DD216044A5 - Verfahren zur herstellung eines rekombinierenden dna-klonierungsvektors - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors, das darin besteht, dass man eine DNA-Sequenz, die ein Restriktionsfragment des Bakteriophagen Lambda enthaelt, welches den PstI-HincI cI Repressor enthaelt, mit einer DNA-Sequenz, die ein Replikon und einen Promotor enthaelt, welche gegenueber dem Repressor nicht sensitiv sind, verbindet. Durch Verbinden des 0,9 kb HincII-PstI Restriktionsfragments des Plasmids pPR3 mit dem 4 kb PstI-HincII Restriktionsfragment des Plasmids pBR322 laesst sich hiernach beispielsweise das Plasmid pPR12 herstellen.Weitere hiernach herstellbare Plasmide sind die Plasmide pPR3, pPR12, pPR18 und pPR12 Delta 2. Die hiernach erhaeltlichen Plasmide koennen mit Vorteil bei Verfahren zur Stabilisierung und Selektion von Wirtszellen eingesetzt werden, die rekombinierende DNA enthalten.

Description

-Ί-

Titel der Erfindung:

,Verfahren zur Herstellung eines rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors

Anwendungsgebiet der>Erfindung: .

15' Die Erfindung bezieht sich auf ein selektives System, das Mittel zur Stabilisierung und Selektion rekombinierender DNA-Wirtszellen durch Verwendung eines letalen chromosomalen Markers schafft, der durch ein an einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor geborenes Gen reprimiert.

wird. Dies ist besonders wichtig, weil rekombinierende DNA-Klonierungsvektoren, wie Plasmide, von Bakterienpopulationen oft rasch verloren gehen und großtechnische Fermentationen mehr als 10 Zellgenerationen erfordern können. Ist die rekombinierende DNA, die für das gewünschte Produkt codiert, daher einmal in ein Plasmid inseriert, dann ist es,wünschenswert, wenn nicht sogar notwendig, daß die das Plasmid enthaltende Mikroorganismenkultur so stabilisiert wird, daß all die Zellen, die die Kultur bilden, das gewünschte Plasmid enthalten. Dies ist kritisch,' weil rekombinierende Plasmide mit fremder DNA. notorisch instabil sind und oft mehr als 90 % der Zellen in einer Population das rekombinierende Plasmid nicht enthalten können, nachdem eine Kultur über Nacht gewachsen ist. Eine Expression der gewünschten Gene ist jedoch nur in ,denjenigen Zellen möglich, die das rekombinierende Plasmid noch enthalten, so daß sich im soeben erwähnten Fall das Produktionsvermögen ganz wesentlich verringert.

Ziel der Erfindung: - . ' ,

Wirtszellen, die rekombinierende DNA enthalten, lassen sich nun bisher unter Anwendung der bekannten Methoden leider nicht genügend stabilisieren, und Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens zur •Herstellung rekombinierender DNA-Klonierungsvektoren, die sich besonders gut zur.Stabilisierung und auch Selektion von Wirtszellen eignen', welche rekombinierende DNA enthalten, so daß sich eine entsprechende KuItür.mit hoher und praktisch gleichbleibender Produktionskapazität ergibt.

Darlegung des Wesens der Erfindung: Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung rekombinierender DNA-Klo-

¹S nierungsvektoren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine DNA-Sequenz, die ein Restriktionsfragment des Bakteriophagen Λ enthält, welches den Pstl-Hincl el Repressor enthält, mit einer DNA-Sequenz, die ein Replikon,und einen Promotor enthält, welche gegenüber dem Repressbr nicht sensitiv sind, verbindet.

-Die hierdurch erhaltenen rekombinierenden DNA-Klonierungsvektoren werden mit besonderem Vorteil bei einem Verfahren zur Stabilisierung und Selektion von Wirtszellen verwendet, die rekombinierende DNA enthalten, welche ein funktionelles Polypeptid exprimierf, und dieses Verfahren besteht darin, daß man

a) die Wirtszellen mit einem entsprechenden rekombinieren- ' den DNA-Klonierungsvektor, der das^yden Pstl-Hincl el Repressor enthaltende Restriktionsfragment des Bakteriophagen λ und ein Gen enthält, das ein funktionelles Polypeptid exprimiert, transformiert und

b) die transformierten Wirtszellen mit einem lysogenen Organismus lysogenisiert, der einen Marker enthält, der in den Wirtsze.llen letal oder bedingt letal ist, invden*transformierten Wirtszellen jedoch durch das Repressorgen, das' im.rekombinierenden DNA-Klonierungs-

vektor enthalten ist, reprimiert wird, · . mit der Maßgabe, daß der rekombinierende DNA-Klonierungsvektor ein Replikon und einen Promotor enthält, die gegenüber dem Repressor nicht sensitiv sind, und mit der weite-5

ren Maßgabe, daß, falls die transformierten Wirtszellen mit einem Iysogenen Organismus, der ein Gen enthält, welches bedingt' letal ist, lysogenisiert werden, die erhaltenen Wirtszellen dann unter restriktiven Bedingungen gezüchtet

werden. . . .

Es sind bisher nur sehr wenig wirksame Methoden zur Stabilisierung rekombinierender Plasmide beschrieben worden, und all diese Methoden haben ernsthafte Nachteile. ,Eine dieser bekannten Methoden besteht im Einbau antibiotikum-· resistenter Gene in rekombinierende Plasmide und in einem anschließenden Zusatz des jeweiligen Antibiotikums zum Kulturmedium.. Die Zellen, welche das Plasmid mit dem anti-. biotikumresistenten Gen beibehalten, werden als geeignet ausgewählt, während diejenigen Zellen, die das Plasmid verlieren, als ungeeignet ausgewählt und daher eliminiert werden. Diese Methode hat jedoch den'Nachteil, daß man hierzu die antibiotikumresistenten Bakterien in einem großtechnischen Maßstab wachsen lassen muß, im Fermentationsmedium ein teures Antibiotikum braucht und eine abschlie- ßende Reinigung zur Entfernung des Antibiotikums vom gewünschten Produkt erforderlich ist.

Eine weitere bekannte Methode zur Stabilisierung rekombinierender Plasmide besteht in einer Komplementierung einer auxotropen Mutation am 'Chromosom. Bei dieser Methode sind der Zusammensetzung des Fermentationsmediums enge Grenzen gesetzt, wobei zudem eine Fermentation in einem Medium erforderlich ist, das die für die Wirtsbakterien erforderlichen Nährstoffe nicht enthält. Infolge von Syntropie kann es'ferner auch dazu kommen, daß Zellen nach Verlust des Plasmids noch weiter wachsen. Beide Selektionsarten sind somit abhängig von einer besonderen Manipulation der Medien. Dies führt zu einer Erhöhung der Ko-

sten der Fermentation und einer Begrenzung der zur Verbesserung der Produktivität verfügbaren Möglichkeiten.

Die bekannten Selektionsmethoden haben obigen Angaben zufolge die verschiedensten Nachteile. Es besteht daher der dringende Bedarf an anderen Selektionsmethoden,'-die von der Zusammensetzung der Medien unabhängig sind, die Aufrechterhaltung des rekombinierenden DNA-Klonierungsvektors unter allen Fermentationsbedingungen erlauben und eine . verbesserte Biosynthese eines Polypeptidprodukts ermöglichen.. Diesem. Bedarf kann durch geeignete Anpassung des sogenannten Zellsuizids entsprochen werden, da sich suizide Zellen aufbauen lassen, die einen letalen Marker an einem Chromosom und einen Repressor oder ein komplementierendes. Gen an einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor enthalten. Derart,aufgebaute Zellen sterben ab, wenn sie den Vektor verlieren. Dieses Prinzip läßt sich nun auf der vorliegenden Erfindung aufbauend verbessern, "indem nicht ' nur sichergestellt wird, daß praktisch alle lebenden Zellen in einer : Kultur den gewünschten rekcmbinierenden Klonieruhgsvektor enthalten, sondern daß auch die Expression-von Genen, die im Klonierungsvektor enthalten sind, verbessert wird.

Die verbesserte Expression von Produktgenen und ferner auch ;das Fehlen von Plasmidsegregation stellen besondere . Vorteile dar und dienen zur Unterscheidung der Erfindung von anderen selektiven Systemen, die ebenfalls Gebrauch machen vom Bakteriophagrepressor A. el". Es wurde demnach nun ein selektives System aus Klonierungsvektoren gefunden, das sowohl das el Repressorgen, welches das ~2,5 kb BgIII Restriktionsfragment des Bakteriophagen X enthält, als auch ein Gen enthält, das ein funktionelies Polypeptid exprimiert. Hierbei wird'zwar das Gen exprimiert, das - für, das funktioneile Polypept.id codiert, doch zeigt der • darin beschriebene besondere Plasmidaufbau eine gewisse Segregation und ermöglicht ferner auch keine verbesserte und optimale Bildung an gewünschtem Produkt. Diese Probleme werden lediglich durch das erfindungsgemäße verbesserte Verfahren gelöst, durch das sich rekombinierende DNA ent-

haltende Wirtszellen sowohl hervorragend stabilisieren und selektieren lassen, als auch gleichzeitig die Genexpression und Biosynthese eines funktioneilen Polypeptids maximal gestalten läßt. ;

Unter einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor wird vorliegend jedes Mittel unter Einschluß von Plasmiden, Bakteriophagen und Viren verstanden, das aus einem DNA-Molekül besteht, an welches ein oder mehr weitere DNA-. Segmente gebunden sein können.

- ' ^:

Unter Transformation ist die Einführung von DNA in eine Rezipientenwirtszelle zu verstehen, die den Genotyp verändert und somit zu einer verefbbaren Veränderung in der Rezipientenzelle führt.

Ein Transformant stellt eine Rezipientenzelle dar, die ei- '

ne Transformation erfahren hat. .

Ein Repressor ist ein Gen, das sich an einem rekombinie-2Q renden DNA-Klonierungsvektor befindet und das eine Expression eines letalen oder bedingt letalen Gens'in einem ' Chromosom einer Wirtszelle reprimiert und verhindert..

Unter einem funktiönellen Polypeptid versteht man ein ge-₂fwinnbares bioaktives vollständig heterologes Polypeptid oder einen entsprechenden Vorläufer, ein gewinnbares bioaktives Polypeptid aus einem heterologen Polypeptid und . einem Teil oder Gesamten eines homologen Polypeptids,, ein gewinnbares bioaktives Fusionspolypeptid aus einem heterologen Polypeptid und einem bioinaktivierenden homologen

Polypeptid, das spezifisch gespalten werden kann, oder ein bioaktives Polypeptid, dessen Anwesenheit feststellbar ist.

Ein verschmolzenes Genprodukt ist ein gewinnbares heterologes Polypeptid, das mit einem Teil oder Gesamten eines 35

homologen Polypeptids verschmolzen ist.

Unter einem iMarker versteht man ein Gen oder eine Kombina-.

tion aus Genen bekannter Funktion und Stellung in einem Chromosom, ei^ nem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor.oder einem Virus.

'· ,! · '

Mit der Abkürzung Ap wird der ampicillinresistente Pheno-

' ·' ' ·

typ bezeichnet.

.Mit der Abkürzung Ap^s ist. der ampicillinsensitive.Phenptyp .' gemeint. ' . '

Unter der¹Abkürzung Tc;^r wird der tetracyclinresistente Pheno.typ verstanden.

Mit - der Abkürzung Te ist der tetracyclinsensitive Phenb-

typ' gemeint. / , / ' -

''...· - " .. '·. ' . ".' · . .;

Von der Erfindung kann, wie bereits oben erwähnt, Gebfauch gemacht werden zum Wachsenlas.sen von Kulturen, die Produkte produzieren, welche von rekombinierender DNA codiert -..werden. Ohne ein wirksames 'selektives System verlieren vie-Ie.Zellen in einer solchen Kultur das gewünschte Plasmid, wodurch sich die Bildung des gewünschten Produkts, wesentlich . reduziert. Hierdurch wird nicht \nur sichergestellt,

' ' !

daß praktisch- alle lebenden Zellen in einer Kultur den rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor . tragen , sondern es Ot . wird hierdurch auch die Genexpression derart verbessert, daß hierdurch durch Biosynthese größere Mengen eines funktioneilen PöTypeptids gebildet werden. Im Vergleich zu den bekannten Verfahren komnt es.hierbei daher zu keiner Plasmidsegrega-

tion., wobei das Ausmaß der Genexpression zudem verbessert ist und auch OQ wesentlich"höhere Mengen an funktionellem Polypeptid gebildet werden.

Das erfindungsgemäß nun zugängliche neue Verfahren zeichnet sich auch durch eine besondere Vielseitigkeit aus, da es sich" auf die Bildung irgendeiner Substanz' anwenden laßt, deren Synthese von

_o_- einem rekombinierenden DNA-Klonierungsvektor bestürmt wird. Ein bevorzugter rekombinierender DNA-Klonierungsvektor ist das Plasmid, obwohl sich hierzu natürlich auch Bakteriophagen und sonstige Vektoren eig-

' 'Hen. Diese neue Methode ist.unabhängig von den Genen, die ein- funktio- :

nelles Polypeptid exprimieren, so daß sie sich auf rekombinierende Stämme anwenden läßt, die ein oder mehrere großtechnisch bedeutende Gene enthalten. Die' bereits beschriebene Verbesserung der Genexpression ist weiter auch nicht auf irgendein bestimmtes Produktgen beschränkt. Es läßt sich daher hiernach irgendein fu.nktione.lles Polypeptid oder sonstiges Genprodukt unter Verwendung rekombinierender DNA herstellen. ~

Die Anwendbarkeit des Zellsuizids zur - Aufrechterhaltung und Stabilisierung rekombinierender DNA-Wirtszellen wird anhand der Wechselwirkung zwischen dem Bakteriophag λ. und Escherichia coli.K12·beschrieben. Das Bakteriophag Λ. ist.ein abgeschwächtes Bakteriophag, das bei der Infizierung von Escherichia coli Kl2 einem von zwei sich gegenseitig ausschließenden Zyklen folgt. In der lytischen Phase repliziert sich das Bakteriophag DNA autonom, lenkt, die Synthese und Anordnung der Bakteriophagkomponenten und tötet die. Zellen zugleich mit der Freisetzung von reifem Bakteriophag ab. In der lysogenen Phase ist das Bakteriophag in das Chromosom des Wirts als Prophag integriert, repliziert sich als Marker am Chromosom und blockiert eine Synthese der Bakteriophagkomponenten. Ein Bakteriophaggen, nämlich Xc-I, codiert für einen Repres-

oc sor, der ..den lysogenen Zustand aufrechterhält und eine Expression'von Genen für Bakteriophagkomponenten und eine Reifung blockiert. Wird der Repressor inaktiviert oder von der Zelle entfernt, dann tritt das Prophag aus dem Chromosom aus, geht in den lytischen Zyklus über und tö-

OQ tet die Zelle. Ein Bakteriophag mit einem schadhaften

Gen XcI kann den lysogenen Zustand nicht aufrechterhalten und ist für die Zelle letal, sofern nicht von einer anderen Quelle für,einen funktioneilen Repressor .gesorgt wird. Bei einer .Ausführungsform dieser Methode, wird A cI90 als

_c,r- repressorabhängiges Prophag und als funktioneller Repressor ein Gen el verwendet, das in einem Restriktionsfragment enthalten und in einen rekombinierenden DNA-Klo-

,nierungsvektor geklont ist. . "

Das ; erfindungsgemäß zugängliche, verbesserte selektive System läßt sich vor allem durch Klonieruhg des Pias-' mid ρΙΑ7Δ4Δΐ /*1.3 kb EcoRI-BamHI Res triktioris fragments-, '„ das das t.rpE·'-Insulin A.Kettengen enthält, auf das neue Plasmid pP.Rl2 -zeigen. Diese Klonierung wird, so durchgeh, führt, daß es hierdurch, zu einer Auslöschung des Plasmid pPRl2 ^:λ> 0.4 kb EcoRI-BamHI -Segments kommt. Das Plasmid ' pPRl2 ist allgemein als Vektor brauchbar, weil anstelle des Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ -^l. 3 kB R'estriktionsf ragment§ jedes /gewünschte DNA-Fragment verwendet werden, kann. Das Plasmid pPRl2 wird aufgebaut durch Insertion des Plasmid pPR3 ^*-¹- 0.9 kb Pstl-HincII Restriktionsfragments , das den Bakterio-

^5 phag Ac_I8 57 Repressor enthält, in das Plasmid pBR322. Das Plasmid pPR3, wird aufgebaut, durch Insertion des 2.5 kb BgIII Fragments des Bakteriophagen Xcl857 in die alleinige BamHI Restriktionsstelle des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ. Das' 2.5 kb_v . BqI11 Restriktionsfragment des Bakteriophagen AcI857.' en€-

2^ hält zusätzlich zum, Repressorgen c_I auch^ noch das rex-Gen und einen,Teil des cro-Gens. Die Auslöschung des cro-Gens und des Großteils des rex-Gens vom Restriktionsfragment, das das oI-Repressorgen enthält, 'führt überraschenderwei·^· se zu einer starken Erhöhung und Verbesserung der Genex-

.·" pres'sion ,und somit der Bildung an funktionellem Polypep- , tid. Ein besonders bevorzugtes λ-cl enthaltendes Restriktionsfragment mit ausgelöschtem cro-Gen und fex-Gen; das vorliegend· zur Erläuterung der Erfindung verwendet wird, · ist das ~Ό.9 kb Pstl-HincII ι Restriktionsfragment des- Plasmids pPR3. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für die'.,Plasmi.de ρΙΑ7Δ4/Λ1 , pIBT^4^1, pPR3 und pPRl2- gehen im-einzelnen 'aus. den:'.Fig. 1 bis' 4 der Zeichnung hervor.

Das hierin.ebenfalls beschriebene Plasmid ΌΪΑ7Δ4Δ1 ent-¹

" '· ' ' ^: ' " ^:'

'hält den Escherichia c.oli-Tryptophanpromotor, Antibio.ti-

kumresistehzmarker' und ein Gen,, das" ein verschmolzenes . Genprodukt exprimiert, welches besteht aus einem Teil des ' ' Esche'richia coli trp E-Pro.teins in Verschmelzung mit der

A Polypeptidkette von Humaninsulin. Das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ ist ähnlich aufgebaut, mit der Ausnahme, daß das Gen, das das verschmolzene Genprodukt exprimiert, aus einem Teil des trp Ε-Proteins in Verschmelzung mit der B-Polypeptidkette von Hurnaninsulin anstelle der A-Polypeptidkette von 'Humaninsulin besteht. . ·

Das Plasmid ρΙΑ7Δ4 Δ 1 ist vom Plasmid pBR322 abgeleitet, und sein Aufbau erfolgt nach dem in Beispiel IA-I beschriebenen Verfahren. Mit dem Symbol "Δ" wir.d der übli-· chen Ausdrucksweise entsprechend eine Auslöschung bezeichnet. Die Bezugnahme auf ein Plasmidi mit anschließender Anführung von 'AEcop-XbaP beschreibt ,daher beispielsweise das Plasmid, von welchem die Nucleotidsequenz zwischen den Restriktionsenzymstellen EcoRI und Xbal durch Verdauung mit diesen Enzymen entfernt worden ist. Der Einfachheit > halber werden bestimmte Auslöschungen auch durch Zahlen angegeben. Beginnend vom ersten Basenpaar (bp) der EcoRI-

""Erkennungs stelle, die dem. Gen für die Tetracyclinresistenz

ν - .20 im Stammplasmid pBR322 vorangeht, beinhaltet das Symbol Δι daher eine Auslöschung von bp 1-30 (nämlich vonΔ EcoRI-Hindlll) und 'somit eine Außerkraftsetzung des Tetracyclinpromotor/Operatorsystems, das Symbol Δ2 eine Auslöschung von bp l-3 7i5 (nämlich AEcoRI-BamHI) und somit eine Entfernung von sowohl dem Tetracyclinpromotor/Operatorsystem als auch einem Teil des Strukturgens, das den Code für die Tetracyclinresistenz trägt, und das Symbol Δ4 eine Auslöschung von up — 900 bis ^1500 vom trp Operonfragment un- ' -ter Eliminierung des Strukturgens für das trp D Polypeptid,-

Die .Klonierung des Restriktionsfragments des Plasmids , ρΙΑ7Δ4 Δΐ , das das /ν 1.3 kb EcoRI-BamHI trp E-lnsulin A-Kettengen enthält, in das -^ 4 .7 kb EcoRI-BamHI Restrik- ^ tionsfragment des Plasmids pPRl2, welches im folgenden als ρΡΚΐ.2Δ 2 bezeichnet wird, führt zum neuen Pl.asinid pPRl7. Das Plasmid ρΙΑ7Δ4Δ 1 ~Ί .3 kb EcoRI-BamHI .Restriktionsfr.agment enthält einen Teil von Δ 2, so daß dieser Aufbau·

.. " - -ίο -

1, von Δ2 zu Δΐ führt. Das Plasmid pPRl7 enthält das ^ 0.9 kb Pstl-HincII Restriktionsfragment des Bakteriophags λ-οΐ857 und blockiert daher die lytische Entwicklung des Bakteriophags λ. in lysogenisierten Wirtszellen. Darüber hinaus ergibt das Plasmid .pPRl7 eine Codierung und Expression des oben erwähnten verschmolzenen Genprodukts trp E-Insulin A Kette in Mengen, die,wesentlich über den Mengen, .1 legen, die. von-anderen das Gen XcI enthaltenden· bekannten ·. ,.·. Plas'miden gebildet werden. Ein Restriktionsstellenplan und ein Funktionsplan für das Plasmid pPRl7 geht aus Fig. 5 der. Zeichnung hervor.' . -

Das neue rekombinierende Plasmid pPR.17 kann in Escherichia' ', colitransformiert werden, beispielsweise in Escherichia coli K12 294 QProc. Nat. Acad. Sei. U. S. A- . 76 : 106 (1979 ) ) ·,

v " ' . '

Escherichia coli K12 RV 308 ( J. Mol. Biol. 139:147 bis . . 161 (1980)), Escherichia coil K12 C600 (Bacteriol. Rev. 36: 526 bis 557 (1972)) oder Escherichia coli K12 C600R_k~ M_k (Proc. .Nat. Acad.; Sei. 71: 1030 bis 1034 (1974)), und di,e erhaltenen Stämme lassen sich dann mit irgendeinem ..--Bakteriophag Λ- lyso^genisieren, das keinen funktioneilen c_I Repressor bildet, wie, beispielsweise das Bakteriophag > Die aufgebauten Stämme Escherichia coil K12 294

:> Escherichia coli^;' K12 RV3 0 8icI9 0/.pPrl7, Escherichia coli'K12 G600\cI90/pPrl7 und Escherichia coli K12 C600R, -M,-XcI90/pPRl7 erfordern daher eine Beibehaltung des Plasmids pPRl7/ während die aufgebauten Stämme Esche- ' ' richia coli K12 294/pPR17, Escherichia coli K12 RV308/ pPR-17,. Escherichia coli. K12 C600/pPRl7 - und Escherichia· coli.Rl2 CoOOR^-M₁ -/pPR17 gleich gut ohne dieses Plasmid \ ^; ·,' überleben. Ein Vergleich der Plasmidretention in den Stammen macht deutlich, daß praktisch alIe ' lebenden Zellen in· . den'erfindungsgemäß zugänglichen Stänrren das gewünschte Plasrrdd haben. Die Stämme Escherichia coli K12 29'4XcI90/pPRl7, Escheri- ' chia coil K12 RV308>£l90/pPRl7 _f Escherichia cdi K12

C600XcI90/pPR17 und'Escherichia coli K12 C600R₁.-M_;.-XcI90/ pPR17, behalten darüber hinaus'das Plasmid p?R17 nicht nur . bei,¹' sondern sie bilden ferner -auch das gewünschte var-

- ⁿ -

' schmolzene Genprodukt..

Das verbesserte selektive System und die Eignung der Erfindung lassen sich ferner auch zeigen, indem man das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ 'ν 1. 3 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragment, welches das trp Ε-Insulin B-Kettengen enthält, in der oben für das Plasmid pPRl7 beschriebenen Weise auf

das Plasmid pPRl2 kloniert. Das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 ist vom Plasmid pBR322 in analoger Weise abgeleitet wie dies oben für .ρΙΑ"ϊ-^4Δΐ beschrieben worden ist. Der Aufbau des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ geht aus dem später folgenden Beispiel .2 hervor.

Die Klonierung des Restriktionsfragments des Plasmids 15. ρΐΒ7Δ4Δΐ, das das wl.3 kb EcoRI-BamHI trp Ε-Insulin'B-Kettengen enthält, auf das ^4..7. kb EcoRI-BamHI ,Restriktionsfragment des Plasmids pPRl2 führt zum neuen Plasmid. pPRl8. Das Plasmid pPRl8 .enthält das <~0.9kb Pstl-HincII Restriktionsfragment des Bakteriophags XcI357' und bl.o-kkiert daher die lytische Entwicklung des Bakteriophags X in lysogenisierten Wirtszellen. Darüber hinaus codiert und exprimiert das Plasmid pBRl8 auch das oben erwähnte verschmolzene Genprodukt trp Ε-Insulin B-Kette in Mengen,: die wesentlich über den Mengen liegen, wie sie von anderen, das Gen XcI enthaltenden bekannten Plasmiden gebildet werden. Ein Restriktionsstellenplan und ein Funk- -tionsplan für das Plasmid pPR18 geht aus Fig. 6 der Zeich- nung hervor. . ' ...

on . ·

^ου Das neue rekombinierende Plasmid pPRlS kann in --Escherichia coli transformiert werden, beispielsweise in Escherichia coli K12 294, Escherichia. coli K12 RV308,. Escherichia coli K12 C6C0 oder Escherichia coli K12 CBOOR₁ -M₁ ,

und die hierdurch erhaltenen Stämme lassen sich dann.mit irgendeinem Bakteriophag X lysogenisieren, das keinen funktionellen Repressor el bildet, beispielsweise mit dem Bakteriophag Xc_I9 0. Genauso wie oben für die lysogenisierten und das Plasmid dPR17 enthaltenden Stämme, ,.beschrieben.,

ist auch für die in obiger Weise aufgebauten Stämme Escherichia coli K12 294XcI90/pPR18, Escherichia coli K12 RV308A£l90/pPR18, Escherichia coli K12 CöOOX^cigO/pPRlS und Escherichia coli K12" C600R, -M, -Xcl90/pPRl8. eine Beibehaltung des Plasmids pPRl8 erforderlich, .während dies für die aufgebauten Stämme Escherichia coli K12 294/pPRl8, Escherichia coli Kl2 RV308/pPRl8, Escherichia coli K12 C600/ pPrl8 und Escherichia coli K12 C600R, -M,-/pPRl8 nicht gilt, . so daß diese genauso gut ohne das Plasmid überleben. Ein Vergleich der Plasmidretention in.den Stämmen zeigt deutlich, daß praktisch alle lebenden Zellen in_; den erfindungs-; gemäßen Stämmen das gewünschte Plasmid enthalten. Darüber hinaus behalten die. Stämme Escherich/ia coli Kl2 294λρΙ90/ pPRl8, Escherichia coli K12 RV308^cI90/pPR18, Escherichia coli K12 -C&OOXcigO./pPRlS und Escherichia coli K12 C600R,-.

M, -ACI90/PPR18 ihre Plasmide nicht nur bei, sondern sie

': ) X —: . ·.. .·. -.

bilden auch das gewünschte verschmolzene Genprodukt.

-Das- neue/ Plasmid pPRl2 läßt sich ferner auch in eine Reihe von Wirtszellen transformieren, beispielsweise in

Escherichia coli.K12 C600R, -M,'-. Die hierdurch· erhaltenen - Stämme lassen sich genau so wie die Transformanteh der Plasmide pPRl7 und pPRl8 lysogenisieren, wodurch man zu Stämmen gelangt,, die ohne das Plasmid nicht überleben

Der aufgebaute Stamm Escherichia coli K12 C600R, -M, -

XcI90/pPRl2.erfordert daher die Beibehaltung des Plasmids. pPRl2, während der aufgebaute Stamm Escherichia coli K12 C60OR- -M_v-/pPRl2 auch ohne dieses Plasmid genau so gut ,.überlebt. Ein Vergleich der Plasmidretention"in den Stäm- •• 30. men zeigt deutlich, daß praktisch alle lebenden Zellen in den' erfindungsgemäßen Stämmen das gewünschte Plasmid ent- .' '-halten. · '. · ' ,

Das hierin zur.Erläuterung der Erfindung verwendete Repressorgen λ£ΐ857 ist temperaturempfindlich und wird bei Temperaturen von 38°C bis 44⁰G oder darüber inaktiviert. Eine 'Temperaturerhöhung auf 38 bis '44⁰C führt daher zu einer Lyse der Zellen unter Einleitung des. lyrischen Zy- *'

¹ - 13 - .

/

kl us des λ Prophags, das auf der Erfindung aufbauend in den Wirtszellenstamm eingebaut worden ist. Bei Verwendung eines tem-

peraturempfindlichen Repressors, der einen letalen oder bedingt letalen Marker reprimiert, welcher eine Wirtszellenlyse verursacht, und bei Züchtung der Wirtszellen bei ' einer Temperatur, die zu einer Inaktivierung des Repressors führt, oder im Falle eines bedingt letalen Markers , bei einer Temperatur, die nicht innerhalb des Temperatur-, bereichs für eine zulässige Züchtung der Wirtszellen liegt, ermöglicht die erfindungsgemäße verbesserte Selektionsmethode daher auch ein einfaches, bequemes und wohlfeiles ' Verfahren zur Lyse von Zellen.zur Reinigung intrazellularer Produkte. · ,

Dieses Verfahren macht von einem plasmidgeborenen Gen Gebrauch, um einen letalen" chromosomalen Marker zu reprimieren. Die Selektion der Zellen ist unabhängig vom Replikon und auch von den anderen Genen am Plasmid, wobei - obwohl bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Gebrauch gemacht wi-rd vom Bakteriophag XcI857, welches das -Ό.,9 kb Pstl-HincII el Restriktionsfragment enthält - allgemein auch ein ~0.9 kb Pstl-HincII el enthaltendes Restriktionsfragment irgendeines anderen Starn-.. mes eines Bakteriophags λ verwendet werden kann, der einen 25- fünktionellen .Repressor bildet. Das zur beispielsmäßigen Erläuterung der Erfindung yerwendete Prophag trägt zwar eine Xc_I90 Mutation und bildet keinen f ünktionel len XcI Repressor, doch können statt dessen auch andere Mutanten des Bakteriophags X verwendet werden, falls diese eben-^JU falls kein fünktionelles £l Repressorgen enthalten. Selbstverständlich braucht man für solche Mutanten eirfe andere Quelle für den Repressor / um den lysogenen Zustand aufrechtzuerhalten.

Das erfind¹ jngsgemäß mögliche Selektionsverfahren ergibt eine ver- besserte Expression eines funktioneilen Polypeptids und laßt sich auf Wirtszellen anwenden, die plasmidgebcrene

* Gene enthalten, welche eine Reihe brauchbarer Produkte

'.· - 14 -

"I exprimieren. Das plasmidgeborene Gen kann beispielsweise ein natürlich vorkommendes Gen, ein nicht in der Natur ' vorkommendes Gen oder ein Geh sein, das zum. einen Teilnatürlich vorkommt und zum anderen synthetisch oder nicht in der Natur vorkommend ist. Weiter kann von der Erfindung auch Gebrauch gemacht werden zur Selektion und Aufrechterhaltung von Zellen, die ein plasmidgeborenes Gen enthalten, welches codiert für Humanpräproinsulin, Humanpro-insulin, Humaninsu.lin-Ä-Kette ,'. Human insu lin-B-Kette, Humanwachstumshormon , Nichthumanwachstumshormon, Nichthumaninsulin, Humaninter«- feron, Niqhthuinaninterferon, virales Antigen, Urokinase, irgendein Peptidhormon, irgendein Enzym, irgendein PoIypeptid oder praktisch für irgendein sonstiges Gen, das in der Forschung" und Technik Bedeutung hat., ..

•15' ' .. . . ' ; ; · ' . ' ' ' : ' \.

Bei "den hierin beschriebenen speziellen Ausführungsformen werden Plasmidreplikation und Expression des Genprodukts bestimmt durch das -Replikon: von pMBl (Life" Sei, 25:¹ 807 bis 818 (1979)) oder.den trp Promotor. Ändere Replikone und Promotoren lassen sich ebenfalls verwenden, ¹ sofern sie in Escherichia coli Kl2 funktionell und gegenüber dem jeweils zu verwendenden Repressor nicht sensitiv sind. Selbstverständlich, weiß der Fachmann oder kann der Fachmann ohne' weiteres bestimmen, welche Replikone und Promotoren in Escherichia coli K12 funktionell und welche, gegenüber einem bestimmten Repressor nicht sensitiv sind. Zu.Beispielen für solche andere Replikone gehören unter anderem die Replikone von CoIEl, NRl, RK2, 'RK6, pSClOl, RPl, RP4 oder ^F unter Einschluß von Bakteriophagen,, die in'Escherichia coli K12 replizieren. Zu Beispielen für

andere Promotoren gehören Iac Promotor, Lipcproteinpromotor, ribosomale Proteinpromotoren, ribosomale RNA-Promo-" toren und praktisch irgendwelche sonstige Promotoren'. Der Aufbau sonstiger Replikone und Promotoren liegt selbstver-

^ ständlich i'm Rahmen des fachmännischen Könnens.

Escherichia coli K12 ist nicht nur der bevorzugte Wirt für das Bakteriophag X, sondern stellt infolge seiner .;

Wohlhabenheit der genetischen und' biologischen Information, auch eine bequeme Wirtszelle für die erfindungsgemäßen Zwecke dar. Der Stamm Escherichia coli K12 RV308 wird zwar am meisten bevorzugt, doch ist die Erfindung nicht auf irgendeinen Genus, eine Spezies oder einen Stamm beschränkt, sondern sie läßt, sich auf irgendeinen Escherichia coli, irgendeine, Coli-Form oder irgendeine sonstige Zelle anwenden, in welcher das Bakteriophag X lysogen ist und in die ein funktioneller Repressor geklont werden kann.

Allen Ausführungsformen der Erfindung ist das Merkmal gemeinsam, daß· sie gegenüber der Zusammensetzung der jeweiligen Medien nicht sensitiv sind. Die Erfindung ermöglicht daher einen breiten Bereich an Fermentationsmanipulation zur Verbesserung der Produktivität.

Ausführungsbeispiele:

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter beschrieben. Darin werden erforderlichenfalls sowohl Erklärungen als auch Erläuterungen über die·tatsächlichen Verfahren zum Aufbau der Erfindung gemacht.

Beispiel' 1· ,;

Aufbau des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ

A. Aufbafa des Pl'asmids pBRHtrp ·.. .

Das Plasmid pGMl trägt das Escherichia coli Tryptophancperon, welches die Auslöschung ΔLE1413 (J. Bacteriology, 1457 bis 1466 (1978;) enthält und somit ein verschmolzenes Protein exprimiert, das aus den ersten sechs Amino-^ 3s säuren des trp Führungsglieds und etwa dem letzten Dr.ittel des trp E-Polypeptids (im folgenden als LE¹. bezeichnet) sowie dem gesamten trp D-Polype-ptid besteht, und diese Expression er.folgt insgesamt unter der Steuerung durch

C'

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ι ' ' ' ·../ _;

das trp Promotor-Operator sy stem. Escherichia coli ΚΓ2. , W3110tna2trp-Al02/pGMl· wurde bei der American Type CuI- . ture Collection (ATCC Nr. 31622) hinterlegt, und pGMl läßt sich in üblicher Weise vom Stamm unter Anwendung der . 5 im folgenden beschriebenen Maßnahmen entfernen.

Etwa "20 \xq des Plasmids werden mit dem Restriktionsenzym* PvuIT verdaut, das das plasmid an fünf Stellen aufspaltet. ., Sodann werden die Genfragmente mit EcoRI-Verknüpfern (die '^ aus Einern selbstkomplementären Oligonucleotid mit der Sequenz pCATGAATTCATG bestehen) vereinigt, wodurch man¹eine ; EcoRI-Verknüpfungsstelle für'die spätere Klonung in ein Plasmid erhält, welches eine EcoRI Stelle aufweist. Die 'aus pGMl erhaltenen 20 \x<4 an DNA-Fragmenten behandelt man '5 'mit 10 Einheiten T^ DNA-Ligase in Gegenwart von 200 pico-MoI des in Stellung 5' phosphorylierten synthetischen Oli-. gonücleotids pCATGA'aTTCATG und in 20'μΐ T₄ DNA Ligasepuff er (20 ~mM· Tris, pH 7,6, 0,5 ituM ATP, 10 mM MgCl_> 5 .inM Dithiothreit) über Nacht bei einer Temperatur von 4⁰C. Die Lösung wird dann 10 Minuten auf 7O⁰C erwärmt, um die Ligation zum Stillstand kommen zu lassen.. Hierauf werden die Verknüpfer durch Verdauung 'mit EcoRI abgespalten und die erhaltenen Fragmente,, welche nun Endstücke EcoRI auf-

' 'weisen, durqh Elektrophorese unter Verwendung von 5 %-igem

nc -. '- " ' ' ' · · · . . Polyacrylamidgel (dieses Verfahren wird später abgekürzt

als'PAGE bezeichnet) aufgetrennt. Die drei größten Frag- : men'te-werden vom Gel- isoliert, indem man das Gel zuerst : ' mit. Ethidiumbromid anfärbt und dann die Fragmente mit Ultraviolettlicht sichtbar macht, worauf man die interessie-

" ·

χenden Teile vom Gel ausschneidet. Jedes Gelfragment gibt

^J man zusammen mit. 300 μΙΟ,IxTBE in einen Dialyseschlauch und unterzieht das Ganze hierauf einer Elektrophorese bei 100 V über eine Zeitdauer von 1 Stunde . in 0 , lxTBE-Puf f er-,

(TEE-Puffer enthält 10,8 σ Trisbase, 5,5 g Borsäure, 0,09

' " - ' ' " κ ' ..: :.

g. Na-EDTA in 1 Liter H^O). Diel wäßrige Löspng wird vom Dialyseschlauch gesammelt, mit. Phenol extrahiert, mit ' , ,Chloroform extrahiert und.bezüglich Natriumchlorid auf eine Molarität von Ö,2 eingestellt. Nach entsprechender

Ausfällung mittels Ethanol gewinnt man die DNA in Wasser. Das trp Promotor/Operator enthaltende Gen mit klebrigen

; Enden EcoRI wird nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren identifiziert, das in einer Insertion von Fragmen-.ten in ein tetracyclinsensitives Plasmid besteht, welches, nach erfolgter Promotor/Operator-Insertion tetracyclinresistent wird. Alle später beschriebenen Isolierungen von DNA-Fragmenten werden unter Anwendung des oben erwähnten PAGE-Verfahrens durchgeführt, denen sich dann die oben beschriebene Elektroelutionsmethode anschließt.

* Entsprechende Restriktionsenzyme und sonstige Enzyme sind von folgenden Firmen erhältlich: Bethesda Research Laboratories, Inc.,Box 6010, Rockville, Maryland 20850

Boehringer Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Drive, P.O.. Box 50816, Indianapolis, Indiana 46250, Research Products, Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana 46515 . .... '

B. Aufbau des Tetracyclinresistenz .exprimierenden Plasmids pBRH trp unter Steuerung durch den Trp Promotor/Operator und Identifizierung sowie Ver- mehrung des gemäß obige Stufe; A isolierten DNA-Fragments, welches den Trp Promotor/Operator ent-. hält .

Das Plasmid pBRHl (Nucleic Acids Research 6, .3267 bis

3287 (1979)) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält 3^ das Gen für die Tetracyclinresistenz, exprimiert diese Resistenz jedoch nicht, da es mit keinem Promotor in Ver-.

bindung steht. Das Plasmid ist daher tetracyclinsensitiv. • Durch Einführung eines Prcmotor/Operator-Systems in die '

EcöRI-StelIe kann das Plasmid tetracyclinresistent ge-^OJ macht werden.

Das Plasmid p3RHl wird mit EcoRI verdaut. Das Enzym wird durch Extraktion' mit Phenol und anschließende Extraktion

mit Chloroform entfernt, worauf man die. DNA nach Ausfällung „mittels Ethanol in Wasser gewinnt. Das jeweils in getrennten Reaktiqnsgemischen erhaltene DNA-Molekül wird mit jedem der drei nach obigem Beispiel IA erhaltenen DNA Fragmente vereinigt u"nd in der bereits beschriebenen Weise

' . mit T. DNÄ-Ligäse verknüpft. Mit der im Reaktionsgemisch vorhandenen DNA transformiert man dann einen leistungsfä- ' higeri Stamm ,294 von Escherichia coli K12 (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 73:4174 bis 4198 '(1976 ), ATCC Nr. 314.46) unter Anwendung herkömmlicher Techniken (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71:3455,bis 3459 (1974), worauf man die Bakterien auf LB-P,latten (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York (1972) von- Miller), auf trägt, die 20 μg/Inl Ampicillin und 5 μ^/ΐηΐ

Tetracyclin enthalten. ' '

Mehrere tetracyclinresistente Kolonien werden -selektiert und das Plasmid DNA wird isoliert und als pBRHtrp bezeichnet. Die Anwesenheit des gewünschten Fragments wird durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Das Plasmid pBRHtrp exprimiert ß-Lactamase, verleiht Ampicillinresistenz und enthält ein DNA-Fragment, welches den trp Promotor/Operator enthält. Das DNA-Fragment codiert ferner auch für ein erstes Protein (welches als LE¹ bezeichnet wird), das aus einer Verschmelzung der ersten sechs Aminosäuren des trp-Führungsglieds .und etwa dem ,letzten Drittel des trp E-Polypeptids, einem zweiten Protein (das als D' bezeichnet wird), welches etwa der ersten Hälfte des trp D~ Polypeptids entspricht, und einem dritten Protein besteht., welches für das tetracyclinresistente Gen codiert.

' C. Aufbau des Plasmids pSOM7A2

Das Plasmid pBRHtrp wird mit dem EcoRI Restriktionsenzymverdaut, und das -erhaltene Fragment wird nach Isolierung unter Anwendung der PAGE-'Methode und Elektroelution mir dem durch EcoRI verdauten Plasmid pSDMll (Sei. 198:1056 (1977) ,GE-OS 2 007 676A) ' vereinigt .

wird mit T. DNÄ-Ligase verknüpft und die dabei angefallene DNA in der bereits beschriebenen Weise in Escherichia co-Ii K12 Stamm 294 transformiert. Die transformierten-Bak-. terien werden auf ampicillinhaltigen Platten selektiert, . und die erhaltenen ampicilllnresistenten Kolonien werden durch Koloniehybridisierung (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 72:3951 bis 3965 (1975)) einem Screening unterzogen. Das dabei erhaltene trp Promotor/Operator enthaltende Fragment,

32 welches aus pBRH trp isoliert und dann mit P radioaktiv markiert.worden ist, wird als Probe bei obigem Verfahren verwendet. In der Koloniehybridisierung erweisen sich mehrere Kolonien als positiv, und diese, werden daher ausgewählt.- Das Plasmid DNA wird isoliert, und die Orientierung der inserierten Fragmente wird durch Restriktionsanalyse unter Verwendung der Enzyme BgIII und BamHI in einer Doppelverdauung bestimmt. Die Kolonien, die das gewünschte Plasmid mit dem '-trρ Promotor/Operator-Fragment in der geeigneten Orientierung enthalten, läßt man in LB-Medium¹ (Experiments in Molecular Genetics, Cold-Spring Harbor. "20 Labs, Cold .Spring Harbor, New York (1972)) wachsen, welches 10 μ^'/ΐηΐ Ampicillin enthält* Das gewünschte Plasmid wird als pSOM7A 2 bezeichnet, und dieses Plasmid wird für die im folgenden beschriebenen Aufbaumethoden verwendet.

D. .- Aufbau des Plasmids pTrp2 4

1. Aufbau eines Genfragments aus Codonen für die Distalbereiche des LE¹-Polypeptids mit den Restriktionsstellen BgIII bzw. EcoRI an den Enden 5' bzw. 3' des Codieqn . ·

⁰^ rungsstrangs ·

Man verdaut das Plasmid pSOM7A 2 zuerst mit Hindi11 und dann· mit A.-Exonuc'lease (einer 5¹- bis 3 ' -Exonuclease) unter solchen Bedingungen, daß sich eine Verdauung/nach der ¹^ ' BgIII Restriktionsstelle, im LE'-Codierungsbereich ergibt. Man löst -etwa 20 ^g von mit Hindlll verdautem pSOM7A2 in einem entsprechenden Puffer (20 mM Glycinpuffer, pH 9,6, 1 mM MgCl^, 1 mM' ß-Mercapfoethanol). Das.erhaltene Gemisch

ν - 20 - :.

] wird 60 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 Einheiten λ-Εχο-nuclease behandelt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird dann mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und anschließend, in Ethanol gefällt. .. ' ·

',. Zur" Bildung eines Rests EcoRI am distalen Ende des LE'-

¹ 3 2

Genfragments synthetisiert man einen Primer pCCTGTGCATGAT unter Anwendung der verbesserten Phosphotriestermethode (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75:5765 (1978).) und. hybridisiert

]Q das Ganze dann an das einzelsträngige Ende des durch Verdauung mit X-Exonucl'ease erhal'tenen LE.'-Genf ragments. Zur Hybridisierung löst man 20 ^g des mit X-Exonuclease behandelten Hin_dIII-Verdauungsprodukts des.Plasmids pSOM7A2 in 20 μΐ Wasser und vereinigt die erhaltene.Lö-

]5 . sung mit 6 μΐ einer Lösung, die etwa 20 pico-Mol des oben beschriebenen 5'-phosphqrylierten Oligonucleotids enthält. Das synthetisierte Fragment -wird an das 3'-Ende der. LE¹-Codierungssequenz hybridisiert, und.der verbleibende einzelsträngige Anteil des LE'-Fragments "wird mit Klenow-Polymerase I unter Verwendung von dA.TP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Bei Klenow-Polymerase I handelt es sich um ' das'durch proteo.lytische Spaltung von DNA-Polymerase I er-',. hai tene Fragment. Es verfügt über die 5' -*· 3' -Polymerisa- -tionsaktivität, die 3' ♦ 5'-exonucleolytische Aktivität, nicht jedoch über die 5\ -* 3'-exonucleolytische Aktivität • des Stammenzyms (Kornberg, Verlag W.H. Freeman und Co., SFO,. 98 (.1974) ) . .. , , .

. Zur Durchführung obiger Umsetzung erwärmt man das Reaktionsgemisch auf 5O⁰C.und läßt es.dann langsam auf 1O⁰C abkühlen, worauf man 4 μΐ Klenow-Enzym zugibt.· Das Ganze wird zuerst 15 Minuten bei Raumtemperatur und dann 30 Mi-. nuten bei 37°C bebrütet, .worauf man.die Reaktion durch

" Z.ugabe von 5 μΐ 0,25 molarer SDTA unterbricht. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol extrahiert, mit ,.Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefäl'lt. Im Anschluß daran spaltet man- die DNA mit dem Restrikt-ionsenzym BgIII und ; trennt die Fragmente unter Anwendung der PAGE-Methode auf.

' Ein vom Gel erhaltenes Autoradiogramm ergibt ein mit .P markiertes Fragment mit der erwarteten Länge von etwa 470 bp, das durch Elektroelution gewonnen wird. Dieses Fragment LE' (d) hat, wie bereits erwähnt, ein Bglll-Endstück und ein stumpfes Ende, das mit dem Anfang des·Primers zusammenfällt.

2. Aufbau des Plasmids pTh&l

Zum Aufbau des Plasmids pTHccl inseriert man ein synthetisiertes Gen für Thymosinc61 in das Plasmid pBR322. Die Synthese der für Tymosinctl codierenden DNA besteht in einer Synthese und anschließenden Verknüpfung der 16 Oligonucleotide (T, bis T,,), die in Fig. 7 der Zeichnung

"15 durch Doppelpfeile angegeben sind. Am N-terminalen Ende wird ein Met Coden ATG inseriert, und die 5',-Endstücke sind mit einsträngigen kohäsiven Enden versehen, um eine Anbindung an Plasmide zu erleichtern, die mit EcoRl und BamHl gespalten werden. Die Stelle BgIII im Zentrum des Gens unterstützt dabei selbstverständlich die Analyse der rekombinierenden Plasmide.

Die Oligodesoxyribonucleotide T, bis T,, werden unter Anwendung der modifizierten Phosphotriestermethode und Einsatz vollständig geschützter Tridesoxyribonucleotid-Aufbaublöcke synthetisiert (Science 198: 1056 (1978)., Proc. Nat. Acad. Sei, USA 75: 5765 (1978)). Die verschiedenen Oligodesoxyribonucleotide gehen aus der folgenden Tabelle.

I hervor

30

- 22 -

- TABELLE Γ

Synthetische Oligonucleotide "für das Thymosinal-Gen

Ver bindung	Sequenz, - t	Länge	HPLC-Analyse Retentions-; zeit (min)*
Ti	A-A-T-T-C-A-T-G-T-C	10	17,4
T2	T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A	15j	24,3
T3	T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A	12	20,3
T4 V	G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A	13	22/0·
T5	G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G	15	24,8
T6	G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C1-A	12	20,1
T7	A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A	13	22,6
T 8	A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T	12	.20,2
T 9	G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G	12	.20,4.
m 10 .	A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T	12	21,1
: tii '	G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T	. 12 .	20,5
T12	G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G . /_	12	2O',4
T13	c_j-t-c-t-t-c-t-c-c-t-t	12	19,9
T 14 ·.	T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C'	12	20,5
m 15	G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C	12	20,2
	G-A-T-C-C-T-A-T-T-A	10 ,	17,2 .

*) Bei Umgebungstemperatur

.Die obige Synthese wird anhand des folgenden Herstellungsbeispiels für das Fragment T-* _r erläutert, und dieses Verfahren geht aus Fig. 8 der Zeichnung hervor. Die zur Synthese von T,_ verwendeten verschiedenen Nucleotidfragmente sind in dieser Figur durch Zahlen bezeichnet. Die darin enthaltenen Abkürzungen haben folgende Bedeutungen:

TPSTe = 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazol

BSA = Benzolsulfonsäure , · '

TLC = Dünnschichtchromatographie -

HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

-.23 -

DMT = 4,4"'-Dimethoxytrityl

CE .= 2-Cyanoethyl '

R = p-Chlorphenyl Bz = Benzoyl An = Anisoyl

iBu = Isobutyryl ' ^;

Py = Pyridin AcOH = Essigsäure Et-,Ν = Triethylamin.

Die vollständig geschützten Tridesoxyribonücleotide 4 (85 mg, 0,05 mMol) und 2 (180 mg, 0,1 mMol) werden an den in Stellung 5' befindlichen Hydroxylgruppen durch Behandlung mit 2 %-iger BSA in einem Lösungsmittelgemisch aus 7 Vol.-Teilen Chloroform und 3 Vol.-Teilen Methanol (10 ml bzw. 20 ml) über eine Zeitdauer von 10 Minuten bei 0⁰C von den Schutzgruppen befreit. Die Umsetzungen werden durch Zugabe von gesättigtem wäßrigen Ammoniumbicarbonat (2 ml) beendet,'worauf man das Ganze mit Chloroform (25 ml) extrahiert und dann mit Wasser (2 χ 10 ml) wäscht. Die organischen Schichten werden getrocknet (Magnesiumsulfat), auf geringe Volumina (etwa 5 ml) eingeengt und durch Zugabe von Petrolether (Siedebereich 35 bis 60⁰C) ausgefällt. Die farblosen Niederschläge werden abzentrifugiert und in einem Exsikkatior unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 6 bzw. 8 gelangt, und hierbei handelt es sich aufgrund einer dünnschichtchromatographischen Untersuchung unter Verwendung von Siliciumdioxidgel jeweils um homogene Produkte (Merck 6 0 F254, Chloroform/Methanol, 9:1).

Die Trimeren 1 und 3 (270 mg, 0,15 mMol bzw. 145 mg, 0,075 rnMol) werden in ihre Phosphodiester (5 bzw. 7) überführt, indem man sie mit Gemischen aus Triethylamin, Pyridin und Wasser (1 : 3 : 1, Vol./Vol., 10 ml) über eine Zeitdauer ' von 25 Minuten bei Umgebungstemperatur behandelt. Die Reagenzien werden in einem Rotationsverdampfer entfernt und die Rückstände durch wiederholte Verdampfungen mittels wasserfreiem'Pyridin (3 χ 10 ml) getrocknet. Das Trimere 8

. (O,05 mMol) und das Trimere 7 vereinigt man mit TPSTe (50 mg, 0,15 mMol) in wasserfreiem Pyridin (3 ml), worauf man das Reaktionsgemisch:bei Umgebungstemperatur 2 Stunden unter Vakuum stehen läßt. Eine anschließende dünnschichtchromatographische Analyse zeigt, daß hiernach 95 % des · Trimeren 8 in das hexamere Produkt umgewandelt worden sind (was durch Sichtbarmachung der DMT-Gruppe durch Be-^>: sprühung mit 10 %-iger wäßriger Schwefelsäure und Erwärmen auf 60°C gezeigt wird). Die Reaktion wird durch Zugabe von Wasser (1,0 ml) abgebrochen und das Lösungsmittel dann unter verringertem Druck eingedampft. Das nach Entfernen , des Pyridins durch gleichzeitige Verdampfung mit Toluol erhaltene Hexamer wird in der Stellung 5' unter Verwen-.; dung von 2 %-iger^BSA (8 ml) in der oben bereits für die Trimeren 4 und 2 beschriebenen Weise von den Schutzgruppen, befreit. Das Produkt (10) wird unter Verwendung einer

. ". . mit Siliciumdioxidgel gefüllten Säule (Merck 60 H, 3,5 χ 5 cm)' und Anwendung einer stufenweisen Gradientenelution mit;Chloroform/Methanol (98 : 2 bis 95 : 5, V/V) gereinigt.

20. Die jenigen Fraktionen, die das gewünschte Produkt 10 ent-. halten, werden zur Trockne eingedampft.

In ähnlicher Weise kuppelt"man auch das Trimer 5 an das Trimer. 6 und reinigt das erhaltene vollständig geschützte Produkt dann direkt über Siliciümdioxidgel. Sodann wird

. die erhaltene Verbindung an ihrem Endstück 3' unter Ver-' wendung von Triethylamin, Pyridin und Wasser in der oben beschriebenen Weise von den Schutzgruppen befreit, wodurch man zum Fragment 9 gelangt

-.. - -·, . .

Abschließend kuppelt man die Hexameren 9 und 10 in wasserfreiem Pyridin (2.ml) unter Verwendung von TPSTe (75 mg, ' 0,225,mMol) als Kondensationsmittel. Nach beendeter Kon-. ' .densation (4 Stunden, Umgebungstemperatur) wird das Reaktionsgemisch auf einem Rotationsverdampfer eingedampft und der Rückstand über Siliciümdioxidgel chromatographiert. Das durch Ausfällung mit Petrolether erhaltene Produkt 11 (160 mg) erweist sich im Dünnschichtch'romatogramm als ho-

-.25 -

mögen. Einen Teil der Verbindung 11 (20 mg) in Pyridin (0,5 ml) befreit man durch Behandlung mit konzentriertem' Ammoniumhydroxid (7 ml, 8 Stunden, 60⁰C) und anschließende Behandlung in 80 %-iger Essigsäure (15 Minuten, Umgebungstemperatur) vollständig von den Schutzgruppen. Der nach Verdampfen der Essigsäure erhaltene feste Rückstand wird in 4 %-igem wäßrigem Ammoniumhydroxid '(VoLZVoI..,

' 4 ml) gelöst und mit Ethylether (3x2 ml) extrahiert.

Die wäßrige Phase wird auf 1 bis 2 ml eingeengt, und eine Teilmenge davon unterzieht man zur Reinigung der Verbindung 12 einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Die dem überwiegenden Maximum entsprechenden Fraktionen werden zusammengefaßt (etwa 2,0 Einheiten mit einer optischen Dichte von 254) und auf ein Volumen von etwa 5 ml eingeengt. .Das erhaltene Endprodukt 12 wird unter Verwendung von Biogel P-2 (1,5 χ 100 cm) und Elution mit 20 %-igem wäßrigem Ethanol von Salz befreit, worauf man das Ganze zur Trockne eindampft und wieder in Wasser (200 μΐ) suspendiert und so zu einer Lösung von A-C₄ ⁼ 10 gelangt. Die Sequenz der Verbindung 12 wird durch zweidimensionale Sequenzanalyse bestätigt. '

Das vollständige Thymosinal-Gen wird aufgebaut aus 16 synthetischen Oligonucleotiden unter Anwendung der Methoden, wie sie im einzelnen beschrieben sind' für Somatostatin (Sei. 198:1056 (1977)), Insulin (Proc. Nat. Acad. Sei.. USA 76:106 (1979)) und Wachstumshormon (Nature 218:544 (1979)). Eine Menge von 10 μg der Oligonucleotide T₀ bis

-32-T₁J. phosphoryliert man quantitativ mit /_t~ P-Z-ATP (New

England 'Nuclear') ·in Gegenwart von T. Polynucleotidkinase (Proc.' Nat.. Acad. Sei. USA 76:106 (1979)), wodurch man zu. spezifischen Aktivitäten von etwa 1 CiZrnMol gelangt. Radiomarkierte Fragmente werden durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 20 %-igem Polyacrylamid und 7 Mol Harn- or . ,'

. stoff gereinigt, und die. Sequenzen der eluierten Fragmente werden durch zweidimensionale ElektrophoreseZHomochromatographie (Nucleic Acids Res. 1: 331 (1974)) von SchnekkenvenomteilVerdauungsprodukten bestätigt. Die Fragmente

- 26 - .

T, und T,, werden nicht phosphoryliert, um so eine unerwünschte Polymerisation während anschließender Verknüpfungsreaktionen möglichst gering zu halten. Diese Oligonucleotide (2 ^g jeweils) werden in vier Gruppen aus jeweils vier Fragmenten (siehe Fig. 9 der Zeichnung) durch · T. DNA-Ligase unter Anwendung bekannter Methoden zusammengefaßt (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76:106 (1979)). Die. Reaktionsprodukte werden durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 15 %-igem Polyacrylamidgel, das 7 Mol Harnstoff enthält, gereinigt (Proc. Nat. .Acad. Sei. USA 71: 3455 (1977)). Die vier isolierten Produkte werden miteinander verbunden., und das erhaltene Reaktionsgemisch wird elektrophoretisch unter Verwendung von 10 %-igem Polyacrylamidgel aufgetrennt. Durch Elektroelution gewinnt man dann DNA im Größenbereich des Thymosin<aol-Gens (90 bis 105 Basenpaare).

Man behandelt das Plasmid pBR322 (0,5 μg) mit BamHI und EcoRI Restriktionsendonucleasen und trennt die Fragmente durch Elektrophorese mittels Polyacrylamidgel auf. Das große Fragment wird vom Gel durch Elektroelution gewonnen und dann.an synthetische DNA (Nature 281:544 (1979)) , gebunden. Mit dem so erhaltenen Gemisch transformiert man dann Escherichia coli K12 Stamm 29 4, ATCC Nr. 31446. 5 % ' des" Transformationsgemisches gibt man dann auf LB-Platten., die 20 μ9/ΐη1 Ampicillin enthalten. Die erhaltenen vier ampicillxnresistenten Kolonien sind gegenüber Tetracyclin sensitiv, was zeigt, daß eine Inserierung in das. Gen für die Tetracyclinresistenz erfolgt ist. Eine Analyse der Plas.mide aus diesen vier Kolonien zeigt, daß das Plasmid, welches als pThal bezeichnet wird, jeweils enthält (a) eine BqIII.Stelle, 'die im pBR322 selbst nicht zu finden ist, was auf die Anwesenheit des' Thymosin(Xl-Gens gemäß Fig. hinweist, und (b) ein Fragment mit etwa 105 Basenpaaren-, d_as durch BamHI/EcoRI Spaltung gebildet worden ist. Der ' Aufbau des Plasmids pThCtL (nicht maßstabsgetreu), geht aus Fig. 9 der Zeichnung hervor, in welcher die starken Punkte die in Stellung 5' befindlichen Phosphatgruppen an-

- 27 geben-

3. Umsetzung von behandeltem pThal mit dem Fragment LE'(d)

Das Plasmid pThal enthält ein Gen, das für die Ampicillinresistenz spezifisch ist, und ein Strukturgen, welches für' Thymosinal spezifisch ist, und dieses ist an seinem in Stellung 5' befindlichen Codierungsstrangende an eine Stelle EcoRI und an seinem in Stellung 3' befindlichen Ende an eine Stelle BamHI geklont. Das Thymosingen enthält ebenfalls- eine Bglll-Stelle. Zur Bildung eines Plasmids, das zur Aufnahme des in obiger Weise hergestellten LE.¹ (d) Fragments befähigt ist, verdaut man pThal mit EcoRI und' unterzieht das Ganze dann einer Klenow-Polymerase I-Reaktion mit dTTP und dATP zum Abstumpfen.der Reste EcoRI.

Durch anschließende Verdauung des erhaltenen Produkts mit BgIII ergibt sich ein lineares DNA-Fragment, das das Gen für die Ampicilliriresistenz enthält und das an seinen entgegengesetzten Enden über einen klebrigen Rest BgIII und ein stumpfes Ende verfügt.. Das erhaltene Produkt laßt sich wieder zu einem Ring schließen, indem man es mit dem LE¹ (d)-Fragment, das ein.klebriges Ende BgIII und ein stumpfes Ende enthält, in Gegenwart von T.-Ligase umsetzt, wodurch man zum Plasmid pTrp24 gelangt. Auf diese Weise wird an der Stelle, an der es zu einer Verknüpfung des stumpfen Endes kommt, wieder eine Stelle E_coRI gebildet.

E. -Aufbau des Plasmids pSOM7A2A4

Durch aufeinanderfolgende Verdauung von pTrp24 mit BgIII und EcoRI, anschließende Umsetzung nach der PAGE-Methode und Elektroelution gelangt man zu einem Fragment, das Codone aufweist für das LE¹ (d) Polypeptid mit einem klebrigen Ende BgIII und einem klebrigen Ende EcoRI, das sich an dem 3'-Codierungsende befindet. Das LE' (d)-Fragment kann in die- Stelle BgIII des Plasmids pSOM7A2 geklont werden, wodurch ein LE'-Polypeptid/Somatostatin-Fusionsprotein gebildet wird, das unter Steuerung durch den Tryptophanpro-

T motor/Operator exprimiert wird. Zu diesem Zweck braucht man (1) eine EcoRI-Teilverdauung von pSom7A2 zur Spaltung der distal zum Tryptophanpromotor/Operator angeordneten Stelle EcoRI und (2) eine geeignete Auswahl der Primär-.5 sequenz zur sauberen Beibehaltung des Codonleserahmens und. zur erneuten ,Bildung einer EcoRI-Spaltsteile.

Im einzelnen verdünnt man hierzu 16 μς des Plasmids . .' . pSom7A 2 in 200' μΐ eines Puffers aus 20 jM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl₀, 0,0'2 NP4 0 Detergens und 100 mM NaCl und behandelt das Ganze, dann mit 0,5 Einheiten EcoRI. Nach 15 Minuten langer Umsetzung bei 37°C wird das Reaktionsgemisch mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt, worauf man .das Ganze mit BgIII verdaut. Das größere.erhaltene Fragment wird unter Anwendung der PAGE-Methode isoliert und dann e^ner Elektroelution . unterzogen. Dieses Fragment enthält die Codone LE' (p) für das proximale Ende des LE'-Polypeptids, nämlich die Codone, die nach der Stelle BgIII folgen. Sodann knüpft man dieses Fragment in Gegenwart von T^ DNA-Ligase an das . obige LE¹ (d)-Fragment', wodurch man zum Plasmid pSom7A2A,4 gelangt, welches nach Transformation in Escherichia coli Stamm 294 unter Steuerung durch den ' Tryptophanpromotor/ " Operator in ausreichender Menge ein Fusionsprotein bil'det, das aus dem völlig wiederhergestellten LE-Polypeptid und Somatostatin besteht.

F., , Aufbau von linearer DNA mit einem Rest Pstl am Ende 3' und einem Rest BgIII am Ende 5' unter Bindung eines eine Tetracyclinresistenz ergebenden Gens

Man verdaut das Plasmid pBR322 mit Hindlll und verdaut die herausstehenden Enden Hindlll dann mit Sl-Nuclease. Die Verdauung mit Sl-Nuclease besteht in einer Behandlung von ίο yg, von mit Hindlll gespaltenem pBR322 in 30 μΐ Sl-Puffer (0,3 M' NaCl, 1 mM ZnCl₂, 25 mM Natriumacetat, pH 4,5) mit 300 Einheiten Sl-Nuclease über e^ine Zeitdauer von 30 Minuten bei 15°C'. Die. Umsetzung wird durch Zugabe von 1 μΐ

30 χ Si-Nucleaseunterbrechungslösung {0,8 M Trisbase, 50 mM EDTA) gestoppt. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und dann in der beschriebenen Weise mit EcoRI verdaut. Das nach Anwendung der PAGE-Methode und durch anschließende Elektroelution erhaltene Fragment hat ein klebriges Ende EcoRI und ein stumpfes Ende, dessen Codierungsstrang mit dem Nucleotid Thymidin beginnt. Der mit Thymidin beginnende und mit Sl verdaute Rest Hindlll kann'an einen durch Behandlung mit Klenow-Polymerase I erhaltenen Rest BgIII gebunden werden, wodurch nach entsprechender Verknüpfung die "Bglll-RestriktionsstelIe wieder gebildet wird.

Das gemäß Beispiel 1 C. hergestellte Plasmid pSOM7A 2 wird

. /

daher mit BgIII verdaut, worauf man die erhaltenen klebrigen Enden BgIII durch Behandlung mit Klenow-Polymerase I unter Verwendung aller vier Desoxynucleotidtriphos'phate ⁽ doppelsträngig macht." Durch Spaltung des erhaltenen Produkts mit EcoRI und anschließende Behandlung des' kleinen Fragments unter Anwendung der PAGE-Methode und Elektroelution gelangt man zu einem linearen Stück an DNA, das den Tryptophanpromotor/Operator enthält und für die proximale LE'-Sequenz codiert, die sich nach der Stelle BgIII (LE' (p)) befindet. Das erhaltene Produkt hat ein Ende EcoRI und ein stumpfes Ende, das vom Auffüllen an der Stelle Bg_l_ I I herrührt. Die Stelle BgIII wird jedoch durch Verknüpfung des Stumpen Endes mit dem stumpfen Ende des oben erwähnten und mit Sl verdauten HindiII-Fragments wieder aufgebaut. Die zwei Fragmente werden daher in Gegenwart von T. DNA-Ligase miteinander verknüpft, wodurch man zum rezirkularisierten Plasmid pHKYlO gelangt, das durch Transformation in leistungsfähige Zellen des Stammes 294 von Escherichia coli propagiert wird. Die tetracyclinresistenten Zellen, die das rekombinierende Plasmid pHKYlO enthalten, werden selektiert, und das Plasmid DNA wird extrahiert. Durch -Verdauung mit BgIlI und Pstl und anschließende Isolierung des großen Fragments unter Anwendung der

. · ^v - 30 -

PAGE-Methode und der Elektroelution gelangt man zum gewünschten linearen Stück der DNA mit den klebrigen Enden Pstl und BgIII.. Dieses in der angegebenen Weise aus pHKYlO hergestellte DNA-Fragment enthält den Replikations-Ursprung und eignet sich daher als Komponente zum Aufbau des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ/ bei welchem die Gene, die sowohl für das trp¹ LE¹ 'Polypeptidverschmelzungsprotein als auch die Tetracyclinresistenzcodieren, durch den trp Promoter/Operator gesteuert werden.

;' ,

G.* Aufbau von linearer DNA, die den Trp Promotor/Opera-

, , tor enthält ,

Das- gemäß Beispiel IE hergestellte Plasmid ρεθΜ7Δ2Δ4 unterzieht man einer Teilverdauung mit EcoRI und. einer anschließenden Verdauung mit Pstl. Das erhaltene Fragment, , das den trp Promotor/Operator enthält,:wird unter Anwendung der PAGE-Methode und durch anschließende Elektroelution isoliert . Die Teilverdauung mit EcoRI ist für die Bildung eines Fragments notwendig, das neben dem Ende 5¹' des Somatostatingens gespalten wird, jedoch nicht, gespalten wird,an der Stelle EcoRI, .die sich zwischen dem Gen für die Ampicillinresistenz und dem trp Promotor/Operator befindet. Die durch den Schnitt mit Pstl im Gen für die. .Ampicillinresistenz verlorengegangene Ampicillinresistenz läßt sich:durch Verknüpfung.mit dem fertigen, pHKYlO linearen DNA-Derivat wieder herstellen, das, gemäß obigem Bei^w spiel IF. gebildet worden ist.

H. Isolierung des Strukturgens für die Α-Kette von In-' sulin ₍' . ' -

Das Strukturgen für die Α-Kette von Insulin wird hergestellt durch Verdauung des Plasmids pIAl mit EcoRI und BamHI., und der Aufbau des hierzu benötigten Plasmids wird in Ptoc. Nat. Acad. Sei. USA 76:106 (1979) beschrieben. Das gewünschte Fragment wird unter Anwendung der PAGE-Methode' und durch Elektroelution gereinigt, und es verfügt

über die Endstücke EcoRI und BamHI.

I. Gegenseitige Verknüpfung des Strukturgens für die Α-Kette von Insulin, des Trp Promotors/Operators und des pHKYlO linearen DNA-Fragments mit den Enden Pstl und BgIII

Man verknüpft das Strukturgen der Α-Kette von Insulin, das lineare DNA-Fragment, welches den trp Promotor/Operator enthält (hergestellt gemäß Beispiel 1,G)- und das pHKYlO lineare DNA-Fragment.(hergestellt gemäß'Beispiel IF) in geeigneter Orientierung miteinander, wie dies im einzelnen aus Fig. 1 der Zeichnung hervorgeht, wodurch man zum gewünschten Plasmid ρΙΑ7Δ4Δΐ gelangt- Das Plasmid ρΙΑ7Δ 4Al läßt sich ohne weiteres selektieren, da es wieder über eine Ampicillinresistenz und eine Tetracyclinresistenz verfügt.' ,

Beispiel 2

Aufbau des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ

Zum Aufbau des gewünschten Plasmids geht man wie in Beispiel IA bis I beschrieben vor, wobei man für die abschließende Verknüpfung hier jedoch das Strukturgen für die B-Kette von Insulin verwendet und nicht, das Strukturgen für die Α-Kette von Insulin. Zur Herstellung des Strukturgens für die B-Kette von Insulin unterzieht man das Plasmid pIBl, dessen Aufbau in Proc. Nat. Acad. Sei.

USA 76:106 (1979) beschrieben wird, einer Verdauung mit EcoRI und BamHI. Das den Code für die B-Kette von Insulin tragende DNA-Fragment wird unter Anwendung der PAGE-Methode und durch Elektroelution gereinigt und' weist die Enden EcoRI und BamHI auf.

' . '

Das Plasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ geht aus Fig. 2 der Zeichnung hervor, und es läßt sich infolge seiner wiederhergestellten . Air.picillinresistenz und Tetracyclinresistenz ohne weiteres

: - 32 -

selektieren.

B e i s ρ i e 1 3 \ Aufbau des Plasmids. pPR3 . .

A. .. Isolierung'eines -^2.5 kb BgIII Restriktionsfragments , . des Bakteriophags λ., das Gene fürcl, rex und einen Teil von cro enthält ,

ίο. - '' .;/ · ' .' ' Die verschiedenen BgIII Restriktionsstellen im Bakteriophag A-CI857 und eine einzelne BamHI Restriktionsstelle im Plasmid ρΙΒ7Δ4Δ1 ermöglicht eine Klonierung der Bakteriophagf ragmente in den Klonierungsvekto.r ρΙΒ7Δ 4Δ1 . Das Bakteriophag Xci857 enthält sechs Stellen, die gegenüber BgIII sensitiv sind. Eines der Fragmente BgIII enthält 2,5 kb unter Einschluß des Gens λ-cl und ferner auch des Gens Xrex (Gene 7:217 bis 280 (1979) und Genetic Maps, Band 1-, NIH, (1980 ) ,Verlag 0' Brien). Die Fragmente BgIII enthalten 5'-Extensionen mit der Sequenz GATC, die komplementär sind zu den 5'-Extensionen an den Fragmenten BamHI. Das Humaninsulihplasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ enthält eine einzelne Stelle, die durch BamHI gespalten wird. Eine Klonierung in die Stelle BamHI führt zu einer Inaktivierung des Gens für die Tc-Resistenz, das am ρΙΒ7Δ4Δ1 getragen wird. Die Verknüpfung von BgIII Fragmenten mit BamHI"Fragmenten führt

AGATCC GGATCT zu Rekombinanten mit den Sequenzen _TCTAGG oder _CCTAGA ^an den Verbindungsstellen. Diese Sequenzen werden durch BgIlI oder BamHI nicht gespalten. Durch Restriktion mit beiden Enzymen kommt es daher zu einer ,Eliminierung aller Verknüpfungsprodukte mit Ausnahme derjenigen, bei denen ein Xoglll-Fragment an die Stelle BamHI von ρΓΒ7Δ4Δΐ gebunden ist. . ·'

3- Entsprechende Restriktionsenzyme sind von den in Beispiel IA angeführten Firmen erhältlich, und sie werden unter.Anwendung bekannter Methoden eingesetzt. Darüber hinaus liefern auch die Hersteller zusätzliche Instruktionen. Hier-

- 33 nach wird das Bakteriophag^.cl857 sus S_ DNA bei 37 ⁰C in einem Reak-

tionsgemisch vollständig restriktiert, das 100 μ9 DNA, , 12 mM Tris.HCl, pH 7,5, 12 mM MgCl₃, 12 mM 2-Mercaptoethanol und 100 Einheiten (in einem Volumen von 1 ml) BgIII Restriktionsenzym enthält. Die Restriktionsfragmente werden durch Agarose-Gel-Elektrophorese (im folgenden abgekürzt als AGE bezeichnet) aufgetrennt. Die aufgetrennten Fragmente werden im Gel durch Anfärben mit Ethidiumbromid und Sichtbarmachung von fluoreszierenden Banden mit einem Ultraviolettlicht lokalisiert. Das interessierende ~2.5 kb Fragment wird aus dem Gel ausgeschnitten und -nach den Angaben des Beispiels IA in TBE elektroeluiert. Die wäßrige Lösung wird aus dem Dialyseschlauch gesammelt und über eine DEAE-Cellulosesäule * (0,5 ml Whatman DE52) geführt, ." die mit einem Äquilibrierungspuffer (0,1 m KCl, 10,0 mM Tris-HCl, pH 7,8) äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit 2,5 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen und die DNA (etwa 5 μg) mit 1,5 ml Elutionspuffer (1 M NaCl, 10. mM Tris.HCl, pH 7,8) eluiert. Das Eluat wird bezüglich der

Na -Ionenkonzentration auf eine Molaritat von etwa 0,35

eingestellt, worauf man die DNA durch Zugabe von 2 Volumina (etwa 9 ml) 100 %-igem Ethanol und anschließende 16 Stunden lange Abkühlung auf -2O⁰C ausfällt. Der Niederschlag an DNA wird durch Zentrifugieren pelletisiert, mit 75 %-igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Die Isolierung des DNA-Fragments erfolgt durch die AGE-Methode, Elektroel'ution, DEAE-CeIlulosechromatographie und Ausfällung mit Ethanol nach dem oben beschriebenen Verfahren. Die erhal- - tene DNA wird wieder in TE-Puffer gelöst (1 mM EDTA, 10 _:

mM Tris.HCl, pH 7,8).

*) Die benötigte DEAE-Cellulosesäule und DE52 sind erhältlich von Whatman Inc., 9 Bridewell· Place, Clifton, New Jersey 07Ό14, V.St.A.

-

.- '·. . -. 34 - .·..- . ;

B. . Verdauung des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ mit dem Restriktionsenzym BamHI

Das Plasmid. ρΙΒ7Δ4Δ1; wird bei 37°C in einem 50 μΐ Reaktionsgemisch vollständig restriktiert, das 20 mM Tris.HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 7mM MgCl-, 2 mM 2-Mercaptoethanol' und ,10 Einheiten BamHI-Restriktionsendonuclease enthält.

C. ; Bindung des Fragments XcI mit den Enden BgIII an TO das mit BamHI verdaute ρΙΒ7Δ4Δΐ . ·

Die Verknüpfung mit T, DNA-Ligase"wird in 100 μΐ eines Rea*ktionsmediums aus etwa T>,4 μg 2.5 kb BgIII Fragment (hergestellt gemäß Beispiel 3A), etwa 1,5 μg mit BamHI restriktiertem pIB,7A4Al (hergestellt gemäß Beispiel 3B), ' . 50 mM Tris.HCl, pH 7,8, 10 mM Dithiothreit, 5 % Glycerin, 10 mM MgCl₂, 0,ImM ATP und 0,1 Einheiten T₄ DNA-Ligase durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird 18 Stunden bei 4°C bebrütet, worauf man die Umsetzung durch 5 Minuten langes Erwärmen auf 65⁰C beendet. Das auf diese Weise hergestellte Plasmid pPR3 Wird bis zur späteren Verwendung bei einer Temperatur von 4⁰C aufbewahrt.

B e i s ρ i e 1 4

Transformation des Plasmids pPR3 in Escherichia coli K12

Frische, über Nacht gebildete Kulturen von Escherichia co-Ii K12 C600R, -M, - (Proc. Nat. Acad. Sei. 71: 1030 bis 1034 (1974)) unterteilt man in 1 :. 10 -Subkulturen in frischer L-Brühe (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor,New York'(1972) von Miller) und läßt sie 1 Stunde bei 37°C wachsen. Die hiernach insgesamt geernteten 660 Klett-Einheiten an Zellen werden mit.2,5 ml 100 mM Natriumchlorid gewaschen, in 150 mM Calciumchlorid mit 10 % Glycerin suspendiert und 20 Minuten bei Raumtemoeratur bebrütet. Die Zellen werden durch Zen-

trifugieren geerntet, in 0,5 ml CaClp-Glycerin resuspendiert, 3 bis 5 Minuten auf Eis abgeschreckt und dann eingefroren. Die Zellsuspensionen werden bis zum Gebrauch in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Durch diese Konservierung und Aufbewahrung kommt es zu keiner Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit oder Häufigkeit der Transformation durch kovalent geschlossene zirkuläre DNA. Die Zellen werden in einem Eisbad aufgetaut und in einem Verhältnis von 0,1 ml Zellen zu 0,05 ml DNA (5 μΐ pPR3), hergestellt gemäß Beispiel 3C und verdünnt mit 45 μΐ 0,1X-SSC /Standard Kochsalzcitrat/) vermischt.,'Die auf diese Weise hergestellten Proben werden 20 Minuten auf Eis abgekühlt, 1 Minute einem Wärmeschock von 42°C unterzogen, weitere 10 Minuten"auf Eis abgekühlt, mit 0,85 ml L-Brühe verdünnt, 2 Stunden,bei 32°C bebrütet, auf L-Agar (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New

9 York (1972) von Miller) mit etwa 1 χ 10 an jeweils XKH54hX und AKH54h80 (Science 196: 182 (1977)) aufgetragen und bei 32°C bebrütet. Die Transformanten werden hinsichtlich ihrer Immunität gegenüber den Bakteriophagen y\KH54hX und \.KH54h80 bei 32⁰C selektiert. Durch entsprechende Untersuchung der Rekombinanten ergibt .sich eine Ap^r, Tc^S, XKH54h\ und \KH54h80 Immunität bei. 32°C und ei-· ne XKH54hX und "XKH54h80 Sensitivität bei 42°C. Ein Transformant wird selektiert und als Escherichia coli K12 C600R -M -/pPR3 bezeichnet. Diese überlebende Kolonie wird bezüglich der erwarteten Phenotypen untersucht und zur Vermehrung und Isolierung des aufgebauten rekombinierenden Plasmids pPR3 verwendet. Durch Restriktionsenzymanalyse des Plasmids pPR3 ergibt sich, daß nicht das Gen \c_I, sondern das Gen Xrex am nächsten zum Gen trp E für die B-Kette des Insulins liegt. ' . '^

Beispiel 5 .

Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPR3

Das Plasmid DNA von Escherichia coli Kl2 C600R -M -/ppR3

wird mit Chloramphenicol vermehrt und nach dem sogenannten geklärten Lysatverfahren (J. Mol. Biol. 36:185 bis 194 ₍( 1:968)) isoliert. Die kovalent geschlossene zirkuläre DNA wird durch Gleichgewichtsultrazentrifugierung in ' CsCl

,5 und Propidiumdiiodid gereinigt. Das Propidiumdiiodid wird mit 2-Propanol extrahiert, und die erhaltene DNA wird bei^; -2O⁰C in CsCl aufbewahrt. Entsprechende Arbeitslösungen der DNA werden durch Chromatographie mittels Sephadex (PDlQ*)-Säulen in SSC/10-Puffer (0,015 M NaCl, 0,0015 M

,10 Natriumeitrat, pH 7,5) ausgetauscht.

* )..' Erhältlich von Pharmacia, 800 Centennial Ave, Piscataway, New Jersey Ό8851, V.St.A.

B e i s ρ i e 1 6 , '

Aufbau des Plasmids pPRl2

A. Isolierung eines Gens Ticl, das lineare DNA mit En-. . , ' den Psti und, Hindi enthält.

. Man löst etwa 70 μg des Plasmids pPR3 (isoliert unter Anwendung des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens,) in 70 μΐ 1OX Pstl-Puffer (200 mM Tris.HCl, pH 7,5, 100 mM . MgCl₂, 500 mM .(NH₄) ₂'SO₄) , 50 μΐ (1 mg /ml). BSA (Rinderserumalbumin) und 555 μΐ H_O und bebrütet das Ganze etwa 15 Minuten bei 65°C. Sodann gibt man etwa 25 μΐ Restriktionsenzym P'stl (1 Einheit/μΐ) zu und bebrütet das erhaltene Gemisch etwa 4,5 Stunden bei 37°C. Hierauf werden die erhaltenen Pstl-Restriktionsfragmente unter Anwendung der AGE-Methode in üblicher Weise isoliert. Im Plasmid pPR3 sind zwei Pstl-Restriktionsstellen vorhanden, so daß eine vollständige Verdauung von Pstl zu einem ~3.6 kb Fragment und ferner auch zu einem ~4.2 kb Fragment führt. Das letzte Fragment enthält das interessierende Bakteriophag XcI Gen. Das ^4.2 kb Fragment wird daher in der oben beschriebenen Weise gewonnen. Das erhaltene DNA-Pellet, wel-, ches das' gewünschte 4.2 kb Restriktionsfragment enthält,

' 1 wird in 50 μΐ TE -Puffer suspendiert. Die DNA-Suspension' wird dann 15 Minuten bei 65⁰C bebrütet und anschließend bis zur weiteren Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt.

Etwa 50 μΐ des -^4.2 kb'Pstl Restriktionsfragments (in obiger Weise hergestellt), 10 μΐ 1OX HincII-Puffer (100 mM TrIs.HCl, pH 7,9, 600 mM NaCl, 66 mM MgCl₃, 10,mM Dithiothreit), 38 μΐ H₀O und 2 μΐ (10 Einheiten/μΐ) HincII

1 t* . . —————

Restriktionsenzym bebrütet man zuerst etwa 20 Minuten bei TO 37°C und dann etwa 5 Minuten bei 65⁰C. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird auf etwa 20 ⁰C abgekühlt und mit etwa 200 μΐ TBE versetzt, worauf die·.Restriktionsfragmente in üblicher Weise unter Anwendung der AGE-Methode isoliert werden. Das gewünschte ^0.9 kb Pstl-HincII R.estriktionsfragment, welches das Bakteriophag λ_£ΐ Gen enthält, wird in 10 μΐ TE-Puffer gelöst und.bei 4°C aufbewahrt.

B. . Isolierung eines Replikons und eines Gens te , das lineare DNA mit Enden HincII und Pstl enthält

Ein Gemisch aus etwa 100 μΐ (3,2 μg) Plasmid pBR322, 15 μΐ 10X HincII-Puffer, 34 μΐ H₃O und 1 μΐ (10 Einheiten/μΐ) an HincII Restriktionsenzym bebrütet man zuerst etwa 20 Minuten bei 37°C und dann etwa 5 Minuten bei 65°C. Das.Reäktionsgemisch wird dann auf 4°C abgekühlt und wie in Beispiel 3 angegeben mit Ethanol gefällt. Das gewünschte und durch Teilverdauung mit HincII erhaltene Plasmid pBR322 wird in einer Lösung aus 10 μΐ 10X Pstl-Puffer und 79. μΐ H_O suspendiert, worauf man die erhaltene Suspension 5 Minuten bei 65⁰C bebrütet und dann auf 4⁰C abkühlt. Sodann versetzt man das Ganze mit 10 μΐ (1 mg/ml) BSA und 2 μΐ Pstl (10 Einheiten/ml) Restriktionsenzym.. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird zuerst 1 Stunde bei 37⁰C und dann 5 Minuten bei 65°C inkubiert, worauf man es auf 4⁰C abkühlt.Das auf diese Weise hergestellte HincII-Pstl Restriktionsfragment wird in- üblicher Weise unter Anwendung der AGE-Methode isoliert. Die DNA wird in TE-Puffer gelöst und bis zur weiteren Verwendung bei'4⁰C aufbewahrt.

V- ^: , ..' . .· - 38 -

C. Verknüpfung des Fragments mit-dem Gen XcI und dem ._ , linearen pPBR322 DNA Fragments mit Enden Pstl und

'.. ' . Hi nc 11 ,

Man vermischt etwa 10 μΐ (1,8 μg) ~ 0.9 kb HincII-Pstl · ;.. Fragment (hergestellt gemäß Beispiel 6A) und ΊΟ μΐ (0,9 pg) :; ¹^ 4 kb Pstl-HincII Fragment (hergestellt nach Beispiel 6B) , , miteinander und fällt das Ganze zweimal mit'Ethanol. Die

·.' ; erhaltene DNA wird in einer Lösung von 2 μΐ 5X Ligations- ·..-.. ·, 10 puffer (250 mM Tr is.. HGl, pH 7,8, 50 mM MgCl₂,. 25 mM Di-

thiothreit und; 25 % Glycerin) und 4,67 μΐ H-O gelöst. Die ' )-,.' 'Lösung wird 10 Minuten bei 65⁰C bebrütet und dann mit etwa V 3 μΐ 0,66 mM ATP und 0,33 μΐ (2 · Einheiten/μϊ) T₄ DNA-Liga-, se.versetzt. Das erhaltene Ligationsgemisch wird 1,5Stunden bei Umgebungstemperatur umgesetzt, wodurch, man zum gewünschten P.lasmid pPRl2 gelängt. Das auf diese Weise hergestellte Plasmid pPRl2 DNA wird bis zur weiteren Verwen- '. / dung bei 4⁰C aufbewahrt. ^!

B e i s ρ i e 1 7 .

' Transformation des Plasmids pPRl2 in Escherichia coli K12 C600R_k-M_k- ' \ ' ' .

'' ; 25 Die gewünschte Transformation wird'praktisch wie in Beispiel' 4 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pPR3 hier jedoch das Plasmid pPRl2 verwendet. Die Transformanten werden bezüglich ihrer Immunität gegenüber den Bakteriophagen KH54h und KH54h80 bei 32°G se- > lektiert. Eine entsprechende Untersuchung der Rekombinan-' .' ten ergibt eine Ap^S, Tc^r, XKH54h>- und XKH54h80 Immuni^v tat bei 32⁰C und eine XKH54hX und \KH54h80 Sensitivität bei 4 2⁰C. Ein Transformant wird selektiert und als Escherichia coli K12 CeOOR₁-M, -/pPRl2 bezeichnet. Diese über-. 35 lebende Kolonie wird bezüglich der erwarteten Phenotypen ". . untersucht und zur Vermehrung sowie Isolierung des Plasmids pPR12 verwendet.

- 39 'Beispiele

Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl2

Die gewünschte Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl2 wird praktisch wie in Beispiel 5 beschrieben durch geführt.

Beispiel 9 10

Aufbau des Plasmids pPRl7

. A. Isolierung des ^4.7 kb EcoRI-BamHI linearen Fragments des Plasmids pPRl2, das das Gen XcI sowie Replikon enthält.

Ein Gemisch aus etwa 150 μΐ (20 μg) Plasmid pPRl2 DNA (hergestellt gemäß Beispiel 8) 20 μΐ 1OX BamHI Puffer (200 mM Tris.HCl, pH 7,0, 1 M NaCl, 70 mMMgCL, 20 mM '20 2-Mercaptoethanol) , 2 μΐ (20 Einheiten/μΐ·) . BamHI-Restriktionsenzym und 28 μΐ H-O bebrütet man zuerst 30 Minuten bei 37⁰C, dann 1,3 Stunden bei Umgebungstemperatur und schließlich 5 Minuten bei 65⁰C. Das Reaktionsgemisch wird auf 4°C abgekühlt und dann mit etwa 4 μΐ (10 Einheiten/μΐ)' EcoRI-Restriktionsenzym versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 37 ⁰C bebrütet, wodurch man zum gewünschten ^'4.7 kb Restriktionsfragment gelangt. Nach herkömmlicher Isolierung unter Anwendung der AGE-Methode wird das gewünschte DNA-Pellet in TE-Puffer suspendiert und dann bis zur weiteren, Verwendung bei -4°.C aufbewahrt.

B. Isolierung des *j 1. 3 kb EcoRI-BamHI linearen Fragments des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ, das das Gen für ein Fusionspolypeptid von trp 1' E' und eine Α-Kette für

Humaninsulm enthalt . -

Die gewünschte Isolierung wird praktisch wie in Beispiel 9A beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des.Plasmids

ι I

pPRl2 hier jedoch das Plasmid ρΙΑ7Δ 4Δ1 verwendet. Ferner setzt man das EcoRI Restriktionsenzym auch nur etwa 0,5'. * Stunden um, da man lediglich eine Teilverdauung durch EcoRI haben möchte. Das nach herkömmlicher Isolierung un-· ter Anwwendung der AGE-Methode erhaltene gewünschte-^l. 3 kb EcoRI-BamHI-Restriktionsfragment wird sofort beim folgen- ^; ,den Verknüpfungsverfahren verwendet. .

C. Verknüpfung des insulinverschmolzenen Gens und des- . ,10 linearen pPR12 DNA-Fragments mit Enden EcoRI und BamHI

Man vermischt etwa 1,5 μq: der ~ 4 .7 kb DNA enthaltenden Lösung, von Beispiel 9A und 1,5 μg .des ~Ί. 3 kb DNA enthaltenden Gemisches von Beispiel 9B' miteinander und unterzieht das Ganze einer zweimaligen Fällung mit Ethanol. Das erhaltene Pellet wird in einer Lösung aus 6 'μΐ Wasser und 2 μΐ 5X Ligationspuffer gelöst und dann 10 Minuten . bei 65°C bebrütet. Nach erfolgter Bebrütung wird das Gemisch auf 15°C abgekühlt und mit etwa 2 μΐ 0,66 mM ATP und .0,1 μΐ (1 Einheit/μΐ) T. DNA-Ligase versetzt. Die Verknüpfungsreaktion wird etwa 18 Stunden bei 16⁰C durchgeführt, wodurch man zum gewünschten Plasmid pPRl7 gelangt.

B 'e i s ρ i e. 1 10 .

'. ' f .

Transformation des Plasmids pPRl7 in Escherichia coli K12

G600R_k-M_k-' ,. ' · -

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des. Plasmids pPR3 hier jedoch das Plasmid pPR17 verwendet. Die Trahsformanten werden bezüglich ihrer Immunität gegenüber den Bakteriophagen λΚΗ54ηλ. und \KH54h80 bei 32°C selektiert Durch Untersuchung der Rekombinanten ergibt sich eine Ap , Tc^r, XKH54hX und 7uKH54h80 Immunität bei 32⁰C und eine XKH54h\und \KH54h80 Sensitivität bei 42°C. Ein Transformant wird selektiert und als Escherichia coli K12 C600R,-

M, -/pPRl7 bezeichnet. Diese überlebende Kolonie wird bezüglich der erwarteten Phenotypen untersucht und zur Vermehrung sowie Isolierung des Plasmids pPRl7 verwendet.

B e i' s ρ i e 1 11

Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl7

Die gewünschte Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl7 wird praktisch wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 12 ,;-

Aufbau'des Plasmids pPRl8

Der gewünschte Aufbau wird praktisch wie in Beispiel 9A. bis C beschrieben .durchgeführt, wobei man abweichend davon anstelle des Plasmids ρΙΑ7Δ4Δΐ hier jedoch, das Piasmid ρΙΒ7Δ4Δΐ zur Bildung des <^l.ßkb EcoRI-BamHI Restriktionsfragments verwendet.

Beispiel 13 , .

Transformation des Plasmids pPRl8 in Escherichia coli Kl2

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle des Plasmids pPR3 hier jedoch das Plasmid pPRl8 verwendet. Die Transformanten werden bezüglich ihrer Immunität gegenüber den Bakteriophagen XKH54h\ und \KH54h80 bei 32°C selektiert. -Die Rekombinanten werden entsprechend untersucht, wodurch sich eine Ap^S, Tc^r, \KH54h"X_ und \KH54h80 Immuni- -35 tat bei 32°C und eine \KH54h\ und \KH54h80 Sensitivität bei 42⁰C ergibt. Ein Transformant wird selektiert und als Escherichia coli K12 C600R, -M, -/pPR18 bezeichnet. Diese überlebende Kolonie wird bezüglich der erwarteten Phenoty-

- 42 -

' pen untersucht und zur Vermehrung sowie Isolierung des Plasmids pPR18 verwendet.

Beispiel 14

. .,. ' .. ' .

, Transformation des Plasmids pPRl7 in Escherichia coIi K12 ' 2 94 ^; .

Erfindungsgemäße Plasmide werden gegenüber dem K-Restriktionssystem durch Transformation in Escherichia coli Kl2' modifiziert. Escherichia coli K12' 294 ist R, -M, , so daß nach entsprechender Transformation nichtmodifiziertes Plasmid DNA modifiziert und resistent gegenüber einer Restriktion -durch Stämme, mit R, M, Spezifität wird. Escherichia coli K12 294 Transformanten werden zur Vermehrung und Isolierung erfindungsgemäßer Plasmide für eine anschließende Transformation in Stämme von R, M, Escherichia coli verwendet. Zu solchen Stämmen gehört beispielsweise Escherichia coli K12 RV308. . . . ..'. ^:'. ... *

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle von Escherichia coli K12 C'6 0 OR^-M, - hier jedoch Escherichia_t coli K12 294' und anstelle des Plasmids pPR3 hier jedoch das Plasmid pPRl7 verwendet. Die Transformanten werden ^; bezüglich'Tc selektiert. Die Rekombinanten werden entsprechend untersucht, wodurch sich eine Ap ,Tc Immunität bei 32⁰C gegenüber XKH54h>. -.und XkH54h80 und eine Sensitivität bei' 42⁰C gegenüber \KH54hX und XKH54h80 er-

^O gibt. Die Transformanten verfügen über eine 100 %-ige genetische Verknüpfung der vermeintlichen plasmidgeborenen Marker. Ein Transformant wird selektiert und als Escherichia coli.Kl2 294/pPRl7 bezeichnet. Diese Kolonie wird ^

zur Verifizierung'der erwarteten Phenotypen untersucht oc. ·

^OJ und dann zur Vermehrung sowie Isolierung des Plasmids P.PR17 verwendet.

. · - 43 -

!Beispiel 15

Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPR17

Die gewünschte Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPRl7 wird praktisch wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, wobei abweichend davon hier jedoch Escherichia coli K12 294/pPRl7 verwendet wird.

Beispiel 16

Transformation des Plasmids pPR18 in Escherichia coli K12 294

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt,'wobei anstelle des Plasmids pPRl7 hier jedoch das Plasmid pPRl8 verwendet wird.

B e i s ρ i e 1 17

- Vermehrung.und Isolierung des Plasmids pPRl8

Die gewünschte Vermehrung und Isolierung des Plasmids pPR18 wird praktisch wie in Beispiel 5 beschrieben durch-. geführt, wobei abweichend davon hier jedoch Escherichia coli K12 294/pPR18 verwendet wird.

Beispiel 18 30

Transformation des Plasmids pPR17 in Escherichia coli K12 RV308 ...

Die gewünschte Transformation wird praktisch wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt, wobei hier abweichend davon jedoch das Plasmid pPRl7 von Beispiel 15 und Escherichia coli K12 RV308 verwendet werden. ι

· - 44 -Beispiel 19 ' .

Transformation des Plasmids pPR18 in Escherichia .co.li K12 RV308

Die gewünschte Transformation;wird praktisch wie in Beispiel .14 beschrieben durchgeführt, wobei hier abweichend davon jedoch das Plasmid pPRl8 von Beispiel 17 und Esche-. richia coil K12 RV308 verwendet werden.

Beispiel 20 . , /

Aufbau von Escherichia coli K1-2 RV30 8XcI90/pPRl7 durch Lysogenisierung mit λχ:Γ90 , . ,

Man läßt Escherichia coli K12 RV308/pPR17 (hergestellt ge-, maß Beispiel. 18) bei 32°C so lange wachsen, bis 35 Klett-Einheiten vorhanden sind, worauf man das Ganze 60 Minuten auf .45⁰C hält. Die -Zellen werden mit XcI90 unter einem moe-Wert von 20 infiziert und 40 Minuten bei 45⁰C bebrütet. Man

läßt entsprechende Kolonien bei 32°C auf L-Agar wachsen, . der 10 μg/ml Tetracyclin enthält. Die erhaltenen Kolonien Escherichia coli K12 RV308Xcl90/pPRl7 werden entsprechend untersucht, wodurch sich, ein ^Wachstum' bei 32°C und e.ine Sensitivität bei 42⁰C ergeben.

B e i s ρ i e 1 21

Aufbau.von Escherichia coli K12 RV308XcI90/pPR18

. Der gewünschte Aufbau wird praktisch wie in Beispiel 20

beschrieben durchgeführt,' wobei man anstelle von Escherichia 'CoIi K12 RV308/pPRl7 hier jedoch Sscherichia coli K12 RV308/pPRl8 (hergestellt gemäß Beispiel 19) .verwendet. 35

-45- !Beispiel 22

Aufbau von Escherichia coli K 12 C600R, -M, -XcI90/pPRl2

Der gewünschte Aufbau wird wie in Beispiel 20 beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle von Escherichia coli ΚΊ2 RV308/pPRl7 hier jedoch Escherichia coli K 12 C600R_k-M_k~/ pPR12 (hergestellt gemäß Beispiel 7) verwendet.

Zu Beispielen für andere Stämme, die .sich erfindungsgemäß aufbauen lassen, gehören folgende: .

Beispiel Nr. Bezeichnung .

23 Escherichia coli K12 ' C600/PPR17" \

24 Escherichia coli Kl2. C600/pPR18

25 Escherichia' coli K12 RV308/pPR12

26 Escherichia coli K12 RV3 08XcI9 0/pPRl2

27 Escherichia coli K12 C600Xcl90/pPRl7

28 Escherichia coli K12 C600Xcl90/pPR18

ί

29 . Escherichia ccli K12 294xcl90/pPR17

30 Escherichia coli K12 294^cl90/pPR18

31 Escherichia coli K12 CSOOR₁-M₁ -Xcl90/pPRl7

32 'Escherichia coli K12 ceOOR^-M, -%cl90/pPRl8

Verfahren zur Bestimmung -der Stabilität von Wirtszellen, die rekombinante Plasmide enthalten, mit und ohne Selektion

Zur Bestimmung der Häufigkeit der Zellen, die die Plasmide enthalten, verwendet man das Gen Tc an den rekombinierenden Plasmiden. Reihenverdünnungen der Kultur sprüht man auf L-Agar und läßt sie darauf bei 32⁰C mit und ohne 10 μg/ml Tetracyclin wachsen. Die Häufigkeit der.Plasmid -Zellen ist der Wert aus dem Verhältnis der tetracyclinresistenten Kolonien zur Gesamtanzahl an Kolonien, die auf L-Agar. ohne Tetracyclin wachsen. Bei einem anderen Versuch trägt man die Kolonien auf L-Agar auf, der 10 ^g/ml Tetracyclin ent-

. - 46 - . '

hält, und läßt das Ganze bei 32°C wachsen. Die Häufigkeit der Plasmid -Zellen stellt den Wert aus dem Verhältnis der tetracyclinresistenten Kolonien zur Gesamtanzahl der Kolonien dar, die auf L-Agar ohne Tetracyclin wachsen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Form entsprechender Prozentwerte zusammengestellt in Tabelle II für die Stämme Escherichia .coli K12 RV308/pIA7A4Al und Escherichia coli Kl2 RV308XcI90/pPRl7, in Tabelle III für die Stämme Escherichia coli Kl2 RV308/pIB7Ä 4Δ1 und Escheriohia coli K12 RV308XoI90/pPR18,.und in Tabelle JV für die Stämme Escherichia coli K12 C600R,-M,-/pPR12 und Escherichia coli K12 C600R,-M, -XcI90/pPRl2.

TABELLE II

.Stabilitäten von rekombinanten Plasmiden

Anzahl der Prozentuale Plasmidretention Kulturver- Escherichia coli K12 Escherichia coli Kl2 . dpppelungen. _κν30 8/ρΙΑ7Δ4Δ 1 RV30-8XcI-90/pPR17 "

9 _. ; 96 - 100

'. . .-. 30 . .95 ' . 100

TABELLE III

Stabilitäten von rekombinanten Plasmiden

-in ' ^; ' ^A '

^ou Anzahl der Prozentuale Plasmidretention

Kulturver- Escherichia coli K12 Escherichia coli K12 ' doppelungen RV308/pIB7A4Al . RV30 8XCI9 0/PPR18

9 96 100

' ' 3 0 7 9 100

TABELLE IV

Stabilitäten von rekombinanten Plasmiden

Anzahl der Prozentuale Plasmidretention

Kulturver- Escherichia coli K12 Escherichia coli K12

doppelungen C600R_k-M_k"/pPRl2 C600R_k^M_k

33 87 100

Die in den Tabellen II bis IV enthaltenen.Ergebnisse zeigen deutlich die Wirksamkeit des vorliegenden selektiven Systems zur Aufrechterhaltung rekombinierender Plasmide in Bakterienpopulationen. Etwa 5 % der Zeilen in der KuI-tür von Escherichia coli Kl2 RV308/pIA7A 4Δ1 und etwa 21 % der Zellen in der Kultur von Escherichia coli K12 RV308/pIB7A 4Δ1 sind nach 30 Kulturverdoppelungen plasmidminus.'Keine der -Zellen in den Kulturen von Escherichia coli K12 RV308XcI90/pPRl7 und Escherichia coli K12 RV308- ^cl90/pPRl8, bei denen sich das selektive System-an Ort und Stelle befand, waren plasmidminus. Die Kultur von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k-Xcl90/pPRl2 zeigte darüber •hinaus, auch eine ausgezeichnete Plasmidstabilität. Es waren daher 13 % der Zellen in der Kultur von Escherichia coli K12 C600R_k-M_k~/pPRl2 nach 33 Kulturverdoppelungen plasmidminus, während alle Zellen in der Kultur von. Escherichia coli Kl2 C600R_k-M_k-Xcl90/pPRl2, ^:bei der sich ¹ das selektive System an Ort und Stelle befand, plasmidplus 'waren.

Keines der erfindungsgemäßen Plasmide zeigt irgendeine ' Plasmidsegregation. Die erfindungsgemäßen verbesserten Plasmide unterscheiden sich daher von den Plasmiden, die über keine derartige Verbesserung verfügen, durch ein Fehlen an Rekombination mit dem Prophag. Nach Wachsenlassen mit dem verbesserten selektiven System an Ort und Stelle ließ sich keine einzige Plasmidminus-Kolonie feststellen.

Claims (6)

Patentansprüche;'

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinierenden DNA-Kloni,erungsvektors, dadurch. g e k e η η ζ ei c h η e t ,daß man eine DNA-Sequenz, die ein Restriktionsfragment des Bakteriophagen λ enthält, welches den Pstl-Hincl el Repressor enthält,, mit einer DNA-Sequenz, die ein Replikon Und einen Promotor enthält, welche, gegenüber dem Repressor nicht sensitiv sind, verbindet.

; .'

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung des Plasmids pPR3, dadurch; g e k e. η η ζ e i c h η e t ,

.- '.;. daß man das 2,5 kb BgIII Restriktionsfragment des Bakterio-• phagen λ c_I857 mit dem BamHI Restriktionsfragment des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δ'1 verbindet.

3. . Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung des Plasmids pPRl2, dadurch g-e k e η η - ζ e i c h η e t , daß man das ,0,9 kb HincII-Pstl Restriktionsfragment des Plasmids pPR3 mit dem 4 kb Pstl-HincII Restriktionsfragment des Plasmids pBR322 verbindet.

4. - Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung des Plas-

• . mids pPRl7, dad.ur ch g eke η nz ei c h η e t, 25, daß man das 4,7 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragment des ·- ' Plasmids pPR12 mit dem 1,3 kb EcoRI-BamHI' Restriktionsfragment, des Plasmids ρΙΑ7Δ,4Δΐ verbindet.

5. Verfahren'nach Anspruch 3 zur Herstellung des Plasmids pPR18, dadurch gekennzeichnet:, daß man das 4,7 kb EcoRI-BamHI .Restriktionsfragment des Plasmids pPRl2 mit dem 1,3 kb EcoRI-BamHI Restriktionsfragment des Plasmids ρΙΒ7Δ4Δΐ verbindet.

6. Verfahren nach Anspruch 3 zur Herstellung des Plasmids. pPRl2Δ2, d a d u r c -h gekennzeichnet , daß man das Plasmid pPR12 mit BamHI-Restriktions-, enzym und EcoRI-Restriktionsenzym behandelt.