EP1929351A1 - Mikroskopierverfahren und mikroskop - Google Patents

Mikroskopierverfahren und mikroskop

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Publication number
EP1929351A1
EP1929351A1 EP06805709A EP06805709A EP1929351A1 EP 1929351 A1 EP1929351 A1 EP 1929351A1 EP 06805709 A EP06805709 A EP 06805709A EP 06805709 A EP06805709 A EP 06805709A EP 1929351 A1 EP1929351 A1 EP 1929351A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
detection
detected
detection step
sample radiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06805709A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Wolleschensky
Michael Kempe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss MicroImaging GmbH filed Critical Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Publication of EP1929351A1 publication Critical patent/EP1929351A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes

Definitions

  • the invention relates to a microscopy method for producing an image of an image field lying at a predetermined depth of a sample to be examined, comprising a plurality of illumination steps, in each of which a part of the image field is illuminated with a focused illumination beam that causes the generation of sample radiation due to an interaction with the sample causes detection steps in which the generated sample radiation is detected, and an evaluation step, in which the image is generated on the basis of the detected sample radiation.
  • the invention further relates to a microscope for generating an image of an image field lying at a predetermined depth of a sample to be examined, having an illumination module which illuminates the image field in a plurality of illumination steps, wherein in each illumination step a respective part of the image field is illuminated with a focused illumination beam, which causes the generation of sample radiation due to an interaction with the sample, a detection module that detects generated sample radiation, and an evaluation module that generates the image on the basis of the detected sample radiation.
  • a diaphragm is used, which shadows unwanted sample light.
  • structuring or intensity modulation of the illumination can be used to achieve confocal depth discrimination in the wide field or in the case of partial illumination of the image field (eg, a line illumination).
  • a phase shift of the structured illumination By means of a phase shift of the structured illumination, a deeply discriminated optical section can then be calculated and thus the desired image of the object can be generated.
  • MAA Neil et al. “Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope "Optics Letters 22 (24) 1997, 1905-1907, this can be achieved with three phase images at 0 °, 120 ° and 240 °.
  • Structuring is required.
  • a different grating must be provided in the rule, the interference of the coherent sub-beams are changed or another diffractive optical element can be used.
  • the object is achieved in a microscopy / experience of the type mentioned in that during each illumination step, a first and a second detection step are performed, wherein in the first detection step in focus and out of focus generated sample radiation and in the second detection step, a lesser proportion of in Focus generated sample radiation is detected as generated in the first detection step and out of focus sample radiation, and that in the evaluation step, the sample radiation detected in the second detection step is used to reduce the non-focal portion in the detected in the first detection step sample radiation.
  • the spatial limitedness of the illumination within the image field due to the focusing is used to detect different proportions of the sample radiation generated in the focus in the first and second detection step with substantially the same sample radiation generated outside the focus. This is then advantageously used in the evaluation step to reduce the extra-focal portion of the sample radiation detected in the first detection step.
  • a low-discriminated cut can be generated with little effort, without having to provide a physical aperture for shading the extra-focal sample radiation.
  • the illumination beam z. B. focused point you can spectrally split the detected sample radiation and z. B. detect a line detector spectrally resolved.
  • the additional degree of freedom (or the additional spatial coordinate) can thus be used to spectrally detect in the detection steps and at the same time to realize the desired deeply discriminated generation of the image of the image field.
  • the two detection steps can be performed simultaneously during at least one illumination step.
  • the measurement time can be kept as low as possible.
  • both detection steps can be carried out chronologically successively during at least one illumination step.
  • the sample radiation emerging from a second section of the sample surface is detected from a first section of the sample surface and in the second detection step, wherein both sections adjoin one another or the second section only partially covers the first section.
  • the two sections may be immediately adjacent (touching) or spaced apart from each other.
  • the focus area in the image field can be imaged onto a detector, while in the second detection step, an adjacent area in the image field is detected.
  • the signal detected in the second detection step can be subtracted from the signal detected in the first detection step.
  • a relative weighting of the two signals to each other can be taken into account.
  • the illumination steps, the detection steps and the evaluation step for a plurality of image fields can be carried out at different predetermined depths of the sample, in order thus to be able to produce a plurality of deeply discriminated sectional images of the sample. From this, three-dimensional sample images can then be generated by known methods.
  • the illumination beam (preferably diffraction-limited) can be focused point or line.
  • the object is further achieved in a microscope of the type mentioned in that during each illumination step, the detection module performs a first and a second detection step, wherein in the first detection step in focus and out of focus generated sample radiation and in the second detection step, a lesser proportion of the focus generated sample radiation is detected as generated in the first detection step and out of focus sample radiation, and that the evaluation module uses the detected in the second detection step sample radiation to reduce in the detected in the first detection step sample radiation the non-focal portion.
  • the sample radiation can be detected spectrally resolved in the two detection steps. It is exploited that no physical aperture for shading the extra-focal portion of the sample radiation is necessary and that there is a further degree of freedom on the detection side due to the spatial limitedness of the focused illumination beam.
  • the sample radiation can be spectrally split and spectrally detected by means of a line detector. The spectral splitting takes place in the direction of extension of the line detector.
  • a line detector z. B. only one row or one column of a spatially resolving surface detector can be used.
  • the spectral splitting preferably takes place transversely to the direction of extent of the linear focus.
  • the spectral splitting can be carried out with any suitable optical element (with suitable dispersion), for. B. by means of a prism or a diffraction grating.
  • the detection module can thus optics for spectral splitting Have the sample radiation and at least one spectrally split sample radiation spectrally resolved detecting detector.
  • the detection module may comprise two detectors, whereby a simultaneous execution of the two detection steps over both detectors is possible.
  • the detection module may also have a single detector, so that both Detechnischs intimide are performed sequentially in time.
  • the sample radiation emerging from a second portion of the sample surface can be detected from a first portion of the sample surface and in the second detection step, the two portions of the sample surface adjacent (directly or spaced apart) or the second portion only partially the first portion covered.
  • the detection module can be designed such that the focus area in the image field is imaged on a detector in the first detection step and in the second detection step an area of the image field adjacent to the focus area is imaged on a detector of the detection module.
  • the evaluation module can subtract the signal detected in the second detection step from the signal detected in the first detection step, wherein a weighting of the two signals relative to one another is possible.
  • a weighting of the two signals relative to one another is possible.
  • the illumination module may include a scanner module that deflects the illumination beam to illuminate the entire field of view.
  • the illumination module can direct the illumination beam to the field of view as a focused spot or line-focused illumination beam.
  • FIG. 1 is a schematic view of the microscope according to the invention
  • FIG. 2 is an enlarged view of the detection module of FIG. 1
  • 3 is a cross-sectional view of the sample to be examined
  • Fig. 4 is a plan view of the detectors of Fig. 2;
  • Fig. 5 is a modification of the detectors of Fig. 4; Fig. 6 shows an alternative embodiment of the Delementsmoduls of Figure 1, and
  • FIGS. 7 and 8 show a further alternative embodiment of the detection module of FIG. 1.
  • the microscope is designed as a laser scanning microscope comprising a light source module 1, a scanning module 2, a lens 3, a recording module 4 and an evaluation module 5.
  • the light source module 1 which has a laser 8 and a beam shaping optics 9, generates a laser beam LS1 which is directed to the scanning module 2 via a beam splitter 6 connected between the light source module 1 and the scan module 2, thus deflecting the beam LS1 over the sample 7, an image field within the sample is completely illuminated.
  • the laser beam LS1 is focused by means of the lens 3 in the sample 7, in the depth of the image field from which an image is to be generated (optical section).
  • the laser beam LS1 is focused in a punk shape (preferably diffraction-limited) so that the scanning module 2 deflects the laser beam LS1 in two independent directions so as to be able to cover the entire image field within the sample 7 with the focused laser beam LS1.
  • sample radiation LS2 is generated, which impinges on the scan module 2 via the objective 3, which scans the sample radiation LS2 coming from the sample 7, so that the sample radiation LS2 is present behind the scan module 2 as stationary radiation beam LS2 ,
  • the beam splitter 6 is designed so that it transmits the sample radiation LS2 so that it strikes the detection module 4.
  • the generated sample radiation can, for. B. fluorescent light, luminescent light, reflected, transmitted and / or scattered light.
  • the detection module 4 comprises a detection optics 11 and a first and second detector D1, D2 whose signals are supplied to the evaluation module 5.
  • the focus area of the image field ie the area in which the laser beam LS1 focuses
  • the focus area of the image field is imaged onto the detector D1, while an area adjacent thereto is imaged onto the detector D2.
  • FIG. 3 shows a cross section through the sample to be examined 7, wherein the beam waist 12 of the illumination beam LS1 is shown. Between the dashed lines horizontal lines L1 and L2 is the depth range (field of view) of the sample 7 to be displayed. In this area is the laser beam LS1 focused. This can be seen from the fact that the beam waist 12 has the smallest diameter in this area.
  • the sample radiation generated in the obliquely hatched area B1 reaches the detector. It can be seen that in addition to the desired confocal sample radiation from the section of the area B1 between the dashed lines L1 and L2 nor the extra-focal sample radiation passes, which is generated above and below the line L1 and L2 in the area B1.
  • the sample radiation generated in the horizontally hatched region B2 passes to the detector D2. Since only a region adjacent to the focus region is detected with the detector D2, only the sample radiation which is generated outside the focal region (between L1 and L2) by the beam LS1 within the region B2 strikes the detector D2. In the example described here, the detector D2 thus sees only sample radiation LS2 generated outside the focus.
  • Fig. 4 the detector-side illumination distribution is shown in focus for clarity.
  • the focused laser beam LS1 is imaged only on the detector D1 (circle F1), so that the detector D2 does not receive any confocal signals.
  • the confocal signal Sc and the non-confocal signal Snc may be given as follows:
  • n can be empirically z. B. from the minimization of the background signal during the measurement. Typical values for n are 1 to 1, 3.
  • the detectors It is generally convenient to arrange the detectors so that the boundary between both detectors D1 and D2 is about 1 to 2 Airy Unit radii away from the center of the spot distribution on the detector D1.
  • a spacing of the two areas B1 and B2, as shown in Fig. 3 for simplified graphical representation, for example, less 1AU between two detectors D1 and D2 (for example, by a web) is not a problem.
  • the detectors D1 and D2 are shown for the case that there is not a punctiform focusing, but a linear focusing.
  • the linear focus (ellipse F2) is then imaged onto the detector D1, as shown in FIG.
  • the scan module 2 is adapted accordingly, so that under certain circumstances (if the line is so long that it covers the entire image field in the line direction) only a deflection transverse to the extension direction of the linear focus is necessary.
  • the microscope has a control unit 10.
  • the focusing has a local boundary in at least one direction in the image field, wherein this limit is preferably as sharp as possible.
  • the steepness of the boundary should preferably correspond to at least one spatial frequency at half the cutoff frequency of the objective 3.
  • FIG. 6 shows an alternative embodiment of the detection module 4.
  • the detection module 4 has a beam splitter 13, which, for example, reflects and transmits half of the incident sample light LS2 and thus splits it into two detection arms.
  • the focal component LS2c and the non-focal component LS2nc are shown, with only the confocal component LS2c shown in the detection arm pointing upwards for the sake of simplicity. Due to the local arrangement of the detectors D1, D2 in the detection arms, only the non-focal component LS2nc strikes the detector D2, while the focal component LS2c strikes the detector D1.
  • FIG. 7 and 8 an embodiment of the detection module 4 is shown in which only a single
  • Detector D1 is provided. Between the detection optics 10 and the detector D1, a rotatable glass plate 14 is arranged, which, depending on the rotational position, ensures that either the focal component LS2c or the extra-focal component LS2nc strikes the active surface of the detector 1.
  • the line detectors can of Fig. 5 are used for spectrally resolved detection.
  • the detected sample radiation must be split only spectrally in the direction of extension of the line detector before it hits the line detectors D1, D2.
  • the laser beam LS1 is focused linearly. Then at least one spatially resolving planar detector is necessary, wherein z. B. in the column direction spatially resolved line focus and in the line direction of the spectrally resolved in this direction line focus is detected spectrally resolved.

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Abstract

Es wird bereitgestellt ein Mikroskopierverfahren zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe hegenden Bildfeldes, mit mehreren Beleuchtungsschritten, in den jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbundel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, Detektionsschritten, in denen die erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und einem Auswerteschritt, in dem auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt wird, wobei wahrend jedem Beleuchtungsschritt ein erster und ein zweiter Detektionsschritt durchgeführt werden, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und wobei im Auswerteschritt die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung genutzt wird, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.

Description

Mikroskopierverfahren und Mikroskop
Die Erfindung betrifft ein Mikroskopierverfahren zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit mehreren Beleuchtungsschritten, in denen jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, Detektionsschritten, in denen die erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und einem Auswerteschritt, in dem auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt wird. Ferner betrifft die Erfindung ein Mikroskop zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit einem Beleuchtungsmodul, das in mehreren Beleuchtungsschritten das Bildfeld beleuchtet, wobei in jedem Beleuchtungsschritt jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, einem Detektionsmodul, das erzeugte Probenstrahlung detektiert, und einem Auswertemodul, das auf der Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt.
Um die gewünschte konfokale Tiefendiskriminierung zu erreichen, damit das Bild des in einer vorbestimmten Tiefe der zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes erzeugt werden kann, wird bei der Laser-Scanning-Mikroskopie eine Blende eingesetzt, die unerwünschtes Probenlicht abschattet.
Es ist ferner bekannt, daß zur Erzielung von konfokaler Tiefendiskriminierung im Weitfeld bzw. bei partieller Beleuchtung des Bildfeldes (z. B. einer Linienbeleuchtung) eine Strukturierung bzw. Intensitätsmodulation) der Beleuchtung eingesetzt werden kann. Durch eine Phasenverschiebung der strukturierten Beleuchtung kann dann ein tiefendiskriminierter optischer Schnitt berechnet und so das gewünschte Bild des Objekts erzeugt werden. Wie beispielsweise in M.A.A. Neil et al. „Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope" Optics Letters 22(24) 1997, 1905-1907 beschrieben ist, kann dies mit drei Phasenbildern bei 0°, 120° und 240° erreicht werden.
Zur Strukturierung der Beleuchtung werden entweder Gitter im Beleuchtungsstrahlengang, die Interferenz von kohärenten Teilstrahlen oder der Einsatz von diffraktiven optischen Elementen vorgeschlagen. Nachteilig ist die dadurch bedingte Inflexibilität und der erhöhte Aufwand, da bei einem Wechsel des Objektivs des Lasermikroskops im allgemeinen auch ein Wechsel der
Strukturierung erforderlich ist. Dazu muß dann in der Regel ein anderes Gitter vorgesehen werden, die Interferenz der kohärenten Teilstrahlen geändert werden oder ein anderes diffraktives optisches Element eingesetzt werden.
Ausgehend hiervon ist es Aufgabe der Erfindung, ein Mikroskopierverfahren und ein Mikroskop der eingangs genannten Art derart weiterzubilden, daß die Erzeugung tiefendiskriminierter optischer Schnitte einfach möglich ist, ohne physikalische Blenden zum Abschatten außerfokaler Probenstrahlung vorsehen zu müssen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei einem Mikroskopien/erfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß während jedem Beleuchtungsschritt ein erster und ein zweiter Detektionsschritt durchgeführt werden, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und daß im Auswerteschritt die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung genutzt wird, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.
Es wird somit die aufgrund der Fokussierung vorliegende räumliche Begrenztheit der Beleuchtung innerhalb des Bildfeldes dazu genutzt, im ersten und zweiten Detektionsschritt bei im wesentlichen gleicher Probenstrahlung, die außerhalb des Fokus erzeugt wird, unterschiedliche Anteile der im Fokus erzeugten Probenstrahlung zu detektieren. Dies wird dann im Auswerteschritt vorteilhaft dazu genutzt, den außerfokalen Anteil der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung zu reduzieren.
Somit kann mit geringem Aufwand ein tiefendiskriminierter Schnitt erzeugt werden, ohne eine physikalische Blende zum Abschatten der außerfokalen Probenstrahlung vorsehen zu müssen.
Da ein Vorsehen einer physikalischen Blende nicht notwendig ist und da aufgrund der Fokussierung eine räumliche Begrenztheit der Beleuchtung gegeben ist, gewinnt man detektionsseitig einen räumlichen Freiheitsgrad. Wenn das Beleuchtungsstrahlenbündel z. B. punktförmig fokussiert wird, kann man die detektierte Probenstrahlung spektral aufspalten und mittels z. B. einem Liniendetektor spektral aufgelöst detektieren. Der zusätzliche Freiheitsgrad (bzw. die zusätzliche räumliche Koordinate) kann somit dazu genutzt werden, in den Detektionsschritten spektral zu detektieren und gleichzeitig die gewünschte tiefendiskriminierte Erzeugung des Bildes des Bildfeldes zu realisieren.
Da keine die außerfokale Probenstrahlung abschattende Blende notwendig ist, kann eine größere Detektionseffizienz erreicht werden, da sehr viel mehr Probenlicht (im Vergleich zu einem Verfahren mit Pinhole-Blende) .detektiert und für die Auswertung genutzt werden kann.
Insbesondere kann im zweiten Detektionsschritt keinerlei der im Fokus erzeugten Probenstrahlung und somit nur außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert werden. Der Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung, der im zweiten Detektionsschritt detektiert wird, beträgt somit null.
Die beiden Detektionsschritte können während zumindest einem Beleuchtungsschritt gleichzeitig durchgeführt werden. Damit läßt sich die Meßzeit möglichst gering halten.
Alternativ ist es auch möglich, daß beide Detektionsschritte während zumindest einem Beleuchtungsschritt zeitlich nacheinander durchgeführt werden. In diesem Fall kann man für beide Beleuchtungsschritte einen einzeigen Detektor einsetzten.
Insbesondere wird im ersten Detektionsschritt die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenfläche austretende Probenstrahlung detektiert, wobei beide Abschnitte aneinander grenzen oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt. Die beiden Abschnitte können unmittelbar aneinandergrenzen (sich berühren) oder aber auch voneinander beabstandet sein. Ferner kann man im ersten Detektionsschritt der Fokusbereich im Bildfeld auf einen Detektor abbilden, während im zweiten Detektionsschritt eine benachbarte Fläche im Bildfeld detektiert wird.
Im Auswerteschritt kann das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt detektierten Signal subtrahiert werden. Natürlich kann dabei eine relative Gewichtung der beiden Signale zueinander berücksichtigt werden.
Insbesondere können die Beleuchtungsschritte, die Detektionsschritte und der Auswerteschritt für mehrere Bildfelder in unterschiedlichen vorbestimmten Tiefen der Probe durchgeführt werden, um somit mehrere tiefendiskriminierte Schnittbilder der Probe erzeugen zu können. Daraus können dann mit bekannten Verfahren auch dreidimensionale Probenbilder erzeugt werden.
Bei dem Verfahren kann das Beleuchtungsstrahlenbündel (bevorzugt beugungsbegrenzt) punkt- oder linienförmig fokussiert werden.
Die Aufgabe wird ferner bei einem Mikroskop der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß während jedem Beleuchtungsschritt das Detektionsmodul einen ersten und einen zweiten Detektionsschritt durchführt, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und daß das Auswertemodul die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung nutzt, um bei der im ersten Detektionschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.
Durch diese Art der Detektion kann auf eine physikalische Blende zum Abschatten der außerfokalen Probenstrahlung verzichtet werden, da die durch die räumliche Begrenztheit des im Bildfeld fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündels vorliegende örtliche Modulation der Beleuchtung mittels den beiden Detektionsschritteπ ausgenutzt wird, um unterschiedliche Anteile der im Fokus erzeugten Probenstrahlung zu detektieren. Insbesondere kann im zweiten Detektionsschritt nur außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert werden. Der Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung, der im zweiten Detektionsschritt detektiert wird, beträgt dann null.
Femer kann man in den beiden Detektionsschritten die Probenstrahlung spektral aufgelöst detektieren. Dabei wird ausgenutzt, daß keine physikalische Blende zur Abschattung des außerfokalen Anteils der Probenstrahlung notwendig ist und daß durch die räumliche Begrenztheit des fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündels detektionsseitig ein weiterer Freiheitsgrad vorliegt. So kann bei einem punktförmig fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel die Probenstrahlung spektral aufgespalten und mittels einem Liniendetektor spektral detektiert werden. Die spektrale Aufspaltung erfolgt in Richtung der Erstreckungsrichtung des Liniendetektors. Natürlich kann als Liniendetektor z. B. auch nur eine Zeile oder eine Spalte eines ortsauflösenden Flächendetektors eingesetzt werden. Wenn das Beleuchtungsstrahlenbündel linienförmig fokussiert wird, wird ein Flächendetektor eingesetzt, wobei hier die spektrale Aufspaltung bevorzugt quer zur Erstreckungsrichtung des linienförmigen Fokus erfolgt. Die spektrale Aufspaltung kann mit jedem geeigneten Optikelement (mit geeigneter Dispersion) durchgeführt werden, z. B. mittels einem Prisma oder einem Beugungsgitter. Das Detektionsmodul kann somit eine Optik zur spektralen Aufspaltung der Probenstrahlung sowie zumindest einen die spektral aufgespaltene Probenstrahlung spektral aufgelöst detektierenden Detektor aufweisen.
Das Detektionsmodul kann zwei Detektoren umfassen, wodurch eine gleichzeitige Durchführung der beiden Detektionsschritte über beide Detektoren möglich ist. Alternativ kann das Detektionsmodul auch einen einzigen Detektor aufweisen, so daß beide Dektionsschritte zeitlich nacheinander durchgeführt werden.
Im ersten Detektionsschritt kann die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenoberfläche austretende Probenstrahlung detektiert werden, wobei die beiden Abschnitte der Probenoberfläche aneinandergrenzen (direkt oder voneinander beabstandet sein) oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt.
Ferner kann das Detektionsmodul derart ausgebildet sein, daß der Fokusbereich im Bildfeld im ersten Detektionsschritt auf einen Detektor abgebildet wird und im zweiten Detektionsschritt eine zum Fokusbereich benachbarte Fläche des Bildfeldes auf einen Detektor des Detektionsmoduls abgebildet wird.
Das Auswertemodul kann das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt detektieren Signal subtrahieren, wobei eine Gewichtung der beiden Signale zueinander möglich ist. Damit wird in einfacher Art und Weise der außerfokale Anteil im detektierten Signal des ersten Detektionsschritt.es reduziert.
Das Beleuchtungsmodul kann ein Scannermodul aufweisen, das das Beleuchtungsstrahlenbündel so ablenkt, daß das gesamte Bildfeld beleuchtet wird.
Ferner kann das Beleuchtungsmodul das Beleuchtungsstrahlenbündel als punkt- oder linienförmig fokussiertes Beleuchtungsstrahlenbündel auf das Bildfeld richten.
Die Erfindung wird nachfolgend beispielshalber anhand der beigefügten Zeichnungen noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Ansicht des erfindungsgemäßen Mikroskops; Fig. 2 eine vergrößerte Darstellung des Detektionsmoduls von Fig. 1 ;
Fig. 3 eine Querschnittsansicht der zu untersuchenden Probe;
Fig. 4 eine Draufsicht auf die Detektoren von Fig. 2;
Fig. 5 eine Abwandlung der Detektoren von Fig. 4; Fig. 6 eine alternative Ausführungsform des Dektionsmoduls von Fig.1 , und
Fig. 7 und 8 eine weitere alternative Ausführungsform des Detektionsmoduls von Fig. 1.
Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform ist das Mikroskop als Laser-Scanning-Mikroskop ausgebildet, das ein Lichtquellenmodul 1 , ein Scanmodul 2, ein Objektiv 3, ein Aufnahmemodul 4 sowie ein Auswertemodul 5 umfaßt.
Das Lichtquellemodul 1 , das einen Laser 8 und eine Strahlformoptik 9 aufweist, erzeugt einen Laserstrahl LS1 , der über einen zwischen dem Lichtquellemodul 1 und dem Scanmodul 2 geschalteten Strahlteiler 6 zum Scanmodul 2 gelenkt wird, das den Strahl LS1 so über die Probe 7 ablenkt, das ein Bildfeld innerhalb der Probe vollständig beleuchtet wird. Der Laserstrahl LS1 wird dabei mittels des Objektivs 3 in die Probe 7 fokussiert, und zwar in die Tiefe des Bildfeldes, von dem ein Bild erzeugt werden soll (optischer Schnitt).
Bei der hier beschriebenen Ausführungsbeispiel wird der Laserstrahl LS1 punkförmig (bevorzugt beugungsbegrenzt) fokussiert, so daß das Scanmodul 2 den Laserstrahl LS1 in zwei unabhängige Richtungen voneinander ablenkt, um somit das gesamte Bildfeld innerhalb der Probe 7 mit dem fokussierten Laserstrahl LS1 überstreichen zu können.
Aufgrund der Wechselwirkung des Laserstrahls LS1 mit der Probe wird Probenstrahlung LS2 erzeugt, die über das Objektiv 3 auf das Scanmodul 2 trifft, das die von der Probe 7 kommende Probenstrahlung LS2 descannt, so daß die Probenstrahlung LS2 hinter dem Scanmodul 2 als ruhendes Strahlenbündel LS2 vorliegt. Der Strahlteiler 6 ist so ausgebildet, daß er die Probenstrahlung LS2 transmittiert, so daß diese auf das Detektionsmodul 4 trifft.
Die erzeugte Probenstrahlung kann z. B. Fluoreszenzlicht, Lumineszenzlicht, reflektiertes, transmittiertes und/oder gestreutes Licht sein.
Wie in Fig. 2 schematisch dargestellt ist, umfaßt das Detektionsmodul 4 eine Detektionsoptik 11 sowie einen ersten und zweiten Detektor D1 , D2, deren Signale dem Auswertemodul 5 zugeführt werden. Auf den Detektor D1 wird der Fokusbereich des Bildfeldes (also der Bereich, in dem der Laserstrahl LS1 fokussiert) abgebildet, während auf den Detektor D2 ein dazu benachbarter Bereich abgebildet wird.
Dies wird in Verbindung mit Fig. 3 noch näher erläutert. Fig. 3 zeigt einen Querschnitt durch die zu untersuchende Probe 7, wobei die Strahltaille 12 des Beleuchtungsstrahlenbündels LS1 dargestellt ist. Zwischen den gestrichelt eingezeichneten waagrechten Linien L1 und L2 liegt der darzustellende Tiefenbereich (Bildfeld) der Probe 7. In diesem Bereich ist der Laserstrahl LS1 fokussiert. Dies erkennt man daran, daß die Strahltaille 12 in diesem Bereich den geringsten Durchmesser aufweist.
Durch die Abbildung des Fokusbereiches auf den Detektor D1 gelangt auf den Detektor die im schräg schraffierten Bereich B1 erzeugte Probenstrahlung. Man erkennt, daß neben der gewünschten konfokalen Probenstrahlung aus dem Abschnitt des Bereichs B1 zwischen den gestrichelten Linien L1 und L2 noch die außerfokale Probenstrahlung gelangt, die oberhalb und unterhalb der Linie L1 und L2 im Bereich B1 erzeugt wird.
Auf den Detektor D2 gelangt die in dem waagrecht schraffierten Bereich B2 erzeugte Probenstrahlung. Da mit dem Detektor D2 nur ein Bereich neben dem Fokusbereich detektiert wird, trifft auf den Detektor D2 nur die Probenstrahlung, die außerhalb des fokalen Bereiches (zwischen L1 und L2) vom Strahl LS1 innerhalb des Bereiches B2 erzeugt wird. Bei dem hier beschriebenen Beispiel sieht der Detektor D2 somit nur außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung LS2.
In Fig. 4 ist zur Verdeutlichung die detektorseitige Beleuchtungsverteilung im Fokus dargestellt. Der fokussierte Laserstrahl LS1 wird nur auf den Detektor D1 abgebildet (Kreis F1 ), so daß der Detektor D2 keine konfokalen Signale aufnimmt.
Wenn man annimmt, daß die beiden Detektoren D1 und D2 ungefähr die gleiche Fläche und Empfindlichkeit haben, kann man für das konfokale Signal Sc und das nicht konfokale Signal Snc folgendes angeben:
Sc = S1 - n • S2 und
Snc= S1 + n • S2 - Sc = 2 • n • S2
wobei S1 und S2 die Signale der Detektoren D1 und D2 sind. Die Konstante n kann man empirisch z. B. aus der Minimierung des Untergrundsignals während der Messung bestimmen. Typische Werte für n betragen 1 bis 1 , 3.
Es hat sich gezeigt, daß insbesondere bei dicken Proben die genaue Lage und die Schärfe der Trennlinie zwischen beiden Detektoren mit Bezug zum beugungsbegrenzten Fokusspot aus dem Fokalbereich nicht wesentlich ist.
Es ist im allgemeinen zweckmäßig, die Detektoren so anzuordnen, daß die Grenze zwischen beiden Detektoren D1 und D2 ca. 1 bis 2 Airy-Unit-Radien vom Zentrum der Spotverteilung aus dem Fokus auf dem Detektor D1 entfernt liegt. Die Airy-Unit wird objektseitig als 1 AU = 1 ,22 λ/NA definiert, wobei λ die Vakuumwellenlänge des Beleuchtungsstrahlenbündels LS1 und NA die numerische Apertur des Objektivs 3 ist. Auch eine Beabstandung der beiden Bereiche B1 und B2, wie dies in Fig. 3 zur vereinfachten graphischen Darstellung dargestellt ist, von beispielsweise kleiner 1AU zwischen beiden Detektoren D1 und D2 (beispielsweise durch einen Steg) stellt kein Problem dar.
In Fig. 5 sind die Detektoren D1 und D2 für den Fall dargestellt, daß nicht eine punktförmige Fokussierung vorliegt, sondern eine linienförmige Fokussierung. In gleicher Weise wird der linienförmige Fokus (Ellipse F2) dann auf den Detektor D1 abgebildet, wie in Fig. 5 dargestellt ist. Natürlich ist dann das Scanmodul 2 entsprechend angepaßt, so daß unter Umständen (wenn die Linie so lang ist, daß sie das gesamte Bildfeld in Linienrichtung abdeckt) nur eine Ablenkung quer zur Erstreckungsrichtung des linienförmigen Fokus notwendig ist.
Für die Steuerung des Mikroskops und die Durchführung der beschriebenen Schritte weist das Mikroskop eine Steuereinheit 10 auf.
Natürlich ist man nicht auf eine punkt- oder linienförmige Fokussierung beschränkt. Wesentlich ist, daß die Fokussierung zumindest in einer Richtung im Bildfeld eine örtliche Begrenzung aufweist, wobei diese Begrenzung bevorzugt möglichst scharf ist. Die Steilheit der Begrenzung sollte bevorzugt zumindest einer Raumfrequenz bei der halben Grenzfrequenz des Objektivs 3 entsprechen.
In Fig. 6 ist eine alternative Ausbildung des Detektionsmoduls 4 gezeigt. Hier weist das Detektionsmodul 4 einen Strahlteiler 13 auf, der beispielsweise je die Hälfte des einfallenden Probenlichtes LS2 reflektiert und transmittiert und somit in zwei Detektionsarme aufspaltet. Bei dem nach rechts laufenden Detektionsarm in Fig. 6 ist sowohl der fokale Anteil LS2c als auch der außerfokale Anteil LS2nc eingezeichnet, wobei in dem nach oben laufenden Detektionsarm zur Vereinfachung nur noch der konfokale Anteil LS2c dargestellt ist. Aufgrund der örtlichen Anordnung der Detektoren D1 , D2 in den Detektionsarmen trifft auf den Detektor D2 nur der außerfokale Anteil LS2nc, während auf den Detektor D1 der fokale Anteil LS2c trifft.
In Fig. 7 und 8 ist eine Ausführungsform des Detektionsmodul 4 gezeigt, bei der nur ein einziger
Detektor D1 vorgesehen ist. Zwischen der Detektionsoptik 10 und dem Detektor D1 ist eine drehbare Glasplatte 14 angeordnet, die je nach Drehstellung dafür sorgt, daß entweder der fokale Anteil LS2c oder der außerfokale Anteil LS2nc auf die aktive Fläche des Detektors 1 trifft.
Wenn das Beleuchtungsstrahlenbündel bzw. der fokussierte Laserstrahl LS1 punktförmig fokussiert wird, wie in Verbindung mit Fig.1 beschrieben wurde, können die Liniendetektoren von Fig. 5 zur spektral aufgelösten Detektion genutzt werden. Dazu muß die detektierte Probenstrahlung nur spektral in Richtung der Erstreckungsrichtung des Liniendetektors aufgespalten werden, bevor sie auf die Liniendetektoren D1 , D2 trifft.
Entsprechendes gilt, wenn der Laserstrahl LS1 linienförmig fokussiert wird. Dann ist mindestens ein ortsauflösender flächiger Detektor notwendig, wobei z. B. in Spaltenrichtung ortsaufgelöst der Linienfokus und in Zeilenrichtung der in diese Richtung spektral aufgelöste Linienfokus spektral aufgelöst detektiert wird.

Claims

Patentansprüche
1. Mikroskopierverfahren zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit mehreren Beleuchtungsschritten, in den jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten
Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt,
Detektionsschritten, in denen die erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und einem Auswerteschritt, in dem auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt wird, dadurch gekennzeichnet, daß während jedem Beleuchtungsschritt ein erster und ein zweiter
Detektionsschritt durchgeführt werden, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte
Probenstrahluπg und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und daß im Auswerteschritt die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung genutzt wird, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringern.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem die beiden Detektionsschritte während zumindest einem Beleuchtungsschritt gleichzeitig durchgeführt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem die beiden Detektionsschritte während zumindest einem Beleuchtungsschritt zeitlich nacheinander durchgeführt werden.
4. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem im ersten Detektionsschritt die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche auftretende Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenoberfläche austretende Probenstrahlung detektiert wird, wobei beide Abschnitte aneinandergrenzen oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt.
5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem im Auswerteschritt das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt detektierte Signal subtrahiert wird.
6. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die Beleuchtungsschritte, die beiden Detektionsschritte und der Auswerteschritt für mehrere Bildfelder in unterschiedlichen vorbestimmten Tiefen der Probe durchgeführt werden, um mehrere tiefendiskriminierte Schnittbilder der Probe zu erzeugen.
7. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungsstrahlenbündel punkt- oder linienförmig fokussiert wird.
8. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, bei dem in den beiden Detektionsschritten die Probenstrahlung spektral aufgelöst detektiert wird.
9. Mikroskop zum Erzeugen eines Bildes eines in einer vorbestimmten Tiefe einer zu untersuchenden Probe liegenden Bildfeldes, mit einem Beleuchtungsmodul, das in mehreren Beleuchtungsschritten das Bildfeld beleuchtet, wobei in jedem Beleuchtungsschritt jeweils ein Teil des Bildfeldes mit einem fokussierten
Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet wird, das aufgrund einer Wechselwirkung mit der Probe die Erzeugung von Probenstrahlung bewirkt, einem Detektionsmodul, das erzeugte Probenstrahlung detektiert, und einem Auswertemodul, das auf Basis der detektierten Probenstrahlung das Bild erzeugt, dadurch gekennzeichnet, daß während jedem Beleuchtungsschritt das Detektionsmodul einen ersten und einen zweiten Detektionsschritt durchführt, wobei im ersten Detektionsschritt im Fokus sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung und im zweiten Detektionsschritt ein geringerer Anteil der im Fokus erzeugten Probenstrahlung als im ersten Detektionsschritt sowie außerhalb des Fokus erzeugte Probenstrahlung detektiert wird, und daß das Auswertemodul die im zweiten Detektionsschritt detektierte Probenstrahlung nutzt, um bei der im ersten Detektionsschritt detektierten Probenstrahlung den außerfokalen Anteil zu verringen.
10. Mikroskop nach Anspruch 9, bei dem das Detektionsmodul zwei Detektoren umfaßt, so daß eine gleichzeitige Durchführung der beiden Detektionsschritte möglich ist.
1 1 . Mikroskop nach Anspruch 9, bei dem das Detektionsmodul für die beiden Detektionsschritte einen einzigen Detektor aufweist.
12. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , bei dem im ersten Detektionsschritt die aus einem ersten Abschnitt der Probenoberfläche und im zweiten Detektionsschritt die aus einem zweiten Abschnitt der Probenoberfläche austretende Probenstrahlung detektiert wird, wobei die beiden Abschnitte der Probenoberfläche aneinandergrenzen oder der zweite Abschnitt den ersten Abschnitt nur teilweise überdeckt.
13. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei dem das Auswertemodul das im zweiten Detektionsschritt detektierte Signal vom im ersten Detektionsschritt detektierten Signal subtrahiert.
14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 13, bei dem das Beleuchtungsmodul ein Scannermodul aufweist, das das Beleuchtungsstrahlenbündel über das Bildfeld lenkt.
15. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 14, bei dem das Beleuchtungsmodul das Bildfeld mit einem punkt- oder linienförmig fokussierten Beleuchtungsstrahlenbündel beleuchtet.
16. Mikroskop nach einem der Ansprüche 9 bis 15, bei dem in den beiden Detektionsschritten die Probenstrahlung spektral aufgelöst detektiert wird.
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