JP4231754B2 - レーザ走査型蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、３色以上の蛍光検出に用いるレーザ走査型蛍光顕微鏡に関する。

従来、所定の遺伝子やＤＮＡの染色体上での検出方法として、ＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）が知られている。この方法は、所定の蛍光体でマーキングした遺伝子やＤＮＡプローブを水銀ランプ等で励起し、発した蛍光を検出器で検出する方法である。
近年、蛍光分光画像解析は、最新の遺伝子工学等に欠かせない技術となっている。そして、ＦＩＳＨを応用した検出方法として、少なくとも３色以上の蛍光体を用いて、例えば多重遺伝子の検出を可能とする所謂Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨが知られている。

Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨを用いた顕微鏡としては、例えば、次の非特許文献１に開示のものが提案されている。
「M-FISHシステム 取扱説明書」，オリンパス光学工業株式会社，１９９８年１２月，M002，ｐ１，３，６

従来、ＦＩＳＨは、１光子励起に基づいて行なわれていた。このため、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨを行なうためには、励起波長が複数必要であり、また各蛍光のみを検出するためのフィルタ（バリアフィルタ）等も、その分だけ必要であった。
そして、非特許文献１に記載の顕微鏡では、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨを行なうために、水銀ランプを光源とする通常の蛍光顕微鏡を用いるとともに、透過波長の異なる励起フィルタとバリアフィルタを多数用意し、これらのうち所望の励起フィルタとバリアフィルタを顕微鏡内においてカセットやターレットを介して順次切り替えることにより、切り替える都度、所望の励起波長で標本を励起するとともに、その励起波長で励起された蛍光を検出していた。

このため、従来の蛍光顕微鏡では、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨを行なうための複数波長の蛍光検出を一度の測定で行なうことができず、しかも複数波長の蛍光励起のための操作がその分、煩雑化していた。

また、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨをレーザ走査型蛍光顕微鏡の１光子（１光子）で行なうためには、励起波長の種類分のレーザ光源が必要となる。しかし、従来型の共焦点レーザ走査型顕微鏡では、一般に、ごく少数種類の励起波長しか利用できない。このため、非特許文献１に記載の従来型の共焦点レーザ走査型顕微鏡では、２色程度のＦＩＳＨであれば、２本のレーザを用いることにより対応可能であるが、例えば３色〜７色の蛍光検出をする場合には、その蛍光の数に応じた多数のレーザを用いなければならず、到底対応できなかった。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであり、小型で、操作が簡単で、かつ、一度の測定で３色以上の蛍光色素を励起、検出可能なレーザ走査型蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明によるレーザ走査型蛍光顕微鏡は、レーザ光源部と、対物レンズと、前記レーザ光源部からの光が前記対物レンズを経て照射された標本で発する蛍光を検出する検出部とを有し、前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、前記検出部が、前記標本から前記対物レンズ方向に向かう蛍光を前記対物レンズを経て検出する少なくとも１つの第一の検出器と、前記標本から前記対物レンズの光軸とは所定の角度を持った方向に発散する蛍光を前記対物レンズを経ないで検出する少なくとも１つの第二の検出器と、を含む少なくとも３つの検出器を有しており、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を同時に検出するように構成されていることを特徴としている。
なお、このレーザ走査型蛍光顕微鏡は、前記検出部が、前記第一の検出器を３つ有し、前記第二の検出器を５つ有しており、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも８つの波長の異なる各蛍光を同時に検出するように構成されていることが好ましい。

また、上記目的を達成するため、本発明によるレーザ走査型蛍光顕微鏡は、レーザ光源部と、対物レンズと、前記レーザ光源部からの光が前記対物レンズを経て照射された標本で発する蛍光を検出する検出部とを有し、前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、前記検出部が、前記標本から前記対物レンズ方向に向かう蛍光を前記対物レンズを経て検出する第一の検出器と、前記第一の検出器で検出する蛍光と同じ種類であり前記標本から前記対物レンズの光軸とは所定の角度を持った方向に発散する蛍光を前記対物レンズを経ないで検出する第二の検出器とを組み合せたものを少なくとも３つ有しており、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を同時に検出するように構成されていることを特徴としている。
なお、このレーザ走査型蛍光顕微鏡は、前記検出部が、前記第一の検出器と前記第二の検出器とを組み合わせたものを５つ有しており、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも５つの波長の異なる各蛍光を同時に検出するように構成されていることが好ましい。

また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、染色体（ＤＮＡ）の解析に必須の、３色以上の蛍光を検出するＭｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨ（Fluorescence in situ Hybridization）に適用可能に構成されていることを特徴としている。

本発明によれば、小型で、操作が簡単で、かつ、一度の測定で３色以上の蛍光色素を励起、検出可能なレーザ走査型蛍光顕微鏡が得られる。

実施例に先立ち、本発明の作用効果について説明する。
従来の１光子励起や、３光子励起では、用いる蛍光色素の吸収波長域（３光子では約３倍の波長）に対応した励起光を照射しなければ、蛍光を効率よく発生させることができない。これに対し、２光子励起では、ある波長（例えば８００ｎｍ）を標本に照射すると、様々な蛍光色素を同時に励起させることができる。
本発明は、この点に着目し、レーザ走査型蛍光顕微鏡を、所謂２光子励起により蛍光を発生させるとともに、２光子励起で発生した３種類以上の波長の蛍光をほぼ同時に検出できるように構成したものである。

このように構成すれば、一つのレーザ（波長）を用いて、Ｍｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨによる３種類以上の波長の蛍光検出をほぼ同時に行なうことができる。なお、２光子励起により標本で発せられる３種類以上の波長領域の蛍光を検出する手段は、必要に応じて最適な手段を用いることができる。

具体的には、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、光源に一つの超短パルスレーザを用い、標本から２光子励起による蛍光が発せられるようにし、その蛍光中の少なくとも３種類の波長の異なる蛍光を検出するように構成する。このようにすれば、一つのレーザ（特定波長）で、少なくとも３種類以上の蛍光色素をほぼ同時に励起、検出することができる。

また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、検出器を検出する波長の種類分設ける。このようにすれば、各波長の蛍光を同時に検出することが可能となる。

また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、染色体（ＤＮＤ）の解析に必須なアプリケーションである、ＭｕｌｔｉＣｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ In ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に適用可能に構成する。このようにすれば、従来の顕微鏡に比べて、より簡単な操作でＭｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨによる３色以上の蛍光検出を行なうことができる。

以下、本発明の実施例を図面を用いて説明する。

図１は本発明の参考例にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の概略構成図である。
参考例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、２光子励起用レーザ光源部１と、ミラー２と、走査ユニット３と、ダイクロイックミラー４と、対物レンズ５と、ダイクロイックミラー６_１〜６_ｎ（ｎ：３≦ｎ）と、光電子増倍管（ＰＭＴ）７_１〜７_ｎ（ｎ：３≦ｎ）を有して構成されている。

２光子励起用レーザ光源部１は、例えば、チタンサファイアレーザで、レーザ光が１００フェムト秒程度の超短パルスで、近赤外の波長を持ち、１００ＭＨｚ程度の繰り返し周波数を持つレーザ装置として構成されている。

走査ユニット３は、所定方向に傾きを変えることにより標本８上を走査可能なミラー３ａを有している。
ダイクロイックミラー６₁は、標本８で発生し、ダイクロイックミラー４で反射された蛍光のうち所定波長の蛍光を反射し、その他の波長の蛍光を透過するように構成されている。
ダイクロイックミラー６₂は、ダイクロイックミラー６₁を透過した蛍光のうち所定波長領の蛍光を反射し、その他の波長の蛍光を透過するように構成されている。
ダイクロイックミラー６_nは、ダイクロイックミラー６_n-1を透過した蛍光を反射するように構成されている。

このように構成された参考例のレーザ走査型蛍光顕微鏡では、２光子励起用レーザ光源部１から近赤外の波長を持ち１００フェムト秒程度の超短パルスのレーザ光が出射される。出射されたレーザ光は、ミラー２、走査ユニット３、ダイクロイックミラー４、対物レンズ５を経て、標本８上に照射される。標本８はレーザ光を２光子励起されることで、３種類以上の複数の波長の蛍光を発する。蛍光は、対物レンズ５を経て、ダイクロイックミラー４で反射される。反射された蛍光は、ダイクロイックミラー６_１〜６_ｎ、光電子増倍管７_１〜７_ｎを介して、夫々所定の波長の蛍光ごとに検出される。

従って、参考例のレーザ走査型蛍光顕微鏡によれば、従来の１光子顕微鏡を用いた場合と異なり、２光子励起により、一つのレーザでもって、様々な色の３種類以上の蛍光色素を同時に励起させることができる。また、従来の１光子顕微鏡を用いた場合のような複数波長の光励起操作のために励起フィルタとバリアフィルタを多数用意してこれらのうち所望の励起フィルタとバリアフィルタを切り替えるという必要がなくて済む。

次に、図２に本発明の第１実施例に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡を示す。本実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、図１の構成のダイクロイックミラー６_１〜６_３、光電子増倍管７_１〜７_３に加えて、所定波長の蛍光のみを透過させるバリアフィルタ９ａ_１〜９ａ_５と光電子増倍管９ｂ_１〜９ｂ_５とを備えた５つのユニット９_１〜９_５が設けられている。ユニット９_１〜９_５のそれぞれのバリアフィルタ９_ａ１〜９_ａ５は、それぞれ所望波長の蛍光のみ透過する特性を有している。なお、図２中、レンズ５_１’〜５_５’は、標本８で発生し対物レンズ５以外の方向に向かって発散する蛍光を平行光にしてバリアフィルタ９_ａ１〜９_ａ５に導くレンズである。
本実施例によれば、標本８で発生した蛍光のうち、対物レンズ５以外の方向に向かう５種類の蛍光は、ユニット９_１〜９_５の光電子増倍管９ｂ_１〜９ｂ_５で検出され、一方、対物レンズ５を通過した３種類の蛍光は、光電子増倍管７_１〜７_３で検出される。つまり、本実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡によれば、合計８種類の蛍光を検出することができる。
そして、対物レンズ５以外の方向の蛍光を含めて合計８種類の蛍光を検出するので、対物レンズ５を通過した蛍光のみで８種類の蛍光を検出するように構成した場合に比べて、ダイクロイックミラー４の後方に配置すべき光電子増倍管の数を少なくすることができ、ダイクロイックミラー４以降の装置の長さ（大きさ）を短く（小さく）することができる。

また、本実施例の変形例として、対物レンズ５を通過した蛍光を検出する光電子増倍管の数と、対物レンズ５以外の方向に向かう蛍光を検出する光電子増倍管の数とを同数配置、例えば、光電子増倍管７_１〜７_５と光電子増倍管９ｂ_１〜９ｂ_５というように夫々５個ずつ配置し、光電子増倍管７_１と光電子増倍管９ｂ_１、光電子増倍管７_２と光電子増倍管９ｂ_２、…、光電子増倍管７_５と光電子増倍管９ｂ_５を夫々ペアーとし、ペアー毎に同じ種類の蛍光を検出することができるようにして合計で５種類の蛍光を検出することができるようにし、図示省略した蛍光信号合成手段等を介して同じ種類の蛍光を合成するようにしてもよい。
このように構成した場合は、標本８で発生する蛍光が非常に強度が弱い場合であっても、標本８で発生する対物レンズ５以外の方向に向かう蛍光と対物レンズ５を通過する蛍光とを同じ種類の蛍光として同時に検出することができ、その分、より多くの光量で高精度に検出することができ、明るい蛍光観察が可能になる。

本発明の参考例にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の概略構成図である。 本発明の実施例にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の変形例を示す概略構成図である。

符号の説明

１ ２光子励起用レーザ光源
２，３ａ ミラー
２’，４，６_１，６_２，６_ｎ ダイクロイックミラー
３ 走査手段
５ 対物レレンズ
５_１’，５_２’，５_３’，５_４’，５_５’ レンズ
７_１，７_２，７_３，７_ｎ，９ｂ_１，９ｂ_２，９ｂ_３，９ｂ_４，９ｂ_５ 光電子増倍管
８ 標本
９_１，９_２，９_３，９_４，９_５ ユニット
９ａ_１，９ａ_２，９ａ_３，９ａ_４，９ａ_５ バリアフィルタ

Claims (5)

1. レーザ光源部と、対物レンズと、前記レーザ光源部からの光が前記対物レンズを経て照射された標本で発する蛍光を検出する検出部とを有し、
   前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、
   前記検出部が、前記標本から前記対物レンズ方向に向かう蛍光を前記対物レンズを経て検出する少なくとも１つの第一の検出器と、前記標本から前記対物レンズの光軸とは所定の角度を持った方向に発散する蛍光を前記対物レンズを経ないで検出する少なくとも１つの第二の検出器と、を含む少なくとも３つの検出器を有しており、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を同時に検出するように構成されていることを特徴とするレーザ走査型蛍光顕微鏡。
2. 前記検出部が、前記第一の検出器を３つ有し、前記第二の検出器を５つ有しており、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも８つの波長の異なる各蛍光を同時に検出するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
3. レーザ光源部と、対物レンズと、前記レーザ光源部からの光が前記対物レンズを経て照射された標本で発する蛍光を検出する検出部とを有し、
   前記レーザ光源部が、前記標本で２光子励起による蛍光を発生させる一つの超短パルスレーザで構成され、
   前記検出部が、前記標本から前記対物レンズ方向に向かう蛍光を前記対物レンズを経て検出する第一の検出器と、前記第一の検出器で検出する蛍光と同じ種類であり前記標本から前記対物レンズの光軸とは所定の角度を持った方向に発散する蛍光を前記対物レンズを経ないで検出する第二の検出器とを組み合せたものを少なくとも３つ有しており、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも３つの波長の異なる各蛍光を同時に検出するように構成されていることを特徴とするレーザ走査型蛍光顕微鏡。
4. 前記検出部が、前記第一の検出器と前記第二の検出器とを組み合わせたものを５つ有しており、前記標本で２光子励起により発した蛍光のうち少なくとも５つの波長の異なる各蛍光を同時に検出するように構成されていることを特徴とする請求項３に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
5. 染色体（ＤＮＡ）の解析に必須の、３色以上の蛍光を検出するＭｕｌｔｉ Ｃｏｌｏｕｒ ＦＩＳＨ（Fluorescence in situ Hybridization）に適用可能に構成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。