EP1664887A1 - Konfokales laser-scanning-mikroskop - Google Patents

Konfokales laser-scanning-mikroskop

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Publication number
EP1664887A1
EP1664887A1 EP04765251A EP04765251A EP1664887A1 EP 1664887 A1 EP1664887 A1 EP 1664887A1 EP 04765251 A EP04765251 A EP 04765251A EP 04765251 A EP04765251 A EP 04765251A EP 1664887 A1 EP1664887 A1 EP 1664887A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
spots
spot
along
microscope
excitation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04765251A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dieter GRÄFE
Martin KÜHNER
Frank Eismann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jenoptik AG
Original Assignee
Carl Zeiss Jena GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Jena GmbH filed Critical Carl Zeiss Jena GmbH
Publication of EP1664887A1 publication Critical patent/EP1664887A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers

Definitions

  • the invention relates to a conf ⁇ cal laser scanning microscope with an excitation beam path that bundles the excitation beam in several spots located in an object plane, and a detection beam path that confocally images the spots by means of pinhole diaphragms on a multi-channel detector, and with a scanning device that causes a two-dimensional relative movement between an object located in the object plane and the spots.
  • Another confocal laser scanning microscope of the type mentioned is known from US ⁇ .028.306.
  • a spot distribution with several spots is imaged in an object plane by means of a laser light source and a microlens array.
  • the spots are imaged confocally using an aperture array.
  • An x / y beam scanner scans the area to be examined, in one embodiment the spots being shifted over a path length which is the same as the distance between neighboring spots. This allows a large area to be scanned with a small beam deflection, since the each of the adjacent individual spots covers a small area and all these areas together fill the scanned area.
  • a disadvantage of this arrangement is that the small scanned areas must meet seamlessly with tolerances in the micrometer range. In some applications, overexposure would cause bleaching and saturation effects of fluorophores that cannot be compensated for.
  • the invention has for its object to provide a laser scanning microscope of the type mentioned, with which an object can be scanned quickly.
  • This task is accomplished in a confocal laser scanning microscope with an excitation beam path that bundles excitation radiation in several spots 30 located in an object plane (11) and a detection beam path that confocates the spots (30) onto a multichannel by means of pinhole diaphragms (14.2).
  • the object is thus scanned in strips, each strip being detected in that all spots are passed over it.
  • the object area to be detected is therefore not divided into individual areas to be seamlessly joined together, each of which is sensed by a spot, but rather all spots detect fluorescent radiation from the strip.
  • the next strip of the object is imaged by a subsequent displacement of the spots in a second direction, which is preferably orthogonal to the first direction.
  • the object area is thus divided into strips, with all spots being guided over each strip.
  • the generation of the spot pattern is expediently carried out by means of a microlens array not used for the detection in the excitation beam path, the microlens array bringing about a line-shaped or a rectangular or square arrangement of the spots.
  • the pinhole covers are of course adapted to the spot pattern; in the case of a cell-shaped microlens array, an aperture row will be used; in the case of a rectangular or square spot pattern, a corresponding aperture array is provided.
  • the pinhole diaphragms are advantageously not located in the excitation beam path, but are, for example, arranged upstream of the multi-channel detector, since then no disturbing excitation beam reflections occur. There are separate diffraction-limiting ones for the generation and for the detection of the spots Objects provided and a central aperture, which is part of both the excitation and the detection beam path, can be disregarded.
  • This distance should preferably be at least ten times the spot diameter.
  • a large distance between adjacent spots can be realized particularly easily if the spot pattern is tilted with respect to the first direction in such a way that the spots have a distance perpendicular to the direction equal to or less than the spot diameter.
  • This configuration ensures, on the one hand, that the strip of the object is scanned without gaps during the displacement along the first direction and, on the other hand, that an almost arbitrarily large distance between adjacent spots can be set.
  • the tilt or inclination of the spot pattern with respect to the first direction with which the scanning device moves the beam relatively can be achieved in an optical scanning device in that the element producing the optical spots in the excitation beam path, for example the aforementioned microlens array, as well as the pinhole diaphragms and the multi-channel detector can be rotated about the optical axis with respect to the first direction in the beam path.
  • the element producing the optical spots in the excitation beam path for example the aforementioned microlens array, as well as the pinhole diaphragms and the multi-channel detector can be rotated about the optical axis with respect to the first direction in the beam path.
  • the microscope according to the invention can particularly preferably choose the path of displacement along the first direction significantly larger than the distance between adjacent spots, so that the problem mentioned with respect to US Pat. No. 6,028,306 that small areas must be joined together seamlessly is avoided.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of spot distribution and scanning movement in a spot line
  • FIG. 5 shows a scanning movement with a square spot distribution
  • Fig. 6 shows a laser scanning microscope similar to that of Figure 2, but with a table scanner.
  • FIG. 1 shows a conventional laser scanning microscope with an optical beam scanner, an object being scanned with a beam.
  • the radiation from a laser 1 is adapted to the requirements of the microscope with regard to the beam parameters such as waist position and beam cross section with an optical arrangement 2.
  • the excitation or illumination radiation is coupled into the general beam path via a divider 3 and directed to beam scanners 4 and 5.
  • the beam scanners are closely adjacent and are arranged in the immediate vicinity of a pupil of the beam path can be controlled separately.
  • a downstream scanning optics 6 generates a spot image in all the different beam deflections generated by the scanners in an image plane 7.
  • a tube lens 8 collects the radiation in an aperture plane 9, from which an objective 10 generates a reduced spot image in an object plane 11.
  • sample parts at the spot emit fluorescence radiation with radiation which is shifted longer than the excitation radiation, which is collected again by the objective 10 and which runs the same way back through the arrangement described.
  • the beam splitter 3 effects a separation of the fluorescent radiation into a detection beam path.
  • An interference filter 12 separates portions of the short-wave excitation radiation that are still present in the beam path.
  • a lens 13 generates a spot image in a pinhole plane 13 from the object spot 11 that is just illuminated or fluorescent.
  • a detector 15 downstream of this in this case a single-point receiver, delivers a radiation-intensity-dependent video signal, which is converted into an image signal by a connected evaluation unit ,
  • the splitter 3 is not a wavelength-selective, dichroic beam splitter, but a simple neutral beam splitter.
  • the emission filter 12 is then omitted.
  • the size of the pinhole diaphragm With the size of the pinhole diaphragm, the size of the object structure to be detected can be adjusted and with smaller diaphragm diameters, a greater depth discrimination in the Object level is set, ie the depth range is set from which radiation is taken to form the image. In this way, disruptive beam components from other depth ranges can be eliminated. This is the decisive advantage of laser scanning microscopy over conventional light microscopy.
  • FIG. 2 shows a confocal multichannel laser scanning microscope which, except for the deviations described below, corresponds to the design according to FIG. 1.
  • the arrangement is equipped for multi-channel operation.
  • a collimated laser beam is expanded accordingly by a telescope 2.2, so that it illuminates a lens array 16 as completely and uniformly as possible.
  • the lens array 16 to be selected depends on the geometry and the number and distribution of the channels according to the detector array used, for , B.
  • the corresponding multianode photomultiplter tubes from Hamamatsu for example the type H7546 with 8 x 8 individual receivers or H7260 a linearly arranged detector array with 1 x 32 individual receivers.
  • the lens array 16 In the first case a lens array (square arrangement) with 8 x 8 microlenses is required, in the second case a linear array (row) with 32 microlenses in a row.
  • the individual lenses of the lens array 16 have a sufficiently uniform focal length, which e.g. in the case of production using lithographic processes.
  • the expansion optics 2.2 for the laser beam are dimensioned accordingly for the illumination of the respective lens array 16.
  • the homogeneity of the illumination must be taken into account here.
  • corresponding holographic optical elements (HOE) can also be used to improve the illumination.
  • the expanded and collimated beam is broken down into several partial beams by the lens array 16.
  • Fan-shaped collimated bundles of rays emanate from the aperture image, one bundle for each spot.
  • the size of the scanners are dimensioned in such a way that they detect all beams even when fully deflected.
  • a scanning optical system detects the beam bundle and generates a spot distribution in an image plane 7, ie an arrangement of several individual spots, which moves with the scanner movement.
  • a fixed or adjustable diaphragm arrangement 7 is attached in the image plane 7, which marks exactly the area to be scanned so that spots, which are due to the measuring regime, lie outside the desired image area, do not reach the object field and there fluorescence bleaching, saturation or other irreversible Can cause sample changes.
  • the spot distribution is imaged into the object plane 11 in a reduced manner via a tube lens 8 and an objective 10.
  • the fluorescent structure or sample located in the object plane is excited by the migrating spot distribution to emit generally longer-wave fluorescent radiation. This takes the same way back to the main color splitter due to the optical arrangement as the excitation radiation.
  • the beam passage is scanned, ie canceled, by the passage twice over the scanner, so that a stationary beam is created in the section between scanner 4 and detector, which is now designed as a detector array 15.2.
  • the dichroic beam splitter 3 separates the detection beam path from the excitation beam path, an emission filter 12 blocking off residual residues of the excitation light.
  • a lens system 18 and 13 produces a focus in a further image plane located immediately in front of the detector array 15.2.
  • a confocal pinhole array 14.2 lies in this image plane. It is adjusted to the position of the spot distribution generated by the lens array 16 and acts analogously to the pinhole diaphragm 14 and separates light from different depth planes of the sample attached to the object plane 11.
  • the individual channels of the detector array 15.2 simultaneously assign each spot, coupled with the scanner movement, time signals which can be assembled into an image in an electronic evaluation.
  • FIG. 3 shows the spot distribution in a linear (row) arrangement of lens array 16, detector array 15.2 and pinhole array 14.2.
  • the scanning process is shown over an area 34 to be scanned.
  • the starting point for the scanning process is, for example, a position of an inclined spot row to the right of an area 34.
  • the first scanner moves the spot row in a direction 32 and shifts the spots 30 over a strip of the object field.
  • the second scanner then takes action and shifts all spots 30 in the direction of 33.
  • the first scanner then moves back in the direction of 32 and a second adjacent strip is imaged. This continues to scan the entire area.
  • Each spot 30 runs on a track 31 and all tracks 31 cover a strip together.
  • the scan length in direction 32 is determined by the length of area 34, increased by the length of the spot distribution along direction 32.
  • the row of spots is shown much longer than the corresponding dimensions of area 34.
  • the length of the spot row if the spot distance is 10 times the diameter, is 100 ⁇ m.
  • the spots 30 lie on an inclined straight line 34 with respect to the direction 32 or the tracks 31.
  • the spot radius 35 is dimensioned to match the resolution of the objective 10. At a given wavelength and diffraction-limited optical design, this is only determined by the reciprocal numerical aperture.
  • the spots 30 have at least a distance 36 in the projection perpendicular to the scanning direction 32 or path 31, the size of a spot radius 35.
  • the distance 36 is determined by the crosstalk between neighboring spots 30 and is calculated according to the image function (point spread function PSF).
  • the lens array 16 is set up at this angle at an angle to the direction 32 or path 31.
  • the spot array 30.5 is not detailed in the illustration.
  • the inclination specified between the individual spots, which is now expressed as an array inclination, is also set here, and the inclined image is scanned over the sample area 34.
  • FIG. 6 shows an arrangement with an x / y table scanner.
  • the optical structure is analog here. Light microscope.
  • the image of the spot distribution arises in the image plane in front of the receiver 15.2, in which the confocal pinhole array 14.2 is arranged.
  • the sample is moved with the x / y scanning table in the directions indicated, analogously to 32 and 33 or 32.5 and 33.5 in FIGS. 3 and 5.
  • such an arrangement is advantageous in order to quickly also detect larger sample areas 34.

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Abstract

Es wird beschrieben ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Anregungsstrahlengang, der Anregungsstrahlung in mehreren in einer Objektebene (11) gelegenen Spots (30) bündelt, und einem Detektionsstrahlengang, der die Spots (30) konfokal mittels Pinholeblenden (14.2) auf einen Mehrkanal-Detektor (15.2) abbildet, sowie mit einer Scaneinrichtung (4, 5, 37), die eine zweidimensionale Relativbewegung zwischen einem in der Objektebenen (11) gelegenen Objekt und den Spots (30) bewirkt, wobei die Scaneinrichtung (4, 5, 37) bei der Relativbewegung die Spots (30) entlang einer ersten Richtung (32) verschiebt und dadurch mit den. Spots (30) einen Streifen des Objekts (34) abtastet und dann die Spots (30) entlang einer zweiten Richtung (33) verschiebt, um danach durch erneute Verschiebung entlang der ersten Richtung (32) einen benachbarten Streifen abzutasten.

Description

Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop
Die Erfindung bezieht sich auf ein konfόkales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Anregungsstrahlengang, der Anregungsstrahlurig in mehreren in einer Objektebene gelegenen Spots bündelt, und einem Detektionsstrahlengang, der die Spots konfokal mittels Pinholeblenden auf einen Mehrkanal-Detektor abbildet, sowie mit einer Scaneinrichtung, die eine zweidimensionale Relativbewegung zwischen einem in der Objektebenen gelegenen Objekt und den Spots bewirkt.
Laser-Scanning-Mikroskopie mit gleichzeitiger Abtastung mehrer Spots ermöglicht es, ein Objekt beschleunigt abzutasten. US 6.262.423 beschreibt ein konfokales Laser-Scanning- Mikroskop der eingangs genannten Art, bei dem mit einem aufgeweiteten Laserstrahl ein auf einer Nipkowscheibe befindliches Mikrolinsenarray ausgeleuchtet wird. Die Spots der durch das Linsenarray erzeugten Teilstrahlen werden mit einem Mikrodbjektiv in die Objektebene abgebildet und von den Spots ausgehende Fluoreszenzstrahlung wird vom Mikroobjektiv aufgenommen und über einen Strahlteiler einem CCD-Empfänger zugeführt. Mit einer Umdrehung der Nipkowscheibe wird punktweise der CCD-Flächensensor ausgeleuchtet, der auf diese Weise das komplette Bildsignal aufnimmt Mit etwa hundert Einzellinsen auf der Scheibe ist eine sehr schnelle Objektabtastung möglich. Die Auflösung ist durch Pixel-Anzahl und -Größe des CCD- Flächensensors vorgegeben und nicht änderbar. Auch ist es technologisch aufwendig und damit teuer, die mit exakt positionierten Mikrolinsen belegten Nipkowscheibe zu produzieren.
Ein weiteres konfokales Laser-Scanning-Mikroskop der eingangs genannten Art ist aus der US θ.028.306 bekannt. In der dort beschriebenen Vorrichtung wird mittels einer Laserlichtquelle und einem Mikrolinsenarray eine Spotverteilung mit mehreren Spots in eine Objektebene abgebildet. Mittels einem Blendenarray werden die Spots konfokal abgebildet. Ein x/y-Strahlscanner rastert die zu untersuchende Fläche ab, wobei in einer Ausführungsform die Spots über eine Weglänge verschoben werden, die genauso groß ist, wie der Abstand benachbarter Spαts. Dadurch kann mit einer kleinen Strahlablenkung eine große Fläche abgerastert werden, da die benachbarten Einzelspots jeweils einen kleinen Bereich überdecken und all diese Bereiche zusammen die abgerasterte Fläche füllen. Nachteilig bei dieser Anordnung ist, daß die kleinen abgerasterten Bereiche nahtlos mit Toleranzen im Mikrometerbereich aneinanderstoßen müssen. Überstrahlungen würden bei manchen Anwendungen Bleich- und Sättigungseffekte von Fluorophoren hervorrufen, die nicht kompensiert werden können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Laser-Scanning-Mikroskop der eingangs genannten Art bereitzustellen, mit dem ein Objekt schnell abgetastet werden kann.
Diese Aufgabe wird bei einem konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Anregungsstrahlengang, der Anregungsstrahlung in mehreren in einer Objektebene (11) gelegenen Spots 30 bündelt, und einem Detektionsstrahlengang, der die Spots (30) konfokal mittels Pinholeblenden (14.2) auf einen Mehrkanal-Detektor (15.2) abbildet, sowie mit einer Scaneinrichtung (4, 5, 37), die eine zweidimensionale Relativbewegung zwischen einem in der Objektebenen 11 gele- genen Objekt und den Spots (30) bewirkt, dadurch gelöst, daß die Scaneinrichtung (4, 5, 37) bei der Relativbewegung die Spots (30) entlang einer ersten Richtung (32) verschiebt und dadurch mit den Spots (30) einen Streifen des Objekts (34) abtastet und. dann die Spots (30) entlang einer zweiten Richtung (33) verschiebt, um danach durch erneute Verschiebung entlang der ersten Richtung (32) einen benachbarten Streifen abzutasten.
Erfindungsgemäß wird also das Objekt in Streifen abgerastert, wobei jeder Streifen dadurch erfaßt wird, daß alle Spots über ihn geführt werden. Im Gegensatz zur eingangs erwähnten US 6.028.306 wird die zu erfassenden Objektfläche also nicht in nahtlos aneinanderzufügende Einzelbereiche aufgeteilt, die jeweils von einem Spot abgefühlt werden, sondern alle Spots de- tektieren Fluoreszenzstrahlung aus dem Streifen. Durch eine nachfolgende Verschiebung der Spots in einer zweiten Richtung, die vorzugsweise orthogonal zur ersten Richtung liegt, wird der nächste Streifen des Objekts abgebildet. Die Objektfläche wird somit in Streifen unterteilt, wobei über jeden Streifen alle Spots geführt werden.
Die Erzeugung des Spotmusters wird zweckmäßigerweise mittels eines nicht für die Detektion verwendeten Mikrolinsenarrays im Anregungsstrahlengang vorgenommen, wobei das Mikrolinsenarray eine zeilenförmige oder eine rechteckige bzw. quadratische Anordnung der Spots bewirkt. Die Pinholeblenden sind natürlich an das Spotmuster angepaßt; bei einem zellenförmigen Mikrolinsenarray wird eine Blendenzeile zum Einsatz kommen, bei einem rechteckigen oder quadratischen Spotmuster ist ein entsprechendes Blendenarray vorgesehen. Vorteilhafterweise liegen die Pinholeblenden nicht im Anregungsstrahlengang, sondern sind z.B. dem Mehrkanal-Detektor vorgeordnet, da dann keine störenden Anregungsstrahjungsreflexe auftreten. Für die Erzeugung und für die Detektion der Spots sind also eigene beugungsbegrenzende Objekte vorgesehen und auf eine zentrale Blendenheit, die Bestandteil sowohl des Anregungsais auch des Detektionsstrahlenganges ist, kann verachtet werden.
Um ein Übersprechen zwischen benachbarten Spots zu verhindern, ist es zweckmäßig, einen bezogen auf den Spotdurchmesser großen Abstand zwischen benachbarten Spots einzustellen.
Vorzugsweise sollte dieser Abstand mindestens gleich dem zehnfachen Spotdurchmesser sein.
Für die vom erfindungsgemäßen Mikroskop durchgeführte Abtastung kann ein großer Abstand zwischen benachbarten Spots besonders einfach realisiert werden, wenn das Spotmuster be- züglich der ersten Richtung so gekippt, daß die Spots senkrecht zur Richtung einen Abstand gleich oder kleiner dem Spotdurchmesser haben. Mit dieser Ausgestaltung ist zum einen sichergestellt, daß der Streifen des Objektes bei der Verschiebung entlang der ersten Richtung lückenlos abgetastet ist und daß zum anderen ein nahezu beliebig großer Abstand zwischen benachbarten Spots eingestellt werden kann.
Die Kippung bzw. Schrägstellung des Spotmusters gegenüber der ersten Richtung, mit der die Scaneinrichtung den Strahl relativ bewegt, kann bei einer optischen Scaneinrichtung dadurch erreicht werden, daß das die optischen Spots im Änregungsstrahlengang erzeugende Element, beispielsweise das erwähnte Mikrolinsenarray, ebenso wie die Pinholeblenden und der Mehr- kanal-Detektor gegenüber der ersten Richtung im Strahlengang um die optische Achse gedreht werden.
Das erfindungsgemäße Mikroskop kann besonders vorzugsweise den Weg der Verschiebung entlang der ersten Richtung deutlich größer als den Abstand benachbarter Spots wählen, so daß die bezüglich der US 6.028.306 erwähnte Problematik, daß kleine Bereiche nahtlos aneinandergefügt werden müssen, vermieden ist.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielhalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:
Fig. 1 ein bekanntes Laser-Scanning-Mikroskop, das ein Objekt mit einem Strahl abtastet,
Fig. 2 ein erfindungsgemäßes Laser-Scanning-Mikroskop, das ein Objekt mit mehreren Strahlen abtastet,
Fig. 3 eine schematische Darstellung von Spotverteilung und Scanbewegung bei einer Spot- Zeile,
Fig. 4 eine schematische Darstellung der Lage benachbarter Spots zueinander,
Fig. 5 eine Scanbewegung bei einer quadratischen Spotverteilung, Fig. 6 ein Laser-Scanning-Mikroskop ähnlich dem der Figur 2, jedoch mit einer Tischscanneinrichtung.
Figur 1 zeigt ein herkömmliches Laser-Scanning-Mikroskop mit einem optischen Strahlscanner, wobei ein Objekt mit einem Strahl abgetastet wird. Die Strahlung eines Lasers 1 wird mit einer optischen Anordnung 2 hinsichtlich der Strahlparameter wie Taillenlage und Strahlquerschnitt an die Erfordernisse des Mikroskops angepaßt. Über einen Teiler 3 wird die Anregungs- oder Beieuchtungsstrahlung in den allgemeinen Strahlengang eingekoppelt und auf Strahlscanner 4 und 5 geleitet Die Strahlscanner sind eng benachbart und in unmittelbarer Nähe einer Pupille des Strahlengangs angeordnet Sie haben wie in der Figur dargestellt, senkrecht aufeinander stehende Drehachsen und können separat voneinander angesteuert werden.
Eine nachgeordnete Scanoptik 6 generiert bei allen von den Scannern erzeugten unterschiedlichen Strahlauslenkungen in einer Bildebene 7 ein Spotbild. Eine Tubuslinse 8 sammelt die Strahlung in einer Aperturebene 9, von der aus ein Objektiv 10 in einer Objektebene 11 ein verkleinertes Spotbild erzeugt.
Im Falle einer Fluoreszenzanregung senden Probenteile am Spot Fluoreszenzstrahlung mit gegenüber der Anregungsstrahlung längerwelliger verschobener Strahlung aus, die durch das Objektiv 10 wieder aufgesammelt wird und die durch die geschilderte Anordnung den gleichen Weg zurück läuft.
Aufgrund der zweimaligen Passage durch die Strahlscanner 4 und 5 wird die Strahlbewegung nach dem Scanner aufgehoben und man erhält wieder einen ruhenden Strahl.
Der Strahlteiler 3 bewirkt eine Separation der Fluoreszenzstrahlung in einen Detektionsstrah- lengang. Ein Interferenzfilter 12 trennt dabei im Strahlengang noch vorhandene Anteile der kurzwelligeren Anregungsstrahlung ab.
Eine Linse 13 erzeugt von dem gerade beleuchteten bzw. fluoreszierenden Objektpunkt in der Objektebene 11 ein Spotbild in einer Pinholeebene 13. Ein dieser nachgeordneter Detektor 15, in diesem Falle ein Einpunktempfänger, liefert ein strahlungsintensitätsabhängiges Videosignal, das von einer angeschlossenen Auswerteeinheit zu einem Bildsignal umgewandelt wird. Bei Anordnungen zur Strukturuntersυchung wird die von dem Objekt 11 reflektierte Strahlung auf- genommen und der Teiler 3 ist kein welleπlängenselektiver, dichroitischer Strahlteiler, sondern ein einfacher neutraler Strahlteiler. Das Emissionsfilter 12 entfällt dann. Mit der Größe der Pinholeblende, kann die Größe der zu detektierenden Objektstruktur eingestellt werden und es wird mit kleiner werdenden Blendendurchmessern auch eine höhere Tiefendiskrimination in der Objektebene eingestellt, d. h. es wird der Tiefenbereich eingestellt, aus der Strahlung zur Bildentstehung genommen wird. Damit können störende Strahlanteile aus anderen Tiefenbereichen eliminiert werden. Das ist der entscheidende Vorteil der Laser-Scanning-Mikroskopie gegenüber üblicher Lichtmikroskopie.
Die Figur 2 zeigt ein konfokales Mehrkanal-Laser-Scanning-Mikroskop, das bis auf die nachfolgend beschriebenen Abweichungen, der Bauart gemäß Figur 1 entspricht. Die Anordnung ist für Mehrkanalbetrieb ausgerüstet. Zu diesem Zwecke wird ein kollimierter Laserstrahl durch ein Teleskop 2.2 entsprechend aufgeweitet, so daß er ein Linsenarray 16 möglichst vollständig und gleichförmig ausleuchtet Das zu wählende Linsenarray 16 richtet sich in der Geometrie und in der Anzahl und der Verteilung der Kanäle nach dem eingesetzten Detektorarray, z. B. den entsprechenden Multianode Photomultiplter Tubes der Firma Hamamatsu, beispielweise dem Typ H7546 mit 8 x 8 Einzelempfängern oder H7260 einem linear angeordnetem Detektorarray mit 1 x 32 Einzelempfängern. Im ersten Falle ist ein Linsenarray (Quadrat-Anordnung) mit 8 x 8 Mi- krolinsen, im zweiten Falle ein lineares Array (Zeile) mit 32 Mikrolinsen in einer Reihe erforderlich. Die Einzellinsen des Linsenarrays 16 haben genügend einheitliche Brennweite, was z.B. bei einer Herstellung nach lithographischen Verfahren erfüllt ist.
Für die Ausleuchtung des jeweiligen Linsenarrays 16 ist die Aufweitungsoptik 2.2 für den Laser- Strahles entsprechend dimensioniert. Hierbei ist die Homogenität der Ausleuchtung zu beachten. Alternativ können auch entsprechende holographisch optische Elemente (HOE) zur Verbesserung der Ausleuchtung eingesetzt werden.
Der aufgeweitete und kollimierte Strahl wird durch das Linsenarray 16 in mehrere Teilstrahlen zerlegt. Ein Linsensystem 17 und 18, dessen Funktion auch durch eine Einzellinse realisiert werden kann, transformiert die so gebildeten einzelnen Spots in ein gemeinsames Aperturbild, das vorteilhafterweise zwischen den eng benachbarten Strahlscannern 4 und 5 liegen kann. Vom Aperturbild gehen fächerförmig kollimierte Strahlbündel aus, für jeden Spot ein Bündel. Die Scanner sind in ihrer Spiegelgröße so dimensioniert, daß sie auch im voll ausgelenkten Zustand alle Strahlenbündel erfassen. Eine Scanoptik erfaßt die Strahlenbündei und erzeugt in einer Bildebene 7 eine Spotverteilung, d.h. eine Anordnung aus mehreren Einzelspots, die mit der Scannerbewegung wandert. Vorzugsweise ist in der Bildebene 7 eine feste oder verstellbare Blendenanordnung 7 angebracht, die genau das zu scannende Gebiet markiert, damit Spots, die durch das Meßregime bedingt, außerhalb des gewünschten Bildbereichs liegen, nicht das Objektfeld erreichen und dort Fluoreszenzbleichung, -Sättigung oder andere irreversible Probenveränderungen hervorrufen können. Über eine Tubuslinse 8 und ein Objektiv 10 wird die Spotverteilung verkleinert in die Objektebene 11 abgebildet. Die in der Objektebene befindliche fluoreszierende Struktur oder Probe wird durch die wandernde Spotverteilung zur Emission von in der Regel längerwelliger Fluoreszenzstrahlung angeregt. Diese nimmt bis zum Hauptfarbteiler durch die optische Anordnung zurück den gleichen Weg wie die Anregungsstrahlung. Durch die zweimalige Passage über die Scanner wird die Strahlbewegung descannt, d. h. aufgehoben, so daß ein ruhender Strahl in dem Abschnitt zwischen Scanner 4 und Detektor, der nun als Detektorarray 15.2 ausgebildet ist, entsteht.
Der dichroitische Strahlteiler 3 separiert den Detektionsstrahlengang vom Anregungsstrahlengang, wobei ein Emissionsfilter 12 reflektierte Reste des Anregungslichtes abblockt. Ein Linsensystem 18 und 13 erzeugt eine Fokussierung in eine weitere Bildebene unmittelbar vor dem Detektorarray 15.2 gelegen. In dieser Bildebene liegt ein konfokales Pinholearray 14.2. Es ist zur Lage der durch das Linsenarray 16 erzeugten Spotverteilung justiert und wirkt analog der Pinholeblende 14 und separiert Licht aus unterschiedlichen Tiefenebenen der Probe angebracht auf der Objektebene 11. Die Einzelkanäle des Detektorarrays 15.2 liefern simultan jedem Spot zugeordnet, mit der Scannerbewegung gekoppelt Zeitsignale, die in einer elektronischen Auswertung zu einem Bild zusammengesetzt werden.
Figur 3 zeigt die Spotverteilung bei linearer (Zei!en-)Anordnung von Linsenarray 16, Detektorarray 15.2 und Pinholearray 14.2. Dabei ist der Scanvorgang über ein zu scannendes Gebiet 34 dargestellt. Ausgangspunkt für den Scanvorgang ist beispielsweise eine Lage einer geneigten Spotreihe rechts neben einem Gebiet 34. Mit dem Scanstart bewegt der erste Scanner die Spotreihe in einer Richtung 32 und verschiebt die Spots 30 über einen Streifen des Objektfel- des. Danach tritt der zweite Sanner in Aktion und verschiebt alle Spots 30 in Richtung 33. Anschließend wandert der erste Scanner wieder in Richtung 32 zurück und ein zweiter benachbarter Streifen wird abgebildet. Dies setzt sich fort, um das gesamte Gebiet abzuscannen. Jeder Spot 30 läuft so auf einer Bahn 31 und alle Bahnen 31 überdecken gemeinsam einen Streifen. Die Scanlänge in Richtung 32 wird durch die Länge des Gebiets 34 bestimmt, vergrößert um die Länge der Spotverteilung entlang Richtung 32. Zur Verdeutlichung ist die Spotreihe wesentlich länger dargestellt als die entsprechenden Abmaße des Gebiets 34.
Unter der Annahme eines Spotdurchmessers von 1 μm und 10 Einzelspots beträgt die Länge der Spotreihe, wenn der Spotabstand 10-mal so groß wie der Durchmesser ist, 100 μm. Mit einer Blende 7 in der Bildebene können Seitenbereiche neben dem Gebiets 34 vor einer Beleuchtung geschützt werden. Wie in Figur 4 genauer dargestellt ist, liegen die Spots 30 bezüglich der Richtung 32 bzw. den Bahnen 31 auf einer geneigten Gerade 34. Der Spotradius 35 ist passend zur Auflösung des Objektivs 10 dimensioniert. Diese wird bei vorgegebener Wellenlänge und beugungsbegrenz- tem Optikdesign nur durch die reziproke numerische Apertur bestimmt. Um die Auflösung durch den Scanvorgang voll zu nutzen, weisen die Spots 30 in der Projektion senkrecht zur Scanrichtung 32 bzw. Bahn 31 mindestens einen Abstand 36 in Größe eines Spotradius 35 auf. Der Abstand 36 wird durch das Übersprechen zwischen benachbarten Spots 30 bestimmt und berechnet sich nach der Bildfunktion (point spread function PSF). Der nach Figur 3 einzustellende Neigungswinkel 34 entspricht arctan (Spotradius/Spotabstand). Bei einem Spotabstand gleich 10 x Spotdurchmesser gilt arctan (1/20)=2.86°. Um diesen Winkel ist das Linsenarray 16 zur Richtung 32 bzw. Bahn 31 geneigt aufgestellt.
In Figur 5 sind Scanbewegungen 32.5 und 33.5 bei einem quadratischen Spotarray dargestellt. Das Spotarray 30.5 ist auf der Darstellung nicht im einzelnen ausgeführt. Es ist hier ebenfalls die zwischen den einzelnen Spots die angegebene Neigung eingestellt, die sich nun als Array- neigung ausdrückt, und das geneigte Bild wird über das Probengebiet 34 gescannt.
Figur 6 zeigt eine Anordnung mit x/y- Tischscanner. Der optische Aufbau ist hier analog einem. Lichtmikroskop. Das Bild der Spotverteilung entsteht in der vor dem Empfänger 15.2 gelegenen Bildebene, in der das konfokale Pinholearray 14.2 angeordnet ist. Die Probe wird mit dem x/y- Scanningtisch in den angegebenen Richtungen, analog 32 und 33 bzw. 32.5 und 33.5 in den Figuren 3 und 5 verschoben. Bei hohen Spotzahlen, bei denen aufgrund der begrenzten, zur Verfügung stehenden, Lichtleistung mit geringen Geschwindigkeiten zu scannen ist, ist eine solche Anordnung vorteilhaft, um auch größere Probengebiete 34 schnell zu erfassen.

Claims

Patentansprüche
1. Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Anregungsstrahlengang, der Anre- gungsstrahlung in mehreren in einer Objektebene (11 ) gelegenen Spots 30 bündelt, und einem Detektionsstrahlengang, der die Spots (30) konfokal mittels Pinholeblenden (14.2) auf einen Mehrkanal-Detektor (15.2) abbildet, sowie mit einer Scaneinrichtung (4, 5, 37), die eine zweidi- mensionale Relativbewegung zwischen einem in der Objektebenen (11) gelegenen Objekt und den Spots (30) bewirkt, dadurch gekennzeichnet, daß die Scaneinrichtung (4, 5, 37) bei der Relativbewegung die Spots (30) entlang einer ersten Richtung (32) verschiebt und dadurch mit den Spots (30) einen Streifen des Objekts (34) abtastet und dann die Spots (30) entlang einer zweiten Richtung (33) verschiebt, um danach durch erneute Verschiebung entlang der ersten Richtung (32) einen benachbarten Streifen abzutasten.
2. Mikroskop nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch ein Mikrolinsenarray (16) zur Bündelung der Anregungsstrahlung, das zellenförmig oder rechteckig angeordnete Mirkolinsen aufweist, welche ein zeilenförmiges oder rechteckiges Spotmuster (30.5) bewirken.
3. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Spotmuster (30.5) bezüg- lieh der ersten Richtung (32) so gekippt ist, daß die Spots (30) senkrecht zur ersten Richtung (32) einen Abstand gleich oder kleiner dem Spotdurchmesser haben.
4. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand in der Objektebene (11) benachbarter Spots mindestens gleich dem zehnfachen Spotdurch- rnesser ist.
5. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Weg der Verschiebung entlang der ersten Richtung (32) größer als der Abstand benachbarter Spots (30) ist.
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