JP4827335B2 - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は染色した標本上をレーザ光により走査することにより、得られる標本からの光を分光し、分光データを得ることのできる走査型レーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞や組織を観察し易くするために、染色用の試薬で染色することが行われている。染色用の試薬には種々のものがあり、生体組織は成分により、染まり易い試薬と、染まり難い試薬とがある。これを利用して、目的に応じた所望の試薬により試料（標本）を染色して、顕微鏡観察に供することが行われている。そして、現在では更に一歩進めて、複数種の蛍光試薬で染色した試料にレーザ光を照射し、このレーザ光照射により試薬から励起された蛍光放射を分光して得られたスペクトルのデータを収集し、分析に用いることが行われている。
【０００３】
そのために用いるのが走査型レーザ顕微鏡であり、これは、レーザ光を対物レンズを介して集光して走査装置により標本上を走査し、標本からの光を分光器に与えて分光するとともに、前記走査装置からの走査信号に同期して分光データを得ることで、試料におけるレーザ照射位置からの光のスペクトル情報を得るものである。
【０００４】
（従来技術１）
走査型レーザ顕微鏡の一例をあげると、特表平９−５０２２６９号公報に示す如きの技術がある。ここに開示された技術は蛍光光束をプリズム等のスペクトル分解手段により分光し、一方では第一スペクトル範囲を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分を反射して第二スペクトル範囲をなす二つの光路を構成し、それぞれの光路に対して光検出器を設けて構成した共焦点走査型レーザ顕微鏡である。
【０００５】
図５は、上記共焦点走査型レーザ顕微鏡の構成を示す図である。レーザ光源２０２から出射されたレーザ光束２０３は、方向変更ミラー２０４、レーザラインフィルタ２０５、レンズ２０６、絞り２０７を介してダイクロイックミラー２０８に導かれて、ここで反射させ、レンズ２０９、Ｘ−Ｙ走査光学系２１０、瞳投影レンズ２１１、対物レンズ２１２を経て試料２１３に達する。
【０００６】
試料２１３からの反射光および蛍光からなる光束２１４は、対物レンズ２１２、瞳投影レンズ２１１、Ｘ−Ｙ走査光学系２１０、レンズ２０９を経てダイクロイックミラー２０８に戻る。そして、光束２１４のうち、蛍光分はダイクロイックミラー２０８を透過して蛍光光束２１７となり、このうち、共焦点絞り２１５を通過したものが分光器２１６へと入射する。
【０００７】
図６は、分光器２１６の構成を示す図である。選択装置２２５は、光束２１７を分解するスペクトル分解手段２２７と、一方では第一スペクトル範囲２２９を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分２３０を反射する手段２２８とを有している。光検出器２２６は、絞り込まれた第一スペクトル範囲２２９の光路に配置された第一光検出器２３１と、反射されたスペクトル範囲の光路に設置された第二光検出器２３２とを有している。
【０００８】
さらに選択装置２２５は、反射されたスペクトル範囲２３０の光路に設置され、第二スペクトル範囲２３４を絞り込む手段２３３を有する。第二光検出器２３２は、絞り込まれた第二スペクトル範囲２３４の光路に設置されている。
【０００９】
（従来技術２）
また、別の例として、特開２０００−５６２４４号公報には、反射光や蛍光のような、分散しながら分割される照明光と対象物からの光との両方または一方を波長選択するための、照明と検出工程との両方または一方に、選択的に切り替え可能な少なくとも１基の微小鏡配列（ＤＭＤ）を持つ走査型レーザ顕微鏡が開示されている。
【００１０】
この公報に開示された走査型レーザ顕微鏡の構成は図７に示す如きである。すなわち、この構成において、レーザ光源Lsからのレーザ光LBは走査手段Scnにより間欠的に位置を移動させるかたちで走査されることにより試料Smp上をＸ−Ｙ走査され、その走査位置にある試料Smpからレーザ光LBにより励起された蛍光が放射される。
【００１１】
試料Smpから放出される（蛍光）放射は対象物と共役な平面内に位置する共焦点ピンホールPh上へ焦点を結ぶ。このピンホールPhは同時に分光装置の開口部でもあり、プリズムＰを用いた分光器は当該プリズムＰの分散作用によって試料放射をそのスペクトル成分へ分離する。試料放射の焦点面には１次元のＤＭＤがあり、ここに試料スペクトルが光学的に結像される。
【００１２】
１次元のＤＭＤは個別に駆動可能な多数の切り替え鏡からなる。そして、レーザ光源Lsからのレーザ光LBが試料Smpの上に留まる間、逐次的に鏡が１つずつ個別に駆動（そしてこれにより切り替え）されることにより、その位置に分光されて到達した光を検出器Dtcに送る。こうして試料放射の個々のスペクトル成分が逐次的に検出器Dtcにて検出され、試料Smpから放出される（蛍光）放射の全スペクトルデータが得られる。
【００１３】
また別の方法として、複数の鏡を同時に駆動して、試料からの所望のスペクトル域の光を選択的に検出器に導くこともできる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
近年蛍光観察においては、単染色のみならず多重染色が多用されている。もとより、蛍光染色は細胞、組織内の特定対象を視認可能にするために行われる。このため多重染色観察では、各染色部位が明確な色の差、すなわち、蛍光波長の違いとして検出されなければならない。しかも、蛍光波長の部分的な重なり（クロスオーバ部分）を効率良く除去して検出する必要がある。
【００１５】
さらに、細胞機能の研究を行う上で、細胞内のカルシウムイオン濃度を検出するための蛍光プローブが広く利用されるようになった。カルシウムイオンは細胞の活動状況に密接な関係を持つためである。カルシウムイオンの染色には蛍光試薬として“ＩＮＤＯ−１”が良く知られているが、この“ＩＮＤＯ−１”を用いることで、定量的に細胞内カルシウムイオン濃度を測定できる。
【００１６】
“Ｉｎｄｏ−１”で染色した試料（標本）は、ＵＶ光（紫外線）を照射することにより、蛍光を発する。そして、発生した当該蛍光を２つの異なる波長域（中心波長４０５[ｎｍ]と４８０[ｎｍ]）で検出し、検出光量の比（中心波長４０５[ｎｍ]の蛍光／中心波長４８０[ｎｍ]の蛍光）を演算して求めることにより、カルシウムイオン濃度を測定できる。
【００１７】
走査型レーザ顕微鏡を用いて試料に対し、レーザ光の走査を繰り返し行い、前記演算により細胞内カルシウムイオン濃度の時間変化を測定する。なお、一般的には特定波長帯の光を反射し、他は透過させる光学特性を持つダイクロイックミラーにより、試料からの蛍光を４５０[ｎｍ]で二つの光路に分岐し、一方は中心波長４０５[ｎｍ]、バンド幅約２０[ｎｍ]、他方は中心波長４８０[ｎｍ]、バンド幅約２０[ｎｍ]のバンドパスフィルタＢＰＦ１，ＢＰＦ２を使用して検出波長領域を絞るようにしている。
【００１８】
しかしながら、前記蛍光の中心波長は細胞の状態、例えばｐＨ（ペーハー；水素イオン濃度）によりシフトする。例えば、上記Ca2+maxおよびCa2+minなる蛍光が図８に示すようにその中心波長がＯ1，Ｏ2にシフトしたとすると、この場合、バンドパスフィルタＢＰＦ１，ＢＰＦ２の中心波長BPF1o，BPF2oと蛍光Ca2+maxおよびCa2+minの中心波長Ｏ1，Ｏ2との間にズレが生じ、その結果、本来得られるべき光量が得られなくなるので、データのＳ／Ｎ（信号／雑音）が劣化するだけでなく、光量比で表わされる演算結果も本来得られるべき値とは違ったものとなる可能性がある。
【００１９】
つまり、従来技術１における前述したようなフィルタのセットは常に最良であるとは限らない。
【００２０】
一方、特表平９−５０２２６９号公報の装置は各検出器に導く試料からの蛍光の波長域を自由に変更できるので、従来技術１における上記のような問題点を解決する上で、有効と考えられる。事実、多重染色観察において蛍光波長の部分的な重なり（クロスオーバ部分）を効率良く除去して検出する目的においては、繰り返し走査して画像を確認しながらスリットを制御することにより、試料からの蛍光スペクトルを自由に選択できるので、光学的なバンドパスフィルタを利用する方式より遙かに良い。但し、繰り返しレーザ走査を行うことにより試料は退色するのでレーザ走査は可能な限り少なくできることが望ましい。
【００２１】
しかしながら、上記細胞内カルシウムイオン濃度を測定する例では、細胞の状態、例えば、ｐＨは検査者にとっては未知であり、蛍光の中心波長がどこにあるのか、蛍光波長の部分的な重なり（クロスオーバ部分）がどのレベルであるかを事前に正確に知る術はないことから、得られた結果が最善か否かがわからないと言う問題がある。
【００２２】
すなわち、カルシウムイオン濃度の変化を捉えることができたとしても、その結果が最善のものであるかどうかは検査者は全くわからないということであり、最善の結果が得られている保証はないわけである。
【００２３】
試行錯誤的に繰り返し試験を行うことが可能であれば、得られる結果を最適なものに近づけることは可能ではある。しかし、この種の試験は一度データ取得を行うと、基本的には試料を交換しなければならず（一般的には薬品で刺激を与えることにより試験を開始するが、一旦刺激を与えると２度目の刺激は効果がない。）、したがって、細胞の準備等に莫大な手間と費用が必要であり、現実的には困難と言わざるを得ない。
【００２４】
このように、上記従来技術の根本的な欠点は、試料の像を作るために、あらかじめ設定したスペクトル、つまり、スリットを通過する蛍光の平均強度だけしか利用できない点にある。
【００２５】
一方、特開２０００−５６２４４号公報の技術は、試料からの蛍光の分光データを得るに際して、全分光データを収集しようとする場合、ＤＭＤのミラー素子を一枚ずつ駆動して光検出器に試料からの蛍光の分光スペクトルを導かなければならないので、全スペクトル領域のスペクトルデータを得るには時間がかかるという欠点がある。
そのため、細胞内カルシウムイオン濃度のような変化の速い現象を観察、測定するには不向きな装置となる。従って、従来技術では、細胞内カルシウムイオン濃度のような変化の速い現象を観察、測定の対象とすることはできなかった。故に、これを打開する技術の早急な開発が嘱望されている。
【００２６】
従って、本発明の目的とするところは、細胞内カルシウムイオン濃度を測定するような場合のように、試料からの蛍光スペクトルを正確に知ることができない試験や撮像を行うに当たり、最適な解析結果を確実に得ることのできる走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【００２７】
また、本発明の目的とするところは、染色した試料の放出する光の全スペクトルを一度にデータ収集できるようにした走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【００２８】
また、本発明の目的とするところは、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で、所望のスペクトルについて反映された画像を表示できるようにした走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【００２９】
また、本発明の目的とするところは、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で、望ましくは１回の走査で蛍光波長の部分的な重なり（クロスオーバ部分）を効率良く除去して画像表示することのできる走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【００３０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決し、目的を達成するために、本発明の走査型レーザ顕微鏡は以下のように構成する。
【００３１】
［１］ レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させて検出することにより、スペクトルのデータを得るようにした走査型レーザ顕微鏡において、
入射光量対応に電気信号を発生する複数の微小受光素子を直線的に配列させた１次元光検出手段を用い、前記分光手段の分光出力をこの１次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが所定の関係を以て入射される配置関係とすることにより画素単位でスペクトルのデータを得る検出器と、
前記検出器の各微小受光素子より得られる電気信号を収集して画素単位でのスペクトル分布データとして記憶保存する手段と、
画像表示するためのスペクトル域の指示を受け付ける手段と、
前記記憶保存されたデータのうち、前記指示されたスペクトル域に対応するデータを抽出して加算し、前記スペクトル域の画像を生成する手段と、
前記生成された画像を表示する手段を備え、
スペクトル域の前記指示入力とそれに対応したスペクトル域の画像生成と表示を、前記記憶保存された同じデータに基づいて繰り返して実施可能にしたことを特徴とする。
［２］ また、［１］項の構成において、前記スペクトル域の指示を受け付ける手段は、画面上で表示されたスペクトル分布の中から所望の前記スペクトル域を指示するためのインターフェースを備えたことを特徴とする。
【００３２】
レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させ、検出手段で検出することにより、試料における１地点毎のスペクトルデータを得るが、スペクトルデータは例えばプリズム等による分光手段を用い、この分光手段により分光して１次元光検出手段に入射させることで得る。１次元光検出手段は、複数の微小受光素子を直線的（１次元的）に配列させた構成であり、前記分光手段の分光出力をこの１次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが対応関係を以て入射される配置関係としてあることから、微小受光素子はその位置がどこであるかにより、入射される波長域が定まる。従って、特定位置の微小受光素子にはスペクトルの特定波長域の光が入射する構成となるから、この各微小受光素子よりその入射光量対応の信号を得てこれを受光素子個別にディジタルデータ化し、受光素子の並び順に収集すると波長成分が特定できるデータ、すなわち、全てのスペクトル分布がわかるデータとして収集されると言う効果がある。
【００３３】
しかも、試料に照射するレーザ光は、試料上を移動走査させるので、その時々で収集される上記データは試料に対するレーザ光の照射点における放出光のデータであり、走査範囲で定まる画面を構成する画素単位でのスペクトル分布データとなる。そのため、画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集できる。
【００３４】
従って、本発明によれば、試料からの蛍光の分光データを短時間に一度に全て取得することが可能な技術が確立する。また、本発明によれば、細胞内カルシウムイオン濃度を測定するような場合のように、試料からの蛍光スペクトルを正確に知ることができない試験や撮像を行うに当たり、最適な解析結果を確実に得ることのできる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【００３５】
また、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で、必要な蛍光スペクトルのデータを収集できるようになる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【００３７】
この構成によれば、前記検出器の各微小受光素子より得られる電気信号を収集して得たデータを画面構成分収集し、記憶保存し、この保存データを用いて画像を生成するが、画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集されていることから、所望にスペクトル範囲を種々指定してその指定範囲のスペクトルによる画像を表示でき、従って、１度データを収集してしまえば、そのデータを利用して種々に画像を生成することで、最適な画像を見付けることができる。
【００３８】
従って、本発明によれば、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で、所望のスペクトルについて反映された画像を表示できるようになる走査型レーザ顕微鏡を提供できる。
【００３９】
［３］ また、［１］項の構成において、前記スペクトル域の指示を受け付ける手段は、前記レーザ光源の出力レーザ波長より長い波長である少なくとも二種のスペクトル域の指示を受け付け、
前記スペクトル域の画像を生成する手段は、前記保持されたデータのうち、前記指示された二種のスペクトル域に対応するデータをそれぞれ抽出して加算するとともに、両者の比を求めて当該比に基づく画像を生成し、次の画像を生成するまでの間、前記生成した画像を出力し、
前記表示する手段が前記出力された画像を表示することを特徴とする。
【００４０】
この構成においては、１画面分の走査を終えると時間をおいて再びレーザ光による試料の１画面分の走査を実施する間欠走査において、一つの走査が終了するたびに画像表示されるので、検査者は画像の変化の様子を確認できる。そのため、もし、試験が上手くいっていないようなら、そこで試験を中止する等の対応ができ、時間の浪費をせずに済むようになる。
【００４１】
その他、本発明は次のような態様が包含され得る。
【００４２】
（１）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を対物レンズを介して集光して走査装置により試料上を走査し、試料からの光を分光器に投射するとともに、前記走査装置からの走査信号に同期して所定のスペクトル帯に対応する分光データを得ることのできる走査型レーザ顕微鏡であって、前記分光データにおいて、所望のスペクトル域のデータのみを抽出して演算し、この演算結果をもとに、走査終了後に画像表示を行うものである。
【００４３】
（２）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、所望のスペクトル域を変更することによりデータの演算を再度行い、この演算結果をもとに再度画像表示を行うものであり、またこのシーケンスを繰り返し行うものである。
【００４４】
（３）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）、（２）に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記分光データにおいて、複数の所望のスペクトル域を指定し、これら各スペクトル域のデータのみを抽出して演算し、この演算結果をもとに、少なくとも１枚の画像プレーンに画像表示するものである。
【００４５】
（４）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）、（２）に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記分光データにおいて、複数の所望のスペクトル域を指定し、これら各スペクトル域のデータのみを抽出して演算し、この演算結果をもとに、前記指定された複数のスペクトル域に対応する画像をそれぞれ各画像プレーンに表示するものである。
【００４６】
（５）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）〜（４）に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記画像表示は、所望のスペクトル域のデータ（光強度データ）の合計値をもとに行うものである。
【００４７】
（６）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（３）に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、２つの所望のスペクトル域を指定し、各スペクトル域のデータのみを抽出して、それぞれの合計値を演算するとともに、これら合計値の比を演算し、この演算結果をもとに画像表示するものである。
【００４８】
（７）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）〜（６）に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記画像表示は、レーザ波長を除く全スペクトル域のデータ（光強度データ）の合計値またはレーザ波長を除く、これよりも長いスペクトル域のデータ（光強度データ）の合計値をもとに行うことが、あらかじめ設定されている。
【００４９】
（８）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）〜（６）に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記画像表示は、レーザ波長を除く全スペクトル域のデータ（光強度データ）の合計値またはレーザ波長を除く、これよりも短いスペクトル域のデータ（光強度データ）の合計値をもとに行うことが、あらかじめ設定されている。
【００５０】
（９）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、前記分光器は１次元、または２次元のＣＣＤ配列を含んでいる。
【００５１】
（１０）本発明の走査型レーザ顕微鏡は、上記（１）に記載の走査型レーザ顕微鏡であり、時間経過観察のために試料走査は所定回数だけ間欠的に行われ、前記画像表示は走査後に所定回数行われる。
【００５２】
【発明の実施の形態】
本発明は、試薬により染色された試料からの蛍光の分光データを全スペクトル範囲に亙り、短時間に全て取得することができるようにし、この取得した全スペクトル範囲の分光データの中から、所望のスペクトル領域の分光データを用いて解析や画像表示を行えるようにしたもので、以下、図面を参照して本発明の実施例の詳細を説明する。
【００５３】
（第１の実施形態）
図１は、本発明の第１の実施形態に係わる共焦点走査型レーザ顕微鏡の構成を示す図である。図において、１は所望の波長のレーザ光を発振出力するレーザ光源であり、測定対象を例えば、Ｉｎｄｏ−１で標識された細胞内カルシウムイオン濃度とする場合にはレーザ光源１として、３５１[ｎｍ]の発振線を有するアルゴンレーザ光源を用いる。２はこのレーザ光源１から出射されたレーザ光束（レーザビーム）である。
【００５４】
３はビームエキスパンダであり、レーザ光源１から出射されたレーザ光束２を、対物レンズ瞳径に略一致するようにビーム径を拡大させるための光学系である。４はレーザラインフィルタであって、予め設定した所望の波長の光を選択的に透過させるフィルタである。測定対象をＩｎｄｏ−１で標識された細胞内カルシウムイオン濃度とする場合には、３５１[ｎｍ]の波長を選択的に透過させる光学フィルタとする。また、５はダイクロイックミラーであって、特定波長帯の光を反射し、他は透過させる光学特性を持つハーフミラーである。測定対象物を細胞内カルシウムイオン濃度とする場合には、３５１[ｎｍ]の波長を選択的に反射させ、他は透過させる光学特性を持つミラーを用いる。
【００５５】
また、６はＸ−Ｙ走査光学系であって、７は瞳投影レンズ、８は結像レンズ、９は対物レンズ、１０は試料である。試料１０は目的に応じた試薬で染色してある。対物レンズ９は試料１０に近接して進退調整可能であって、試料１０に対する光学系の焦点を合わせるためのレンズであり、結像レンズ８および瞳投影レンズ７はその光軸を対物レンズ９の光軸に一致させて配されている。
【００５６】
また、１１は共焦点レンズ、１２は共焦点絞り、１３はコリメートレンズ、１５はプリズムであって、これら共焦点レンズ１１、共焦点絞り１２、コリメートレンズ１３は試料１０からの光をプリズム１５に導く光学経路上にその光軸を一致させて配置されている。
【００５７】
プリズム１５は、入射された各波長の光を分光するためのものである。
【００５８】
ダイクロイックミラー５は試料１０からの光をプリズム１５に導く光学経路上であって共焦点レンズ１１とＸ−Ｙ走査光学系６との間の光路にその面を斜めにして配置され、レーザラインフィルタ４を介してレーザ光源１から導かれたレーザ光束２を、ここで反射させて試料１０側に導くと共に、試料１０側からの光を共焦点レンズ１１側に導くよう、レーザ光源１の光軸上との交点に配置してある。
【００５９】
共焦点レンズ１１は試料１０に対する対物レンズ９の焦点位置と共役な焦点位置を持つレンズであり、共焦点絞り１２はこの共焦点レンズ１１の共焦点位置に配置された絞りである。共焦点絞り１２はピンホールの役割を担うものであり、抽出対象の光の持つ波長により理想のピンホール径は異なるので、調整できるよう、絞りとしての機能も備えている。
【００６０】
試料１０から放出される蛍光は試料における観察対象物部分と共役な平面内に位置するこの共焦点絞り１２上へ焦点を結ぶので、この共焦点絞り１２を通った光が分光器１４に入射し、当該分光器１４のプリズム１５に入射されて分光される仕組みである。
【００６１】
Ｘ−Ｙ走査光学系６はダイクロイックミラー５と、瞳投影レンズ７との間の光路中に配され、所定の範囲内で光路を光学的に移動させることができるものである。１６は集光レンズ、１７は１次元ＣＣＤ（画素が一列に配列された固体撮像素子）であって、集光レンズ１６はプリズム１５により分光された光を所定範囲に集めるためのレンズであり、１次元ＣＣＤ １７上に集光するためのものである。なお、１次元ＣＣＤ １７は集光レンズ１６の焦点位置に配置されている。
【００６２】
図２に示すように、１次元ＣＣＤ １７は画素に相当する複数の受光セルを一列に密に配列してなるラインイメージセンサであり、プリズム１５により分光された光を集光レンズ１６により１次元ＣＣＤ １７の受光セル配列範囲内に集めることにより、特定のスペクトルの光は特定のセル位置に入射して検出される構成となっている。そして、ＣＣＤ １７は光の入射によってそのセルに生成された電荷による画素信号（輝度信号）を、読み出し時にはセルの並ぶ順番に直列データで出力する構成であるから、画素信号の直列データの位置がそれぞれ特定スペクトルの検出信号となる対応関係を持つ構成である。
【００６３】
尚、プリズム１５、集光レンズ１６、１次元ＣＣＤ １７で分光器１４を構成している。レーザ光はＸ−Ｙ走査光学系６により試料１０に対してＸ−Ｙ走査するものであり、ある瞬間でのレーザ光により励起された蛍光のプリズム１５による分光後の１次元ＣＣＤ １７出力は、レーザ光が照射された位置での励起蛍光（或いは反射光）に含まれる全てのスペクトル分を個別に含む検出画素信号ということになる。
【００６４】
３１は制御装置であって、Ｘ−Ｙ走査光学系６を駆動制御するものであり、３０は信号処理装置であって、１次元ＣＣＤ １７で検出された入射光強度対応の信号を、制御装置３１のサンプリング信号に同期して、ディジタル信号に変換して出力するものであり、３２はコンピュータであって、信号処理装置３０の出力するデータを受けてこれをファイルとして記憶手段に保存すると共に、保存されたこれらファイルを用いてスペクトル画像を生成したり、スペクトルのグラフ表示をしたり、スペクトル範囲を指定することで、その指定したスペクトル範囲の画像を生成したりするといった機能を有する。３３はモニタ装置であり、コンピュータ３２の出力画面を表示する画像表示装置である。
【００６５】
尚、コンピュータ３２は、画像生成のアプリケーションと、検査者の操作や指示を行い易くサポートするインタフェースであるＧＵＩ（Graphical User Interface；画面上に表示されたアイコンやウインドウなどのグラフィカルな要素を、マウスなどのポインティング・デバイスを用いてコンピュータを操作する方式のインタフェース）を持ち、画像毎に収集された全てのスペクトル分布を画面に表示したり、表示されたスペクトル分布の中から、所望のスペクトル範囲を少なくとも１つ以上個別に指定したり、その指定スペクトル領域についてのデータを記憶手段から抽出して画像を生成して表示したりすると云った機能を有する。
【００６６】
次にこのような構成の本装置の作用を説明する。いま、細胞内カルシウムイオン濃度に関する測定を実施しようとする場合を考える。この場合、試料１０の染色には蛍光試薬として“ＩＮＤＯ−１”を用いる。また、この場合、レーザ光源１としてはアルゴンレーザ光源を用いる。“ＩＮＤＯ−１”により染色された試料１０を対物レンズ９の下に置き、対物レンズ９の焦点を合わせる。
【００６７】
その後、レーザ光源１からレーザ光を出射させる。レーザ光源１は３５１[ｎｍ]の発振線（レーザ光）を有するアルゴンレーザ光源であり、当該レーザ光源１から出射された３５１［ｎｍ］のレーザ光束２は、ビームエクスパンダ３により対物レンズ瞳径に略一致するようにビーム径が拡大される。そして、レーザラインフィルタ４を介してダイクロイックミラー５へと導かれる。
【００６８】
レーザラインフィルタ４では３５１[ｎｍ]の発振線を選択的に透過させる。レーザラインフィルタ４を透過した３５１[ｎｍ]の波長を有するレーザ光はダイクロイックミラー５で反射され、Ｘ−Ｙ走査光学系６、瞳投影レンズ７、結像レンズ８、対物レンズ９を経て試料１０に達する。
【００６９】
ここで、試料１０に対するレーザ光集束点は対物レンズ９で定まり、試料１０上でのレーザ光集束位置はレーザ光をＸ−Ｙ走査するためのＸ−Ｙ走査光学系６によるＸ−Ｙ走査位置により定まる。
【００７０】
試料１０は蛍光試薬“ＩＮＤＯ−１”で標識されており、３５１[ｎｍ]の波長を有するレーザ光が試料１０に照射されることにより、その照射点となった試料１０からは反射光もしくはレーザ光による励起によって蛍光が生じる。試料１０からの反射光および蛍光からなる光束２０は、対物レンズ９、結像レンズ８、瞳投影レンズ７、Ｘ−Ｙ走査光学系６、を経てダイクロイックミラー５に戻る。そして、光束２０はダイクロイックミラー５を透過し、ここで、元のレーザ光波長成分の光が除去されて、蛍光成分の光のみとなり、これはさらに共焦点レンズ１１を透過し、前記試料１０の前記照射点となった位置からの光が集束されて共焦点絞り１２の側に焦点を結ぶ。そして、その集束点にある共焦点絞り１２により、前記試料１０の前記照射点となった位置からの光が取り出され、それ以外は共焦点絞り１２の絞り開口部（ピンホール）から外れることにより除去される。共焦点絞り１２を通過した光はコリメートレンズ１３によりコリメート（平行光線化）され、分光器１４に入る。
【００７１】
分光器１４はプリズム１５、集光レンズ１６、および１次元ＣＣＤ １７からなり、共焦点絞り１２を通過してコリメートレンズ１３により平行光線化された光束はプリズム１５でスペクトル分解され、集光レンズ１６を介して１次元ＣＣＤ １７上に集光される。１次元ＣＣＤ １７は集光レンズ１６の焦点位置に配置されており、しかも、微少なサイズの複数の受光セルが、リニアに、且つ、密に配列されたものであって、分光されるスペクトルの分布範囲が１次元ＣＣＤ １７における受光セルの配列範囲に見合うように、集光レンズ１６により集光される。
【００７２】
従って、各受光セルの配列位置と、分光されるスペクトルの波長域は特定の関係にある。分光されて得られたスペクトルの波長と１次元ＣＣＤ １７におけるその波長のスペクトルを検出する受光セルの位置が定まっているわけである。
【００７３】
従って、プリズム１５によりスペクトル分解されることにより、各波長別に分離された光は、１次元配列された１次元ＣＣＤ １７上における分光光路対応位置の受光セルに入射する。そして、１次元ＣＣＤ １７には試料１０におけるその時点でのレーザ光照射位置における出力光の持つスペクトル成分が、その成分対応の受光セルに入射する結果、その受光セルは入射光量相当の電荷を生成する。
【００７４】
このようにして生成された電荷は受光セルの並び順にしたがって順番に読み出され、受光セル単位で連なる光強度信号として信号処理装置３０に与える。信号処理装置３０は制御装置３１からのサンプリング信号に同期して１次元ＣＣＤ １７で検出された光強度信号をディジタル信号に変換処理し、そして、例えば、パソコンの標準バスであるＰＣＩバスを経由してコンピュータ３２に転送する。
【００７５】
コンピュータ３２では、これを受け取って記憶手段に記憶する。この記憶した１ライン分の各受光セルのディジタル信号は、試料１０における特定走査位置での出力光の持つ全スペクトル成分の成分別データ（スペクトル分布特性のデータ）である。そのため、試料１０における特定走査位置での出力光の持つ全スペクトル成分の成分別データが一度に収集できることになる。
【００７６】
一地点でのデータ収集が終わったならば、制御装置３１は自己の発生するサンプリング信号に同期させながらＸ−Ｙ走査光学系６を駆動制御して次の画素のスペクトルデータを取得すべく、試料１０に対するレーザ光２の位置を移動させる。そして、上述のようにその位置からの光をプリズム１５により分光してその位置での試料１０のスペクトル成分の全データ（スペクトル分布特性のデータ）を収集する。
【００７７】
制御装置３１はサンプリング信号に同期させながらＸ−Ｙ走査光学系６を駆動制御して試料１０に対するレーザ光２の位置を移動させることで、試料１０の各位置を網羅するようにＸ−Ｙ走査し、各位置での試料１０のスペクトル成分の全データを収集していくことになる。
【００７８】
上述した１次元ＣＣＤ １７は、例えば、受光セル数が２５６素子相当のラインイメージセンサであり、最短波長３５０[ｎｍ]、１素子あたり約１[ｎｍ]に相当するようにプリズム１５と集光レンズ１６の焦点距離が光学的に設定されていたとすると、この場合、１次元ＣＣＤ １７は３５０[ｎｍ]から６０５[ｎｍ]までの範囲のスペクトルが検出可能な構成となる。
【００７９】
そして、信号処理装置３０は１次元ＣＣＤ １７の出力を各素子毎に、例えば、８ビット分解能でディジタル化処理する構成であったとする。するとこの場合には、制御装置３１の一つのサンプリング信号毎に（つまり画像上の１ピクセル（１画素）に対して）、２５６[Ｂyte]（バイト）の容量のデータ（スペクトル分布特性のデータ）が収集されることになる。Ｘ−Ｙ走査光学系６は２５６×２５６ピクセルに亙り、走査するものとすれば、１画面当たり、２５６×２５６回分のサンプリング信号が出力されることになるので、画像１枚（２５６×２５６ピクセル）につきデータ容量は１７[ＭＢyte]の容量を持つことになる。
【００８０】
２５６×２５６ピクセル構成の１枚の画像を１秒で取得するものとする場合、信号処理装置３０からコンピュータ３２にデータ転送する転送レートは１７[ＭＢyte／秒]程度であるから、一般的なコンピュータに搭載されているＰＣＩバス経由で十分に転送可能である。
【００８１】
また、コンピュータ３２に１[ＧＢyte]のメモリを搭載しておくことにより、少なくとも画像５０枚分のピクセル別のスペクトル分布特性のデータをコンピュータに転送し、コンピュータメモリ上に記録することが可能である。
【００８２】
以上のことから、観察対象の試料について、ピクセル毎に、全スペクトルに亙り、各成分別の光強度のデータ（ピクセル別のスペクトル分布特性のデータ）を含んだ５０秒間（画像５０枚）分の経時観察データを得ることができるようになる。
【００８３】
ここで、以下に示すように、各画像ピクセル（Ｘｉ，Ｙｊ）ｎ（但し、（Ｘｉ，Ｙｊ）は画素位置、ｎはｎ枚目の走査画像を指す）についての全スペクトルデータ列を、そのスペクトル成分別にＩ（Ｋ1）ｎ，Ｉ（Ｋ2）ｎ，Ｉ（Ｋ3）ｎ，…，…， …，Ｉ（Ｋm）ｎ、例えば、Ｉ（３５０）ｎ，Ｉ（３５１）ｎ，Ｉ（３５２）ｎ，…，…，…，Ｉ（６０５）ｎと表記することにする（ｎ＝１〜５０、また、Ｋ1，Ｋ2，…は波長を示していて、Ｉ（３５０）ｎならば、ｎ枚目の画像の波長350[ｎｍ]の入射光量値，Ｉ（３５１）ｎならば、ｎ枚目の画像の波長351[ｎｍ]の入射光量値，…であることを示している）。
【００８４】
以上が、本発明の走査型レーザ顕微鏡におけるスペクトル成分のデータ収集である。次に画像表示方法について説明する。
【００８５】
データ取得後、検査者は画像表示するためのスペクトル範囲を選択する。これはコンピュータ３２の持つソフトウエアにより実施する。
【００８６】
コンピュータ３２は、画像生成のアプリケーションと、検査者の操作や指示を行い易くサポートするインタフェースであるＧＵＩや操作手段等を持つ。そして、これらのソフトウエアによるメニュー画面をモニタ装置３３に表示して検査者に何の処理を行わせたいのか、指示させる。今、収集されたスペクトルのデータから検査者が所望のスペクトル成分の画像を生成する指示をしたとすると、この指示を受けてコンピュータ３２は、そのスペクトル範囲の指定画面を生成し、モニタ装置３３に送って表示させる。そして、検査者は所望のスペクトル範囲を指示する。
【００８７】
例えば、収集されたスペクトルのデータからスペクトル特性の分布図をグラフ表示し、その表示された分布図上で所望のスペクトル範囲を指定する。その結果、図３（ａ）において符号ｐ，ｑを付したハッチング領域で示すように、２つのスペクトル範囲を指定したとする。すなわち、一つは波長３９０[ｎｍ]から４２０[ｎｍ]までの範囲（ｐ）、他方は４６５[ｎｍ]から４８５[ｎｍ]までの範囲（ｑ）である。
【００８８】
この指定情報を受けてコンピュータ３２は、その指定範囲のスペクトルデータ積算値ΣＩ（Ｋ）ｎをそれぞれピクセル単位で求める。上述の例の場合、
【数１】

として演算するわけである。そして、画面全体の構成ピクセルそれぞれについての当該演算を行い、その結果を反映させた画像を生成する。
【００８９】
３９０[ｎｍ]から４２０[ｎｍ]のスペクトルに対応する画像をＡ、４６５[ｎｍ]から４８５[ｎｍ]のスペクトルに対応する画像をＢとする。カルシウムイオン濃度の上昇とともに試料１０からの蛍光スペクトルはそれまでの図３（ａ）のような特性から図３（ｂ）に示すように、短波長側に移動したとすると、これにより、画像Ａは明るさを増し、画像Ｂは暗くなることが認められる。
【００９０】
そして、カルシウムイオン濃度を求めるために、
【数２】

但し、αは検査者が定めることのできる適宜な定数である。
を演算する。
【００９１】
例えば、“ＩＮＤＯ−１”で染色した試料（標本）は、ＵＶ光（紫外線）を照射することにより、当該試料から励起される蛍光を２つの異なる波長域（中心波長４０５[ｎｍ]と４８０[ｎｍ]）で検出し、検出光量の比（中心波長４０５[ｎｍ]の蛍光／中心波長４８０[ｎｍ]の蛍光）を演算して求めることにより、カルシウムイオン濃度を測定できる。
【００９２】
従って、このことを利用して[数２]の演算をコンピュータ３２にて行うことで、カルシウムイオン濃度を求めることができる。
【００９３】
各ピクセル別にこのようなカルシウムイオン濃度を求め、１画面全てのピクセルについてこのような演算を終えたならば、次にコンピュータ３２はピクセル毎に求めたカルシウムイオン濃度を反映させた画像を生成する。
【００９４】
そして、得られたカルシウムイオン濃度を表わす画像表示のためのデータをＣとすれば、１画像毎に図１（ｂ）に示すように、画像Ａ，Ｂ，Ｃが得られるので、上記の例では５０枚分それぞれにおけるＡ，Ｂ，Ｃの画像が得られることになる。得られたこれらの画像はモニタ装置３３に表示させ、検査者はこの表示画像を観察することになる。
【００９５】
尚、上述の例では５０枚分の画像を得ているので、これら５０枚の画像を順次表示すれば、細胞内カルシウムイオン濃度の変化を動画として表示することができる。
【００９６】
本実施形態に示した走査型レーザ顕微鏡装置は、もとになる全てのスペクトル成分のデータを、コンピュータ３２のメモリ上に保持させてあるので、選択するスペクトル範囲はコンピュータ３２に対して指定することにより、何度でも再設定できる。そのため、選択するスペクトルの範囲を種々変更して画像の状態を比較することにより、カルシウムイオン濃度の変化を表わす最善の画像を得ることができる。
【００９７】
以上、この実施形態に示したものは、レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させて検出器で検出することにより、スペクトルのデータを得るようにした走査型レーザ顕微鏡において、前記検出器は入射光量対応に電気信号を発生する複数の微小受光素子を密に直線的に配列させた１次元光検出手段を用い、前記分光手段の分光出力をこの１次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが所定の関係を以て入射される配置関係とするようにしたものである。
【００９８】
また、前記分光手段の分光出力をこの１次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが所定の関係を持つよう集光させる光学系を設けて構成した。
【００９９】
また、前記１次元光検出手段の各微小受光素子の出力電気信号をディジタル信号化して微小受光素子配列順のデータを得る信号処理手段（信号処理装置３０）と、この得られたデータを保持する保持手段とを設けた。
【０１００】
更には、保持手段に保持したデータを用いて指定のスペクトル範囲のデータを抽出しその指定範囲のスペクトル成分による画像を生成する構成とした。
【０１０１】
レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させて検出器で検出することにより、試料における１地点毎のスペクトルデータを得るが、スペクトルデータは例えばプリズム等による分光手段を用い、この分光手段により分光して１次元光検出手段に入射させることで得る。１次元光検出手段は、複数の微小受光素子（受光セル）を密に直線的（１次元的）に配列させた構成であり、前記分光手段の分光出力をこの１次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが関係を以て入射される配置関係としてあることから、微小受光素子はその位置がどこであるかにより、入射される波長域が定まる。従って、特定位置の微小受光素子にはスペクトルの特定波長域の光が入射する構成となる。そのため、この各微小受光素子よりその入射光量対応の信号を得てこれを受光素子個別にディジタルデータ化し、受光素子の並び順に収集すると波長成分が特定できるデータ、すなわち、全てのスペクトル分布がわかるデータとして収集されると言う効果がある。
【０１０２】
しかも、試料に照射するレーザ光は、試料上をＸ−Ｙ走査させるべく移動させるので、その時々で収集される上記データは試料に対するレーザ光の照射点における放出光のデータであり、Ｘ−Ｙ走査範囲で定まる画面を構成する画素単位でのスペクトル分布データとなる。そのため、画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集できる。このデータを画面構成分収集し、記憶保存し、この保存データを用いて画像を生成するが、画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集されていることから、所望にスペクトル範囲を種々指定してその指定範囲のスペクトルによる画像を表示でき、従って、１度データを収集してしまえば、そのデータを利用して種々に画像を生成することで、最適な画像を見付けることができる。
【０１０３】
蛍光試薬による試料染色した試料（蛍光染色試料）の蛍光観察においては、単染色のみならず多重染色が多用されており、特に、蛍光染色は細胞、組織内の特定対象を視認可能にするために行われることが多い。このため、多重染色観察では、各染色部位が明確な色の差、すなわち、蛍光波長の違いとして検出されなければならない。しかも、蛍光波長の部分的な重なり（クロスオーバ部分）を除去して検出する必要がある。
【０１０４】
本発明では画素毎に全てのスペクトル分布が把握できるデータとして収集でき、このデータを画面構成分収集して記憶保存し、この保存データを用いて所望のスペクトル範囲の画像を生成するが、データが保存されているので、スペクトル範囲を繰り返し何度でも種々指定し直して画像を表示できることから、１度データを収集してしまえば、そのデータを利用して種々に画像を生成することで、最適な状態の画像を見付けることができるようになる。
【０１０５】
また、スペクトル領域の範囲指定は同時に複数可能であり、しかも、指定したスペクトル領域内のスペクトル成分のデータを加算してその指定領域のスペクトル成分による画像を生成し、さらにそれを利用してイオン濃度などを演算にて求めることができ、その求めたイオン濃度の画像を表示したり他の画像と合成したりして表示できるので、検査者に試験結果についての詳細な情報を提供できる効果もある。
【０１０６】
なお、上記例では２次元画像を対象としたが、ライン走査（１次元）であってもよいことは言うまでもない。この場合には画像の横方向には走査の空間軸が、縦軸には時間（または走査回数）がとられる。また、分光にはプリズムを用いた例を示したが、これは回折格子を利用しても良く、分光可能な手段であれば利用することができる。
【０１０７】
以上は、ピクセル毎のスペクトル分布のデータを収集して保持しておき、その保持データを用いて所望のスペクトル領域を定めてその領域の成分による画像を求める方式であったが、試験を実施しながらその状況を把握できるようにし、状況如何により試験継続か中止かを判断できるようにして、もし、試験が上手くいっていないようであるならば、そこで試験を中止する等の対応ができて、時間の浪費をせずに済むようにした実施形態を次に第２の実施形態として説明する。
【０１０８】
（第２の実施形態）
この実施形態では、スペクトルデータの収集時に、あらかじめレーザ光源の出力レーザ波長成分を除く、これよりも長い二つのスペクトル域のデータの合計値を演算するとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとに画像表示するように構成するとともに、試料に対する１画面分のレーザ走査終了のたびに画像表示を更新するようにして経過を逐次、把握できるようにするものである。
【０１０９】
図４（ａ）は、本発明の第２の実施の形態に係わる共焦点走査型レーザ顕微鏡の構成を示す図である。この実施形態においても、基本構成は第１の実施形態で説明したものと同じで良い。但し、第２の実施形態では、レーザ光源１として４４２[ｎｍ]の発振線を有するヘリウムカドミウムレーザ光源を用いている点、Ｘ−Ｙ走査光学系６は５１２×５１２ピクセルに亙り、走査するようにした点、１次元ＣＣＤ １７は例えば、１０２４素子相当のラインセンサであり、最短波長４３０[ｎｍ]、１画素当たり約０．２５[ｎｍ]に相当するように、プリズム１５と集光レンズ１６の焦点距離が光学的に設定されていて、１次元ＣＣＤ １７は４００[ｎｍ]から６８５[ｎｍ]のスペクトルが検出可能に構成されている点、コンピュータ３２は予めレーザ波長（４４２[ｎｍ]）成分を除く、これよりも長い二つのスペクトル域のデータの合計値を求めるとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとに画像を生成し、モニタ装置３３に画像表示するように設定されており、Ｘ−Ｙ走査光学系６による１画面分の画素範囲のレーザ光走査終了のたびにモニタ装置３３に対する画像表示の更新をするようにした点が第１の実施形態と異なる。尚、３４はコンピュータ３２に接続されたハードディスクなどの大容量記憶装置である。
【０１１０】
このような本実施形態で開示した構成の装置の作用を説明する。ここで観察対象とする試料１０は２種類の蛍光蛋白（例えば、ＣＦＰとＹＦＰの２種類の蛍光蛋白）を遺伝子発現させた細胞であるとする。
【０１１１】
４４２[ｎｍ]の発振線を有するヘリウムカドミウムレーザ光源１から出射されたレーザ光束２は、ビームエクスパンダ３により対物レンズ瞳径に略一致するようにビーム径が拡大されレーザラインフィルタ４に導かれる。レーザラインフィルタ４は４４２[ｎｍ]の発振線を選択的に透過させる。
【０１１２】
レーザラインフィルタ４を透過した４４２[ｎｍ]の波長を有するレーザ光束はダイクロイックミラー５で反射され、Ｘ−Ｙ走査光学系６、瞳投影レンズ７、結像レンズ８、対物レンズ９を経て試料１０に達する。
【０１１３】
試料１０は、ＣＦＰとＹＦＰの２種類の蛍光蛋白を遺伝子発現させた細胞であり、細胞内カルシウムイオン濃度の変化により、ＣＦＰからＹＦＰへのエネルギ移動の変化が生じ、これにより蛍光量が変化するもので、この光量の比を測定することで細胞内カルシウムイオン濃度を測定することができる。
【０１１４】
試料１０に到達したレーザ光によってその到達位置での蛍光蛋白を励起し、または反射光を生じる。
【０１１５】
ここで、試料１０に対するレーザ光集束点は対物レンズ９で定まり、試料１０上でのレーザ光集束位置はレーザ光をＸ−Ｙ走査するためのＸ−Ｙ走査光学系６によるＸ−Ｙ走査位置により定まる。
【０１１６】
試料１０からの反射光および蛍光からなる光束２０は、対物レンズ９、結像レンズ８、瞳投影レンズ７、Ｘ−Ｙ走査光学系６、を経てダイクロイックミラー５に戻る。そして光束２０はダイクロイックミラー５、共焦点レンズ１１を透過し、共焦点絞り１２、コリメートレンズ１３を介して分光器１４に入る。
【０１１７】
分光器１４はプリズム１５、集光レンズ１６、および１次元ＣＣＤ１７からなり、ダイクロイックミラー５を透過した光束はプリズム１５でスペクトル分解され、集光レンズ１６を介して１次元ＣＣＤ １７上に集光される。なお１次元ＣＣＤ １７は集光レンズ１６の焦点位置に配置されている。
【０１１８】
Ｘ−Ｙ走査光学系６を駆動制御する制御装置３１のサンプリング信号に同期して、信号処理装置３０は１次元ＣＣＤ １７で検出された光強度信号をディジタル信号に変換し、ＰＣＩバス経由でコンピュータ３２に転送する。
【０１１９】
１次元ＣＣＤ １７は例えば、受光セルが１０２４素子相当のラインセンサであり、最短波長４３０[ｎｍ]、１画素当たり約０．２５[ｎｍ]に相当するように、プリズム１５と集光レンズ１６の焦点距離が光学的に設定されている。したがって、受光セル１０２４素子は、順に４００[ｎｍ]から６８５[ｎｍ]のスペクトル範囲をカバーしている。そして、その各受光セルは、自己の対応する波長成分の光の強度に対応する電気信号を発生することになる。すなわち、１次元ＣＣＤ１７は４００[ｎｍ]から６８５[ｎｍ]のスペクトルが検出可能に構成されているわけである。
【０１２０】
信号処理装置３０は１次元ＣＣＤ １７の出力を各素子毎に８ビット分解能で処理し、その並び順に並ぶデータとして出力する。
【０１２１】
したがって、この信号処理装置３０の出力するデータは、制御装置３１の一つのサンプリング信号に対して（つまり画像上の１ピクセルに対して）、１[ＫＢyte]（キロバイト）のデータ容量を有する。
【０１２２】
Ｘ−Ｙ走査光学系６によるＸ−Ｙ走査の範囲は、１画像当たり５１２×５１２ピクセル相当であるから、制御装置３１はこれに対応するサンプリング信号を出力することとなるので、画像１枚（５１２×５１２ピクセル）につき２６８[ＭＢyte]のデータ容量となる。
【０１２３】
１枚の画像を６０秒おきに取得する場合、信号処理装置３０からコンピュータ３２に必要な転送レートは、一般的なコンピュータに搭載されているＰＣＩバス経由で十分に対応可能である。また、このデータをコンピュータ３２に接続されたハードディスクなどの大容量記憶装置３４に、試料に対する１画面分のレーザ走査終了ごとに書き込むことにより、少なくとも画像５０枚分のデータを記録することが可能である。信号処理装置３０からコンピュータ３２へのデータ転送時間とハードディスク（大容量記憶装置３４）ヘの書き込み時間の合計が画面毎のレーザ走査間隔時間に対して小さければ良いことになる。
【０１２４】
この実施形態では、コンピュータ３１での処理は、あらかじめレーザ波長（４４２[ｎｍ]）成分を除く、これよりも長い二つのスペクトル域のデータの合計値を演算するとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとに画像を生成して画像表示するように設定されており、レーザ走査終了のたびに画像表示を更新するようになっている。
【０１２５】
すなわち、二つのスペクトル範囲をあらかじめ指定しておく。一つは４６５[ｎｍ]から４９５[ｎｍ]までを、他方は５２０[ｎｍ]から５５０[ｎｍ]までである。
【０１２６】
この指定情報を受けてコンピュータ３２は、その指定範囲のスペクトルデータ積算値ΣＩ（Ｋ）ｎを、それぞれピクセル単位で求める。上述の例の場合、
【数３】

として演算するわけである。そして、画面全体の構成ピクセルそれぞれについての当該演算を行い、その結果を反映させた画像を生成する。
【０１２７】
４６５[ｎｍ]から４９５[ｎｍ]のスペクトルに対応する画像をＡ、５２０[ｎｍ]から５５０[ｎｍ]のスペクトルに対応する画像をＢとする。カルシウムイオン濃度の上昇とともに試料からの蛍光スペクトルはエネルギ移動により、画像Ｂは明るさを増し、画像Ａは暗くなる。
【０１２８】
そしてカルシウムイオン濃度を求めるために、
【数４】

但し、αは検査者が定めることのできる適宜な定数である。
を演算する。
【０１２９】
そして、演算により求めたカルシウムイオン濃度を表わす画像表示のためのデータによる画像をＣとすれば、１画像毎に図４（ｂ）に示すように、画像Ａ，Ｂ，Ｃが得られるので、例えば、ｎ＝１の画像のための走査が終了段階でそのｎ＝１の画像は生成が可能であるから、その生成画像を表示するようにする。
得られたこれらの画像は大容量記憶装置３４に保存させ、また、モニタ装置３３に表示させるので、検査者はこの表示画像を観察することになる。
【０１３０】
ｎ＝２の画像のためのレーザ走査が終了した段階で、ｎ＝２の画像を生成し、大容量記憶装置３４に保存し、また、ｎ＝１の画像に代えてそのｎ＝２の画像を表示し、ｎ＝３の画像のためのレーザ走査が終了した段階でｎ＝３の画像を生成し、大容量記憶装置３４に保存し、また、ｎ＝２の画像に代えてそのｎ＝３の画像を表示し、…と云う具合に、画像Ａ，Ｂ，Ｃを走査終了の度に画像の生成とその生成した画像のモニタ装置３３への更新表示を実施する。これにより試験の状況を把握しながら、時間経過観察ができることになる。
【０１３１】
また、生成画像は大容量記憶装置３４に保持させてあるので、所定回（前記例では５０画面に亘って）のレーザ走査終了後に当該保持させてある所定枚（前記例では５０枚）の画像を順次表示すれば細胞内カルシウムイオン濃度の変化を動画として表示して時間経過観察することができる。
【０１３２】
すなわち、この実施形態においては時間経過観察のために試料走査は所定回数だけ間欠的に行われ、前記画像表示は各レーザ走査終了毎にあるいは全枚数分の画像取得のためのレーザ走査全てが完了した後に所定回数行われるようにした。
【０１３３】
また、レーザ走査によって収集された各ピクセル毎のスペクトル分布のデータは保存されているので、選択するスペクトル範囲は何度でも再設定し直して画像表示できることから、カルシウムイオン濃度の変化を表わす最善の画像を得ることができる。
【０１３４】
このようにこの実施形態に示したものは、レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させて検出器で検出することにより、スペクトルのデータを得るようにした走査型レーザ顕微鏡において、スペクトルデータの収集時に、あらかじめレーザ光源の出力レーザ波長成分を除く、これよりも長い二つのスペクトル域のデータの合計値を演算するとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとにした画像を表示するように構成したものであり、レーザ光による試料の走査終了のたびに画像表示を更新するようにして経過を逐次、把握できるようにしたものである。
【０１３５】
そのため、試験を実施しながらその状況を把握できるので、状況如何により試験継続か中止かを判断できるようになり、もし、試験が上手くいっていないようであるならば、そこで試験を中止する等の対応ができて、時間の浪費をせずに済むようになる等の効果が得られる。
【０１３６】
従って、この実施形態においては、１画面分の走査を終えると時間をおいて再びレーザ光による試料の１画面分の走査を実施する間欠走査において、一つの走査が終了するたびに画像表示されるので、検査者は試験途中でＣＦＰ，ＹＦＰそれぞれの画像と、カルシウムイオン濃度の変化を確認できる。そのため、もし、試験がうまくいっていないようならば、そこで試験を中止する等の対応をとることができ、時間の浪費をせずに済むようになる。
【０１３７】
尚、上記例ではレーザ光源としてヘリウムカドミウムレーザ光源を用いて１光子励起で観察を行っているが、モードロックチタンサファイヤレーザ等の赤外域の波長を有する超短パルスレーザ光源を用いて、２光子励起観察を行い、これよりも短い２つのスペクトル域のデータの合計値を演算するとともに、ピクセル毎の比を演算し、これらの演算結果をもとに画像表示するように設定し、走査終了のたびに演算結果の画像表示を更新するようにしてもよい。ここで、２光子励起（２光子励起法）とは吸収波長の何倍化の波長を有する長波長のレーザ光を高密度で照射することにより、焦点面で局所的に蛍光分子を励起する方式で多光子励起法とも呼ばれるものであり、ピンホールなしで共焦点観察法と同等なセクショニング画像を得ることができる手法である。
【０１３８】
そして、このような超短パルスの長波長レーザ光を用いて、２光子励起によりデータを取得する方法は細胞に対する光毒性が少なく、より長時間に亙る観察が可能になる。
【０１３９】
また、この例では１次元のＣＣＤを用いたが、試料からの光束が集光レンズ１６により集光され、ここで形成される回折スポット径がＣＣＤの画素サイズよりも大きい場合は２次元ＣＣＤを用いる構成としてもよい。これにより、スポット径が大きい場合に、試料からの光を効率良く検出でき、Ｓ／Ｎの良いデータを取得することができるようになる。
【０１４０】
なお、本発明は上述した実施形態に示す例に限定されるものではなく、種々変形して実施可能である。
【０１４１】
また、本発明において、上記実施形態には種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出され得るものである。例えば、実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題の少なくとも１つが解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果の少なくとも１つが得られる場合には、当該実施形態での構成要件が一部削除された構成についても発明として成立し得るものである。
【０１４２】
【発明の効果】
本発明によれば、走査ピクセル毎にスペクトルデータを有しており、画像表示のためのスペクトル域を自由に選択することができ、しかも何度でもスペクトル域の指定を変更できるので、細胞内カルシウムイオン濃度を測定するような、試料からの蛍光スペクトルを正確に知ることができない試験や撮像を行う場合でも、最適な解析結果を得ることのできる、自由度の高い走査型レーザ顕微鏡を提供することができる。
【０１４３】
さらに、多重染色観察において、試料の退色を防止するために、少ない走査回数で蛍光波長の部分的な重なり（クロスオーバ部分）を効率良く除去して画像表示することのできる走査型レーザ顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施形態を説明するための図である。
【図２】本発明を説明するための図であって、本発明の走査型レーザ顕微鏡における分光器の構成例を説明するための図である。
【図３】得られたスペクトルの例とスペクトル範囲指定の例およびその遷移状況の例を説明するための図である。
【図４】本発明の第２の実施形態を説明するための図である。
【図５】従来技術を説明するための図である。
【図６】従来技術を説明するための図である。
【図７】従来技術を説明するための図である。
【図８】従来技術を説明するための図である。
【符号の説明】
１…レーザ光源、 ２…レーザ光束
３…ビームエクスパンダ、
４…レーザラインフィルタ
５…ダイクロイックミラー、６…Ｘ−Ｙ走査光学系
７…瞳投影レンズ、 ８…結像レンズ
９…対物レンズ、 １０…試料
１１…共焦点レンズ、 １２…共焦点絞り
１３…コリメートレンズ、１４…分光器
１５…プリズム、 １６…集光レンズ
１７…１次元ＣＣＤ、 ２０…試料からの光束
３０…信号処理装置、 ３１…制御装置
３２…コンピュータ、 ３３…モニタ装置
３４…ハードディスク装置（ＨＤＤ）

Claims (3)

1. レーザ光源からのレーザ光を観察対象の試料に集束させて照射させると共に試料に対して前記レーザ光を移動走査させ、試料から得られた光を分光手段により分光させて検出することにより、スペクトルのデータを得るようにした走査型レーザ顕微鏡において、
   入射光量対応に電気信号を発生する複数の微小受光素子を直線的に配列させた１次元光検出手段を用い、前記分光手段の分光出力をこの１次元光検出手段の微小受光素子配列範囲にその入射位置と波長域とが所定の関係を以て入射される配置関係とすることにより画素単位でスペクトルのデータを得る検出器と、
   前記検出器の各微小受光素子より得られる電気信号を収集して画素単位でのスペクトル分布データとして記憶保存する手段と、
   画像表示するためのスペクトル域の指示を受け付ける手段と、
   前記記憶保存されたデータのうち、前記指示されたスペクトル域に対応するデータを抽出して加算し、前記スペクトル域の画像を生成する手段と、
   前記生成された画像を表示する手段を備え、
   スペクトル域の前記指示入力とそれに対応したスペクトル域の画像生成と表示を、前記記憶保存された同じデータに基づいて繰り返して実施可能にしたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. 前記スペクトル域の指示を受け付ける手段は、画面上で表示されたスペクトル分布の中から所望の前記スペクトル域を指示するためのインターフェースを備えたことを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記スペクトル域の指示を受け付ける手段は、前記レーザ光源の出力レーザ波長より長い波長である少なくとも二種のスペクトル域の指示を受け付け、
   前記スペクトル域の画像を生成する手段は、前記保持されたデータのうち、前記指示された二種のスペクトル域に対応するデータをそれぞれ抽出して加算するとともに、両者の比を求めて当該比に基づく画像を生成し、次の画像を生成するまでの間、前記生成した画像を出力し、
   前記表示する手段が前記出力された画像を表示することを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。

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