DD204711A5 - Verfahren zur herstellung eines dns-uebertragungsvektors - Google Patents
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Abstract
Verfahren fuer die Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors fuer den Einsatz bei der Aufrechterhaltung und Replikation einer fuer Rinderpraewachstumshormon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz, gekennzeichnet dadurch, dass eine fuer Rinderpraewachstumshormon kodierende Desoxynucleotid-Sequenz mit einem durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym hergestellten DNS-Molekuel umgesetzt wird.
Description
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Verfahren zur Herstellung eines DNS-Ubertragungsvektors Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines DNS-Übertragungsvektors, welcher eine Nukleotidsequenz enthält, die Rinderpräwachstumshormon oder Wachstumshormon codiert} sie bezieht sioh gleichfalls auf eine Methode zur Herstellung einer Rinderwachstumshormon codierenden Nukleotidsequenz für die Verabreichung an Jungtiere zur Steigerung ihrer Wachsturnsgeschwindigkeit und ihres Massezuwachses.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen .
Wachstumshormon ist ein Polypeptid-Hormon, welohes in der Adenohypophyse (Hypophysen-Vorderlappen) synthetisiert und durch die Adenohypophyse sekretiert wird. Das Wachstumshormon wird als ein Vorläuferprotein (Prä-Wachstumshormon) mit einem N-terminalen Signalpeptid und der Wachstumshormon-Sequenz synthetisiert.
Die Aminosäuresequenz für bovines Wachstumshormon ist ermittelt worden (Dayhoff, M. D· et al«, Atlas of Protein Sequence and Structure, Bd. 5, Nachtr. 3· 245-352, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C. (1978)).
Normalerweise wird Wachstumshormon während des gesamten Lebens produziert, wenngleich die Produktion der größten Mengen während der Periode vor dem Erwachsenenstadium erfolgt· Das Hormon wird für das Wachstum in dieser Periode benötigt. Obwohl sein Mechanismus noch nicht bis ins Detail geklärt ist, so ist dooh bekannt, daß Wachstumshormon das Skelettwachstum, die Stickstoffretention und die Proteinsyntheee fördert sowie den Glukose- und Lipidmetabolismus beeinflußt. Mit anderen Worten« Wachstumshormon ist ein
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allgemein anabolisch wirkendes Agens*
Die Verwendungen von bovinem Wachstumshormon basieren auf seiner oben beschriebenen bekannten biologischen Aktivität» Bovines Wachstumshormon kann Jungrindern zwecks Steigerung ihrer Wachsturasgeschwindigkeit und ihres Massezuwaohses verabreicht werden, wodurch die zwischen Geburt und Rindfleisohvermarktung liegende Zeitspanne verktirzt wird. Der daraus resultierende Anstieg der Fleisohproduktion könnte beträchtlich sein. Des weiteren unterscheidet sich bovines Wachstumshormon von ovinem Wachstumshormon durch lediglich einige wenige Aminosäuren. Folglich kann bovines Wachstumshormon an Schafe verabreicht werden, um dort die gleichen Ziele wie beim Rind, also steigende Wachstumsrate, steigenden Zuwachs und damit steigende Fleischproduktion zu erreichen. Es ist darüber hinaus möglich, in Verfolgung der eben genannten Zwecke bovines Wachstumshormon auch an Schweine und andere Tierarten zu verabfolgen.
Inzwischen sind grundsätzliche Techniken zur Klonung von DNS-Sequenzen bekannt. So beschreiben beispielsweise Seeburg, P. H. et al., Nature, 270, 486 (1977) das Klonen des Ratten-Waohstumshormon-Gensj Shine, J· etal», Nature, 270, 494 (1977) beschreiben das Klonen des humanen Somatomammotropin-Gens; Derynok, R· et al., Nature, 285, 542 (1980) schließlich beschreiben das Klonen des humanen Fibroblast-Interferon-Gens·
Methoden zur Darstellung heterologer DNS in einem Mikroorganismus sind nunmehr ebenfalls bekannt. Im Prinzip wird die die heterologe DNS codierende Sequenz an einem Punkt innerhalb eines darstellbaren Operons in einen DNS-Ubertragungsvektor inseriert. Für die Produktion eines Hybridproteins
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muß sich die inserierte Sequenz mit der codierenden Sequenz des Operons in der Ableserahmen-Phase befinden und hinsichtlich der Translation gleichartig ausgerichtet sein. Sind diese Bedingungen gegeben, dann resultiert die Translation des Operons in einem "Durchlesen" zur inserierten codierenden Sequenz dergestalt, daß es sich bei dem so erzeugten Protein um ein Fusionsprotein handelt, welches eine durch das expressible Operon codierte N-terminale Aminosäuresequenz enthält, der sich wiederum eine durch die Einlagerung codierte Aminosäuresequenz anschließt. Siehe hierzu Polisky, B. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71, 3900 (1976) sowie Itakura, K« et al., Science. 198, 1056 (1979)· Verschiedene expressible Operons sind bereits verwendet worden, darunter jene für ß-Galaktosidase, /2> -Laktamase nnä Tryptophan.
Die im vorliegenden Text verwendeten Abkürzungen werden allgemein anerkannt und von kompetenten Fachleuten benutzt. So sind beispielsweise diese Abkürzungen durch das J. Biöl. Chem. ohne weitere Erläuterung angenommen worden.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines DNS-Ubertragungsvektors, der eine Nucleotidsequenz enthält, die Rinderwachstumshormon oder Wachstumshormon οodiert für die Anwendung zur Steigerung der Fleischproduktion.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein industriell anwendbares Verfahren für die Herstellung eines DNS-Ubertragungsvektors mit den gewünschten Eigenschaften aufzu-
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finden.
In einer der vorliegenden Verkörperungen ist das Verfahren zur Herstellung eines die Rinderpräwachstumshormon-Sequenz enthaltenden DNS-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet, daß eine das Rinderpräwachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz mit einem DNS-Molekül reagiert, welches durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde.
In einer anderen Verkörperung ist die Methode weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Rinderpräwachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:
5' - ATG ATG GCT GCA GGC CCC CGG ACC TCC CTG CTC CTG GCT TTC GCC CTG CTC TGC CTG CCC TGG ACT CAG GTG GTG GGC GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC OGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC. AGC AGA GTC ' TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC' ACC CCC CGG GOT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG ' AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3'
\ L
| A »' Desoxyadenyl, | ist. | 19. | 4.1982 | |
| G a Desoxyguanyl} | AP | c 12 N/ 232 811/2 | ||
| C = Desoxyzytosyl und | 59 | 677.18 | ||
| T = Thymidyl | ||||
In einer zusätzlichen Verkörperung wird eine Methode zur Herstellung einer bovines Rinderwachstumshormon codierenden Desoxynukleotidsequenz daduroh gekennzeichnet, daß eine bovines Rinderpräwachstumshormon codierende cDNS-Desoxynukleotidsequenz mit dem Restriktionsenzym Hae II gespalten und das gespaltene Produkt mit einem Enzym inkubiert wird, das aus der das Klenow-Fragment von DNS-PoIymerase I, T4-DNS-Polymerase oder 3f···5'-Exonuklease enthaltenden Gruppe ausgewählt wurde· .
In einer wieder anderen Verkörperung ist die Methode der Herstellung der bovinen Wachstumshormon-Sequenz weiter daduroh gekennzeichnet, daß die Inkubation mit dem genannten Klenow-Fragment in Anwesenheit von dATP durchgeführt und das daraus resultierende Produkt mit S1-Nuklease verdaut wird, wobei eine die Aminosäuren 2...191 von bovinem Wachstumshormon oodierende Desoxynukleotidsequenz gewonnen wird, was wiederum in einer bovines Wachstumshormon codierenden Desoxynukleotidsequenz resultiert, welche einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:
51 - TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA OAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC
ZdZSIl L
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CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG BAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG PAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3'
wobei
A = desoxyadenyl, G = Desoxyguanyl, C = DesoxyzytO8yl und T = Thymidyl
ist.
In noch einer anderen Verkörperung ist die Methode zur Herstellung der bovinen Wachstumshormon-Sequenz weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation mit dem genannten Klenow-Pragment in Anwesenheit von dATP, dGTP, dCTP und dTTP durchgeführt wird und das daraus entstehende Produkt in Anwesenheit von dCTP mit einem Enzym inkubiert wird, welches aus der aus dem genannten Klenow-Fragment, T4-DNS-Polymerase oder 3'···5'-Exonuklease bestehenden Gruppe ausgewählt wird und schließlich gekennzeichnet dadurch, daß das hieraus resultierende Produkt mit S1-Endonuklease verdaut wird, wobei eine die Aminosäuren 1...191 des bovinen Wachstumshormons codierende Desocynukleotidsequenz gewonnen wird, was wiederum in einer bovines Wachstumshormon codierenden Desoxynukleotidsequenz resultiert, welche einen Plus-Strang der folgenden Sequenz aufweist:
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5' - GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CA-G AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG GTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3'
wobei
A = Desoxyadenyl, G = Desoxyguanyl, C = Desoxyzytosyl und T = Thymidyl
ist.
In einer zusätzlichen Verkörperung ist das die bovine Prä-Wachstumshormon-Sequenz enthaltende Plasmid pBP348 dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym hergestellten DNS-Molekül um pBR322 und bei dem Restriktionsenzym um Pst I handelt·
In einer wieder anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines die bovine Wachstumshormon-Sequenz enthaltenden DNS-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet, daß die hergestellte, das bovine Wachstumshormon codierende
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Sequenz an einem Punkt innerhalb eines darstellbaren Operons in einen DNS-Übertragungsvektor inseriert. Für die Produktion eines Hybridproteins muß sich die inserierte Sequenz mit der codierenden Sequenz der Operons in der Ableserahmen- Phase befinden und hinsichtlich der Translation gleichartig ausgerichtet sein. Sind diese Bedingungen ,gegeben, dann resultiert die Translation des Operone in einem "Durchlesen" zur inserierten codierenden Sequenz dergestalt» daß es sich bei dem so erzeugten Protein um ein Fusionsprotein handelt, welches eine durch das expressible Operon codierte N-terminale Aminosäuresequenz enthält, der sich wiederum eine durch die Einlagerung codierte Aminosäuresequenz anschließt Es sind bereits verschiedene expressible Operons verwendet worden, darunter solche für ß -Galaktosidase, p> -Laktamase und Tryptophan«
Zu e) Das erfindungsgemäße Verfahren wird angewandt in der pharmazeutischen Industrie auf dem Gebiet der Arzneimittelsynthese.
Zu f) Erfindungsgemäß wird ein wirtschaftliches und industriell anwendbares Verfahren für die Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors für den Einsatz bei der Aufrechterhaltung und Replikation einer für Rinderpräwaehstumshormon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz zur Verfügung gestellt·
Die Möglichkeit der industriellen Herstellung von Rinderwachstumshormon ermöglicht seine Verwendung für die Verabreichung an Jungtiere in breitem Umfange Damit wird es möglich, die Wachstumsgeschwindigkeit und den Massezuwachs bei Jungtieren zu steigern, wo-
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Desoxynukleotid-Sequenz mit einem DNS-Molekül zur Reaktion gebracht wird, welches durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde*
In einer noch anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Expressions-Übertragungsvektors dadurch gekennzeichnet, daß das durch Spalten eines Übertragungsvektors mit einem Restriktionsenzym erzeugte DNS-Molekül an einem Punkt innerhalb einer expressiblen Kontrollregion gespalten wird.
In einer zusätzlichen Verkörperung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteine» welches die Aminosäuresequenz von bovinem Prä-Wachstumshormon oder die Aminosäure» sequenz von bovinem Wachstumshormon als C-terminales Ende und einen Teil eines prokaryotischen Proteins als N-terminales Ende umfaßt, durch Inkubieren eines Mikroorganismus gekennzeichnet, welcher durch einen Expressions-Übertragungsvektor transformiert wurde, wobei dieser eine das genannte bovine Prä-Wachstumshormon oder das genannte bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz enthält.
In wieder einer anderen Verkörperung ist ein Verfahren zur Synthese von bovinem Wachstumshormon durch Inkubieren eines durch einen Expressions-Übertragungsvektor transformierten Mikroorganismus sowie durch Herausreinigen des bovinen Wachstumshormone aus dem Lysat oder Kulturmedium des genannten Mikroorganismus gekennzeichnet, wobei der genannte Übertragungsvektor eine Desoxynukleotidsequenz enthält, welche das genannte bovine Wachstumshormon unter Bedingungen codiert, die für die Darstellung der genannten bovines Wachstumshormon codierenden Sequenz geeignet sind.
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Die vorliegende Erfindung offenbart insbesondere das Klonen einer das bovine Prä-Wachstumshormon oder das bovine Wachstumshormon codierenden DNS sowie die Darstellung der geklonten DNS in einem Mikroorganismus.
Aus bovinen Hypophysen wird niRNS isoliert, welche das bovine Prä-Wachstumshormon codiert. Eine umgekehrte Abschrift (eine cDNS-Kopie) der mRNS wird hergestellt und in einen Übertragungsvektor inseriert« Eine das bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleotid-Sequenz wird durch Hydrolisieren der die Prä-Sequenz der cDNS für bovines Wachstumshormon codierenden Sequenz zubereitet. Der tJbertragungsvektor wird zur Transformierung von Bakterien verwendet, mit deren Hilfe die·geklonte cDNS dargestellt wird«
Durch Anwendung der cDNS-Methode wird eine das bovine Wachstumshormon codierende DNS-Sequenz gewonnen. Die grundlegenden Techniken der cDNS-Methode sind bekannt und können den Darlegungen von Seebrarg, P· H· et al« (siehe oben) sowie Derynck, R· et al· (siehe oben) entnommen werden» Die cDNS wird unter Verwendung einer RNS-Präparation synthetisiert, welche aus bovinen Hypophysen - als Schablone - extrahiert wurde·
Die RNS wird mittels herkömmlicher Techniken aus bovinen Hypophysen isoliert* Polyadenylierte RNS wird mittels Affini täte -Chromatografie isoliert. Die Reinheit der polyadenylierten RNS wird durch Vornehmen einer zellfreien Translation der polyadenylierten RNS gemäß Beschreibung von Miller, W. L. und McCarthy, B. J«, J, Biöl. Chem., 2J>4_, 742 (1979) sowie Martial, J. Α· et al·, Proc« Nat»Aoad« Sei» USA, 74, 1816 (1977) und durch Analysieren der produzierten Proteine durch SDS-Akrylamid-Gel-Elektrophorese gemäß Beschreibung
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von Laemmli, U. K., Nature, 227, 680 (1970) abgeschätzt. Bovines Wachstumshormon wird des weiteren durch eine von Martial, J. A. et alo, Proco Nat. Aoad. Sei» USA (siehe oben) beschriebene Immunpräzipitations-Reaktion identifiziert.
Die polyadenylierte RNS wird als Schablone unter Anwendung herkömmlicher Techniken zur Herstellung einer doppelstängigen cDNS-Kopie verwendet. Der erste cDNS-Strang wird mittels umgekehrter Transkriptase, mittels eines Oligo-dT-Primers und der polyadenylierten RNS gemäß Beschreibung von Miller und McCarthy (siehe oben) sowie Monahan, J. J. et al·, Biochem», 15, 223 (1976) synthetisiert. Die RNS wird durch Alkaliverdauung entfernt und die einstrangige cDNS wird zur Selbst-Primung der Synthese des zweiten Stranges durch umgekehrte Transkriptase verwendet. Die einstrangige Haarnadelschleife wird durch Verdauung mit S1-Nuklease (Leong, J. A. et al«s J. Virol., £,891 (1972) beseitigt, wie dies von Ullrich, A. et alo, Science, J_96_, 1313 (1977) beschrieben wurde.
Die cDNS ist nun zur Insertion in einen geeigneten Ubertragungsvektor bereit. Zu den geeigneten Übertragungsvektoren gehören Jene, welche in der Lage sind, Bakterien wie etwa Esoherichia coil und Bacillus subtilis. Hefe (Saccharomyces cerevisiae), die inl-, csp- und esp-mutanten Stämme von Neurospora orassa und tierische Zellen in Gewebekultur zu transformieren. Beispiele für Ubertragungsvektoren, die zur Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind und Ee coli transformieren können, umfassen die Plasmide PSC101, pMB9, PBR313, pBR315, pBR3i6 und pBR322 sowie die vom Bakteriophagen abgeleiteten Vektoren, de ho Charon
16A und >gtWES' >B.
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In Tabelle 1 sind Quellen aufgeführt, in denen die Präparation und die kennzeichnenden Merkmale dieser Übertragungsvektoren beschrieben werden.
Übertragungsvektor
Quelle/en
PSC1O1
pMB9 ·
PBR 313 pBR 315 pBR 316 pBR 322
Charon 3A Charon 4A Charon 16a
Cohen, et al·, Proc. Natl. Acad. Sei« USA,
10, 1293 und 3240 (1977). Boyer, et al·, Recombinant Molecules, Beers?
et al·, Eds. Raven Press, WY, Seite 13
(1977).
Cohen et al·, Recombinant Molecules, Seite Rodriguez et alo, Molecular Mechanisms in
Control of Gene Expression (ICN-UCLA
Symposium on Mol. & Cell. Biol. Bd. 5),
Nieslich et al·, Eds·, Academic Press,
NY, Seite 471 (1976). Bolivar, et al., Gene, 2, 75 (1977). Bolivar et al· (siehe oben) Rodriguez et al·, (siehe oben) Rodriguez et al·, (siehe oben) Bolivar et al·, Gene, 2,95 (1977)· Bolivar et al«, Qene. 4, 121 (1978). Sutcliffe, Cold Spring Harbor 3ymp· on Quantο
Biol·, 42, 77 (1978).
Blattner et al·, Soienoe, 196, 161 (1977). Blattner et al·,(siehe oben)* Blattner et al·, (siehe oben)·
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Übertragungs-
vektor Quelle/en
>^gtWES β7B Tremeier et al., Nature« 26ß, 526 (1976). , Leder et al*, Science, 196, 175 (1977).
Andere zur Transformierung von E1CoIl geeignete Vektoren sind bei Sinsheimer, R. L., Ann« Rev« Biochem* 46, 415 (1977) beschrieben. Zur Transformierung von B« subtilis geeignete Übertragungsvektoren sind von Iordanesou, S., J. Bacteriol» VM, 597 (1964) und Ehrlich, S. D., Proo. Natl. Acad. Sei. USA 74, 1680 (1977) beschrieben worden* Ein derartiger Vektor ist als Plasmid pC194 identifiziert worden. Hybridplasmide mit Gehalt an Hefe-DNS — sowohl Plasmidals auch/oder chromosomaler DNS — und bakterieller DNS — Zo B* Plasmid — werden zur Transformierung von Hefe verwendet. Derartige Plasmide sind von Beggs, J. D., Nature, 27jj, 104 (1978)5 Asiav, C. L. und Carbon, J., Proo» Natl. Aoad»_Sci. USA 7J>, 3829 (1979) sowie von Kingsman, A. K. et a1·» Gejie 7, 141 (1979) beschrieben worden. Zu den Übertragungsvektoren, die zur Transformierung von Tierzellen in Gewebekultur verwendet werden können, gehören das Adenodefektive Virus, das SV-defektive Virus und das Polyoma-Virus.
Unter Anwendung konventioneller Techniken wird die cDNS in einen Übertragungsvektor inseriert. Die cDNS wird gewöhnlich in irgendeine im Übertragungsvektor nur einmal existierende Restriktionsstelle inseriert. Charon 3A und 4A sowie auch y gt WES * ^ B enthalten keine solchen einmaligen Stellen? für diese Vektoren werden demzufolge Restriktionsatellen von begrenzter Anzahl herangezogen. Die einmaligen Restriktionsstellen in den verschiedenen Übertra-
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gungsvektoren und die nutzbaren Restriktionsstellen in den Vektoren Charon 3A und 4A sowie >gt WES * >B sind in Tabelle 2 aufgeführt.
| Ubertragungsvektor | Einmalige Restriktionsstellen |
| pSC101 | EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI, |
| Hpa I, Sma I | |
| pMB9 | EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI, |
| PBR313 | EooRI, Hind III, Sal I, Bam HI, |
| Hpa I, Sma I, Xma I | |
| PBR315, PBR322 | EooRI, Hind III, Sal I, Bam HI, |
| Ps t I | |
| PBR316 | Hind III, Sal I, Bam HI, Pst I |
| PC194 | Hind III |
| Charon 16A | EooRI, Sat I |
| Charon 3A | EooRI |
| Charon 4A | EcoRI |
| >gt WES . >B | EcoRI |
Generell wird die cDNS zur Erleichterung der Selektion in eine innerhalb eines phänotypischen Merkmals gelegene Restriktionsstelle inseriert. So befinden sich beispielsweise Hind III, Sal I, und Bam HI in pSC101, pMB9, PBR313, pBR315» PBR316 und pBR322 innerhalb des Gens für Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit oder dessen Kontrollregion. Die Einlagerung an dieser Stelle resultiert in einem Verlust an Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit. Die cDNS kann in den Übertragungsvektor durch Anwendung von Restriktionsstellen-Verbindern oder durch Desoxynukleotid-Schwanzbildung inseriert werden. Bei der erstgenannten Methode kann ein synthetisches Nukleotid, welches eine Rekognitionsstelle für eine einzelne
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Restriktions-Endonuklease von der oben diskutierten Art enthält, am stumpfen Ende mit der cDNS verbunden werden. Die cDNS und der Übertragungsvektor werden separat mit der Restriktions-Endonuklease inkubiert und sodann gekühlt, um den die cDNS enthaltenden Übertragungsvektor zu formieren. Bei der letztgenannten Methode kann die cDNS unter Verwendung eines Desoxynukleotids und terminaler Transferase, wie sie von Roychoudhury,' R. et al·, Nuol» Acids Res», ^, 863 (1976) beschrieben wurde", zur Schwanzbildung gebracht werden. In der gleichen Vorgehensweise kann der Übertragungsvektor nach Verdauung mit einer Restriktions-Endonuklease bei Verwendung des komplementären Desoxynukleotids zur Schwanzbildung gebracht werden. Der geschwänzte Übertragungsvektor und die geschwänzte cDNS werden dann gekühlt, um den cDNS-haltigen Übertragungsvektor zu formieren. So kann die cDNS beispielsweise dC-geschwänzt seint und der Übertragungsvektor kann an der Pst-I-Stelle geöffnet und dG-geschwänzt sein.
Der cDNS-haltige Übertragungsvektor wird nun zur Transformierung eines geeigneten Wirtes verwendet. Zu den für die verschiedenen Übertragungsvektoren geeigneten Wirten gehören E» coil, B. subtilis. Hefe, N. crassa und Tierzellen in Gewebekultur. Die zur Transform!erung jedes dieser Wirte befähigten Übertragungsvektoren sind bereits oben beschrieben worden· Herkömmlicherweise werden drei mutante Stämme von E» coli verwendet. Es handelt sich hierbei um ~ψ 1776, RRI und HB101. E. ooli y 1776 ist bei Curtis, R., Ann. Rev. Microbiol. 3O8 507 (1976) und im US-PS Nr. 4 190 495 beschrieben worden. E. coli RRI ist bei Dugaiczyk, A. et al., Molecular Mechanisms in Control of Gene Expressions, Seite 543 beschrieben worden; E. coli HB101 schließlich ist bei Kedes, Do H. und Thomas, C. A·, Proc. Natl« Acad. Sei.
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USA 73, 1537 (1976) beschrieben worden.
Die geeigneten Wirte werden vermitteis herkömmlicher Techniken transformiert. Beispielsweise wird Eo ooli / 1776 durch den von Cooke, N. E. et al«. J. Biol. Chem., 255, 6502 (1980) beschriebenen cDNS-haltigen Übertragungsvektor transformiert. Ebenfalls durch konventionelle Techniken werden Kolonien selektiert und/oder einem Screening unterworfen. So können Kolonien beispielsweise auf der Basis des Verlustes von einem phänotypischen Merkmal wie etwa der Tetrazyklin-Widerstandsfähigkeit selektiert werden. Das Screening der Kolonien kann (1) durch Beseitigen der cDNS durch eine geeignete Restriktions-Endonuklease sowie Analyse mittels Elektrophorese und Hybridisation (Southern, E. Me, J. Mol. Biol.. 98. 503 (1975) oder (2) Replika-Plattiereh näöh der Beschreibung von Grunstein, M. und Högness,D. S., PrQC. Nat. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975) und Hybridisieren mit einer geeigneten Sonde oder schließlich (3) durch Prüfung der Kolonien direkt hinsichtlich ihrer Darstellung mittels Radi©immunoassay oder anderen Techniken vorgenommen werden© ' " "" '"; "' ' '"" · ' '·'' {i"''' :: ' "':][':: :
Die bovines Wachstumshormon oodierende DNS kann aus jener Einlagerung gewonnen werden, welche bovines Prä-Wachstumshormon codiert. Die das Prä-Hormon codierende DNS wird durch eine geeignete Restriktions-Endonuklease beseitigt. Ist zum Beispiel die cDNS in die Pst-I-Steile des Plasmids pBR322 eingelagert, dann kann die cDNS-Einlagerung durch teilweise Verdauung mit Pst I entfernt werden, da die cDNS für bovines Wachstumshormon zwei interne PgJb-I-St eil en enthält. Andererseits kann das von pBR322 abgeleitete rekombinante Plasmid mit Hae II verdaut werden, um einen Teil der cDNS-Einlagerung zu entfernen. Die Hae-II-Verdauung beseitigt die das N-terminale Signalpeptid codierende DNS sowie zwei der
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drei Basen, die das N-terminale AIa des Wachstumshormons codieren. Diese Basen werden durch Inkubieren der Einlagerung mit dem Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I und der Desocynukleotide ersetzt. Andererseits können die AIa codierenden Basen durch Inkubieren der cDNS mit Klenow-Fragment, T4-DNS-Polyraerase oder 3'··· 5'-Exonuklease in Anwesenheit von dATP ausgestrichen werden· Das Klenow-Fragment ist von Klenow, H. und Henningsen, I·, Proc· Natlo Acad« Sei» USA, 65« 168 (1970) beschrieben worden. Die Wachstumshormon codierende cDNS wird nun in der oben beschriebenen Weise in einen geeigneten Übertragungsvektor inseriert.
Die geklonte DNS wird in Bakterien dargestellt, um entweder ein Fusionsprotein zu erbringen, welches das durch die inserierte Sequenz codierte bovine Wachstumshormon enthält, oder aber um das Wachstumshormon selbst zu erbringen. Verschiedene mögliche Techniken stehen zur Wahl, sie können beinhalten (a) die Modifikation der codierenden Sequenzen zwec.ks Erlangung eines genau erwünschten Übertragenden Startpunktesj (b) die Selektion oder Konstruktion eines optimalen Expressionsvektors und (c) die nach der Übertragung erfolgende Bearbeitung entweder durch Ausnutzung der. in-vivQ-Bearbeitungsaktivität des Wirtes oder in vitro durch chemische Mittel und (d) die direkte Darstellung·
Wo ein Fusionsprotein hervorgebracht wird, wird die Modifikation der geklonten Nukleotidsequenz im allgemeinen solange unnötig sein, solange die resultierende Sequenz die Translation der Einfügung im richtigen Ableserahmen ermöglicht und keine Stop-Kodone vor dem Anfangskodon der inserierten Sequenz intervenieren. Wachsturns-Prähormon oder Wachstumshormon werden als ein Fusionaprotein durch Insertion der cDNS in geeignete Stellen innerhalb ausgeprägter
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Operons (Expressionsvektoren) dargestellt, so etwa unter Einbeziehung der Pst-I-Stelle im ß-Laktamase-Gen von pBR322 (Villa-Komaroff, L. et al., Proc« Nat. Acad«. Sei. USA, 75, 3727 (1978); Serburg, P. et al., Nature 274, 795 (1978)), der EcoRI-Stelle von pBR322, die die lac-Kontrollregion und β -Galaktosidase codierende Sequenz trägt (Itakura, K., siehe oben) oder unter Einbeziehung der Hind-III-Stelle des tr pD-Gens von Plasmid ptrpED5O (Martial, J. et a1·» Science, 205, 602 (1979)).
Modifikationen der Sequenzlänge durch ein oder zwei Nukleotide zwecks Erreichung der korrekten Ablesungsphase sind im Fachgebiet weithin bekannt. Einfügungen an der Pst-I-Stelle von pBR322 mit dem Ziel der Schwanzbildung kommen mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 s 6 in korrektem Phasenzustand und Ableserahmen vor. Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon werden aus Fusionsproteinen hergestellt, die einer spezifischen Spaltung in vitro zugänglich sind. Die geklonte Nukleotidsequenz wird modifiziert, um Jene Aminosäuresequenzen zu codieren, welche die Spezifität für ein proteolytisches Enzym erbringen. Eine dafür geeignete Sequenz ist AspAspAsp AspLys, die vorzugsweise durch das Enzym Enterokinase gespalten wird· Hierzu liegt die Beschreibung in der Anmeldungsschrift der Serien-Nr. 125 878, eingereicht am 29· Februar 1980, vor. Wie dort ausgeführt, wird eine die oben: genannte Aminosäuresequenz codierende koppelnde Nukleotidsequenz nächst der den erwünschten Aminoterminus von Wachstums-Prähormon codierenden Nukleotidsequenz inseriert.
Eine derartige Insertion erfordert beim Wachstums-Prähormon die Modifikation der originalen cDNS-Einlagerung durch Beseitigen der Nukleotide auf dem 5'-Ende der das Wachstums-Prähormon codierenden Sequenz. Die cDNS-Einlagerung für
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Wachstumshormon - oben beschrieben - bedarf keiner Modifikation· Die Modifikation der Einlagerung für Wachstums-Prähormon erfolgt entweder durch kontrollierte Verdauung des 3'-Endes der Einfügung mittels 3'-Endonuklease oder T4-DNS-Polymerase, oder aber durch die Kombination von Restriktions-Endonukleasespaltung an einem Punkt an der 5'-Seite des gewünschten Startpunktes gemeinsam mit chemischer Synthese zum Zwecke der Wiederherstellung jenes so entfernten Teiles der gewünschten Sequenz· Weitere Einzelheiten dieser Vorgehensweisen sind der U.S.-Patentanmeldung der Serien--Wr. 125 878 zu entnehmen· Bei Anwendung dieser Methodik vorzugsweise unter Einsatz von T4-DNS-Polymerase und S1-Nuklease - wird die das Wachstums-Prähormon codierende cDNS-Sequenz ohne die nichtübersetzte 5'-Region gewonnen. Die die vorangehende Aminosäuresequenz codierende Verbinder-Nukleotidsequenz wird durch DNS-Ligase gemäß Beschreibung von Valenzuela et al., Nature, 280, 815 (1979) jener cDNS-stumpfendig verbunden, welche entweder Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon codiert. Die modifizierte cDNS-Sequenz wird in der oben beschriebenen Weise in einen Fusionsprote^- in-Expressionsvektor inseriert. Wirtsbakterien wie etwa E. ooli HB101, RRI oder 9^1776 oder andere Bakterien werden durch jene rekombinanten Vektoren transformiert, welche die inserierte Wachstums-Prähormon codierende Region tragen. Transformanten werden hinsichtlich Ampizillin-Resistenz selektiert. Die Transformanten werden sodann unter Bedingungen angebaut, die für die Darstellung des Fusionsproteins günstig sind· Nach der Darstellung des Fusionsproteine wird das Wachstums-Prähormon oder Wachstumshormon durch enzymatisch« Hydrolyse'mittels Enterokinase heraus gespalten·
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Durch Verwendung geeigneter Expressions-Übertragungsvektoren wird das Wachstums-Prähormon der vorliegenden Erfindung auch direkt dargestellt, d. h. nicht an irgendein prokaryotisohes Protein angeschmolzen. Das der direkten Darstellung zugrundeliegende Prinzip besteht darin, daß das inserierte DNS-Segment vollständig jenes codierende Segment ersetzt, welches normalerweise durch die bakterielle Kontrollregion transkribiert und übersetzt wird. Die zu bewahrende essentielle Komponente der Kontrollregion wird als Expressionseinheit bezeichnet. Die Expressionseinheit umfaßt einen Promoter und eine zum Wirken im Wirtsorganismus befähigte ribosomale Bindungsstellec Es ist nicht erforderlich, die den Wirtsanteil des Fusionsproteins codierenden Nukleotide in ihrer Gesamtheit zu beseitigen. Die Beziehung zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startkodon (AUG) ist solcherart, daß der Startkodon irgendwo innerhalb der 3 bis 11 Nukleotide der ribosomalen Bindungsstelle angesiedelt werden kann (Shine, J. et al«, Proeo Nat. Acad> Sei. USA, 7J.» 1342 (1974) und Steitz, J., Proc. Nat* Aoado Sei» USA, 7_2, 4734 (1975)). In dieser 3· · · 11-Nukleotidregion setzt das zuerst angetroffene AUG den Ableserahmen für die Translation* Im Falle des vom oben beschriebenen ptrpED5O abgeleiteten ptrpE3O, das den Operator, Promotor, Attenuator und die Ribosom~Bindungssequenzen des Tryptophan-Operons gemeinsam mit der Nukleotidsequenz enthält, welche sieben Aminosäuren des trpE-Proteins mit anschließender Hind-III-Stelle codiert, schafft die Beseitigung eines Minimums von 23···29 Nukleotiden von der Hind-III-Stelle einen Platz für die Insertion in eine Expressionseinheit unter Tryptophan-Operonkontrolleο
Für die direkte Darstellung von Wachsturns-Prähormon wird die originale cDNS-Einfügung in oben beschriebener Weise
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modifiziert, um die unübersetzte 5'-Region zu entfernen. Ein Vektor für die direkte Darstellung kann durch Modifikation von ptrpE30 konstruiert werden, indem die 23»»»29-Nukleotide unter Verwendung von T4-DNS-Polymerase und S1-Nuklease in der oben beschriebenen Weise entfernt werden. Eine die Restriktionssequenz flir Bam-HI-Bndonuklease enthaltende Verbinder-Nukleotidsequenz wird stumpfendig durch die von Valenzuela et al» (siehe oben) beschriebene Vorgehensweise sowohl mit der modifizierten cDNS-Einfügung als auch mit dem modifizierten ptrpE30 verbunden· Dies erfolgt zur Erleichterung der Insertion, welche im wesentlichen in der von Ullrich, A. et al., Scienoe, 196, 1313 (1977) beschriebenen Weise vorgenommen wird. Geeignete Wirte wie etwa E. coli HB101, RRI oder ?£>1776 oder andere Bakterien werden durch jene rekombinanten Vektoren transformiert, welche die inserierte Wachsturns-Prähormon codierende Region tragen. Transformanten werden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Ampizillin ausgewählt und dann unter Bedingungen angezogen, die für die Darstellung von Wachstums-Prähormon günstig sind«
Wachstumshormon kann direkt mit der von Goed'd'el D· V· et al·, Nature, 281, 544 (1979) beschriebenen Methode dargestellt werden. Andererseits kann eine die Bam-HI-Stelle und den Startkodon (AUG) enthaltende Verbinder-Nukleotidsequenz stumpfendig mit der Wachstumshormon codierenden cDNS verbunden werden. Diese modifizierte oDNS wird dann in der oben beschriebenen Weise in das modifizierte ptrpE30 iflfleriert.
Waohstums-Prähormon wird durch Entfernen der N-terminalen Sequenz der signalpeptidhaltigen hydrophoben Aminosäuren zu Wachstumshormon umgewandelt· Die in-vitro-Beseitigung ,
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des Signalpeptids könnte durch Behandlung dea aua transformierten, induzierten Zellen extrahierten Proteins mit einer Präparation von "rohen" Mikrosomen ausgeführt werden, wie dies von Jackson, R. C· und Blobel, G.., Proc.Nat. Aoad» Sei« USA» Zi» 5598 (1977) beschrieben wurde. Die in-vivo-Beaeitigung des Signalpeptida kann während der direkten bakteriellen Ausbildung der Wachstums-Prähormon codierenden Sequenz vorkommen« Bakterielle und von Säugern stammende Signalpeptide weisen Sequenzähnlichkeiten auf» Proteine mit Säuger-Signalpeptiden können durch bakterielle Zellen bearbeitet werden} dies resultiert "in einer Bxkretion von Wachstumshormon in den periplasmatisehen Raum oder in das Medium.
Wachsturas-Prähormon und Wachstumshormon, in der beschriebenen Weise synthetisiert., werden durch bekannte Technikenwie beispielsweise Gel-Filtration, Ionen-Austauschchromatografie, Affinitäts-Chromatografie und Differential-Löslichkeitstechniken gereinigt»
Die Einzelheiten der vorliegenden Erfindung sollen weiter durch die folgenden Ausflihrungabeispiele beschrieben werden« In diesen Auaführungsbeispielen wurden die Verdauungen mit Reatriktions-Endonukleasen unter Bedingungen ausgeführt, die für jedes Enzym optimiert worden waren« Reatriktions-Endonukleasen, ihre Nomenklatur und Stellen-Spezifltät sind im einzelnen von Roberts, R«, Crit» Rev. BiooheHU, 4, 123 (1976) beschrieben worden. Die Enzyme wurden auf kommerziellem Wege bezogen und - sofern nicht anders angegeben unter optimalen Bedingungen gemäß den Empfehlungen der Hersteller eingesetzt» Umgekehrte Transkriptase wurde ebenfalls kommerziell bezogen» Die Verwendung von umgekehrter Transkriptase sowie geeignete Reaktionabedingungen sind vor dem bereits von Seeburg, P. H. et al·, Nature, 276, 795 (1978),
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Seeburg, P. Η« et al· (siehe oben) sowie Shine, J· et al. (siehe oben) beschrieben worden. Weiterhin wurde T4-DNS-Polymerase kommerziell bezogen· Die Verwendung von T4-DNS-Polymerase sowie geeignete Reaktionsbedingungen sind bereits in der Anmeldung der Serien-Nr. 125 878 beschrieben worden· Einsatz von S1-Nuklease, welche ebenfalls auf kommerziellem Wege bezogen wurde, und geeignete Reaktionsbedingungen sind bereits von Ullrich, A. (siehe oben) beschrieben worden* Weiterhin wurde termiaale Desoxynukleotid-Transferase auf handelsüblichem Wege bezogen. Die Anwendung dieses Enzyms sowie die hierfür passenden Reaktionsbedingungen sind von Royohoudhury et al. (siehe oben) mitgeteilt worden. Auch das Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I wurde handelsüblich bezogen*
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert*
Weibliche bovine Hypophysen wurden kurz nach Schlachtung der Spenderti ere gesammelt und unverzüglich in flüssigem Stickstoff eingefroren* Die Gesamt-RNS wurde durch Homogenisieren der Hypophysen in einer Guanidin-Thiozyanat-Lösung hergestellt (Chirgwin, J. M. et al., Bioohem., 1_8, 5294 (1979))· Die RNS wurde entsprechend der Beschreibung von Ullrich, A. et al. (siehe oben) durch 5.7M CsCl zentrifugiert. Sodann Wurde die RNS mit Phenol extrahiert und mit Etharioljausgefällte Polyädenylierte RNS würde unter Anwendung
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der Oligo-dT-Zellulose-Affinitätschromatografie gereinigt (Miller und McCarthy - siehe oben - sowie Aviv, H. und Leder, P«, Proc» Nat. Acad. Sei» USA, 69, 1408 (1972)).
Die polyadenylierte RNS wurde gemäß Beschreibung von Miller und McCarthy (siehe oben) sowie Martial, J. A. et al (siehe oben - 1977) unter Verwendung von Kaninchen-Retikulozyten in ein zellfreies System umgesetzt. Das in diesem System synthetisierte bovine Wachs turns-Prähormon wurde mittels eines heterologen antiovinen Wachstumshormon-Antiserums immunpräzipitiert und durch Adsorption an formalinfixierten Staphylococcus aureus Cowan Stamm I gemäß Beschreibung von Martial, J. A. et al.(siehe oben - 1977) präpariert. Die 35 S-Proteine wurden gemäß Beschreibung von Laemmli (siehe oben) der Elektrophorese auf plattenartigen 12,5-%-SDS-Polyakrylamid-Gelen unterzogen. Diese Analyse zeigte, daß die bovines Wachstums-Prähormon codierende polyadenylierte RNS etwa 12,6 % der gesamten pituitären polyadenylierten RNS ausmachte.
Polyadenylierte RNS wurde unter Einsatz von Umkehrtranskriptase nach der von Miller und McCarthy (siehe oben) beschriebenen Methode sowie nach der von Monahan et al. (siehe oben) beschriebenen Methode in einzelstrangige cDNS umgekehrt transkribiert. RNS wurde durch alkalische Hydrolyse beseitigt. Die einzelstrangige cDNS wurde mit Phenol extrahiert, über G-50 Sephadex (Handelsmarke) chromatografiert und einer Ethanolpräzipitation unterzogen. Die einzelstrangige cDNS wurde dazu benutzt, die Synthese des zweiten cDNS-Stranges mittels Umkehrtranskriptase in oben beschriebener Weise selbst in Ganz zu setzen. Die einzelstrangige "Haarnadelschleife" am 3'-Ende des ersten cDNS-Stranges wurde entsprechend der Beschreibung von Leong et al. (siehe
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oben) und Ullrich, A* et al· (siehe oben) durch Verdauung mit S1-Nuklease beseitigt* Die doppelstrangige cDNS wurde mittels Phenolextraktion, Chromatografie über G-50 Sephadex und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die doppelstrangige cDNS wurde laut Beschreibung von Roychoudhury et al« (siehe oben) unter Verwendung von dCTP und terminaler Transferase 3'dCMP-geschwänzt.
Das Plasmid pBR322 wurde durch Pst-I-Endonuklease gespalten und mit dGMP vermittels der oben beschriebenen Schwanzbildungsprozedur geschwänzt, wobei allerdings anstelle von dCTP dGTP eingesetzt wurde. 50 ng des dG-geschwänzten, Pst-I-gespaltenen Plasmids pBR322 sowie 20 ng der dC-geschwänzten doppelstrangigen cDNS wurden in einer 50 Ail-Reaktion gemäß Cook et al. (siehe oben) gekühlt.
Die Transformation von E. coli 9^1776 mit der Plasmid-Präparation wurde folgendermaßen ausgeführt: E. coli ^1776 wurde durch 20minütige Inkubation bei 4 0C in 75 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 und 10 mM Tris (pH 7,5) für DNS permeabel gemacht. Plasmid und Bakterien wurden 60 min bei 4 0C und daran anschließend 2 min bei 41 0C inkubiert. Die transformierten Kolonien wurden hinsichtlich Tetrazyklin-Resistenz selektiert. Das Vorhandensein von geklönter DNS wurde durch Kolonie-Hybridisierung an frisch präparierte ^ P-markierte bovine Hypophysen-cDNS gemäß Beschreibung von Grunstein und Hogness (siehe oben) nachgewiesen. Aus selektierten Kolonien wurde Plasmid-DNS präpariert, mit Pst I zerschnitten, auf 1%iger Agarose einer Elektrophorese unterzogen, mit Ethidiumbromid gefärbt, fotografiert und schließlich naoh der Methode von Southern (siehe oben) auf Nitrozellulosefilter übertragen· Das Vorhandensein von Wachstumshormonsequenzen in der übertragenen DNS wurde durch Hybridisa-
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tion an geklonte Rattenhormon-DNS voller Länge abgeschätzt (Seeburg, Po H. et al· - siehe oben), welche durch Einschnitt-Translation markiert worden war (Maniatis, R, et al·, Proc. Nat. Aoad. Sei. USA, 72, 1184 (1975))» Ein Klon wurde gewonnen, welcher mit der durch Einschnitt-Translation markierten DNS hybridisierte. Dieser Klon erhielt die Bezeichnung pB348o Die Einlagerung enthält 831 Basenpaare.
Sequenzanalyse der cDNS. Plasmid pBP348 wurde mit Pst I zerschnitten, das Phosphat an den 5'-Enden des DNS-Fragments wurde mit alkalischer Phosphatase entfernt und unter Verwendung von Polynukleotid-Kinase durch J P-Phosphat ersetzt. Weiteres Zerschneiden mit einer Reihe anderer RestriktiOns-Endonukleasen, Polyakrylamidgel-Elektrophorese sowie Färben und autoradiografische Untersuchung der DNS-Banden ergeben eine Restriktionskartr der geklonten DNS. Nun wurde eine große Charge pBP348 präpariert und mit Pst I, Pvu II oder Sau 3A zerschnitten sowie mit j Y-32P] ATP und Polynukleotid-Kinase markiert und dann mit anderen Enzymen zerschnitten, um DNS-Fragmente zu erbringen, die an einem einzelnen Ende markiert sind. Diese Fragmente wurden duroh Elution aus Polyakrylamidgel präpariert und nach der Beschreibung von Cooke et al· (siehe oben) sowie Maxam, AV M. und Gilbert, Wo, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74, 1560 (1977) in ihrer Sequenz dargestellt. Die Sequenz für die inserierte cDNS ist in Abbildung 1 gemeinsam mit der entsprechenden vorhergesagten Aminosäuresequenz dargestellt, welche duroh den Empfindungssträng, d» h. den sequentiell der jeweiligen mRNS entsprechenden Sträng codiert wirdο
Der korrekte Ableserähmen wird an einem Fehlen von Termina-
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tionekodonen über einen beträchtlichen Anteil der Einlagerung hinweg wiedererkannt. Die Numerierung der Aminosäurepositionen erfolgt mit der amino-terminalen Aminosäure von bovinem Wachstumshormon beginnend und in der positiven Richtung fortsetzend bis zum Karboxy-terminalen Ende; in der negativen Richtung läuft die Numerierung bis zum ersten AUG-Kodon, vorausgesetzt, daß es sich dabei um den Punkt der Translationsinitiation handelt. :
Unsere Befunde deuten darauf hin, daß - gemeinsam mit vielen anderen Hormonen - die Synthese von Wachstumshormon eine nach der Translation erfolgende Umsetzung mit einschloß» Die Translation von Wachstumshormon-mRNS erbringt einen Vorläufer (Wachsturns-Prähormon), welcher ein'Signalpeptid enthält, das während des Transits in das endoplasmatische Retikulum freigesetzt werden kann.
(A) Ausführungsbeispiel 1 wird wiederholt, wobei anstelle '-von Plasmid pBR322 Plasmid pBR315 verwendet wird. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion der rekombinanten Klone entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung* Die Einlagerung wird entfernt und gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 2 analysierte Als Ausbeute wird eine DNS von etwa 831 Basenpaaren mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz gewonnene
(B) Ausführungsbeispiel 1 wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 Plasmid pBR3i6 verwendet wird. Alle Bedingungen sind mit den in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen identisch. Die Beseitigung und Analyse der Einlagerung gemäß Ausführungsbeispiel 2 erbringt eine DNS mit der
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-:M: ίί .Si .·; 59 677 18
in Abbildung 1 gezeigten Sequenz.
Ausführungsbeispiel 4 ^ ^ !-vt :;,. ..- ..> j u- -^v. :>, ./ii^^i^-.-^"!
Für j dieses Ausführungsbeispiel wird die das bqvin^ Prä-?; Waphstuipshomon codierende c DNS in cder im Ausf Uhr ungsb§i spiel 1 beschriebenen Weise hergestellt. Alle in diesem und;/den ,folgenden Ausführungsbeispielen yerwendetenaRestriktipnss teilen-Verbind er werden nach der yonr Scheller, Jl. JU ^et al.» ,Science 196, 177 (1977)l/b§so-JbJieben^-j!M€i1jhqdte:,,jgube.5ettie.t· Die in diesem und den folgenden Ausführungsbeispielen verwendeten Restriktions-Endonukleasen sind im |tandel zu beziehen: die gewählten optischen Bedingungen richten sich nach den Empfehlungen derHersteller. Die Transformation »/von E. coli > 1776 erfolgt in der in. Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise.
Hind-III-Verbinder mit der Sequenz 51 - GCAAGCTTGG - V werden der in Ausführungsbeispiel 1 hergestellten cDNS durch ^stumpf'endige\JAgation /unter !Einsatzivy;on T4^DNS-rLigaseίverbund en, wie dies von Valenzuela* P* etral.r Nature> 28Θ, 815 (1979) beschrieben worden ist. Nach der Ligation wird das Produkt mit Hind III oder Hsu I entsprechend der von Ullrich, A. et al* Science 1ft6 t 1313 (1977) beschriebenen Vorgehehsweise verdaut# Ebenfalls nach der von^ Ullrich, A· el; ali (siehe oben) heschrieböri
mi;dipBR322 an der Hind-III^RestriktionaB^elle entweder mit Hind jlll oder jHsUil abspaltenf und mi tu alkalischer iPhösphaitas? behandelt» tNach 4er Ethanplausf älluhg wird das J: - s f phpsphatasebehandelte gespaltene pBR322 ;d#r ütohäsive 'Hind-III-rTermini/ enthaltenden^cMS gemäß Beschreibung von - r < Ullrich, A. et al (siehe oben) verbunden. E. GoIi > 1776 wird mit, dem Ligationsgemisch transformiert, und die trans-
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formierten Kolonien werden hinsiohtlich ihrer Tetrazyklin-Resistenz selektiert. Das Vorhandensein von geklönter DNS, wird entsprechend der Beschreibung in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt· Gewonnen wird eine Kolonie, welche eine Einlagerung enthält, die mit der durch Einschnitt-Translation markierten DNS hybridisierte. Die Einlagerung wird durch Verdauung mit Hind III oder Hsu I beseitigt und gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Die Einlagerung enthält etwa 830 Basenpaare und weist die in Abbildung 1 dargestellte Sequenz auf.
(B) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei anstelle von pBR322 verschiedene Vektoren verwendet werden. Im vorliegenden AusfUhrungsbeispiel werden die Plasmide pSC101, pMB9, PBR313, pBR315 und pBR3i6 anstelle von pBR322 verwendet. Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekombinanten Klonen entsprechen der in (A) gegebenen Beschreibung. Für alle Plasmide werden identisohe Ergebnisse erzielt, d· h·, in "Jedem Falle wird ein rekombinantes Plasmid gewonnen, welches eine Einlagerung mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz aufweist.
(C) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei verschiedene andere Restriktionsstellen-Verbinder und Restriktions-Endonukleasen verwendet werden· In diesem Ausführungsbeispiel werden anstelle der Verbinder für Hind III die Verbinder für Sal I und Bam HI verwendet. Die Sequenz dieser Verbindung sind 51 - GGTCGACC - 31 und 5' - CCGGATCCGG 31· Werden Sal-I-Verbinder eingesetzt, dann werden die verbinderbehandelte cDNS und pBR322 mit Restriktions-Endonuklease Sal I gespalten, und werden Bam-HI-Verbinder eingesetzt, dann ist die Restriktions-Endonuklease Bam HIo Alle Bedingungen einschließlich der Selektion von rekombinanten
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Klonen entsprechen der in Ausführungsbeispiel 4(A) gegebenen Beschreibung· Pur beide Verbinder und Restriktions-Endonukleasen werden identische Ergebnisse gewonnen.
(D) Ausführungsbeispiel 4(C) wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 die Plasmide pSC1O1, pMB9, pBR313, PBR315 und pBR3i6 verwendet werdeno Alle Bedingungen entsprechen den in Ausführungsbeispiel 4(C) beschriebenen; es werden identische Resultate erzielt, d. h., in Jedem Falle wird eine Einlagerung gewonnen, welche de in Abbildung 1 gezeigte Sequenz aufweist.
(E) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein Eco-RI-Restriktionsverbinder mit der Sequenz 5' - CCGAATTCGG 3' anstelle des Hind-II!-Verbinders sowie EcοRI anstelle von Hind III (Hsu I) verwendet wird. Alle Bedingungen sind mit den bereits beschriebenen identisch, mit Ausnahme dessen, daß die transformierten Kolonien nicht hinsichtlich Tetrazyklin-Sensitivität selektiert werden. Das Vorhandensein von geklönter DNS wird in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise erreicht. Gewonnen wird ein rekombinanter Klon, weicher eine Einlagerung enthält, die die in Abbildung 1 gezeigte Sequenz aufweist.
(F) Ausführungsbeispiel 4(E) wird wiederholt, wobei anstelle von Plasmid pBR322 die Plasmide pSC1O1, pMB9, pBR3|3 und pBR315 verwendet werden· Beibehalten werden die in Ausführungsbeispiel 4(E) beschriebenen Bedingungen; für jedes Plasmid werden identische Resultate erzielte
(G) Ausführungsbeispiel 4(A) wird wiederholt, wobei ein Pst-I-Restriktionsverbinder mit der Sequenz 51-- GCTGCAGC - V und Pst I anstelle des Hind-III-Verbinders bzw. Hind-III
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(Hsu I) eingesetzt werden. Die gleichen Bedingungen werden beibehalten, mit der Ausnahme, daß die Selektion-rekombinanter Klone in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise vorgenommen wird. Gewonnen wird ein rekombinanter Klon mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz«
(H) Ausführungsbeispiel 4(G) wird wiederholt, wobei anstelle von PBR322 die Plasmide pBR315 und pBR3i6 verwendet werden* Es werden die gleichen Bedingungen wie in AusfUhrungsbeispiel 4(G) beibehalten und identische Resultate erzielt.
(I) Die Ausflihrungsbeispiele 1, 3(A), 3(B) und 4(A)... (H) werden wiederholt, wobei E. coli RRI oder E. coli HB101 anstelle von E. coli ^ 1776 verwendet werden. Alle Bedingungen entsprechen der bereits gegebenen Beschreibung} es werden identische Ergebnisse erzielt.
Ausführungsbeispiel 5
Bei diesem AusfUhrungsbeispiel wird die cDNS wie in Ausfuhrungsbeispiel 1 hergestellt. Eco-RI-Restriktionsstellenverbinder werden gemäß der von Valenzuela, P. et al· (siehe oben) beschriebenen Vorgehensweise stumpfendig an die oDNS angelagert und entsprechend der Beschreibung von Ullrich, A. et al· (siehe oben) mit Eoο RI gespalten·
(A) In der von Blattner et al· (siehe oben) beschriebenen Weise hergestellte Charon-16-DNS wird als Übertragungsvektor verwendet. Die kohäsiven Enden werden durch öOminütige Inkubation bei 42 0C in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) und 10 mM MgCl2 gekühlt'« Der Vektor wird an der Eco-RI-Restriktionsstelle mit Eco-RI-Endonuklease gespalten und dann in der
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von Ullrich, A. et al. (siehe oben) beschriebenen Weise mit alkalischer Phosphatase behandelt. Nach der Ethanolausfällung wird die phosphatasebehandelte Vektor-DNS zu cDNS hinzugegeben, welche kohäsive Ec£-RI-Termini in einem molaren Verhältnis von 2 Mol Vektor zu 1 Mol cDNS enthält. Das Gemisch wird gemäß Beschreibung von Ullrich, A. et al. (siehe oben) mit T4-DNS-Ligase verbunden« Das Ligationsgemisch wird direkt einer Suspension von Eo coli- /' 1776-Zellen zugesetzt, welche entsprechend Ausführungsbeispiel 1 für die Transformation vorbereitet wurden· Ebenfalls nach der im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise wird die Transformation vorgenommen. Die rekombinanten Phagen werden zurückgewonnen und auf Lac" auf Platten angelegt, welche 5-Chlor-4-brom-3-indolyl-/3-D-Galaktosid (X6), (80/tg/ml) enthalten. Pur die Herstellung von farblosen Belägen werden rekombinante Phagen selektiert, welche die in die Eoo-RI-Stelle von Charon 16A inserierte cDNS enthalten. Ein ausgewählter Rekombinant wird isoliert und mit einem Überschuß an Eco-RI-Endonuklease verdaut; das AufSchlußprodukt wird in der in Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Weise analysiert. Zurüokgewonnen wird eine DNS von etwa 830 Basenpaaren Länge und der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz. Anderenfalls wird die Ligationsmisohung dazu benutzt, rekombinante Phagen duroh in-vitro-Verpacken gemäß der Beschreibung von Sternberg, N. et al., Gene 1_, 255 (1977) zu bilden. Rekombinante Phagen können darüber hinaus durch Anwendung der von Benton, W. D. und Davis, R. W., Science 196« 180 (1977) berichteten in-aitu-Plaque-Hybridisationstechnik ausgelesen werden.
(B) In der von Blattner et al. (siehe ob.en) beschriebenen Weise hergestellte Charon-3A-DNS oder Charon-4A-DNS wird anstelle der im vorangegangenen Ausführungsbeispiel genannten Charon-16A-DNS als Übertragungsvektor verwendet. Alle
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Bedingungen sind mit den für Charon-16A-DNS beschriebenen identisch. Die Selektion rekombinanter Phagen erfolgt durch (a) Plattieren der Phagen auf Lac+ Bakterien auf X6-haltigen Platten und Isolieren farbloser Plaques sowie darauffolgend entweder Hybridisation an eine geeignete Sonde oder Restriktions-Endonuklease-Verdauung in der von Blattner et al. (siehe oben) beschriebenen Weise· Die Einlagerung wird naoh der bereits dargestellten Methode entfernt j als Ausbeute wird eine DNS von etwa 830 Basenpaaren Länge mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz gewonnen.
(C) Als Übertragungsvektor wird anstelle der weiter oben verwendeten Charon-16A die nach Beschreibung von Timier et al. (siehe oben) hergestellte ?-gt WES * }~ B-DNS genutzt. Alle Bedingungen entsprechen den für Charon 16A beschriebenen. Die Selektion rekombinanter Phagen erfolgt nach der Hybridisationsmethode von Benton und Davis (siehe oben). Die Einlagerung wird in der oben beschriebenen Weise entfernt und erbringt eine DNS von etwa 830 Basenpaaren Länge mit der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz.
(D) Die Ausflihrungsbeispiele 5(A)...(C) werden wiederholt, wobei E. coli RRI, R. coli HB101, E. coil DP50 oder E. coli DP5OSup3? anstelle von E. coli "T61776 verwendet werden. Alle Bedingungen sind identisch} es werden identische Ergebnisse erzielt.
Pur dieses Ausfiihrungsbeispiel wird die bovines Prä-Wachstumshormon codierende DNS in der in Ausftihrungsbeispiel 1 beschriebenen Weise zubereitet. Es werden Hind-III-Restriktionsstellenverbinder zugesetzt, und die oDNS wird mit
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Hind III oder Hau I in der in AusfUhrungsbeispiel 4(A) beschriebenen Weise verdaut.
Als Übertragungsvektor wird das Plasmid pC194 verwendet, das - wie von Ehrlich, S· Dt (siehe oben) beschrieben - aus S. aureuB isoliert worden war. pC194 wird an der Hind-III-Stelle mit Hind III oder Hsu I gespalten und dann mit alkalischer Phosphatase in der von Ullrich, A· et al· (siehe oben) beschriebenen Weise behandelt. Ebenfalls in der von Ullrich, A· et al· (siehe oben) beschriebenen Weise wird die cDNS mit Hind-III-kohäsiven Termini mit dem gespaltenen pC194 verbunden· Entsprechend der Beschreibung von Sgaramella, V· et al·, J» Mol» Biol·, 10£, 587 (1976) sowie Borenstein, S. und Ephrati-Elizue, E., J» Mol» Biol«, 45, 137 (1969) erfolgt eine Kompetenz-Induktion von B· subtiIis RUB3310 Die Transformation von B. subtilis RUB331 erfolgt" -unter Verwendung der ebenfalls von Sgaramella et al· und Borenstein et al. beschriebenen Ligationsmischung» Die Zellsuspension wird direkt auf L-Platten angelegt, welche 3 Ag Chloramphenikol enthalten. Ein selektierter Rekombinant wird isoliert und mit Hind III verdaut; das Aufschlußprodukt wird gemäß Ausführungsbeispiel 2 analysiert. Zurückgewonnen wird eine DNS von etwa 830 Basenpaaren Länge und der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz·
(A) Plasmid pBR348 wird mit Ha_e-II-Endonuklease verdaut, woraus ein Fragment mit 1 600 Basenpaaren entsteht. Eine Hae-II-Stelle befindet sich innerhalb der das Wachstums-Prähormon codierenden cDNS-Einlagerung, die zweite Stelle
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befindet sich innerhalb des pBR322-Anteils des Plasmids. Die Verdauung erbringt
| - | + 1 | +2 | .. 3-1 | |
| 51 | -G | C | TTC .. | .. 5' |
| V | CGG | AAG .. | ||
Bovines Wachstumshormon kann entweder mit dem +1 ala- oder dem +2 phe-Rest am NH2"terminalen Ende beginnen (Dayhoff.et al· siehe oben), so daß der eine versuchen könnte, den ala-Kodon zu komplettieren, während ein anderer versuchen könnte, den ala-Kodon auszulöschen· Der Versuch des Auslöschens erfolgt durch Inkubieren der DNS mit dATP und dem Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I, da die erste Base des +2 phe-Kodons (auf dem 3' 5'-Strang) A ist. Diese Reaktion ergibt
+ 1 +2
5' - C TTC .... 3'
31 - AAG .... 5'
Die PNS wird mit Phenol extrahiert und ausgefällt. Überschüssiges dATP und die verdauten Basen werden durch Chromatografie auf G-50 Sephadex beseitigt. Das verbleibende 51 überstehende C des +1 ala-Kondons wird sodann gemäß Beschreibung von Shine et al«, Nature 285. 456 (1980) mit S1-Nuklease entfernt. Diese Verdauung erbringt
+2 51 - TTC .... V -
V- AAG .... 5'
(B) Ausführungsbeispiel 7(A) wird wiederholt, wobei die das bovine Prä-Wachstumshormon codierende Desoxynukleotidsequenz duroh Verdauung derjenigen Ubertragungsvektoren entfernt
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wird, die in den Aus flihrunga bei spiel en 3, 4, 5 und 6 durch das geeignete Restriktionsenzym vor der Verdauung mit Hae II hergestellt worden waren. Die verwendeten Übertragungsvektoren und Restriktionsenzyme sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Nach Verdauung mit dem geeigneten Restriktionsenzym wird die bovine Prä-Wachstumshormon-Sequenz mittels Gel-Elektrophorese isoliert und dann gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 7(A) weiterbehandelt. Es werden identische Resultate erzielt.
| Pst | I | III | I | 3A, | 3B, | 4G, | 4H |
| Hind | HI | 4A, | 4B, | 6 | |||
| Sal | RI | 4C, | 4D | ||||
| Bam | 4C, | 4D | |||||
| Eco | 4E, | 4P, | 5A, | 5B, 5C |
(C) Die Ausführungsbeispiele 7(A) und 7(B) werden wiederholt, wobei anstelle des Klenow-Fragments von DNS-Polymerase I T4-DNS-Polymerase oder 31*»·5'-Exonuklease verwendet wird· Alle anderen Bedingungen sind identisch; in jedem Falle wird die identische Sequenz des Fragments von bovinem Wachstumshormon gewonnen.
(A) Da-s bovine Wachstumshormon-Fragment
+1 +2
51 - C TTC .... 3' 3« - G CGG AAG .... 51
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wird durch Hae-II-Verdauung gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 7(A) oder 7(B) hergestellte Der Komplettierungsversuoh wird folgendermaßen durchgeführt j Die DNS wird mit dATP, dCTP, dTTP und dem Klenow-Fragment von DNS-PoIymerase I inkubiert
Diese Reaktion erbringt
+1 +2
5·- G GCC TTC ο... 3'
3' - G CGG AAG .... 51
Die DNS wird mit Phenol extrahiert und ausgefällt. Die Sequenz wird sodann in Anwesenheit von dCTP mit dem Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I inkubiert. Danach wird die Sequenz laut Beschreibung von Shine et al·, Nature. 285, (1980) mit S1-Nuklease verdaut; dies erbringt die Sequenz
5' - GCC TTC .... V y - CGG AAG ..%. 5'.
(B) Ausführungsbeispiel 8(A) wird wiederholt, wobei im zweiten Inkubationsschritt, d. h. unter Anwesenheit von dCTP T4-DNS-Polymerase oder 31··«5'-Exonuklease anstelle des Klenow-Fragments verwendet wird. Die anderen Bedingungen sind identisch? in jedem Falle wird die identische bovine Wachstumshormonsequenz erlangt.
Ausführungsbeispiel 9
Die das bovine Wachstumshormon codierende Desoxynukleotid-Sequenz wird in Übertragungsvektoren inseriert, wie dies im vorangegangenen Text für die das bovine Prä-Wachstumshormon codierende Sequenz beschrieben wurde.
(A) Die AusfUhrungsbeispiele 1, 3(A), 3(B), 4(A)...(I),
Z3ZBI1 L
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(D) und 6 werden wiederholt, wobei anstelle der das bovine Prä-Wachstumshormon codierenden DNS jene DNS verwendet wird, die in den Ausführungsbeispielen 7(A), 7(B) oder 1(C) hergestellt worden war. Alle anderen Bedingungen bleiben unverändert. Die DNS wird durch Verdauung mit dem geeigneten Restriktionsenzym - wie beispielsweise in Tabelle 3 dargelegt - entfernt und gemäß Ausflihrungs bei spiel 2 analysiert. In jedem Falle wird eine DNS mit einer Sequenz gewonnen, welohe mit dem Phe-Kodon auf Position 2 beginnt und sich zum Ende der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz fortsetzt.
(B) Die AusfUhrungsbeispiele 1, 3(A), 3(B), 4(A)...(I), 5(A) ...(D) und 6 werden wiederholt, wobei anstelle der das bovine Prä-Wachstumshormon codierenden DNS jene DNS verwendet wird, die in den Ausflihrungs b eis pi el en 8(A) oder 8(B) hergestellt worden war. Alle anderen Bedingungen bleiben unverändert. Die DNS wird durch Verdauung mit dem geeigneten Restriktionsenzym - wie beispielsweise i'n Tabelle 3 dargelegt - entfernt und gemäß Ausführungsbeispiel 2 analysiert. In jedem Falle wird eine DNS mit einer Sequenz gewonnen, welche mit dem Ala-Kodon auf Position 1 beginnt und sich zum Ende der in Abbildung 1 gezeigten Sequenz fortsetzt.
Bovines Wachstumshormon kann durch jedwede der oben beschriebenen Methoden dargestellt werden.
(A) Darstellung von bovinem Wachstums-Prähormon als ein Fu-
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sionsprotein wurde mittels eines Radioimmunoassay-Versuches und eines Minizeil-Versuches demonstriert. Im Radioimmunoassay-Versuch wurden pBP348-haltige E. coli /Ί776 oder pBR322-haltige E. coli als Kontrollvariante in Nährbouillon angebaut und mittels Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden resuspendiert und lysiert, sodann wurden strahlenmarkiertes ovines Wachstumshormon sowie oviner (oder boviner) Wachstumshormon-Antikörper hinzugegeben. Der Immunkomplex wurde ausgefällt und hinsichtlich Radioaktivität gemessen. Dieser Versuch zeigt, daß das Fusionsprotein einen Teil der bovinen Wachstumshormon-Immunoaktivitat zurückhält. Um darüber hinaus die Produktion eines Fusionsproteins zu veranschaulichen, wurde ein Minizell-Versuoh nach der von Meagher, R. B. et al., CeIl1 IJ), 521 (1977) beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt. Abbildung 2 zeigt die aus E.-coli- 7^1776 -Minizellen resultierenden Gelelektrophorese-Banden. Bande (a) wurde von E. coli 9^1776 gewonnen, das mit pBP348 transformiert worden war. Bande (b) wurde von E. coli P^1776 gewonnen, das mit pBR322 transformiert worden war. Bande (c) sind Molekülmasse-Marker. (A) zeigt das Fusionsprodukt von β -Laktamase und bovinem Wachstums-Prähormon. (B) zeigt Prä-Laktamase, und (C) zeigt (b -Laktamase. Dieser Versuch zeigt, daß pBP348 ein Fusionsprotein erzeugt, welches aus 183 Aminosäuren von /S -Laktamase, 217 Aminosäuren von bovinem Wachstums-Prähormon und einigen durch die normalerweise hichtübersetzte 5'-Region codierten verbindenden Aminosäuren besteht. Die ermittelte gesamte relative Molekülmasse annähernd 45 000 - stimmt mit der vorausberechneten relativen Molekülmasse des Hybridproteins überein.
(B) Zur direkten Darstellung von bovinem Wachstums-Prähormon wird die Einlagerungs-DNS zunächst durch teilweise Pst-I-Endonukleaseverdauung von pBP348 separiert und mittels
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präparativer Gel-Elektrophorese gereinigt. Sodann wird eine 15- U.SrProbe der gereinigten Einlagerungs-DNS modifiziert, indem die DNS in Wasser suspendiert wird, welchem eine konzentrierte Salzlösung zugesetzt wird, so daß die endgültige Zusammensetzung 70 mM Trie (pH, 8,8), 70 mM MgCl2,, 10 mM Dithiothreitol und 13.75 Einheiten T4-DNS-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 250^1 enthält. Das Reaktionsgemisch wird für einige Minuten bei 37 0C inkubiert, sodann wird dATP bis zu einer Konzentration von 50 mM zugesetzt, um die endonukleolytische Verdauung am nächstgelegenen Adenin-Rest zu beenden. Nach 30 s zusätzlicher Inkubation wird das Enzym durch 5minUtige Wärmebehandlung bei 65 0C inaktiviert. Dieser Vorgang wird zweimal durchgeführt, wobei einmal dCTP anstelle von dATP und beim zweitenmal erneut dTTP verwendet wird. Die behandelte DNS wird mittels Ethanolpräzipitation zurückgewonnen. Die Verdauung mit St-Nuklease zur Erlangung von stumpfen Enden wird in der von Ullrich, A· et al· (siehe oben) beschriebenen Weise ausgeführt. Dieses Vorgehen dient dazu, ein DNS-Molekül zu erzeugen, das am Startkodon auf Position Nr. -26 abschließt. Derartige Moleküle werden übersetzt, wenn sie in einen Expressionsvektor inseriert werden, dessen Insertionsstelle sich etwa 3··»11 Nucleotide von der Ribosom-Bindungsstellensequenz einer Expressionseinheit entfernt befindet.
Ein Vektor für die direkte Darstellung wird durch Modifikation des Plasmids ptrpE30 vermittels Beseitigen von 23···29 Nukleotiden unter Einsatz von T4-DNS-Polymerase und S1-Nuklease gemäß obiger Beschreibung konstruiert·
Sowohl die modifizierte cDNS als auch der modifizierte Expressionsvektor werden mit einem spezifischen Verbinder mit der Sequenz 5'-CCGGATCCGG-31 an einem Strang und seiner
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komplementären Sequenz am anderen Strang versorgt; dies erfolgt durchstumpfendlgeLigation unter Verwendung von DNS-Ligase, wie dies von Valenzuela (siehe oben) beschrieben wurde. Die Verbinder liefern gegenüber Bam-HI-Endonuklease sensitive Restriktionsstellen - , letztere wird zur Erleiohterung der Insertion verwendet. Die Insertionsreaktion wird in der von Ullrich, A· et al. (siehe oben) beschriebenen Weise durchgeführt. Die Wirtsbakterien E. coli HB101, RRI oder 9° 1776 werden durch die die inserierte modifizierte Wachstums-Prähormon codierende Region tragenden rekombinanten Vektoren transformiert, und die Transformanten werden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber Ampizillin selektiert. Ein einzelner, für die weitere Analyse ausgewählter Transformant wird als ptrpE30/bGH bezeichnet.
Durch ptrpE30/bGH transformierte Bakterienzellen werden bei 37 0C in einem mit Leuzin, Prolin, Vitamin B1 und Ampizillin angereichertem Standard-Minimalmedium (M9) angebaut. In der frühen log-Phase wird das trp-Operon durch Zusetzen vonß-Indolylakrylsäure (30^g/ml Medium) induziert. Die Kontrollkulturen bleiben uninduziert. Nach drei weiteren Stunden Wachstum werden 1,5 ml Zellen durch Hinzugeben von 20/^ Ci ™S-L-Methionin radioaktiv markiert und 10 min lang inkubiert. Die Zellen werden sodann durch Zentrifugetion gesammelt, gewaschen und in 25Oyu.l Pufferlösung - 10 % (V/V) Glykol, 5 % (V/V)/2-Merkaptoethanol und 2,3 % (M/V) SDS in O,O625M ?ris (pH 6,8) - resuspendiert. Die Suspension wird 5 min gekocht, dann einem 10-%-(M/V)-SDS-Polyakrylamid-GeI appliziert und elektrophoretisch fraktioniert. Die Proteinbanden werden autoradiografisch sichtbar gemacht. Die Ergebnisse fassen das Vorhandensein einer neuen Proteinbande von etwa 24 QOO Dalton erkennen, welche in nichtinduzierten oder nichttransformierten Kulturen nicht beobachtet
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Das bovine Wachstums-Prähormon wird durch herkömmliche Techniken einschließlich beispielsweise Gelfiltration, IonenaustauschchromatografieV Affinitätschromatografie und Differential-Löslichkeitstechniken gereinigt. Die Überführung von Wachstums-Prähormon in Wachstumshormon erfolgt durch das von Jackson, R» C· et al· (siehe oben) beschriebene Verfahren.
(C) Ein spezifischer Verbinder mit der Sequenz 5'-CCGGATCCG GATG-31 auf einem Strang und seiner komplementären Sequenz auf dem anderen wird der das bovine Wachstumshormon codierenden DNS, wie sie in den Ausf iihrungsbei spielen 7(A) ...(C) und 8(A)o..(B) hergestellt wurde, stumpfendig verbunden. Diese modifizierte DNS wird dann gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 10(B) in das modifizierte Plasmid ptrpB30 inseriert. Wirtsbakterien werden laut Ausführungsbeispiel 10(B) transformiert, kultiviert, und das resultierende bovine Wachstumshormon wird gereinigt.
Wenn auch die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen AusfUhrungsformen beschrieben worden ist, so versteht es sich von selbst, daß sie weiterer Modifikationen fähig ist. Mit der vorliegenden Anmeldung sollen einige Variationen, Anwendungen oder Bearbeitungen der Erfindung bezüglich ihrer "Grundsätze geschützt werden; dies schließt auch solche Abweichungen von der hier dargestellten Offenlegung ein, die sich aus der bekannten und üblichen Praxis in Jenem Fachgebiet ergeben, auf das sich die Erfindung bezieht.
Claims (6)
- 232811 219.4.1982AP c 12 N/232 811/259 677 18Erfindungsanspruoh:
- 1. Verfahren für die Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors für den Einsatz bei der Aufrechterhaitung und Replikation einer für Rinderpräwaehstumshormon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz, gekennzeichnet dadurch, daß eine für Rinderpräwachstumshormon kodierende Desoxynucleotid-Sequenz mit einem durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym hergestellten DNS-Molekül umgesetzt wird ο
- 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die für Rinderpräwaehstumshormon kodierende Desoxynucleotid-Sequenz einen Plusstrang folgender Sequenz aufweist» 5' - ATG ATG GCT GCA GGC CCC CGG ACC TCC CTG CTC CTG GCT TTC GCC CTG CTC TGC CTG CCC TGG ACT CAG GTG GTG GGC GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TOC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG OAG AAA TCA GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC: TTC ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG CGi! AGT GAC j GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC TCC TGG TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG- VworinA Desoxyadenyl istG Desoxyguanyl istC Desoxycytosyl ist undT Thymidyl ist.-If3-232811 2AP C 12 N /232 811/2 59 677 18
- 3. Verfahren für die Herstellung des Plasmids pBP348 nach Punlct 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß das durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym hergestellte DNS-Molekül pBR322 ist und das Restrikt ionsenzym Pst I ist.
- 4. Verfahren für die Herstellung eines DNS-Transfer-Vejrtors für den Einsatz zur Aufrechterhaltung und Replikation einer für Rinderwachstumshormon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine für Rinderwachstumshormon kodierende Desoxynucleotid-Sequenz mit einem durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym erzeugten DNS-Molekül umgesetzt wird.
- 5. Verfahren für die Herstellung eines Expressions-Transfer-Vektors nach Punkt 1,2 oder 4 für die Verwendung bei der Expression einer für Rirylerpräwachsturashormon oder Rinderwaohstumshormon kodierenden Desoxynucleotid-Sequenz, gekennzeichnet dadurch, daß das durch Spalten eines Transfer-Vektors mit einem Restriktionsenzym hergestellte DNS-Molekül an einer Stelle innerhalb einer Expressions-Kontroll-Region gespalten wird.HierzoSLSeiten Zeichnungen... . 12 JAH 1983*0615 yÖ
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