JPS58996A - 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 中成長ホルモン（Ｂ（））１）はアミノ＠　１９１個の
ポリペプチドで、初めＣニアミノ＠２６個の信号ペプチ
ドを含有する前駆体成長ホルモンとして合成される〔ハ
ント・エル、ティー（Ｈｕｎｔ、　Ｌ−Ｔ−）及びディ
ホフ、ヱム。

オー（Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ−０，）（１９７６年）、［
蛋白質配列およびＩＩｋ造地図Ｊ　（Ａｔｌａｓ　ｏｆ
　Ｐｒｏｔｅｉｎ　８ｅｑ−ｕｅｎｏｅ　ａｎｄ　８ｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ）、　エム、オー、デイホフ（全米生医
学研究財団、ワシントンＤ、Ｏ・）編、第５巻、補追２
，１１１〜１３９頁、リンガヴパ、グイ−。アール（Ｌ
ｉｎｇＭｎｐａ、Ｖ、’Ｒ・）、デビラース、チアリー
、エイ（Ｄｅｖｉｌｌｅｒｓ−Ｔｈｔｅｒｙ、　Ａ−）
及びプロベル、ジー（Ｂｌｏｂｅｌ、　Ｇ、）（１９７
７年）　Ｐｒｏｏ、Ｎａｔ、１．Ａｃａｄ−８ｃｉ−７
４巻２４３２〜２４３６頁〕。

牛ＧＥの３′−未翻訳領域は我々の実験室で配列につい
て解明され、長さがヌクレオチド１０４個であることが
示された〔４−サページ、ヱヌ、ヱＲ／ｒ８ａｓａｖａ
ｇｅ。

Ｎ、Ｌ・）、スミス・エム・（８ｍｔ　ｔｈ、　Ｍ・）
、ジラム・ニス（Ｇｔｌｌａｍ、　８−　）、アステル
、　シー（Ａｓｔａｌｌ、　Ｏ，）、−ルソン。

ジエイ・エッチ（Ｎｉｌａｏｎ、Ｊ−Ｈ−）及−びロブ
トマン・エフ（Ｒｏｔｔｍａｎ　、　Ｆ、）ｌ　（１９
８０年）バイオケミストリー１９巻１７３７〜１７４３
頁〕。牛プロラクチン（ＰＥ（Ｌ）とＧＨｍＲＮＡとが
、・牛の脳下垂体割薬のｍＲＮＡ集団の大部分ヲナすこ
とを我々は示した〔ニルソンージエイ・エッチ（Ｎｉｌ
ｓｏｎ、　　Ｊ、Ｈ，）、コンペイ・イー・エム（Ｃｏ
ｎｖｅｙ、　Ｅ−Ｍ・）及びロヴトマンＪ・エフ、エム
（Ｒｏｔｔｍａｎ、　Ｆ−Ｍ−）、　（１９７１年）。

Ｊ−ＢｉＯｌ、Ｏｈａｍ、　２５４巻１５１６〜１５２
０頁〕。

本発明で明らかにされた本発明の完成後、ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ）等（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｗ−Ｌ−、−ｔ−Ｖヤ
Ａ／　、　９！（、！４（Ｍａｒｔｉａｌ、　Ｊ−Ａ、
）及びバクスター、ジヱイ、ディー（Ｂａｘｔｅｒ、　
Ｊ、Ｄ、）、　（１９８０年）、Ｊ、阻ｏ１．０ｈｅｖ
ｎ、２５５巻７５２１〜７５２４頁〕及びケシエツト等
Ｃ（ｘｅｇｈｓｔ、　ＩＬｔロスナー、エイ（Ｒｏｓｎ
ｅｒ、Ａ・）、バーンスタイン・ワイ（Ｅａｒｎｓｔａ
ｉｎ、　Ｙ、　）、ゴレ・ツキ・エム（Ｇｏｒｅｃｋｉ
、　Ｍ、　）及びアビブ、エブチｒＡｖｉｖ、　Ｈ−）
　（１９８１年）、　Ｎｕｏｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅ
ｓ、　１１巻　１１１−３０頁〕は、牛ＧＨｃＤ）ｉＡ
のクローニングを報告した。牛ＧＨクローンをふるい分
ける際にケシエツト等が取った方法は間接的なものであ
って、成長ホルモンのクローンｔ’ｉｉｉ認するために
はｓ鵞…Ｇ精製されたＧＥ　ｃＤＮＡプローブＶ倹用す
る我々の一段階直接選別法よりはるか（二多くの取扱い
操作を必要とした。

牛ＧＨクローンの１別５ニミラー等が収った方法は。

ケシエツト等のものより複雑ではないが、それでも２〜
３段階からなるものであった。

ケシエツト等がクローン化した％Ｒ配列は本発明のｐＨ
クローンより短かい。というのは、これは信号ペプチド
の一部のみｔ含んでおり、５′未翻訳領域のどれも含ん
でいないからである。ミラー等が単離した牛Ｇｈクロー
ンは、Ｘ発明のプラスミドｐＬＧ　２３に長さは似てい
るようにみえる。しかしこれら二つのクローンの間には
少なくとも一つの相違が見られる。成長ホルモンのアミ
ノ酸３４に対してコードしている位１　（Ａｒｇ）で、
配列はｐＬ（）２３ではＯＧＯとなっており（ａｈａ　
Ｉ　　開裂位置で実証されるとおり）、１またミラー等
が記載したクローンでは０（）Ｕである。

中下垂体前葉−からのポリ囚を含有するＲＮＡは。

二本＠　ｏＤＮＡの＃素的合成感二対する鋳Φとして使
われる。生ずる二本鍮ｃＤＮＡ　Ｙオリゴ（ｄＧ）−オ
リゴ（ｄｏ）テーリング技術によりｐＢＲ３２２のＰａ
ｔ　　Ｉ位置へ挿入し、ｉＩいて大腸菌Ｚ　１７７６中
へクローン化する。成長ホルモン（ＧＨ）　ｍ）ｔＮＡ
　Ｃ対して相補的な配列を含んだクローンは２部分的に
精整された成長ホルモンｃＤＮＡとのコロニーへイブリ
ブド化（二よって確認される。成長ホルモン陽性クロー
ンからの約８４１−の塩基対の配列は、真正の中成長ホ
ルモンＣ二ついてのコード情報を倉荷することが示され
ている。クローン化ＧＨｏＤＮＡは、５′未翻訳領域の
ほとんどと、信号ペプチド及び成長ホルモンに対するコ
ード領域の全部、それに３′未翻訳領域の全部を含んで
いる。挿入された成長ホルモンｏＤＮＡは、プラスミド
ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のものと同じ方
向にある。

本明細書で使われる記号及び略字は次のとおりである。

ＤＮＡ−デオキシリボ核酸 鮒人−リボ核酸 ｏＤＮＡ−相補ＤＮＡ　（ｍＲＮ人配列配列＃嵩的に合
成される）ｍＲＮＡ−伝令ＲＮＡ ｔＲ［ＪＡ−運嫌ＦＩＮ人 （ＩＡＴＰ−デオキシアデノシン三燐酸ｄＧＴＰ−デオ
キシグアノシン三燐酸 ｄＯＴＰ−デオキシシチジン三燐酸 ｄＴＴＰ−デオキシシチジン三燐酸 Ａ　−アデノシン Ｔ　−チミン Ｏ−グアニン ０−　シトシン トリス−２−アミノ−２−ヒドロキシエチル−１，３−
プロパンジオール ＩＤＴＡ−エチレンジアミン四酢酸 Ａ’ｌ’Ｐ　　−アデノシン三燐酸 ’ＦＴＰ　　−デミジン三燐酸 中下垂体成長ホルモン。ＤＮＡは、オリゴ（ａＯ）　−
オリゴ（ｄＯ）テーリング技術Ｃ、ｉってプラスミドｐ
ＢＲ３２２のＰａｔ　Ｉ　　位置へクローン化される。

長さ約８４１　ｂｐ　ノＧＨフ５　、Ｋ　ミドｐＬ（＋
２３）；ｌ、、ます（）Ｂ濃縮された一ｏ　ＤＮＡとの
コロニー八イブリッド化にょつて固定され、さら５ニサ
ザン・トランスファにより、またＧ）ｉ　ｍ）（ＮＡへ
の選択的へイブリッド化により特性化される。　ＧＨプ
ラスミドは、制限酵素分析と部分的配列化ｇ二よって特
性づけら才℃る。我々の分析は、成長ホルモンプラスミ
ドｐＬＧ　２３　　が次の構造！もっていることを示し
ている。　Ｆｌ　８４１ｂｐの挿入された配列はｒ　ｐ
ｓｔ　Ｉの３切片からＩＩる。挿入物の５′末端（コー
ドヲナしている船（二対するもの）で５７ｂｐの１切片
、配列中央の３３８ｂｐの１切片、及び挿入物のぎ末端
に約４４６ｂｐの切片。プラスミドｐＬＧ２３は約１５
ｂｐの長さと推定される５’　ｄｏ−ｄＧデテール長さ
約３０ｂｐと推定される５′コード１に−なしていない
領域の一部、長さ７８ｂｐと予想される完全な信号ペプ
チドのコードをなす領域、長さ５７３ｂｐと予想される
完全な成長ホルモンのコードＶなす領域、長さ１０４ｂ
ｐと予想される完全な３′のコードをなしていない領域
、良さ約２ｓｂｐ　　と予想される３′ポリ囚テールの
一部、及び長さ約１５Ｊ）と推定される３’　（１０−
ｄＧデテール含１ｉｉＴべきである。成長ホルモン配列
は、β−ラクタマーヤの転写及び−訳の方向である５′
から３′への反時計回り方向で。

ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーン遺遺伝子−挿入され。

このため恐らくは融合蛋白を生じさせるが、枠内で解読
されるならばこの蛋白も幾分のＧｈ特性をもツタロウ、
我々がクローン化した成長ホルモン配置１１］は、完全
な長さのＧＨｍＲＮＡか、又はそれ≦二ごく近いもので
ある。２本鎮ＣＤＮＡへの１相′ｔｘ８−ｊ処理と、ｆ
Ｐ−簀転換削の挿入物の一配列の寸法選定ケ使用するこ
とによって、このような長い挿入物に得ることができる
と我々は信している。

材料　放射性ヌクレオチ三燐酸は−「べてアマージャム
及ヒニューイングランド・ニュークリアーから入手でき
る。末端トランスフェラーゼはエンゾ　バイオケミ社か
ら、プロティナーゼにはＥ、Ｍ。

Ｌａｂｓから得た。Ｔ、−ポリヌクレオチド、キナ−ぞ
はニューイングランド、バイオラボから、ｓ１ヌクレア
ー（はマイルズから、細菌アルカリフォスファターゼは
ワーνントンから、まだリゾチームはシグマから得た。

逆転写＃素は′！に４の給源から１例えはペテスダ研究
所から入手できる。制御ａ＃票はすべてペテスダ研究所
とニューイングランド、バイオラボから購入できるつ制
ｆｆｌ＃素ｌ二よる消化は。

各酵素について供給者がすすめる条件を用いて実施でき
る。

以下は１本発明のＩ＆もよい態様を含め、その実肺手順
を例示下る実施例である。これらの例は限定的に考えら
れてはならない。池（二江急がなければ６分率はいずれ
も重量、溶媒混合物の割合はすべて容１１１二よる。

実施例１　中下垂体ｍＲＮＡの単離 パルミター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ、　Ｒ−Ｄ、（１９７４
年）、バイオケミストリ−１３巻３６０６〜３６Ｉ５頁
〕が記載したマグネシウム沈殿法の変法により、新鮮な
午下垂゛体前葉からポリソーム？調製Ｔる。変法は２Ｄ
％トリトンＸ−１００の代わりＣＯ，２％を使用し、単
離されたポリソームをフェノール／クロロホルム抽出に
先立って短時藺プロプイナーぞに処理（２５０μｇ／−
１３７℃、１．０％Ｂ　ＤＢ＠有緩衝液中に３０分）を
行なう。

ポリ囚含有ＲＮＡは、すでに記載のとおり（デスロシア
ーズ、アール・シー（Ｄｅａｒｏｓｔｅｒａ、　Ｒ，０
・）　７すダリブｖ・ケイ・エッチ（ｌｉ’ｒｉｄｅｒ
ｉｃｉ、　Ｋ、Ｈ−）及びａブトマン・エフ・エム（Ｒ
ｏｔｔｒｎａｎ、　Ｆ−Ｍ−）　（１９７５年）。

バイオケミストツー１４巻４３６７〜４３７６頁〕、オ
リゴ（ｃｌＴ）−セルロース・クロマ１グラプイシニよ
って全ポリゾーマル類人から単離される。

成長ホルモンとプロラクチンｍＲＮＡはポリ内含＊　Ｒ
ＮＡから、　　１０ｍＭ　）リス（ｐＨｙ、ｓ）　、　
ｔ　ｍＭＥＤＴ人及びａ、Ｚ％ＢＤＢ中における５−２
０％（ｖ／ｖ　）庶循勾配での遠心分離（：よって精製
される。遠心分離はベックマン８Ｗ−４１０−ター中で
毎分３５，０００回転、２２℃で１２時問題二行なわれ
る。勾配物を分別し、　２６０ｎｍでの吸光Ｗｌｖキル
フォード２４０記録分光光闇針で測定する。各フラクシ
ョンからのＲＮＡ　Ｖエタノール沈殿によって回収し、
すでに述べたとおり〔ニルソン・ジエイ・ニーフチ等、
Ｗｔｔ掲〕　小麦胚芽の細胞を含まない系の中で翻訳す
る。

（）Ｈ又はＰＲＬ　ｍＲ）ｉＡを含有するプラクジョン
ｔそれぞれプールし、更舊：精製のため、上記のよう（
二３ｊｆ目の遠心分離を行なう。

実施例２１Ｘ飴ｏＤＮＡの合成 ｏＤＮＡ　のポリ内含ＪＲＮ人への合成は１本質的にマ
イヤー等の記載のとおり（二（Ｍｙｅｒｓ、Ｊ、Ｃ，ス
ビーゲル？　７　、　！ス（８ｐｉｅｇｅ１ｍａｎ４Ｂ
、　）及び力Ｖアン・ディー、エル（Ｋａｃｉａｎ、　
Ｉ）、Ｌｌ、　）　（１９７７年Ｌ　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ−Ａｃａ６．Ｂｃｉ、１７８Ａ　７４巻２８４
６〜２８４ｍ頁〕喜すわれる０反応飯分は以下のもので
ある。５０ｍＭ　　）　リス（ｐＨ８，３）、　３７．
５ｍＭ　ＫＪ、　８　ｍＭ　ＭＥ　”＠　、各２５０ｐ
ＭのｃｌＡ’ｒＰ、　　＋１（）ＴＰ、　　　ｄＴＴＰ
、　　（Ｈ）−ｄｏ’！’Ｐ　　　（ミ　　ツ　七　月
７　当り０．０８　Ｃ１す、４００〜ジチオスレイトー
ル、４−ピロ燐酸ナトリウム、　５ｌｌｌｉ−オリゴ（
ｃｌＴ）　　　、１００ル１１−１・ ポリ（４）含有ＲＮＡ　、及び２００単位／−逆転写酵
素。

５００μノの反応物を３７℃で１時間培養し、り００ホ
ルム−イソアミルアルコール（！４：１）で抽出り。

次に２θｍＭ　）すｘ　（ｐＨ７，５）、　２ｍＭ　ｇ
ＤＴＡ、　１００ｍＭＮａｏｌ　及び０．２％８Ｄ′８
中のセファヂプクスＧ−５０上でクロマトグラフィにか
けるａ　ｃＤＲ人を含有するプラクジョンを一緒に集め
、エタノール沈殿さセル、ＲＮＡｖ１７℃”ｔ’　ＯＪ
Ｎ　ＮａＯＨ，Ｑ、ＯＩＭｇＤ’ｌ’Ａ中で２時間培養
することＣ：よって、　ｏｐＮＡから加水分解すル、ｉ
１合物Ｖ　６　Ｎ　Ｍ　”　テ中和Ｌ　１ＭＩ　Ｇｊ　
＊　ｙＱ、ＯＩＭまで１８８　！ｌｌＲＮＡを１０／Ｉ
ＪＦ、−まで加え、２倍量のエタノール（−ｓｏｃ、　
２６１間）′１に加ｉテ０ＤＮＡ　Ｑ沈殿させる。最終
ｃＤＮ人ペレット【水中に溶解し一２０℃に貯蔵する。

コロニーハイブツヴド化に使用のためＧＨ又はＰＲＬ濃
縮ｒｍＲＮＡ彫ｏＤＮＡ力をら合成するとき、　ＲＮＡ
濃度を２０７１１１／１１１Ｃ下げ、　　（飴）−ｄｏ
’ｒＰ　１７）代わりｔ：ｘｏｐｈｔａ”ｐ〕−ｄＯＴ
Ｐ（２０００１／ｍモル）を使用する。

実施例３２本ｆｌＪ　ｃＤＮＡの合成 第二のｏＤＮ人鎖の合成反応の条件は、５０ｍ１Ｍトリ
ス（ｐＨ８，３）　、　３７Ｊ−に６ｊｍ　８　ｍＭ　
Ｍｌ　”會ｐ各２５０ｐＭ（７）　ｄＡＴＰ、　ｄＧ’
ｒＰ　＆び（１’ｌ”ＴＰ、　１００．ｍＭ（”Ｈ１−
ｄｃＴＰ（２３０１／ｍモル）、１０声Ｉ層ｃＤＮＡ、
及び４００単位／−の逆転写酵素である。上記のように
反応を３７℃で２時間培養し。

りｔｆｆｆｆｆホルム−イソアミルアルコールで抽出し
。

上記のようにセフアゾづクス（）−５０上のクロマトグ
ラブイＣ：かけるａ　ｏＤＮＡを含有するフラクション
を一緒に貯え、酵母を囮Ａで４０１１１１／ｇＩＩｇ二
層整し。

エタノール沈殿させる。

３′末端のヘアピンらせんを開くには、室温でｏＤＮＡ
を８ニーヌクレアー（で３０分消化させる。この反応の
成分は、　０−３Ｍ　ＮａＣＪ　、　Ｑ、Ｏ５Ｍ酢酸カ
リウＡ　（ｐｈｗ）。

１ｍＭ　Ｚｎ８０．　、　Ｓｐｌ／ｄ　ｃＤＮＡ、及び
全核ｔｌｌｌｌｌ当り８重ヌクレアーゼ４８単位である
・８．の消化な停止させるためＩ：は、トリス（ｐ）ｉ
　７．４）　、　ＫＤＴＡ、及びｔＲＮ人をそれぞれ８
０Ｉ！Ｍ、　２（１ｍＭ　、及び５ｏｐｔｔ、−まで加
える。

次に反応混合物ケ緩衝濠で飽和させたフェノール−クロ
ロホルムで抽出し、　　ｏＤＮＡ　ｋエタノール沈殿さ
せる・ 実施例４　８．処理された２本＠Ｊｉ　ｃＤＮＡの大き
さの選択 ０、ＩＭ　Ｎａ０ｊ　、　０．００１Ｍ　ＫＤＴＡ、　
　Ｑ、ＯＩＭ　）リス＊＊液。

ｐ）ｉ　７．５　（’ｋＴＢＴ緩衝液）　Ｏ４−中ニ２
　Ｘ　＠　ｏｐＮＡ　を懸濁させ、３０％庶糖のＯ２−
クッションの上の５〜２０％η〜庶糖勾配（Ｎ１１′ｒ
緩衝液）　４Ｊ−上へ適用する。

ＤＮＡを８ＶＢ０．１ｔｆｆ−ター中で４℃、　８６．
００Ｏｒｐｍで１５時間の遠心分離感＝かける。フラク
ション（（Ｌｍ　５８１ｇ）を襲め、各フラクションの
試料を針数する。ピークの中央とそれより重い部分（ｓ
ｏｏ−ｓｏｏ塩基対より大きいか給しい部分）を含有す
るフラクションｌ貯え、を部ＡＶＩＯμｊｌ、−に加え
、核酸を２倍量のエタノールで沈殿させる。

実麺例５　ハイブリッドプラスミドの構築精＠　ｐＢＲ
３２２ＤＮＡ（ポリバー、エフ（Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ
、　）。

ロドリゲス・アール・エル（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、　Ｒ
，Ｌ、　）、グリーン・ビー・ジエイ（Ｇｒｅｅｎｓ、
　Ｐ−Ｊ・）、ベトラック・エム。

シー（ＢｅｔｌａＣｈ、Ｍ−０−）、ハイネツカー・エ
ッチ、エル（Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ＊　）ｉ−Ｌ　）ｒボ
イヤー・−ｒ−ツｆ＃−１’）：Ｌ７（Ｂｏｙｅｒ、　
Ｈ−Ｗ−）、　　クロ夛・ジエイ、エッチ（Ｃｒｏｓａ
。

Ｊ　、Ｈ，’）及びファルコウ・ニス（Ｆａｌａｏｖ、
　−ｒ−ス・）（１４１７７年）「ジーン１２巻９５〜
１１３頁、サトクリフ・ジェイ・ｙ−（８ｕｔｏｌｉｆ
ｆｅ、Ｊ−’Ｇ、（１９７８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｏ
ｉｄｓＲａｇ、　　５巻２７２１〜２７２ｇ頁〕をＰｓ
ｔｌで制限し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させ
、Ｈｌｏに溶解する。　ｄ（）ＴＰのｐＢＲ３２２ＤＮ
Ａへの添加（１２，５μ！ノーに■整）は１４０ｍＭカ
コジル酸、　ＢＯｍＭ）リス塩基。

ｔｔＯｍＭ　Ｎｏ）ｉ、　０．１ｍＭ　ｄＴＴ、　０．
１ｍＭ　ｄ（ｉＴＰ、　１ｍＭ　ＣｏｏＪ、　。

ｐ）ｉ　６．９．及び末端転移＃累７５単位／ｄＹ＠有
する反応混合物中で３７℃、５分間行なわれる。これら
の条件はプラースミドの各末端へ約１５Ｘのヌクレオチ
ドを添加する結果となる。　１０ｍＭまでｇＤＴＡ　ｔ
’添加して反応を伴出させ、　０．１Ｍ　ＫＯｊの存在
下にエタノールを沈殿させる〔ガビンズ、イー・ジエイ
（Ｇｕｂｂ　ｔｎ、８．　Ｅ　、Ｊ　、）＋モーラー・
アール・エイ（Ｍａｕｒ＠ｒ。

Ｒ−Ａｎ　）、　八−トレイ、ジヱイ、　ｘ　ｎｔ　（
ｈａｒｔｌｅｙ、　Ｊ　、Ｌ−）及びドネルソン、ジェ
イ・イー（Ｄｏｎｅｌｓｏｎ、　Ｊ　、Ｒ−）（１９７
９年）　Ｎｕｃｌｅｉｏ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５−６巻９１
５〜９３０頁〕。

我々は下垂体のポリ囚含有ＲＮＡから合成される２本鎖
ｃＤＮＡをクローン化することを選んだ。というのは、
このＲＮＡフラクションから合成されるｏＤＮＡ配列の
大多数はＰＲＬ及びＧＨｍＦＬＮＡに対して相補的だと
予想できるからである。

上記の同じ条件を使用して、　　１２ＰＣ１の〔αｊｌ
ｐ）−ｄＯＴＰ　（ミリモル当り４２９　ａｔ）によっ
て２本釦ｏＤＮＡ　　に尾部を付けるが、但し２本鎖ｏ
ＤＮＡ濃廖は２μｌ／ａｄで、　ｄｃ）ＴＰの代わりに
ａｏ’ｒｐ　Ｖ使用し、末端転移酵素製炭は６００単位
／−である。オリゴ（ｄｏ）テールの長さはおよそ１５
ヌクレオチドである。上記のとおり反応を止め、１０μ
ｌ・−の酵母ｔＲＮＡの存在下に上記のようにエタノー
ル沈殿させる。

オリゴ（ｄＧ）のテールを付けたｐＢｈ　３２２　ＤＮ
Ａとオリゴ（ａＯ）のチー／Ｌ”ｋ”ｔｌけた２本鎖０
ＤＮＡ　Ｙ　。

１００１１Ｍ　Ｎａ０ｊ、、１０ｍＭ）リス（ｐｈ　８
．３）及び１０ｍＭ　ｇＤＴＡ中でそれぞれ８μＩ、ｋ
ｌとα６μｍ−まで希釈する。

ＤＮＡをＬ８倍モル過剰富指洲−ｈ２１二よ６ハ７５℃
ないし３７℃の温度の勾配で一夜２次（二室温で３時間
アニールさせる〔ジャクノン。ディー・エイ（Ｊａｏｋ
ｓｏｎ。

１）、Ａ）、　４Ｆ−イモンズ・アール・エッチ（８ｙ
ｍｏｎｇ、　Ｒ，Ｈ・）及びパーグ、ビー（Ｂｅｒｇ、
　Ｐ、）、　（１１１７２年）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ−８Ｃ１−Ｕ８Ａ　８９巻２９０４〜２９０９
頁〕。

生ずるｒ糟１畦プラスミドを実施例６の形質転換法に使
用する。

一隻」１４」−形質転換 漸の形質転換手順はヴイラ＝コマロフ等（Ｖｉｌｌａ−
Ｋｏｍａｒｏｆｆ、Ｌ−ヱフストラチアデイス、エイ（
Ｒｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ。

Ａ、１．ブルーム・ニス（Ｂｒｏｏｍｅ、８−）ｅロメ
デイコ・ビー（Ｌｏｍｅ−ｄｉｃｏ、Ｐ、）ｓデイザー
ド、アーｔｖ（Ｔｉｚａｒｄ、Ｒ，）、ネーム−。ニス
。

ビー（Ｎａｂ＠ｒ、　８．Ｐ−）、チック、ダブリュー
　、　工ｓｚ　（Ｏｈｉｃｋ、　Ｗ−Ｌ）及びキルパー
ト、ダブリュー　（Ｇｉｌｂｅｒｔ−’Ｗ、）、　（１
９７８年）。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、８ｃｉ−Ｕ８Ａ　７５
巻３７２７〜３７３１ｉ　）　　が記載したものである
が、但し次の変法を加えている。Ｌ−ブロス〔レノック
ス・イー、ニス（Ｌｅｎｎｏｚ　ＩＥ・８、）（１９３
５年）　Ｖｉｒｏｌｏｇ７１巻１１０〜２０６頁）　Ｖ
　ｔｏｏ？レ？）ｌミ）ピメリン酸（ＤＡＰ）及び２０
ｐｇ／ｄテｔｖｙ（’１’ＨＹ）と−緒に補充する。

大腸１１２１７フ６の菌をＡａｏ・−０，３の密度まで
生育させる。形質転換混合物は、０．２−菌体と８．０
１６ｍ　＠換えプラスミド（８，６μＩＩ／ｄ）とから
なる。脳心抽出液（ＢＴ’ｌＩ）　３−とソフト寒天へ
７％を形質転換混合物各１すくいＣ：加えてから、１５
μＩＩ／ＩＩＩ　テトラチイクリン（ＴＥＴ　）含看の
ＢＨＩＩ！ｆｆ（ｘ％）プレート上に平板培養する。大
腸菌ＨＢ　１０１を形質転換に使用する時は。

同じ手順を使うが、　ＤＡＰと’！’Ｉ（Ｙは省略され
る。

実施例７　＠換′オプラスミドの選別 （）Ｈ配列を含有するクローンを同定するためには、　
Ｇ）Ｉ　ｍＲＮＡに特異的なハイブリッド化プローブを
つくる必要がある。これを達成するには。

ｃＤＮＡ　（実施例２　）　？　ｍＲＮＡへ合成し、こ
れを実施例１４＝示すとおりにＲ＠勾配の２沈降段階後
単離する。このやり方でつくるｍＲＮＡは、小麦胚芽系
での菌体を含まない翻訳で検定Ｔると、　（）ＨｍＲＮ
Ａ配列鑑二と９て＆度に濃縮されている点ζ二注意する
ことか重要である。

コロニーハイブリッド化手順は、グルスタイン及びホグ
ネス〔（Ｏｒｕｎａｔｅｔｎ、　Ｍ−及びＨｏｇｎｅｓ
ａ、　ＤＳ。

（１９７５年）、　Ｐｒｏｏ−Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−８
ｏ１−Ｕ８ん７ｚ巻３９６１〜３９６５頁〕が初めＣ；
記載したものの変法である。

個々のコロニーｔｌ−１．５％Ｌ−寒天（ＤＡＰ　、　
’１’ＨＹ及びτＦＡＴＱ含１１ｒ）で支持されたミリ
ボア・フィルターへ移し、３１℃で一夜培ｌＩ″ｆる６
次に細菌を溶菌させ、そのＤＮＡｖＩＪ掲ガビンズ等の
記載のとお６ハコニトロセルロース・フィルター４：固
定する・シラン化ガラスのベトツ皿でｓｘ　５ｓｃｐ（
ベントン、ダブリュー、ディー（Ｂｅｎｔｏ几Ｗ、Ｄ、
）及びデービス、アール。

ダブリｘ−（Ｄａｖｔｓ、　Ｒ、Ｗ）　（１９７７年）
、１）イエラス１１ｉ１６巻１１Ｈ〜ＩＩＩ！頁）、　
０．Ｓ％ＢＤＢ及び１００１１１７ｄ　（Ｄ剪断費性さ
せたチケ***ＤＮＡを含有する５０％ホルムアミド中で
、　ＤＮＡ含有フィルターＶＢ７℃、１時間、予備ハイ
ブリッド化させるａ　（”ｐ　）　−（）ＨＣＤＮＡを
加え（フィルター当り１ｏ’　ｏｐｍ　）ｔノ１イブリ
ブド化を４３℃で少なくとも１５時間醜ける。前掲ベン
トン及びデービスの記載のとおりに５Ｘ　８８０Ｐと０
，５％ＢＤＢを含有する５０％ホルムアミドでフィルタ
ーを３回洗い１次Ｃ２Ｘ　８８０Ｐで２回洗う。

デュポン、クロネツクス照明と強化スクリーンな用いて
、　コｆ　＝ｌ　９　ＲＰ−Ｘ−ＯＭＡ’ｌＬ　７　イ
ｐｖ　Ａ　Ｃ，！Ｉ点のあるフィルターｖＮ出して、陽
性のプロニーが見え有様ｔ（ｒる。

陽性の強いコロニーを同定し、それが含有するプラスミ
ドをｐＬＧ　２３と命名する。

実謝例♂　プラスミド増幅と単離 各クローンをコロニーハイブリッド化によって再選別し
、　’ＤＡＰ（１００μＩ鷹）９Ｔ訂（２０μｇ鷹）及
び’Ｉ’Ｅ’ｒ　（１５μｌ／ｄ　）が補足されたＬ−
ブロス中で一夜生育させる。−夜培養基の１すくいをＬ
−ブロス＋ＤＡＰ＋’ｆ’ＨＹ　Ｉ　Ｊ中ｆ：１：３Ｂ
希釈する。−菌がＡｏ、５ｗ０１７〜０．８に相等する
密度まで生育したら、クロラムフエニプール（１！！Ｉ
ｆｔ／ｓｌ、　１００％エタノール中）を最終濃度７５
μＩｌｒｍ＆まで加え、１５〜２０時間培養する１次に
画体ｔベレット化し、洗ってドライアイス−エタノール
中で凍結させる・ ゴドソン及びνンνヤイマー（Ｇｏｄｓｏｎ、　（）　
、　Ｎ・−及び８１ｎｓｈ＠ｉｍｅｒ、Ｒ−Ｌ−（１９
６７年）　Ｂｉｏｃｈｅｍ　−ＢｉｏｐｈｙａＡｏｔａ
　１４９巻４７６〜４８８頁〕及びフレウェル及びヘリ
ンスキ（Ｏｌｅｖａｌｌ　−Ｄ、Ｂ−及びＨｅ１ｉｎｓ
ｋｉ、　Ｄ−Ｒ−ｆ１＊’ｌｏ年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　９巻４４２８〜４４４０頁〕Ｓ：記載された手
順の多少変更したものを使用して、中性洗剤で溶菌し、
透明な溶菌液をつくる。ｌノ培養基からの凍結薗ベレヴ
トヲ融解し、冷い２５％庶糖−０，０５Ｍトリス（Ｔ）
Ｈ８乃）　１０−に鼾濁する。２５％庶糖−０，０５Ｍ
トリス（ｐＴｌ　ｇ、ｏ）中の新しい冷いりゾチーム（
１０ｗ９／Ｉｌ）２ｗｌｖ＠Ｃ加える。混合物を氷上で
断続的に１０分間かきまぜる。

次に冷い０．５Ｍ　ＲＤＴＡ　２　ｍ　Ｖ加え、混合物
を再び氷上で断続的に５分間かきまぜる。ＮＰ−４０（
周知表面活性＠）溶液（０，２％ＮＰ−４０，６，２５
ｍＭ　ＫＤＴＡ。

５０ｍＭ　）リス、ｐ１１＆０）計１５ｓｇｖ混合しな
がら加え。

雪を室ｉ［：、１０分間放置する。溶菌物ｔ’　２３，
５００ＸＩで４℃、３５分の遠心分離にかける。上澄液
をプロプイナーぞＫ（１００μＩ／ｗｓｌ）及び８Ｄ８
（０，１％）で３７℃。

３０分処理し、水で１＝１に希釈し、フェノール／クロ
ロホルムで抽出し、エタノール沈殿させる。

組換えプラスミドＤＮＡｖ、Ｘ質的に前掲フレウェル及
びヘリンスキの記載のとおりに分離用０ｓＯＪ浮密度勾
配中の遠心分離によって、ＭＡ及び大腸菌染色体ＤＮＡ
からさらに精製する。大腸菌χ１７７６１ノからプラス
ミドＤＮＡ約１５０μｇが定常的に得られる。

ｐＬＧ２３配列を含有する組換えプラスミドを続いて宿
主大腸５ＩＨＢＩＯＩへ移した。

ａＳえプラスミドが大腸１ｎｂｔｏｔ中で増幅されると
キハ、パーンボイム（阻ｎａｚｏｉｍ）及びドラ−（Ｄ
ｏｌｙ）の記載したアルカす抽出手順（Ｂｔｒｎｂｏｉ
ｍ。

Ｈｏｏ、及びＤｏｌｙ、Ｊ、（１９１９年）　Ｎａｏｌ
ｅｉｃ　Ａｃｔｄｓ　Ｒ％８゜７巻ｌ５１３〜１５２３
頁〕の変法を使用し、培養基リットル当りｔｑｍ上のプ
ラスミドの収量を得る。

組換木細菌の単離、生育、溶菌は丁べてＮＩ）ｌの組換
えＤＮＡ研究ガイドラインで特定されているとおり、Ｐ
、封じ込め実験室で行なわれる。

次の一施例は特性化データｖｌＩるために使われる手順
に関するものである。

実施例９　制限酵素分析 ÷ 組換えプラスミドＰｓｔ　［で制限し、挿入されたＤＮ
Ａ配列１１ｔ６％ポリアクリルアミド上でｐＢ）（３２
２プラスミドから分離する。挿入物をゲルから溶離し、
脱燐酸化し、穿キ夛ム及びギルバート（Ｍａｘａｚ。

人、及びＧ１１ｂ＠ｒｔ、　Ｗ、　（１９７７年）、　
Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ−人Ｃａａ＠８ｏ１．Ｕ８Ａ　７４
巻５６０〜５１ｉ４頁〕の記載のとおりに５ｆ末端Ｃｒ
　７　（：”ｐ　）−人ＴＰで標識をつける。末端ラベ
ル化挿入物を別の制限酵素で制限し、６％ポリアクリル
アミドゲル上を走らせ、オートラジオグラフ法にかける
。またはその代わりに、溶離したＰｑｔ’Ｌ切−片を制
限酵素で制限し、６％ポリアクリルアミドゲル上を走ら
せ、臭化エチジウムで染色して兇えるようにする。

クローンｐＬ０２ｍの挿入物は長さ約８４１ｂｐであり
。

内部のＰｓｓｔ　１位置を二つ持っている。Ｐｓｔｌ（
二よるクローンの消化は、６％ポリアクリルアミドゲル
上で見られるごとく、線状ｐＢＲ３２２のほか、　５７
ｂｐ。

３３８　ｂｐ及び約４４６ｂｐの三つの切片をもって−
いる。

各切片をゲルから溶離し、５′末端標識に続いて消化生
成物のオートラジオグラフィ（二か１ｆるが＃女は消化
生成＠を臭化エチジウムで染色することによって、制限
＃素位置の分析Ｖ打なう０両方の場合とも、消化された
切片は６％ポリアクリルアミドゲル上で分離される− 予備的なＳ゛末端標識の制限分析は、　　３３８ｂｐの
挿入切片が少すくトも１回は人Ｊｕ　ｌ　、　Ｈａｅ　
ｌ、　Ｈｈａ　（。

Ｈｐａ　ｌ及びｈａｅ　ｌで制限され、　４４６ｂｐの
挿入切片〜 Ｈｌｎｏ　　ｎ、Ｋｐｎ　Ｔ、Ｓａｃ　Ｉ、　　Ｈｌｎ
ｄ　　Ｉ、８ａｌ　　Ｔ、Ｘｈｏ　％　１゜Ｘｂａ　ｌ
又は８ｓｔｌ制限位置を持たなかった。

更に臭化エチジウム染色で行なった制限分析は。

挿入された配列１：おける制限位置の数と切片の大きさ
についていっそう多くの情報を明らかＣ二している０例
えは、　５７ｂｐの挿入切片はＤｄ・■で１カ所切断さ
れ、約１９ｂｐと３８ｂｐの切片な与える。

３３８ｂｐの挿入切片はＨｈａ　ｌで６７ｂｐ　、　　
１００ｂｐ及び１７１ｂｐの切片に切断される＠　４４
６ｂｐの挿入切片は８ｍｍ　Ｉ　Ｃよって１カ所切断さ
れ、　１２５ｂｐ及び約３２１ｋ）ｐの切片を与え、　
Ｈａｄ　ｌで２力所切片されて、９２ｂｐ、約１５９ｂ
ｐ　、及び１９５ｂｐの切片を与える。

ＷＳ択的八へブリヴド化 組換えプラスミドｖｇｏｏ　ＲＩ消化ｔ４よって線状に
し、ニトロセルロース、フィルター（８Ｂ−Ｂｉ１２）
上に適用し、他のｍＲＮＡでスパイクした中下垂体ポリ
Ａ”　ＲＮＡへ５０％ホルムアミドの存在下に２４時間
（＝わたりへイブリッド化させる。厳密な洗浄後。

ハイブリッド化したＲＮＡを９０％ホルムアミドの存在
下に６５℃で溶離し、小麦胚芽の無細胞翻訳系で翻訳さ
せる。

プラスミドｐＬ（）２３を選択的ハイブリッド化によっ
て更に佃クローンとして特性化する６＠換えプラスミド
を線状にし、ニトロセルロース、フィルターに結合させ
・、中下垂体ポリＡ　”　ＲＮＡ　、グロビンｍＲＮＡ
　、　ＧＨｍＲＮＡ及び卵白アルブミンｍＲＮ−Ａ−の
混合物とハイブリッド化させる。

厳密な洗＃後、へイプリ゛１ド化させたＲＮＡ　）ｉ溶
離し、小麦胚芽の饋細胞ｗＡ駅糸で翻訳さセる。王な翻
訳生成物は前駆成長ホルモンである。

実３１１−１１　　ＤＮＡ配列分析 １ｉＪ褐てキナム及びギルバートが記載したＤＮＡの化
学的変更と開裂反応は、クローン化ＤＮＡ　（Ｄ　制御
ｊ切片を配列決定するのに使われる。

サンガー及びクールソン（８ａｎｇｅｒ　、　Ｆ−Ａ・
及び０ｏｕｌｓ＋ｏｎ、Ａ−Ｒ−（１９７８年）ｌＦＩ
Ｂ８Ｌ／ターズ、８７巻１０７〜１１０頁〕に記載され
た薄い配列化ゲルを全分析に使用する。

ｐＬ０２３挿入物の部分的ヌクレオチド配列　組換えプ
ラスミドｐＬＧ２３から単離されたＤＮＡ　ｖＰｓｔ　
１で消化し２次直：６％ポリアクリルアミドゲル中の電
気脈−にかける〔ピーコック・エイ、シー（Ｐｅａｃｏ
ｃｋ。

Ａ、Ｏ、）及びディングマン、シー、ダブリュー（ＤＩ
Ｄｇｍａｎ。

０、Ｗ、）（１９６８年）、　Ｂｔｏｏｈｅｍｉｓｔ、
ｒｙ　７巻６８８〜６７４頁〕。

挿入物をゲルから溶離し、纏繭アルカリフォスファター
（で説ホスホリル化し、ボリヌクレｆｆド、キナーゼ〔
マキサム及びギルバート、前掲〕で末端標識を付丁、標
識をつけた３３８ｂｐの挿入物切片をＨｈａ　ｌで消化
させる。この消化生成物を６％ポリアクリルアミドゲル
上で分触する。前掲マキサムとギルバートに従って６７
Ｊ）と１’［ｂｐ切片を配列決定する。以下は、上の切
片から得られるヌクレオチド配列と、この配列の一つの
有力な解読枠から予測されるアミノ酸の墾約である。牛
前駆ＧＨの既知アミノ酸配列〔ハント（Ｈｕｎｉ）等、
前掲、及びリンガツバ（Ｌｔｎｇａｐｐａ）等、１１）
掲〕とｐＬＧ２３　　の挿入された配列から推定される
アミノ酸配列との間の相反関係ｅ二より、前駆Ｇ）ｉの
配列を含んだものとしてこのクローンの積極的な同定が
可能となる。

Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖ
ａｌＯＵ（）　Ｃｏｏ　ＵＧＧ　ＡＯＵ　ＯＡＧ　Ｃ）
ＵＣ）　ＧＵＧ　ＧＧｉｎ　（）Ｉｎ　Ｌｙｓ　８ｅｒ
　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　（）ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ
　Ｉｌ＊ＯＡＧ　ｆｌＡ（）　ＡＡＡ　ＵＯＡ　ＧＡＯ
ＵＵ（）　ＧＡ（）　ＯＵＧ　ＯＵＵ　０（）ＯＡＵＯ
０ 成長ホルモンクローンの部分的配列決定と制限分析デー
タは、成長ホルモンのａ、ａ−２４から一２鵞（信号ペ
プチド）とａ−ａ９０−９１に二つのＰａｔ　■認識位
置を見つけている。〔前掲）−ント等、及び前４９ンガ
ヴパ等〕。このように５ｓｓｂｐのＰ纒ｔＴ切片はクロ
ーン化された配列の中央Ｃ：位置し、　５７ｂｐのＰｓ
ｔ　ｌ切片は配列の５東端に位ｊ　ｔ、　、　４４６ｂ
１）のＰｓｓｔＩ切片は成長ホルモン挿入物の３末端に
位置している。

実施例１２　　プラスミドｐＢＲ３２２におけるＧＨ挿
入物の方向づけ プラスミドｐＢＲ３２２のβラクタマー（遺伝子内でど
の方向にＧＨ挿入物が位置づけられるかを見つけるため
、二重消化分析を行なう、クローンｐＬＧ２３の岨換え
プラスミドをＰｖｕ　Ｔ及びＲａａ　ｌ制限＃素で消化
させる。　Ｐｖｕ　ｉはｐＢＲ３２２プラスミドの３７
３４位置ｖ位置所切断し、　ＧＥ挿挿入円内切断しない
。

Ｒａａ　ｌはＧＢ挿入物換向１カ所切断するが、　　ｐ
ＢＲ３２２ＤＮＡ　ｖ制限しない、Ｒａａ　Ｉの認識部
位（５’　０ＯＯＧ（）Ｇ）は挿入物の４４１ｂｐ　Ｐ
ａｔ、ｌ切片にあり＊　（）Ｈａ−ａ、配列ノ１３２〜
１３４位置にあル、　４４８ｂｐ切片をＲａａ　ｌで消
化させると、　１２５ｂｐと約３２１ｂｐの切片が生ず
る・佃配列はプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ　１位置
（３６０ｇ位置）Ｃ二挿入される。これはβラクタマー
ゼ遺伝子のａ、ａ・１８２ｇ＝対するコードンである〔
前掲ヴラ冨コマロフ等、　＆グアーウィン。グー、アー
ル（Ｋｒｖｒｔｎ、　Ｏ−Ｒ−）　＊モーラー・アール
・エイ（Ｍａｕｒｅｒ。

Ｒ，Ａ）及びドネルソ７．ジエイ、イー（Ｄｏｎｅｌｓ
ｏｎ。

Ｊ−１，）目ＳＳＯ年）＊　Ｎｕｃｌｅｉｏ　Ａｏｉｄ
ｓ　Ｒａａ、８巻２！ｉ３７〜ｚｓ４ｓＮ）−このため
ＧＨ挿入物がコード配列に関してｉから３′の時計回り
方向に向いている場合。

Ｒｖｕ　ｌ　−Ｒａａ　ｌ二重消化により４４７ｂｐ切
片と４１５６ｂｐ切片を得られることが予想される。

しかし、β−ラクタマー（遺伝子の場合のように（）Ｈ
配列がＳから３への反時計回り方向に向いている場合〔
前掲ヴイラーコマロフ等及び前掲アーウィン等〕、上の
二重制限から８４６ｂｐと４５５７ｂｐ切片が予想され
る。

ｐＬＧ２Ｂ　ＤＮＡ　ｋ　Ｐｙｕ　Ｔ及びＲａａ　Ｉで
制限する場合ｌ：は高分子量帯と低分子量帯が６％ポリ
アクリルアミドゲル及び１％アガロースゲル中で観察さ
れる。低分子量帯は長さ約８４６ｔ）ｐに相当する。

このように挿入された配列はｐＢＲ３２２のＰａｔ　１
　位置で５′から３′への反時計回りに方向づけられ、
恐らくは融合蛋白としてβ−ラクダマーゼ遺伝子の一部
と共に転写、翻訳される。ＧＨ挿入物が実際にＧＨ−β
ラクタマーイ融合蛋白として表現されるかどうかは、β
−ラクタマー（遺伝子内のこの挿入物の解読枠に依存し
ている。

ｋ）ＧＨの残基ｌ〜１９１のアミノ酸配列は次のとおり
である。

０ Ａｌａ　Ａａｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｎ　ｈｉｓ　Ｌａｕ　ｈｉｓ０ Ｃ）Ｉｎ　Ｌｅｕ人１ａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　　
Ｐｈｅ　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ０ Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｒ）Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｂａｒ０ Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ０ Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｅ　　８ｅｒ　　Ａｓｐ
　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ０ １１ｅ　　８ｅｒ　　ＩＪｕ　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｉ
Ｉｓ　　Ｇｌｎ　　８ｅｒ　　Ｔｒｎ　Ｌｅｕ　　Ｇｌ
ｙ０ Ｂａｒ　　Ｏｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ 罰駆ｂＧＨは、　ｂＧＲ配列のアミノ末端に付加された
次の部分的アミノ酸配列をもっている（ｆｉｌ掲リンガ
ツバ）。

ＭｓｔＭｅｔ・・・・・・・・・Ｐｒｏ・・°・・・・
・・Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬθＵ・・・ｐｈ・・・・Ｌｅｕ
　Ｌｅｕ・・・Ｌｅｕ　Ｐｒｏ・・・・・・・・・・・
・・−・−・・プラスミドｐＬ（）２３は９会衆国イリ
ノイ州ビオヲァの米国農務省、北部研究所（Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎ　ＨｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒｌ！１ｔｏｒｙ、　ＮＲＲＬ）の永久保存機関に。

大腸菌宿主に入れて寄託された。この保存所における呼
出し番号は次のとおりである。

）ＩＢ　１０１（ｐＬＧ２３）−ＮＲＲＬ　Ｂ−１２４
３６大＊１ＩＨＢ１ｏ１は既知の広く入手で参る宿主微
生物である。

１９８１年５月３日に寄託されたそのＮＲＲＬ呼出し番
号はＮＲＲＬ　Ｂ−１１３７１である。

ＮＲＲＬ　Ｂ−１２４３６は、特許取得に伴い一般に入
手できる。この寄託物が入手で奸ることは、政府措置Ｃ
：よって証曹と共覆：授与された特許権を侵害して本発
明Ｖ実施する実施権【成立させるものではないことを理
解すべきである。

大腸１ＩｉＩＢＢＩＯＩの代わ４Ｊ　（二使用できる周
知の他の宿主がある１例えば枯草菌（Ｂ　−８ｕｂｔｉ
ｌｉｓ　）　、　　ストレプ）１セスの鞠、及び酵母で
ある。

本発明６二使用できる他のベクター（ヒビクル）は、ア
ンピシリン及びテトラサイクリン耐性Ｃ二対するコード
をもつｐＢＲ３１３，テトラサイクリン耐性Ｃ二対して
コードをもつｐ８０１０１．カナマイシン耐性Ｃ二対し
てコードをもつｐＯＲｌｆ　、　　λバクテリオファー
ジ・ベクター、例えばシャロンファージ及び酵母２μプ
ラスミドＤＮＡである。

プラスミドｐＬＧ２３の有用性は当業者に明白である。

微生物宿主１例えば大腸菌での中成長「ルモン合成を指
令するのＣ二これを使用できる。前掲ケｙヱ＝７）　、
イー等、　Ｎｔ＋ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１１ｓ　Ｒｔｓ　９
を参照のこと。

出軸人　　ザ　ボーＦ　オブ　）９ステイ一ズ第１頁の
続き ＠ｌ！　　間者ジョン・ヘルマー・エルソンアメリカ会
衆国オハイオ州ユニ バージティー・ハイツ・カンタ バリー・ロード２３２４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｌ　プラスミドρＬ（）２３゜ ２保存機関の呼出し番号ＮＥ（ＲＬ　Ｂ−１２４３６１
   ’　ｂ　’）大腸１（ＪＥ−Ｃｏｌｔ）　ＨＢＩＯＩ　
   （ｐＬ（）２３）。 １　プレｂ（）Ｈアミノ酸配列に対するコードを有する
   ヌクレオチド配列を含むように変更させた微生物つ ４、　プレｂＧＨアミノ酸配列に対するコードを持つヌ
   クレオチド配列を含むＤＮＡ運搬ベクター。 翫　微生物へ運搬されその中で複製された特許請求の範
   囲第４項のＤＮＡ運搬ベクター。 ６、微生物が細１であり、　ＤＮＡ運搬ベクターがプラ
   スミドである。特許請求の範囲第５項のＤＮＡ運搬ベク
   ター。 ７、細菌が大腸菌（ｇｓ”、ｈｅｒｉｃｈｔａ　ｏｏｌ
   ｉ）　ｚ　１７７６　と大腸菌（Ｌｏａｌｔ）　ＨＢＩ
   ＯＩからなる群から遥ばれ、プラスミドがｐＢＲ３２２
   である。特許請求の範囲第６項のＤＮＡ運搬ベクター。 ＆　中成長ホルモンのアミノ酸配列に対するコードを持
   つヌクレオチド配列を含むように変更された微生物。 ９、中成長ホルモンＣ二対するコードを持つヌクレオチ
   ド配列を含むＤＮＡ運搬ベクター。 １０、微生物に運搬されその中で複製される特許請求の
   範囲ＩＩ９項のＤＮＡ運搬ベクター。 １１、　　微生物が細菌であり、　ＤＮＡ運搬ベクター
   がプラスミドである。特許請求の範囲第１０項のＤＮＡ
   運搬ベクター。 １２、　　細菌が大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｘ　１７７
   ６と大腸菌（Ｂ。 ｃｏｌｔ）　ＨＢＩＯＩとからなる群から遥ばれ、プラ
   スミドがｐＢＲ３２２である。特許請求の範囲第１１項
   のＤＮＡ運搬ベクター。 １３、　　中成長ホルモンのアミノ酸配列に対するコー
   ドをもつヌクレオチド配列を含有するように変更された
   細菌を培養することからなる。中成長ホルモン（ｂｅｈ
   　）の製法。 １４、細菌が大腸１１　（Ｌｏａｌｔ）である、特許＠
   ｇの範囲第１３項による方法。