellung eines sechsten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 8 eine schematische Darstellung eines siebenten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig.9 eine schematische Darstellung einer Phasenverteilung in einer Pupille eines
Detektionsstrahlengangs durch Wirkung einer symmetrischen kubischen Phasenmaske jeweils als a) vereinfachte schwarz-weiße Skizze, b) als Graustufenbild sowie c) eine vereinfachte Darstellung der zugehörigen Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function);
Fig. 10 eine schematische Darstellung einer Phasenverteilung in einer Pupille eines
Detektionsstrahlengangs durch Wirkung eines Axikons jeweils als a) vereinfachte schwarz-weiße Skizze, b) als Graustufenbild sowie c) eine vereinfachte Darstellung der zugehörigen Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function);
Fig. 11 eine schematische Darstellung einer Phasenverteilung in einer Pupille eines
Detektionsstrahlengangs ohne Wirkung eines optischen Elements a) vereinfachte schwarz-weiße Skizze, b) als Graustufenbild sowie c) eine vereinfachte Darstellung der zugehörigen Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function);
Fig. 12 eine schematische Darstellung a) einer Phasenverteilung einer ersten
Ringphasenmaske in einer Pupillenebene eines Detektionsstrahlengangs und b) eine stark vereinfachte Darstellung einer zugehörigen simulierten Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function);
Fig. 13 eine schematische Darstellung a) einer Phasenverteilung einer zweiten
Ringphasenmaske in einer Pupillenebene eines Detektionsstrahlengangs und b) eine stark vereinfachte Darstellung einer zugehörigen simulierten Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function); Fig. 14 eine schematische Darstellung a) einer Phasenverteilung einer dritten
Ringphasenmaske in einer Pupillenebene eines Detektionsstrahlengangs und b) eine stark vereinfachte Darstellung einer zugehörigen simulierten Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function); und
Fig. 15 ein Ablaufschema einer Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen
Verfahrens.
Die Ausführungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie mögliche
Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind schematisch dargestellt. Dabei bezeichnen gleiche Bezugszeichen jeweils gleiche technische Elemente.
Das Prinzip der Erfindung ist in der Fig. 2 dargestellt und dem in Fig. 1 illustrierten Stand der Technik gegenübergestellt. Im Detektionsstrahlengang 3 einer
erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung ist ein optisches Element 14 angeordnet, durch dessen Wirkung die Schärfentiefe des Objektivs 5 erhöht wird. Die
Punktbildverwaschungsfunktion PSF (auch: Punktbildübertragungsfunktion) ist in Richtung der Z-Achse Z gestreckt. Diese erhöhte Schärfentiefe EDOF (mit einem Doppelpfeil veranschaulicht) ermöglicht im Ausführungsbeispiel die Erfassung der gesamten Probe 7 in Richtung der Z-Achse Z mit nur einer einzigen Fokusstellung des Objektivs 5. Demgemäß können alle an die Probe 7 gebundenen Marker 8 durch Erfassen ihrer jeweiligen (Fluoreszenz-)signale 12 mittels des Detektors 13 zeitgleich abgebildet werden. Die Information über die Position des Ursprungsorts (Marker 8) eines jeweils erfassten Signals 12 in Richtung der Z-Achse Z geht dabei verloren. Lediglich eine Lokalisierung eines Markers 8 in der Detektionsebene entlang der Achsen X und Y ist möglich.
Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in Fig. 3 als ein Teil eines nicht näher dargestellten Mikroskops 1 gezeigt. Eine
Beleuchtungsstrahlung wird in einer Laserlichtquelle 16 erzeugt und bereitgestellt.
Die Beleuchtungsstrahlung gelangt entlang des Beleuchtungsstrahlungsgangs 2, in dem sich optische Linsen 17 befinden, über einen Strahlteiler 18 in Reflexion zum Objektiv 5. In oder nahe einer Fourierebene des Objektivs 5 ist ein optisches
Element 14 in Form eines Phasenelements angeordnet. In einer Fourierebene wird ein Punkt in eine ebene Welle transformiert und umgekehrt eine ebene Welle in einen Punkt. Damit das jeweils vorhandene Phasenelement auf alle Objektpunkte gleich wirkt, soll dieses in der Fourierebene stehen oder möglichst nah an einer Fourierebene angeordnet sein.
Durch Wirkung des optischen Elements 14 wird eine erhöhte Schärfentiefe EDOF des Objektivs 5 erreicht. Die Beleuchtungsstrahlung bewirkt in der Probe 7 eine Detektionsstrahlung 4, die entlang des Detektionsstrahlengangs 3 auf den
Strahlteiler 18 trifft. Die Detektionsstrahlung 4 weicht in ihren optischen
Eigenschaften von der Beleuchtungsstrahlung ab und wird von dem Strahlteiler 18 transmittiert. Ist die Detektionsstrahlung 4 durch Strahlung mindestens zweier Wellenlängen gebildet, können diese voneinander getrennt und separat erfasst werden. Im dargestellten Ausführungsbeispiel erfolgt eine solche Trennung mittels eines weiteren Strahlteilers 18, der für eine Wellenlänge transparent und für eine andere Wellenlänge reflektierend ist. Eine derart aufgeteilte Detektionsstrahlung 4 gelangt entlang von Teilstrahlengängen zu dem Detektor 13 beziehungsweise einem weiteren Detektor 20.
Die Detektoren 13 und 20 sind mit einer Auswerteeinheit 23 verbunden, mittels der die erfassten Signale 12 als Bilddaten verarbeitet und ausgewertet werden.
Außerdem ist eine Steuereinheit 24 vorhanden, mittels der Steuerbefehle zur
Ansteuerung beispielsweise der Laserlichtquelle 16, des optischen Elements 14, der Tubuslinse 11 und/oder der optischen Linsen 17 erzeugt und ausgegeben werden können. Die Bilddaten sowie Informationen zu generierten Steuerbefehlen und/oder zur aktuellen Konfiguration der Vorrichtung können auf einer Anzeige 25 dargestellt werden.
Die Anordnung des optischen Elements 14 in einer zur Pupille konjugierten Ebene (Fourierebene) (Fig. 4) kann gewählt sein, damit die Beleuchtungsstrahlung nicht das optische Element 14 durchläuft. Im dargestellten dritten Ausführungsbeispiel werden Beleuchtungsstrahlengang 2 und Detektionsstrahlengang 3 beziehungsweise die Beleuchtungsstrahlung und die Detektionsstrahlung 4 mittels eines Strahlteilers 18 voneinander getrennt. Die Detektionsstrahlung 4 wird mittels eines Spiegels 19 auf das optische Element 14 und den Detektor 13 gelenkt.
Ein weiteres mögliches Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (Fig. 5) ist geeignet, um eine erhöhte Schärfentiefe EDOF mittels einer schnellen Verlagerung der jeweiligen Fokusebene DOF zu erreichen. Mittels zweier beispielhaft im Detektionsstrahlengang 3 dargestellter Linsen 17.1 und 17.2 wird ein
Zwischenbild nach der Tubuslinse 11 auf den Detektor 13 abgebildet. Die
Linsen 17.1 beziehungsweise 17.2 können nachfolgend auch stellvertretend für komplexere abbildende Optiken stehen. Zwischen den Linsen 17.1 und 17.2 ist eine varifokale Linse 21 vorhanden, mittels der eine Verlagerung einer aktuellen
Fokusebene DOF und die Erzeugung einer erhöhten Schärfentiefe EDOF ermöglicht ist. Die varifokale Linse 21 kann zusätzlich eine Kompensationslinse 21.1 aufweisen, wie dies in Fig. 5 schematisch gezeigt ist. Die varifokale Linse 21 ist mittels der Steuereinheit 24 ansteuerbar. Insbesondere kann eine Ansteuerung so schnell erfolgen, dass innerhalb eines Erfassungszeitraums des Detektors 13 wenigstens zwei aktuelle Fokusebenen DOF eingestellt werden und somit eine resultierende erhöhte Schärfentiefe EDOF erzeugt ist. Eine Erfassung der Detektionsstrahlung 4 erfolgt mit der (resultierenden) erhöhten Schärfentiefe EDOF.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein Axikon als optisches Element 14 im Detektionsstrahlengang 3 angeordnet (Fig. 6). Das optische Element 14 ist nahe der Linse 17.1 angeordnet, die wiederum
entsprechend ihrer Brennweite von einer Zwischenbildebene 22 entfernt angeordnet ist.
Eine weitere Ausführungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermöglicht eine dynamische Erzeugung der erhöhten Schärfentiefe EDOF unter Nutzung eines adaptiven Spiegels oder eines Mikrolinsenarrays als optisches Element 14 (Fig. 7). Die Linsen 17.1 und 17.2 im Detektionsstrahlengang 3 bilden ein erstes Zwischenbild auf den Detektor 13 ab. In einer Pupille 15 (Pupillenebene) ist das optische
Element 14 vorhanden. Ein Ausführungsbeispiel zur multifokalen Abbildung kombiniert mit erhöhter
Schärfentiefe EDOF ist in Fig. 8 veranschaulicht. Die Linsen 17.1 und 17.2 bilden das Zwischenbild auf den Detektor 13 ab und schaffen zugleich eine weitere konjugierte Pupille 15. In dieser ist das optische Element 14 angeordnet. Durch die Linsen 17.1 und 17.2 ist eine sogenannte Relayoptik gegeben.
Die Detektionsstrahlung 4 wird mit mehreren voneinander verschiedenen
Fokusebenen mit je einer Schärfentiefen DOF erfasst, wobei durch Wirkung des optischen Elements 14 um jede der Fokusebenen eine erhöhte Schärfentiefe
EDOF 1 beziehungsweise EDOF2 erzeugt wird, wie dies schematisch in der vergrößerten Teildarstellung gezeigt ist. Die erhöhte Schärfentiefe EDOF 1 erlaubt dabei eine Abbildung von Signalen 12 von Markern 8, mit markierten Antikörpern 10 verbundene Antigenen 9 und/oder markierten Antikörpern 10 der oberen
Zellmembran 7.1 und die erhöhte Schärfentiefe EDOF 2 eine Abbildung von
Signalen 12 von Markern 8, mit markierten Antikörpern 10 verbundene Antigenen 9 und/oder markierten Antikörpern 10 der unteren Zellmembran 7.2.
In weiteren Ausführungen der Vorrichtung und/oder Ausgestaltungen des Verfahrens überlappen sich die Schärfentiefen DOF beziehungsweise die erhöhten
Schärfentiefen EDOF in Richtung der z-Achse Z vorteilhaft leicht, um eine
unterbrechungsfreie Abbildung des betreffenden Probenvolumens zu erlauben.
Im Detektionsstrahlengang 3 ist weiterhin eine Bildteilereinheit 26 angeordnet. Mittels dieser werden die Anteile der Detektionsstrahlung 4 der unterschiedlichen
Fokusebenen DOF beziehungsweise der unterschiedlichen erhöhten
Schärfentiefen EDOF1 , EDOF2 auf verschiedene Detektoren 13 oder auf
unterschiedliche Bereiche wenigstens eines Detektors 13 gerichtet und separat voneinander erfasst.
Die Erzeugung einer erhöhten Schärfentiefe EDOF kann unter Nutzung von
Phasenmasken erfolgen. Phasenverteilungen in einer Pupille eines
Detektionsstrahlengangs durch Wirkung unterschiedlicher Phasenmasken sind in den Fig. 9 bis Fig. 11 gezeigt. Dabei sind jeweils in den Teilfiguren 9a, 10a und 11 a je eine vereinfachte schwarz-weiß Skizze der in den Fig. 9b, 10b und 11 b
dargestellten Graustufenbilder mit entsprechenden Phasenverteilungen in einer x-y- Ebene gezeigt. In den Fig. 9c, 10c beziehungsweise 11 c sind die vereinfachten Punktbildverwaschungsfunktionen PSF als Schnitt jeweils in einer x-z-Ebene illustriert.
In der Fig. 9a bis 9c sind die Skizze, das Graustufenbild und die PSF einer symmetrischen kubischen Phasenmaske gezeigt.
Fig. 10a bis 10c zeigen die entsprechenden Phasenverteilungen und die PSF eines Axikons.
Phasenverteilung und PSF ohne Anordnung eines optischen Elements 14 im
Detektionsstrahlengang 3 sind in den Fig. 11 a bis 11 c beispielhaft dargestellt.
Verschiedene Ringphasenmasken sowie deren jeweilige simulierte
Punktbildverwaschungsfunktion sind in den Fig. 12 bis 14 gezeigt. Dabei ist jeweils in den Fig. 12a, 13a beziehungsweise 14a schematisch eine erzeugte Ringphasenmaske gezeigt. In den Fig. 12b bis 14b sind die zugehörigen Punktbildverwaschungsfunktionen PSF vereinfacht dargestellt.
Die Fig. 12 betrifft eine Ringphasenmaske mit einem Phasensprung von p zwischen den unterschiedlich schraffierten Bereichen. Die resultierende PSF zeigt in Richtung der Z-Achse Z zwei voneinander getrennte Maxima.
Eine Ringphasenmaske mit mehreren verschiedenen Bereichen, wiederum mit jeweils einem Phasensprung von TT, ist in Fig. 13a schematisch dargestellt. Die zugehörige Punktbildverwaschungsfunktion PSF ist in Richtung der Z-Achse Z auseinandergezogen. Es treten mindestens zwei voneinander getrennte Maxima auf, wobei diese bereits deutlich erkennbare Tendenz haben, weitere Maxima zu bilden. Ringphasenmasken mit mehr als den gezeigten Bereichen und Phasensprüngen erlauben zusätzliche Maxima und damit Fokusebenen DOF und/oder erhöhte
Schärfentiefen EDOF. Je nach Gestaltung der Phasenmasken kann die
Punktbildverwaschungsfunktion PSF an die abzubildende Probe 7 und/oder das angestrebte Ziel der Abbildung angepasst werden.
Ausgestaltungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden anhand des Ablaufschemas der Fig. 15 erläutert. Zur Durchführung des Verfahrens wird insbesondere eine der oben beschriebenen Ausführungsmöglichkeiten der
Vorrichtung verwendet.
Es wird eine Probe 7 bereitgestellt, von der potenziell die Emission von
Fluoreszenzsignalen beziehungsweise von lichtinduzierten Lichtsignalen erwartet wird. Solche Proben 7 sind beispielsweise biologische Oberflächen mit mindestens einem Antikörper 10, der zu einem nachzuweisenden Antigen 9 kompatibel ist und der mit einem Marker 8 versehen ist, der zur Emission von Lichtsignalen geeignet ist. Es kann auch eine mit einem solchen Antikörper 10 inkubierten biologischen
Oberfläche als probe 7 verwendet werden.
Es wird eine erhöhte Schärfentiefe EDOF gewählt, mit der die betreffende Probe 7 auf das Vorhandensein von Fluoreszenzsignalen 12 untersucht werden soll. Erlaubt eine aktuelle Einstellung oder Konfiguration der Vorrichtung, beispielsweise eine aktuell eingestellte Phasenrampe, den Nachweis der Signale 12 mit der gewünschten erhöhten Schärfentiefe EDOF, werden mit dieser Konfiguration die Messungen durchgeführt. Dazu wird die Probe 7 mit der Beleuchtungsstrahlung beleuchtet, wobei diese die Emission der Signale 12 ermöglicht und/oder potenziell auslösen. Fungiert die Beleuchtungsstrahlung als Anregungsstrahlung, werden in dem beleuchteten Bereich der Probe 7 vorhandene und für die Beleuchtungsstrahlung rezeptive Marker 8 zur Emission von Signalen 12 angeregt.
Die emittierten Signale 12 werden mittels der Vorrichtung und der aktuell
eingestellten erhöhten Schärfentiefe EDOF auf den mindestens einen im
Detektionsstrahlengang 3 angeordneten Detektor 13, 20 abgebildet und durch diesen als Bilddaten erfasst (Messung). Die Ortsauflösung des Detektors 13, 20 ermöglicht eine zweidimensionale Zuordnung (2D-Lokalisierung) des Ursprungsorts des jeweiligen Signals 12 in einer X-Y-Ebene. Eine Lokalisierung in Richtung der Z- Achse Z ist allenfalls dahingehend möglich, als dass die Herkunft des Signals 12 aus dem Bereich der erhöhten Schärfentiefe EDOF bekannt ist und somit einer Position in der X-Y-Ebene ein entsprechend grober Bereich in Richtung der Z-Achse Z zugeordnet werden kann. Die Lokalisierung unterstützt die Überprüfung möglicher Doppelerfassungen von Signalen 12 und eine eventuell erforderliche Korrektur der Nachweis- und/oder Zählergebnisse des Verfahrens.
Die erfassten Bilddaten werden, beispielsweise mittels der Auswerteeinheit 23, zu einem resultierenden Gesamtbild zusammengefügt, was auch als Bildsynthese oder Rendern bezeichnet wird.
In einem alternativen Ablauf des Verfahrens wird festgestellt, dass die gewählte erhöhte Schärfentiefe EDOF nicht mit der aktuellen Konfiguration der Vorrichtung, insbesondere mit der aktuellen Phasenrampe, erreicht werden kann. Im dargestellten Beispiel soll die erhöhte Schärfentiefe EDOF durch mehrere Fokusebenen DOF erzeugt werden, die in Richtung der Z-Achse Z hinreichend nah beieinander liegen.
Es werden daher für die gewünschte erhöhte Schärfentiefe EDOF die optimalen Abstände der Fokusebenen DOF sowie deren Überlappung eingestellt. Mittels der so eingestellten Vorrichtung erfolgen die Messung sowie die Lokalisierung des jeweils erfassten Signals 12 entweder in den jeweiligen Fokusebenen DOF und/oder in dem Bereich der erhöhten Schärfentiefe EDOF.
Die erfassten Bilddaten der einzelnen Fokusebenen DOF, und damit der erhöhten Schärfentiefe EDOF, werden anschließend zu einem Gesamtdatensatz
zusammengeführt. Dabei können die bekannten Abstände und/oder Überlappungen der Fokusebenen DOF genutzt werden. Zusätzlich oder alternativ können in den Bilddaten enthaltene und erkannte Strukturen der Probe 7 genutzt werden, um ermittelte Lokalisierungsdaten durch Korrelationen der Strukturdaten zu verifizieren. Der so erhaltene und gegebenenfalls verifizierte Gesamtdatensatz wird zu dem resultierenden Gesamtbild zusammengefügt.
Zusätzlich kann ein Wert eines Ebenenabstands bereitgestellt werden und in den Verfahrensschritt des Zusammenführens zu einem Gesamtdatensatz einfließen. Dieser optionale Wert ist beispielsweise von Vorteil, wenn mehrere Objekte wie zum Beispiel Zellen übereinander vorhanden sind oder in Geweben Bilddaten erfasst werden.
Bezugszeichen
1 Mikroskop
2 Beleuchtungsstrahlengang
3 Detektionsstrahlengang
4 Detektionsstrahlung
5 Objektiv
6 Probenträger
7 Probe 7.1 untere Zellmembran
7.2 obere Zellmembran
8 Marker
9 Antigen
10 Antikörper
DOF Fokusebene; ursprüngliche Schärfentiefe
EDOF Fokusbereich; erhöhte Schärfentiefe
PSF Punktbildverwaschungsfunktion (point spread function)
11 Tubuslinse
12 Fluoreszenzsignal
13 Detektor
14 optisches Element
15 Pupille
16 Laserlichtquelle
17 Linse
17.1 Linse
17.2 Linse
18 Strahlteiler
19 Spiegel
20 weiterer Detektor
21 varifokale Linse
21.1 Kompensationslinse
22 Zwischenbildebene
23 Auswerteeinheit
24 Steuereinheit
25 Anzeige
26 Bildteilereinheit

Claims

Patentansprüche
1. Nachweisverfahren von optischen Signalen (12) in einer dreidimensionalen Region einer Probe (7), umfassend die Schritte:
- Erfassen von Bilddaten der dreidimensionalen Region mittels einer optischen Vorrichtung in einer zweidimensionalen Bildebene, wobei Signale (12) in Form von Fluoreszenzsignalen mit einer gegenüber einer ursprünglichen
Schärfentiefe der Vorrichtung erhöhten Schärfentiefe erfasst und in eine Bildebene projiziert werden,
- Ermitteln der Anzahl von Signalen (12) in der Bildebene und
- Speichern der Anzahl zugeordnet zu der Bildregion sowie Bereitstellen der zugeordneten Anzahl.
2. Nachweisverfahren von Antigenen (9) auf biologischen Oberflächen, mit den Schritten
- Inkubieren der biologischen Oberfläche mit mindestens einem Antikörper (10), der zu dem nachzuweisenden Antigen (9) kompatibel ist und der mit einem Marker (8) versehen ist, der zur induzierten Emission von Signalen (12) in Form von Fluoreszenzsignalen und/oder induzierten Lichtsignalen geeignet ist oder verwenden einer mit einem solchen Antikörper (10) inkubierten
biologischen Oberfläche;
- Anregen der an einem Antigen (9) gebundenen markierten Antikörper (10) zur Emission von Signalen (12);
- Erfassen der emittierten Signale (12) mittels einer optischen Vorrichtung, die einen Detektionsstrahlengang (3) aufweist, wobei entlang des Detektionsstrahlengangs (3) eine Detektionsstrahlung (4) geführt und erfasst werden kann;
ein Objektiv (5) mit einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) in Richtung der Detektionsachse im Detektionsstrahlengang (3) zur Erfassung der Detektionsstrahlung (4) aufweist;
ein optisches Element (14) in einer Pupille (15) des
Detektionsstrahlengangs (4) aufweist, wobei mittels des optischen Elements (14) eine gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) erhöhte Schärfentiefe (EDOF) erzeugt ist;
einen Detektor (13, 20) zur zweidimensional aufgelösten Erfassung von Signalen (12) aufweist, und
eine Auswerteeinheit (23) aufweist, in der die aus dem Detektor (13, 20) ausgelesenen Bilddaten ausgewertet und eine Anzahl der Signale (12) ermittelt, einer Bildregion zugeordnet und abgespeichert werden;
- Auswerten der Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins von erfassten
Signalen (12) und Ermitteln einer Anzahl der erfassten Signale (12) und
- Speichern und Bereitstellen der Anzahl der erfassten Signale (12).
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Marker (8) photoschaltbare Moleküle verwendet werden, von denen jeweils eine Untermenge der Anzahl von Markern (8) zur Emission von Signalen (12) angeregt und die emittierten Signale (12) in einer Zeitserie erfasst werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Fokusebenen mit einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) oder mindestens zwei Fokusbereiche mit einer erhöhten Schärfentiefe (EDOF) oder mindestens eine Fokusebene mit einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) und mindestens ein Fokusbereich mit einer erhöhten Schärfentiefe (EDOF) erzeugt werden und resultierend eine erhöhte Schärfentiefe (EDOF) erzeugt wird.
5. Vorrichtung zum Nachweis von Signalen (12) in Form von Fluoreszenzsignalen und/oder induzierten Lichtsignalen in einer dreidimensionalen Region einer
Probe (7); mit
- einem Detektionsstrahlengang (3), wobei entlang des
Detektionsstrahlengangs (3) eine Detektionsstrahlung (4) geführt und erfasst werden kann;
- einem Objektiv (5) mit einer ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) in Richtung einer Detektionsachse im Detektionsstrahlengang (3) zur Erfassung der Detektionsstrahlung (4);
- einem optischen Element (14) in einer Pupille (15) des
Detektionsstrahlengangs 3, wobei mittels des optischen Elements (14) eine gegenüber der ursprünglichen Schärfentiefe (DOF) erhöhte
Schärfentiefe (EDOF) erzeugt ist;
- einem Detektor (13, 20) zur zweidimensional aufgelösten Erfassung von
Signalen (12) als Bilddaten und
- einer Auswerteeinheit (23), in der die aus dem Detektor (13, 20) ausgelesenen Bilddaten ausgewertet und eine Anzahl der Signale (12) ermittelt, einer Bildregion zugeordnet und abgespeichert werden.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches
Element (14) ein Axikon oder eine Axikon-Phasenmaske im
Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist und die Detektionsstrahlung (4) durch Wirkung des optischen Elements (14) in einen Besselstrahl überführt wird.
7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches
Element (14) eine kubische Phasenmaske im Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches Element (14) eine Ringphasenmaske im Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches Element (14) ein doppelbrechendes Element im Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches Element (14) mindestens eine Flüssiglinse, ein adaptiver Spiegel oder ein
Mikrolinsenarray im Detektionsstrahlengang (3) angeordnet ist.
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