DE3382575T2

DE3382575T2 - Dna-sequenzen, rekombinante dna-molekuele und verfahren zur herstellung von schweinewachstumshormonaehnlichen polypeptiden.

Info

Publication number: DE3382575T2
Application number: DE8383305717T
Authority: DE
Inventors: Nagaswararao Movva; Marie-Francoise Schulz
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1982-09-27
Filing date: 1983-09-26
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2003-09-27
Also published as: AU1933183A; DK440083D0; PT77392A; ZA837034B; CA1341012C; IE832259L; NZ205675A; CZ704783A3; JPS59173083A; JP2620479B2; ATE77103T1; ES525948A0; JP2533470B2; IE64441B1; DE3382575D1; NO833464L; PT77392B; SK704783A3; MX164375B; SK278336B6

Description

Technischer Bereich der Erfindung

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, rekombinante DNA-Moleküle und Verfahren zur Herstellung von Schweinewachstumshormonen und schweinewachstumshormonähnlichen Polypeptiden. Insbesondere betrifft sie in geeigneten Wirten exprimierte DNA-Sequenzen und die über diese Expression hergestellten Produkte. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und rekombinanten DNA-Moleküle sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Polypeptide codieren, die die wachstumsfördernde biologische Aktivität des Schweinewachstumshormons aufweisen. Wie aus der folgenden Beschreibung zu entnehmen Bein wird, können die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen, rekombinanten DNA-Moleküle und Verfahren zur Herstellung von bei Schweinen als allgemeine anabole Wirkstoffe einsetzbaren Polypeptiden verwendet werden, insbesondere um Wachstumsrate, Gewichtszunahme und Fleischproduktion bei diesen Tieren zu steigern.

Technischer Hintergrund

Das Schweinewachstumshormon ("SGH") ist ein Polypeptidhormon, das vom Vorderlappen der Hirnanhangdrüse synthetisiert und sekretiert wird. Man nimmt an, daß das SGH als ein Vorläuferprotein (Schweine-Prä- Wachstumshormon) synthetisiert wird und während der Sekretion und Abgabe des Hormons in die Blutbahn in die reife Form des Schweinewachstumshormons überführt wird. Die Aminosäureteilsequenz vom Schweinewachstumshormon ist mitgeteilt worden [Mills, J.B. et al., "Cyanogen Bromide Cleavage And Partial Amino Acid Sequence Of Porcine Growth Hormone", J. Biol. Chem. 245 (1970), S.3407-15; Wilhelmi, A.E. und Mills, J.B., "Studies On The Primary Structure Of Porcine Growth Hormone", in Growth and Growth Hormone, Hrsg. Pecile, A., und Muller, E.E., Excerpta Medica Foundation (1972), S. 38-41, Amsterdam, Intern. Congr. Ser. 244].
Wachstumshormone werden für gewöhnlich während des gesamten Lebenszyklus produziert, wenn auch anscheinend in größeren Mengen während der Zeit vor dem Erwachsensein. Diese Hormone sind bekannt dafür, daß sie das Skelettwachstum, die Stickstoffretention und die Proteinsynthese fördern und den Glukose- und Fettmetabolismus beeinflussen. Entsprechend werden Wachstumshormone als allgemeine anabole Wirkstoffe betrachtet.
Wachstumshormone sind in gewisser Weise artspezifisch. Jedoch kann ein Wachstumshormon einer Art in einer auf einer niedrigeren evolutionären Stufe stehenden Art biologisch aktiv sein. Obwohl der Mechanismus der biologischen Aktivität des Wachstumshormons nicht gut verstanden wird, ist gezeigt worden, daß die Verabreichung von Wachstumshormonen die Wachstumsrate, den Gewichtszuwachs und die Fleischproduktion bei Tieren deutlich steigert. Zum Beispiel betrug bei einem Test die durchschnittliche Rate der Gewichtszunahme bei Schweinen, die tägliche Injektionen von gereinigtem Schweinewachstumshormon erhielten, 2,26 Pfund pro Tag (verglichen mit der durchschnittlichen Gewichtszunahme von 2,19 Pfund/Tag bei Kontrollschweinen). Noch wichtiger war, daß die behandelten Schweine signifikant weniger Futter pro Tag verbrauchten als die Kontrollschweine (7,03 Pfund verglichen mit 8,40 Pfund). Zusätzlich zeigten die behandelten Schweine eine deutliche Verbesserung in der Rumpfqualität -- die Rümpfe der mit Wachstumshormonen behandelten Schweine wiesen eine durchschnittliche Länge von 30,57 Inch und ein Rückenfett von 1,40 Inch auf, während die der Kontrollgruppe eine durchschnittliche Länge von 29,33 Inch und Rückenfett von 1,77 Inch aufwiesen. Die chemische Zusammensetzung des eßbaren Fleisches war bei den mit Wachstumshormonen behandelten Tieren auch deutlich verbessert -- 13,50% Protein, 49,13% flüssige Bestandteile und 36,76% Fett -- verglichen mit der Kontrollgruppe -- 10,8% Protein, 39,43% flüssige Bestandteile und 49,27% Fett [Turman, E.J. "Some Effects Of Pituitary Anterior Growth Hormone On Swine", Thesis; Purdue University (April 1953)].
Unglücklicherweise kann das vorstehend beschriebene verbesserte Wachstum und die verbesserte Fleischproduktion bei Schweinen mit Schweinwachstumshormonen nicht in großem Umfang verwirklicht werden, weil das SGH nicht ausreichend zur Verfügung steht. Heute wird das SGH aus der Hirnanhangdrüse von Schweinen gewonnen. Klar ersichtlich ist, daß diese Quelle nicht annähernd dazu geeignet ist, die benötigten kommerziellen Mengen an SGH bereitzustellen.
Neuere Fortschritte in der Molekularbiologie haben es ermöglicht, bestimmte, nicht-bakterielle Proteine codierende DNA in Bakterienzellen einzuschleusen. Allgemein gesagt, umfaßt bei DNA, die anders als auf dem Wege der chemischen Synthese hergestellt wird, die Konstruktion von solchen rekombinanten DNA-Molekülen die Schritte der Herstellung einer einzelsträngigen DNA-Kopie (cDNA) von einer Boten-RNA (mRNA)-Matrize, die das gewünschte Protein codiert; die Umwandlung der cDNA in eine doppelsträngige DNA; die Verknüpfung der doppelsträngigen cDNA mit einer geeigneten Stelle in einem geeigneten Clonierungsvehikel zur Bildung eines rekombinanten DNA-Moleküls, und die Transformation eines geeigneten Wirts mit diesem rekombinanten DNA-Molekül. Die Züchtung des transformierten Wirts kann dann dem Wirt ermöglichen, die DNA-Sequenz zu exprimieren und das gewünschte Protein herzustellen.
Über die Herstellung von mehreren nicht-bakteriellen Proteinen unter Verwendung gentechnologischer Verfahren ist berichtet worden. Diese schließen Rinder-Prä-Wachstumshormone [z.B., Miller, W.L. et al., "Molecular Cloning Of DNA Complementary To Bovine Growth Hormone mRNA", Journal Biological Chem. 255 (1980), S. 7521-24, EP-A 47 600 und GB-A 2,073,245] und menschliches Prä-Wachstumshormon, z.B. Martial, J.A. et al., "Human Growth Hormone: Complementary DNA Cloning And Expression In Bacteria", Science 205 (1979), S. 602-06 und EP-A 20 147] ein.
Keines dieser gentechnologischen Verfahren ist jedoch, wie diese Erfindung, ausgerichtet auf Schweinewachstumshormon, auf Schweinewachstumshormon-ähnliche Polypeptide oder auf die deutliche Verbesserung der Fleischproduktion, die erreicht werden würde, wenn kommerzielle Mengen von Schweinewachstumshormonen oder Schweinewachstumshormon-ähnlichen Polypeptiden verfügbar wären.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung löst die betreffenden Probleme durch Isolierung der DNA-Sequenzen, die SGH oder SGH-ähnliche Polypeptide codieren, und durch Expression dieser Sequenzen in geeigneten Wirten, um Polypeptide herzustellen, die die wachstumsfördernde biologische Aktivität von SGH aufweisen.
Dank dieser Erfindung ist es zum ersten Mal möglich, Polypeptide, die die Aktivität von SGH aufweisen, in kommerziellen Mengen für die Verwendung in verschiedenen Anwendungen zur Erhöhung der Wachstumsrate und der Fleischproduktion bei Schweinen zu erhalten.
Wie man der folgenden Beschreibung entnehmen wird, sind die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und die rekombinanten DNA-Moleküle in der Lage, in einem geeigneten Wirt die Herstellung von Schweinewachstumshormon oder Schweinewachstumshormon-ähnlichen Polypeptiden, d.h. von den Polypeptiden, die die wachstumsfördernde biologische Aktivität von SGH zeigen, zu steuern. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind nützlich in Zusammensetzungen und Verfahren zur Verbesserung von Wachstumsraten und der Fleischproduktion bei Schweinen.
Dementsprechend kann dem Vorangegangenen entnommen werden, daß ein grundlegender Gesichtspunkt dieser Erfindung in der Herstellung einer DNA-Sequenz besteht, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein Polypeptid codiert, das die wachstumsfördernde biologische Aktivität von SGH zeigt. Solche DNA-Sequenzen schließen Insertionen ein, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus DNA-Insertionen von pBR322 (Pst)/SGH-9D, pSGH-Δ7, pSGH-(Met-Phe), DNA-Sequenzen, die mit den vorstehend erwähnten Insertionen hybridisieren und die SGH-ähnliche Polypeptide codieren, und DNA-Sequenzen, die bei der Expression ein Polypeptid codieren, das auch durch eine der vorangegangenen DNA-Sequenzen oder Insertionen bei der Expression codiert wird, besteht.

Kurze Beschreibung der Figur

Figur 1 ist ein schematischer Überblick einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Gemischs von rekombinanten DNA-Molekülen, von denen einige durch DNA-Sequenz-Insertionen gekennzeichnet sind, die die erfindungsgemäßen Polypeptide codieren.
Figur 2 ist ein schematischer Überblick zweier Ausführungsformen zu Clon-Absuch-Verfahrensweisen zur Selektion der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen. In der ersten wurde eine SGH-verwandte cDNA-Sequenz durch Hybridisierung mit einer Sonde aus Rinderwachstumshormon selektiert. In der zweiten wurde eine durch Spaltung der SGH-verwandten cDNA hergestellte Sonde verwendet.
Figur 3 ist ein Überblick über die Sequenzierungsstrategie, die eingesetzt wurde, um die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz SGH-9D festzustellen.
Figuren 4-5 stellen die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz SGH-9D und die Aminosäuresequenz dar, die dieser entspricht.
Figur 6 ist eine unvollständige Liste von Restriktionsstellen, bestimmt durch eine Computeranalyse der Nukleotidsequenz, die in den Figuren 4-5 gezeigt ist.
Figur 7 ist ein schematischer Überblick einer Ausführungsform für die Konstruktion vom erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekül pSGH- Δ7.
Figur 8 stellt die zu pBGH-Δ9 (Ser), pSGH-9D und pSGH-Δ7 gehörigen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen dar.
Figuren 9-10 sind ein schematischer Überblick einer Ausführungsform der Konstruktion des erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküls pSGH-(Met-Phe).

Beste Ausführungsart der Erfindung

Damit die hier beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann, wird die folgende detaillierte Beschreibung gegeben.
In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet:

Nukleotid

Eine monomere DNA- oder RNA-Einheit, bestehend aus einem Zuckeranteil (Pentose), einem Phosphat und einer Stickstoff enthaltenden heterozyklischen Base. Die Base ist mit dem Zuckeranteil über den glykosidischen Kohlenstoff verbunden (1'-Kohlenstoff der Pentose). Diese Kombination einer Base und eines Zuckers wird ein Nukleosid genannt. Jedes Nukleotid wird durch seine Base charakterisiert. Die vier DNA Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA Basen sind A, G, C und Uracil ("U").

DNA-Sequenz

Eine lineare Anordnung von Nukleotiden, die über Phosphodiesterbindungen zwischen dem 3' und dem 5' Kohlenstoff von benachbarten Pentosen miteinander verbunden sind.

Codon

Eine DNA-Sequenz von drei Nukleotiden (ein Triplett), die über eine mRNA eine Aminosäure, ein Translationsstartsignal oder ein Translationsterminationssignal codiert. Zum Beispiel codieren die Nukleotidtripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translationsterminationssignale und ATG ist ein Translationsstartsignal.

Leseraster

Die Gruppierung von Codons während der Translation von mRNA in Aminosäuresequenzen. Während der Translation muß das geeignete Leseraster beibehalten werden. Zum Beispiel kann die Sequenz GCTGGTTGTAAG in drei Leserastern oder Phasen translatiert werden, von denen jede eine verschiedene Aminosäuresequenz liefert:
GCT GGT TGT AAG -- Ala-Gly-Cys-Lys
G CTG GTT GTA AG -- Leu-Val-Val
GC TGG TTG TAA G -- Trp-Leu-(STOP)

Polypeptide

Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die miteinander über Peptidbindungen zwischen der α-Amino- und der Carboxyl-Gruppe der benachbarten Aminosäuren verbunden sind.

Genom

Die gesamte DNA einer Zelle oder eines Virus. Es schließt unter anderem die die Polypeptide der Substanz codierenden Gene, ebenso wie Operator-, Promotor- und Ribosomenbindungs- und -interaktionssequenzen, einschließlich Sequenzen, wie die Shine-Dalgarno-Sequenzen, ein.

Gen

Eine DNA-Sequenz, die über ihre Matrize oder Boten-RNA ("mRNA") eine ein bestimmtes Polypeptid kennzeichnende Sequenz von Aminosäuren codiert.

Transkription

Der Vorgang zur Herstellung von mRNA von einem Gen.

Translation

Der Vorgang zur Herstellung eines Polypeptids von einer mRNA.

Expression

Der Vorgang, den eine DNA-Sequenz oder ein Gen durchläuft, um ein Polypeptid herzustellen. Er ist eine Kombination von Transkription und Translation.

Plasmid

Eine nicht-chromosomale doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein intaktes "Replikon" in der Weise enthält, daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingeführt wird, können als Folge der Plasmid-DNA die Eigenschaften dieses Organismus verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel transformiert ein Plasmid, das das Gen für die Tetracyclinresistenz (TetR) trägt, eine zuvor Tetracyclin-empfindliche Zelle in eine solche, die resistent dagegen ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird eine "Transformante" genannt.

Phage oder Bakteriophage

Bakterielle Viren, von denen viele aus DNA-Sequenzen bestehen, die in eine Proteinhülle bzw. einen Mantel ("Capsid") eingekapselt sind.

Clonierungsvehikel

Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die in der Lage ist, in einer Wirtszelle zu replizieren und die durch eine oder eine kleine Zahl von Endonuklease-Erkennungssequenzen gekennzeichnet ist, an denen solche DNA-Sequenzen in einer vorherbestimmbaren Weise gespalten werden können, ohne daß dies mit dem Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA verbunden ist, z.B. der Replikation, der Herstellung von Hüllproteinen oder dem Verlust von Promotor oder Bindungsstellen, und die einen Marker trägt, der geeignet ist für die Verwendung bei der Identifizierung von transformierten Zellen, z.B. Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz. Ein Clonierungsvehikel wird oft als Vektor bezeichnet.

Clonieren

Das Verfahren zum Erhalt einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die sich von einem solchen Organismus oder von einer solchen Sequenz durch asexuelle Reproduktion ableiten.

Rekombinante DNA-Moleküle oder Hybrid-DNA

Ein Molekül, bestehend aus DNA-Segmenten von verschiedenen Genomen, die außerhalb von lebenden Zellen endständig miteinander verbunden worden sind und die Fähigkeit aufweisen, einige Wirtszellen zu infizieren und darin erhalten zu bleiben.

Expressionskontrollsequenz

Eine Sequenz von Nukleotiden, die die Expression von DNA-Sequenzen oder Genen kontrolliert und reguliert, wenn sie mit solchen Sequenzen funktionell verbunden ist. Sie umfassen das lac-System, das trp-System, Haupt-Operator und Promotor-Regionen vom Phagen λ, die Kontrollregion des fd Hüllproteins und anderer Sequenzen, die bekanntermaßen die Genexpression von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen und ihrer Viren oder Kombinationen davon kontrollieren.

SGH

Schweinewachstumshormon.

SGH-ähnliche Polypeptide

Ein Polypeptid, das die wachstumsfördernde biologische Aktivität von SGH zeigt.
Unter Bezug auf die Figur 1, wird darin nunmehr ein schematischer Überblick einer Ausführungsform eines Verfahrens zur Herstellung eines Gemisches von rekombinanten DNA-Molekülen gezeigt, von denen einige durch eingefügte DNA-Sequenzen gekennzeichnet sind, die SGH oder SGH-ähnliche Polypeptide codieren.

Herstellung von poly A&spplus;-RNA-enthaltender Schweinewachstumshormon mRNA (SGH-mRNA)

Es wurden 4-6 g vorderer Schweinehirnanhangdrüse (Pelfreeze, Arkansas), eingefroren in Trockeneis, zu einer Lösung von 5 M Guanidin- Thiocyanat, 50 mM Natriumcitrat, 0,5% Natriumlaurylsarcosyl und 0,1 M β- Mercaptoethanol (10 ml/g Drüse) [Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 18 (1979), S. 5294-99] gegeben. Die Drüsen wurden dann bis 4ºC in der Lösung aufgetaut und das Gemisch wurde mit sechs 20 Sekunden langen Pulsen homogenisiert (Polytron). Nach Zentrifugieren des Homogenats (Sorvall, 6000 UpM, 5 Min., Raumtemperatur) wurden 2,5 ml CsCl (5,7 M in 0,1 M EDTA) mit 7,0 ml des Nukleinsäure enthaltenden Überstandes überschichtet und mit Paraffinöl bedeckt. Das Röhrchen wurde zentrifugiert (SW 41, 30000 UpM, 18 Std., 20ºC), um die RNA enthaltende Fraktion als Pellet zu gewinnen.
Nach Verwerfen des Überstandes und Resuspendierung des Gesamt-RNA enthaltenden Pellets in Wasser, wurde die wässrige Lösung zweimal mit gleichen Volumina an Phenol-Chloroform (1:1) und zweimal mit gleichen Volumina an Ether extrahiert. Dann wurde die RNA aus der wässrigen Phase mit dem dreifachen Volumen an Ethanol ausgefällt und der erhaltende Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt. Ausbeute an Gesamt-RNA: 8 mg.
Es wurden 4 mg der vorstehend beschriebenen Gesamt-RNA in 1 ml Tris-HCl(10 mM, pH 7,5)-EDTA (1 mM) ("TE-Puffer") resuspendiert und die Lösung 10 Minuten auf 65ºC erhitzt. Nach Zusatz von 2 M KCl zu einer Endkonzentration von 0,5 M wurde das Gemisch auf eine Oligo-dT-Zellulose enthaltende Säule gegeben und die Säule mit 0,5 M KCl gewaschen, um die gesamte ribosomale RNA zu entfernen. Schließlich wurde die an die Säule gebundene Poly A&spplus;-RNA mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) bei Raumtemperatur eluiert und die Poly A&spplus;-RNA enthaltenden Fraktionen zusammengegeben. Die RNA wurde, wie zuvor, durch Ausfällung mit Ethanol und Salzen, Zentrifugierung und Resuspendierung in Wasser aus den vereinigten Fraktionen gesammelt. Ausbeute an Poly A&spplus;-RNA: 200 ug.
Um die Aktivität der isolierten Poly A&spplus;-RNA zu überprüfen, wurden 2 ug dieser Poly A&spplus; RNA mit einem Kaninchen-Retikulocytenlysat- ³&sup5;S-Methionin-zellfreien System (NEN) in vitro translatiert [Pelham, H.R.B. und Jackson, R.J., Eur. J. Biochem. 67 (1976), S. 247 ff.], und das Produkt wurde auf einem SDS/Polyacrylamidgel über eine Autoradiographie untersucht. Dieser Test zeigte, daß die isolierte Poly A&spplus;-RNA zur Herstellung eines Polypeptids translatiert wurde, das ein Molekulargewicht aufwies, das der Größe entsprach, die für das Schweine Prä- Wachstumshormon erwartet wurde (etwa 24000).
Es sollte natürlich klar sein, daß die Poly A&spplus;-RNA ein Gemisch einer großen Zahl von verschiedenen RNAs (Figur 1) ist. Mit Ausnahme der für SGH oder SGH-ähnliche Polypeptide spezifischen mRNA, sind diese RNAs unerwünschte Verunreinigungen (Figur 1). Unglücklicherweise verhalten sich diese verunreinigenden RNAs während des übrigen Clonierverfahrens ähnlich wie die SGH-mRNA. Deswegen wird ihr Vorhandensein in der Poly A&spplus;-RNA zu einer großen Anzahl von nutzlosen Clonen führen und ein komplexes Absuchproblem bei der Selektion eines richtigen Clons darstellen, d.h. eines, der unter den vielen, zahlreicheren Verunreinigungen SGH codiert.

Synthese eines SGH-cDNA enthaltenden cDNA-Gemisches

Um eine komplementäre einzelsträngige DNA zu den Poly A&spplus;-RNAs herzustellen, wurden 20 ul Poly A&spplus;-RNA (10 ug in H&sub2;O) und 2 ul 0,15 M CH&sub3;Hg vermischt und die erhaltene Lösung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurden zu der Lösung 10 ul oligo dT (1 ug/ml), 100 ul dNTPs (2,5 mM, d.h. zu einer Endkonzentration von 0,5 mM), 20 ul α-³²P-dATP (10 mCi/ml), 50 ul reverse Transkriptase (16 Einheiten/ul, Life Sciences) und ein gleiches Volumen an Puffer (100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 20 mM MgCl&sub2;, 140 mM KCl, 50 mM DTT in H&sub2;O) zugegeben. Das Gesamtvolumen der Lösung betrug 404,4 ul. Nach einer Inkubation der Lösung 90 Minuten bei 42ºC, wurde sie für einige Minuten auf 100ºC erhitzt und zentrifugiert (10000 G, 5 Min.). Der Überstand enthielt die zu der Poly A&spplus;-RNA komplementären einzelsträngigen cDNAs. Ausbeute an cDNA: 1,438 ug (via TCA-Ausfällung eines kleinen Aliquots).
Wiederum ist klar, daß die einzelsträngige cDNA in Wirklichkeit ein komplexes Gemisch einer großen Zahl von verschiedenen cDNAs ist, die von den entsprechenden im Poly A&spplus;-RNA-Gemisch (Figur 1) vorhandenen mRNAs transkribiert worden sind. Ein weiterer Faktor spielt bei der Erzeugung der Komplexität des cDNA-Gemisches eine Rolle. Nicht jedes mRNA- Exemplar der Poly A&spplus;-RNA kann vollständig transkribiert sein. Stattdessen kann eine große Vielzahl von cDNAs von jeder mRNA-Spezies produziert werden (in Figur 1 nicht gezeigt). Da jede dieser unvollständigen cDNAs sich ähnlich wie die gewünschte cDNA während des übrigen Verfahrens verhält, dient ihr Vorhandensein im cDNA-Gemisch nur dazu, das letzte Absuchverfahren auf Clone weiter zu komplizieren.

Herstellung von doppelsträngiger cDNA

Um die vorstehend hergestellte cDNA in eine doppelsträngige cDNA umzuwandeln, wurde die Hälfte der cDNA (0,7 ug) genommen und 50 ul Klenow (0,7 Einheiten/ul), 1,5 ug MgCl&sub2; (1 M) und ein gleiches Volumen an DNA-Polymerase-Puffer (400 mM Tris-HCl (pH 6,9), 150 mM KCl, 1 mM dNTPs, 20 mM β-Mercaptoethanol) hinzugefügt, und das Gemisch wurde 17 Std. bei 16ºC und dann weitere 30 Min. bei 37ºC inkubiert. Die DNA wurde dann durch Zugabe von 1/8 Volumen an 2 M Natriumacetat (pH 5,5) und 2,5 Volumen Ethanol ausgefällt und 15 Min. auf -70ºC abgekühlt. Nach Sammeln des Niederschlags durch Zentrifugation (10000 g, 10 Min.), wurde das Pellet mit Ethanol gewaschen, in Wasser resuspendiert und auf eine Sephadex G-75 Säule aufgetragen. Die DNA wurde mit 10 mM Tris-HCl-0,1 mM EDTA eluiert und die DNA enthaltenden Fraktionen zusammengegeben. Gesamtvolumen der DNA enthaltenden Fraktionen: 377 ul.
Es wurden 42 ul einer Lösung (2 M NaCl, 500 mM Natriumacetat (pH 4,5), 10 mM Zinksulfat und 8 ul S1 (1000 Einheiten/ul, Boehringer-Mannheim)) zu den vereinigten DNA enthaltenden Fraktionen hinzugegeben und die Lösung bei 30ºC 30 Min. stehengelassen. Dann wurde das Gemisch dreimal mit gleichen Volumina an Phenol und dann Ether extrahiert, die erhaltene wässrige Phase auf eine Sephadex G-75 Säule gegeben und die DNA mit 5 mM KCl eluiert. Die DNA enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben und mit Ethanol wie zuvor ausgefällt.

Clonieren von doppelsträngiger DNA

Eine große Vielzahl von Wirt/Clonierungs-Vehikel-Kombinationen kann bei der Clonierung und Expression von doppelsträngiger cDNA eingesetzt werden. Zusätzlich können innerhalb eines jeden spezifischen Clonierungsvehikels verschiedene Stellen für die Insertion der doppelsträngigen cDNA ausgewählt werden. Die besondere Auswahl für Clonierung und Expression kann von einem Durchschnittsfachmann getroffen werden, ohne den Schutzbereich dieser Erfindung zu verlassen.
Für die anfängliche Clonierung wurde das bakterielle Plasmid pBR322 ausgewählt [Bolivar, F. et al., "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System", Gene (1977), S. 95-113; Sutcliffe, J.G., "pBR322 Restriction Map Derived From The DNA Sequence Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Research 5 (1978), S. 2721-28], die PstI Spaltstelle darin [Villa-Komaroff, L. et al, "A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), S. 3727- 31) und E. coli K12 MC1061 [Casadaban, M. und Cohen, S.N., J. Mol. Biol. 138 (1980), S. 179-207].

1. Herstellung von Pst I gespaltenem, mit dG-Enden versehenem pBR322

Plasmid pBR322 wurde über zwei aufeinanderfolgende CsCl- Gradienten gereinigt und 25 ug davon mit Pst I-Endonuclease unter Standardbedingungen (Figur 1) gespalten. Dann wurden zu dem mit Pst I gespaltenen Plasmid 50 ul H&sub2;O, 3 ul DTT (10 mM), 1,5 ul dGTP (10 mM), 10 ul Gelatine (1 mg/ml), 10 ul Terminale Transferase-Puffer (10 mM CoCl&sub2;, 1,4 M Kaliumcacodylat und 0,3 M Tris-HCl (pH 7,6)) und 0,9 ul Terminale Desoxynukleotidyl Transferase (160 Einheiten/ml, Ratcliff Biochemicals) zugegeben. Nach einer Inkubation der Lösung 13 Min. bei 10ºC, wurden 5 ul EDTA (250 mM) hinzugegeben und das erhaltene Gemisch zweimal mit gleichen Volumina Phenol-Chloroform (1:1) und dreimal mit gleichen Volumina Ether extrahiert. Die wässrige Phase wurde für die nachfolgende Kombination mit der mit dC-Enden versehenen doppelsträngigen cDNA aufbewahrt.

2. Herstellung von mit dC-Enden venehener cDNA

dC-Enden wurden durch Resuspendierung von 1/5 der zuvor hergestellten cDNA (100 ng) in 25 ul H&sub2;O, Zugabe von 50 ul H&sub2;O, 3 ul DTT (10 mM), 1 1,5 ul dCTP (10 mM), 10 ul Gelatine (1 mg/ml), 10 ul Terminale Transferase-Puffer (10 mM CoCl&sub2;, 1,4 M Kaliumcacodylat, 0,3 M Tris-HCl (pH 7,6)) und 0,9 ul Terminale Desoxynukleotidyl Transferase (160 Einheiten/ml, Ratcliff Biochemicals) (Figur 1) an die doppelsträngige cDNA angehängt. Nach Inkubation des Gemischs 13 Min. bei 10ºC wurden 5 ul EDTA (250 mM) zugegeben und das erhaltene Gemisch zweimal mit gleichen Volumina Phenol-Chloroform (1:1) und dreimal mit gleichen Volumina Ether extrahiert. Wieder wurde die wässrige Phase für die Kombinierung mit dem mit dG-Enden versehenen, Pst-gespaltenen pBR322 aufbewahrt.

3. Aneinanderlagern von mit dG-Enden versehenem pBR322 und von mit dC-Enden venehener cDNA

Es wurden 1 ul des mit dG-Enden versehenen, mit Pst I gespaltenen pBR322 (50 ng) und 2,5 ul mit dC-Enden versehener cDNA (1 ng) in 5 ul Puffer zum Aneinanderlagern ("Annealing"-Puffer) (1 M NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA) und Wasser zu einem Endvolumen von 50 ul zusammengegeben. Nach Erhitzen des Gemisches drei Min. auf 80ºC und weitere 2 Std. auf 45ºC wurde die Temperatur der Lösung auf 4ºC gesenkt und die Lösung über Nacht stehengelassen.
Wieder soll klar sein, daß nur sehr wenige der rekombinanten DNA- Moleküle, die durch ein solches Aneinanderlagern hergestellt werden, eine cDNA-Insertion enthalten, die mit dem SGH in Beziehung steht (Figur 1).

4. Transfektion von E. coli K12 MC1061 mit Hybriden

Der vorstehend beschriebene, aneinandergelagerte, mit dG-Enden versehene pBR322 bzw. die mit dC-Enden versehene DNA wird in Collodium- Beutel (UH 100-25) gegen 1/10 "Annealing"-Puffer (supra) zwei Std. bei 4ºC dialysiert, um jede Spezies mit einem niedrigen Molekulargewicht auszuschließen. Dann wurde das Gemisch zu 200 ul vorher kompetent gemachten E. coli K12 MC1061 gegeben, wie im wesentlichen beschrieben in Buell, G.N. et al, J. Biol. Chem. 254 (1979), S. 927-983.
Da das Plasmid pBR322 das die Tetracyclinresistenz codierende und das die Ampicillinresistenz codierende Gen (Figur 1) enthält, und weil das letztere Gen inaktiviert wird, wenn cDNA an der PstI-Spaltstelle eingefügt wird, können Kolonien, die mit rekombinanten DNA-Molekülen mit DNA-Insertionen an der PstI-Spaltstelle transformiert worden sind, aus Kolonien selektiert werden, die nicht so transformiert worden sind (Figur 1). Es wurden etwa 10000 transformierte Kolonien aus 1 ng der cDNA isoliert.
Diese Kolonien enthalten eine Vielzahl von rekombinanten DNA-Molekülen, die vollständige oder Teilkopien des Gemisches von RNAs in der Poly A&spplus;-RNA (Figur 1) darstellen. Die Mehrzahl dieser Moleküle enthält keine SGH-verwandte DNA-Insertion.

Absuchen nach einem die SGH-cDNA enthaltenden Clon

Es gibt mehrere Vorgehensweisen, um eine Genbank von Clonen auf Clone hin abzusuchen, die ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül enthalten, d.h. eines, das eine SGH-verwandte DNA-Insertion enthält. Für das anfängliche Absuchen der Clone wurde entschieden, ein Rinderwachstumshormon codierendes 400 bp PstI-Fragment der cDNA zu verwenden [z.B. Miller et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), S. 7521-24] (Figur 2). Diese Sequenz kann auch erhalten werden durch PstI-Restriktion von pBGH-(Met- Ala), hinterlegt bei der American Type Culture Collection am 16. August 1982 unter der ATCC Hinterlegungsnummer 39173.
Diese Sonde wurde zur Hybridisierungsselektion einer Genbank von Clonen eingesetzt, die in ähnlicher Weise, wie die vorstehend beschriebene (Figur 2) hergestellt worden war. Diese Sonde wurde im wesentlichen, wie bei Grunstein, M. und Hogness, D.D., "Colony Hybridization: A Method For The Isolation Of Cloned DNA's That Contain A Specific Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 (1975), S. 3961-65 beschrieben, markiert und dann eingesetzt, um die Genbank nach Clonen unter Verwendung der SGH-Msp-Fragment-Sonde abzusuchen, wie im wesentlichen infra beschrieben.
Aus einem der Hybridisierungs-positiven Clone wurde ein rekombinantes DNA-Molekül isoliert, das ein inseriertes cDNA-Fragment trug, das, wie durch Nukleotidsequenzierung nachgewiesen wurde, einen Teil der Aminosäuresequenz des SGH codierte (durch Vergleich mit der berichteten Teilaminosäuresequenz (supra)) (Figur 2).
Dann wurde ein 200 bp Fragment dieser positiven cDNA hergestellt (durch Spaltung mit Msp, siehe Figur 2) und zur Verwendung als Hybridisierungssonde für die Genbank von 10000 Clonen (Figur 2) markiert (Grunstein und Hogness, supra). Für die Hybridisierung wurden die 10000 Kolonien auf Nitrocellulose-Filter (Millipore) übertragen und die Filter über Nacht bei 37ºC inkubiert. Nach Lyse der Kolonien mit 0,5 M NaOH 7 Min. lang wurden die Filter mit 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,6 M NaCl (zweimal jeweils 3 Min.) neutralisiert, und in 2x SSC (0,15 M NaCl-0,015 M Natriumcitrat (pH 7)) getränkt. Nach Lufttrocknung wurden die Filter 2 Stunden lang bei 80ºC in einem Vakuumofen gebacken und dann zweimal in 4x SSC (supra), 10x Denhardts Lösung und 0,1% SDS 2 Std. lang bei 65ºC getränkt. Dann wurden 25000 ³²P-gemessene Zerfälle ("Counts")/Filter der vorstehend beschriebenen 200 bp Sonde (2 Min. gekocht und schnell abgekühlt) 4x SSC, 10x Denhardts Lösung und 0,1% SDS hinzugegeben, die Filter wurden 12-14 Std. bei 65ºC hybridisiert, in 4x SSC, 10x. Denhardts Lösung und 0,1% SDS 2 Std. lang bei 65ºC gewaschen, 30 Min. bei 65ºC mit 2x SSC gewaschen und getrocknet. Nach eintägigem Exponieren auf einen Röntgenfilm wurden etwa 100 mit der Sonde hybridisierende Kolonien identifiziert, die DNA-Insertionen enthielten.
Es wurden 40 dieser positiven Clone für eine Restriktionsanalyse und Größenbestimmung (Pvu I/Bgl I) (Figur 3) ausgewählt. Aus dieser Analyse schlossen wir, daß einer dieser Clone eine DNA-Insertion von etwa 750 bp aufwies. Wir bezeichneten diesen Clon als E. coli K12 MC1061 (pBR322 (Pst) /SGH-9D), sein rekombinantes DNA-Molekül als pBR322(Pst)/SGH-9D und seine Insertionen als SGH-9D. Diese Nomenklatur zeigt an, daß die Clone E. coli K12 MC1061 umfassen, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das pBR322 und SGH-9D enthält, wobei die Insertion SGH-9D sich an der PstI-Spaltstelle in pBR322 (Figur 3) befindet.

Bestimmung der Nukleotidsequenz der Insertion SGH-9D

Da wir voraussagten, daß eine DNA-Sequenz, die SGH und seine vermutete Signalsequenz codiert, etwa 648 Nukleotide umfaßt, wurde die Insertion SGH-9D für die Analyse durch Restriktionskartierung und Bestimmung der Nukleotidsequenz ausgewählt.
Unter Bezugnahme auf Figur 3, wird darin die Strategie dargestellt, die zur Bestimmung der Nukleotidsequenz von SGH-9D eingesetzt wurde. Für die DNA-Sequenzierung wurde im wesentlichen eine Methode verwendet, wie sie beschrieben wird von Maxam, A.M. und Gilbert, W., "A New Method For Sequencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), S. 560-64. Die meisten Abschnitte der SGH-9D-Insertion wurden auf beiden Strängen sequenziert und die meisten Restriktionsspaltstellen, die als markierte Enden dienten (die schwarzen Punkte in Figur 3), wurden unter Verwendung von Fragmenten, die sie überbrücken, sequenziert. Die so erhaltene Nukleotidsequenz ist in den Figuren 4-5 dargestellt.
Bezugnehmend auf die Figuren 4-5, wird die Insertion flankiert durch 11 G-Reste am 5'-Ende und durch 10 A-Reste (wahrscheinlich das Poly A&spplus;-Ende der mRNA wiederspiegelnd), gefolgt von 24 C-Resten am 3'- Ende. Zur Bezugnahme ist die Insertion vom ersten auf den dG-Schwanz folgenden Nukleotid bis zum letzten Nukleotid vor den Poly A&spplus;-Resten numeriert.
Durch Vergleich mit der Aminosäureteilsequenz, die für SGH berichtet wird, scheint es, daß die Nukleotide 1-570 SGH codieren, und daß die Nukleotide 571-573 ein Terminationscodon darstellen. Deshalb scheint es, daß SGH ein Protein von 190 Aminosäuren ist. Aus der Sequenz läßt sich auch ableiten, daß es ein Schweine-Prä-Hormon gibt. Jedoch wurde bis jetzt die tatsächliche Länge oder Zusammensetzung der vermuteten Signal- oder Prä-Sequenz des SGH nicht festgestellt, da SGH- 9D anscheinend nicht das gesamte 5'-codierende und nicht-codierende Ende des Schweine-Prä-Hormons einschließt. Die ersten drei Aminosäuren der vermuteten Signalsequenz wurden als Säuren -1, -2 und -3 (Figuren 4-5) bezeichnet. SGH-9D scheint wegen der Lage der Poly A&spplus;-Reste die gesamte 3'-nicht-codierende Region einzuschließen.
Es sollte natürlich klar sein, daß die Selektion von Clonen, die die gesamte 5'-codierende und nicht-codierende Region enthalten, und die Identifizierung der vollständigen Prä-Sequenz des Schweine-Prä- Wachstumshormons von Fachleuten vorgenommen werden kann, ohne den Schutzbereich dieser Erfindung zu überschreiten. Zum Beispiel können die positiven Clone, die identifiziert wurden, im wesentlichen wie zuvor abgesucht werden, wobei eine Sonde, die vom 5'-Ende der Insertion SGH-9D genommen wird, verwendet wird. Zum Beispiel kann eine solche Sonde durch Spaltung von SGH-9D mit NarI und Isolierung des Fragments zwischen den Nukleotiden -5 und -60 (Figur 4) hergestellt werden. Dieses Fragment kann dann wie vorher markiert und verwendet werden, um einen Clon aus zuwahlen, der einen vollständigeren 5'-Teil des SGH enthält. Dieser Clon, sofern er nicht auch das vollständige 3'-Ende von SGH-9D einschließt, kann dann mit dem ganzen oder Teilen von SGH-9D über eine gemeinsame Restriktionsspaltstelle kombiniert werden, wie im Stand der Technik bekannt ist, um eine einzelne DNA-Sequenz herzustellen, die die gesamten codierenden und nicht-codierenden Bereiche des SGH umfaßt.
Es sollte klar sein, daß die in den Figuren 4-5 dargelegte Proteinstruktur Modifikationen auf Genebene nicht ausschließt, d.h. einfache oder mehrfache Basenaustausche, die auch ein Protein liefern, das die in den Figuren 4-5 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Die Nukleotidsequenz von SGH-9D wurde ferner durch Computer analysiert, um darin die Indentität und Lage von einigen Restriktionsendonuklease-Spaltstellen zu bestimmen. Die Ergebnisse der Analyse sind in Figur 6 dargestellt.

Synthese von einem SGH-ähnlichen Polypeptid

Die Herstellungsebene eines Proteins wird durch zwei Hauptfaktoren beherrscht: die Zahl der Kopien seines Gens innerhalb der Zelle und die Effizienz, mit der diese Genkopien transkribiert und translatiert werden. Die Effizienz von Transkription und Translation (die zusammen die Expression umfassen) ist umgekehrt abhängig von Nukleotidsequenzen, die sich normalerweise vor der gewünschten codierenden Sequenz befinden. Diese Nukleotidsequenzen oder Expressionskontrollsequenzen legen, unter anderem, die Stelle fest, mit der die RNA-Polymerase zur Initiierung der Transkription in Wechselwirkung tritt (die Promotor-Sequenz) und an die Ribosomen binden und mit der mRNA (dem Produkt der Transkription) interagieren, um die Translation zu initiieren. Nicht jede dieser Expressionskontrollsequenzen funktioniert mit der gleichen Effizienz. Es ist somit von Vorteil, die spezifischen codierenden Sequenzen für ein gewünschtes Protein von ihren benachbarten Nukleotidsequenzen zu trennen, und sie stattdessen mit anderen Expressionskontrollsequenzen zu verbinden, um eine höhere Expressionsebene zu erreichen. Nachdem dies erreicht worden ist, kann das neu konstruierte DNA-Fragment in ein Multikopien- ("Multicopy"-)Plasmid oder einen Bakteriophagenabkömmling eingefügt werden, um die Zahl der Genkopien innerhalb der Zelle zu vergrößern und dadurch die Ausbeute an exprimiertem Protein weiter zu verbessern.
Eine große Zahl von Wirt-Expressionskontrollsequenz-Vektor-Kombinationen kann daher bei der Herstellung von SGH-ähnlichen Polypeptiden in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel können verwendbare Vektoren aus Abschnitten chromosomaler, nicht-chromosomaler und synthetischer DNA-Sequenzen bestehen, wie verschiedenen bekannten bakteriellen Plasmiden von E. coli, einschließlich col E1, pCR1, pBR322 und ihren Abkömmlingen, Plasmiden mit breiterem Wirtsspektrum, z.B. RP4, Phagen-DNA, z.B. die zahlreichen Abkömmlinge des Phagen λ, und Vektoren die aus Kombinationen des Vorstehenden abgeleitet sind, wie Vektoren, die einen Teil von pBR322, einen Teil des Phagen λ und einen synthetischen Teil enthalten. Verwendbare Wirte können bakterielle Wirte einschließen, wie Stämme von E. coli, z.B. E. coli K12 MC1061, E. coli HB 101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRCI und Stämme von Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus und andere Bacilli, Hefen und andere Pilze, Tier- oder Pflanzen-Wirte, wie Tier- (einschließlich menschliche) oder Pflanzen-Zellen in Kultur oder andere Wirte. Verwendbare Expressionskontrollsequenzen können die Operator-, Promotor-, Ribosomenbindungs- und -interaktions- Sequenzen umfassen (einschließlich Sequenzen, wie der Shine-Dalgarno-Sequenzen) des Laktose-Operons von E. coli ("das lac-System"), die entsprechenden Sequenzen des Tryptophansynthetase-Systems von E. coli ("das trp-System"), die Haupt-Operator- und Promotor- Regionen des Phagen λ (OLPL und ORPIR), die Kontrollregion des Hüllproteins des Phagen fd, oder andere Sequenzen, die die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und ihrer Viren oder verschiedenen Kombinationen davon kontrollieren oder dabei helfen.
Natürlich sind gegebenenfalls nicht alle Wirt-Expressionskontrollsequenz-Vektor-Kombinationen in Bezug auf eine bestimmte codierende DNA-Sequenz gleich effizient. Jedoch kann, wie in dieser Erfindung beschrieben ist und unter gebührender Berücksichtigung der biologischen Sicherheit, aus den Spaltstellen, die in den erfindungsgemäßen SGH codierenden Sequenzen für besondere Konstruktionen verfügbar sind, der Größe der zu exprimierenden SGH-ähnlichen Polypeptide, der Empfindlichkeit dieser Polypeptide gegenüber proteolytischem Abbau durch Wirtszellenzyme, möglichen Verunreinigungen dieser Polypeptide durch Wirtszellproteine, die während der Reinigung schwierig zu entfernen sind, den Expressionseigenschaften der SGH und der SGH-ähnlichen codierenden Sequenzen, wie der Struktur der DNA-Sequenz und der Lage der Start- und Stop-Codons im Hinblick auf die Expressionskontrollsequenzen und anderen Faktoren, die von Fachleuten erkannt werden, eine geeignete Kombination ausgewählt werden.
Es gibt verschiedene Methoden im Stand der Technik für das Einfügen einer DNA-Sequenz und einer Expressionskontrollsequenz in einen Vektor. Diese schließen zum Beispiel die direkte Ligation, synthetische Linker, Exonuklease- und Polymerase-gebundene Reparaturreaktionen, gefolgt von einer Ligation, oder Verlängerung des DNA-Stranges mit DNA- Polymerase und einer geeigneten Einzelstrangmatritze, gefolgt von einer Ligation, ein. Jede dieser kann zur Synthese von erfindungsgemäßen SGH- ähnlichen Polypeptiden gewählt werden.
Es sollte auch klar sein, daß die tatsächliche DNA-Sequenz, die in einer ausgewählten Wirt-Expressionskontrollsequenz-Vektor-Kombination exprimiert wird, zu Produkten führen kann, die nicht identisch mit dem reifen SGH sind. Zum Beispiel könnte die exprimierte DNA-Sequenz für reifes SGH plus ein Methionin oder einen Teil oder die gesamte vermutete Signalsequenz des SGH oder andere Aminosäuren, die mit dem SGH nicht in Beziehung stehen, codieren. Die exprimierte DNA-Sequenz könnte in einer anderen Ausführungsform nur einen Teil oder Teile des SGH allein oder zusammen mit Methionin oder anderen Aminosäuren codieren. Diese Erfindung schließt beide Möglichkeiten ein. Zum Beispiel könnte ein mit einer ein Schweine-Prä-Wachstumshormon oder f-met-SGH codierenden Nukleotid- Sequenz transformierter Wirt diesen SGH-ähnlichen Stoff, für sich allein oder mit anderen Aminosäuren verbunden, herstellen oder er könnte ein reifes SGH-Produkt sekretieren. Alles, was notwendig ist, ist, daß das Produkt entweder nach der Isolierung aus der Fermentationskultur oder nach üblicher Behandlung, wie Spaltung, synthetischer Verknüpfung oder durch andere gut bekannte Verfahren eine wachstumsfördernde biologische Aktivität des SGH zeigt.* * Es sollte ferner klar sein, daß das f-Met oder andere nicht mit SGH in Beziehung stehende Aminosäuren oder für die Aktivität nicht wesentliche Aminosäuren des SGH selbst vor der Verwendung des Produkts chemisch oder enzymatisch entfernt werden können. Sie können auch während der Expression durch die Wirtszelle gespalten werden.
In der vorliegenden Synthese wurde die folgende Konstruktion ausgewählt, um ein Schweinewachstumshormon-ähnliches Polypeptid zu exprimieren: SGH-Δ7. Es wurde ein rekombinantes DNA-Molekül, wie in Figur 7 gezeigt, hergestellt.
Es wurde zunächst pBGH-Δ9 (Ser) aus E. coli K12λ (pBGH-Δ9(Ser)), einer Gabe von Gary Buell und einer Kultur, die bei der American Type Culture Collection am 16. August 1982 unter der Hinterlegungssnummer 39174 hinterlegt wurde, isoliert, wobei das Plasmid-Isolierungsverfahren im wesentlichen wie bei Klein, R.D. et al., Plasmid 3 (1980), S. 88-91 beschrieben, verwendet wurde. Dieses Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen Eco RI und Bam HI gespalten, und das Eco RI-Bam HI-Fragment (Fragment A) (Figur 7) wurde isoliert. Dasselbe Plasmid wurde ferner mit Eco RI und HgiAI gespalten, und das etwa 88 Basenpaare große EcoRI-HgiAI Fragment (Fragment B) (Figur 7) wurde isoliert. Dasselbe Plasmid wurde ferner mit Pvu II und Bam HI gespalten, und das etwa 103 Basenpaare große Pvu II-Bam HI-Fragment (Fragment C) (Figur 7) wurde isoliert.
Dann wurde das vorstehend beschriebene pSGH-9D mit HgiAI und Pvu II unter Verwendung der im wesentlichen selben Bedingungen gespalten und der Teil der SGH codierenden Sequenz isoliert, der sich von der HgiAI Spaltstelle (GTGCT C) bis zur Pvu II Spaltstelle (CAG CTG) (Figuren 7-8) erstreckt. Dann wurde dieses Fragment mit den drei Fragmenten (A, B und C) ligiert, die vorher aus pBGH-Δ9 (Ser) hergestellt worden waren, wobei Standardbedingungen und T4 DNA-Ligase über Nacht bei 16ºC verwendet wurden.
Wegen der Ähnlichkeiten zwischen der BGH-codierenden Sequenz von pBGH-Δ9 (Ser) und pSGH-9D und der Degeneration des genetischen Codes, codiert das rekombinante DNA-Molekül, das durch die vorstehend beschriebene Ligation erhalten wurde, ein SGH-ähnliches Polypeptid, dem die auf das f-Met am Anfang folgenden ersten 7 Aminosäuren (Figuren 7-8) fehlen.
Die SGH-codierende Sequenz, die dieses Molekül kennzeichnet, weist drei Nukleotide auf, die unterschiedlich zu denen sind, die SGH in pSGH-9D (Figuren 4-5) codieren. Zwei dieser Unterschiede resultieren aus den Unterschieden zwischen der BGH codierenden Sequenz und der SGH-codierenden Sequenz (A und C, Figur 8). Der dritte Unterschied entstammt der besonderen Konstruktion, die verwendet wurde, um pBGH-Δ9 (Ser) (C, Figur 8) herzustellen. Keiner dieser Nukleotidunterschiede verändert die Aminosäuresequenz des SGH-ähnlichen Polypeptids, das von der DNA-Insertions-Sequenz von pSGH-Δ7 codiert wird.
Dann wurden 200 ul kompetenter E. coli K12 λ (eine Gabe von Walter Fiers) in Gegenwart von 10 ul 0,1 M MgCl&sub2; durch eine 15 Min. Kühlung der Zellen in Eis, Inkubation bei 42ºC 2 Min. lang und Inkubation bei Raumtemperatur 10 Min. lang transformiert. Nach Zugabe von 2 ml L- Brühe, wurden die Zellen eine Std. lang bei 37ºC gezüchtet und ein 200 ul Aliquot auf Petrischalen ausplattiert, die L-Brühe, versetzt mit 50 ug/ml Ampicillin enthielt. Die Kolonien wurden 16 Std. bei 37ºC gezüchtet, und 24 ampicillinresistente Clone wurden wahllos ausgewählt.
Kulturen aller dieser Clone wurden in 5 ml L-Brühe, versetzt mit 50 ug/ml Ampicillin, 12 Std. bei 37ºC aufgezogen, und es wurde Plasmid- DNA von 1 ml Zellen von jeder Kultur durch die Minipräparations- ("Miniprep")-Methode, beschrieben von Klein et al., supra, gereinigt. Anschließend wurde die Größe der Eco RI-Bam HI-Insertionen in den 24 Plasmiden durch Eco RI-Bam HI-Restriktion und Polyacrylamid-Gelfraktionierung bestimmt. Es wurden 9 Fragmente ausgewählt, die Insertionen von geeigneter Größe aufwiesen. Dann wurde E. coli MC1061, im wesentlichen wie bei Buell, G.N. et al, J. Biol. Chem. 254 (1979), S. 9279-83, beschrieben, mit einem dieser Clone, bezeichnet als pSGH-Δ7, transformiert. Die Zellen wurden auch mit pcI857 (eine Gabe von W. Fiers)* transformiert. Es wurden mit pSGH-Δ7 und pcI857 transformierte Zellen durch Züchten der Kolonien 16 Std. bei 30ºC in L-Brühe, versetzt mit Ampicillin (50 ug/ml) und Kanamycin (40 ug/ml), selektioniert.
Dann wurden willkürlich Ampicillin- und Kanamycin-resistente Kolonien entnommen und über Nacht in 5 ml L-Brühe bei 30ºC gezüchtet, die wie zuvor mit Ampicillin und Kanamycin versetzt worden war. Dann wurden die Kulturen mit 25 ml L-Brühe bei 42ºC verdünnt und die Zellen bei 42ºC * pcI857 ist ein kleines Plasmid, das einen temperaturempfindlichen PL-Repressor und das Gen trägt, das die Kanamycin-Resistenz codiert.
2 Std. (O.D.=1) wachsengelassen. Um die von den transformierten Zellen produzierten SGH-ähnlichen Polypeptide zu isolieren, wurde 1 ml der Zellen genommen und geschleudert (8000 UpM, 4 Min.), 50 ul Laemmli Puffer (1% SDS) hinzugefügt [Laemmli, Nature 227 (1970), S. 681ff.], das Gemisch 15 Min. gekocht und die Zellen noch einmal zentrifugiert (8000 UpM, 4 Min.), um die Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde mittels eines SGH Konkurrenz "Competition"-Radioimmunoassay unter Verwendung von Kaninchen-Antiserum gegen authentisches BGH getestet. Ausbeute: SGH Aktivität (mg/l) 32; SGH-ähnliche Moleküle pro Zelle 1,6 x 10&sup6;.
Deswegen erlauben die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und rekombinanten DNA-Moleküle die Herstellung von SGH-ähnlichen Polypeptiden in hoher Ausbeute. Darüberhinaus erlauben die erfindungsgemäßen Sequenzen, Moleküle und Verfahren die Herstellung von neuen SGH-ähnlichen Polypeptiden, verwendbar nach der Reinigung mit üblichen Verfahren, als allgemeine anabole Wirkstoffe bei Schweinen, insbesondere, um die Wachstumsrate, den Gewichtszuwachs und die Fleischproduktion bei diesen Tieren zu erhöhen.
Während die vorstehend beschriebene Ausführungsform eines Verfahrens zur Herstellung von SGH-ähnlichem erfindungsgemäßem Polypeptid ein SGH-ähnliches Polypeptid liefert, dessen erste 7 Aminosäuren fehlen und das ein f-Met enthält, verglichen mit authentischem SGH, können andere Konstruktionen von Fachleuten vorgenommen werden, um andere SGH- ähnliche Polypeptide herzustellen, ohne den Schutzbereich dieser Erfindung zu überschreiten. Zum Beispiel kann eine Konstruktion vorgenommen werden, in der ein ATG Startcodon oder ein ATG Startcodon und andere Codons direkt mit dem TTC Codon, das die erste Aminosäure des authentischen SGH codiert, verbunden ist (sind). Eine solche Konstruktion würde die Herstellung eines reifen SGH ermöglichen, verbunden mit einem f-Met oder durch andere Aminosäuren mit einem f-Met.*
Jedoch wird die Verwendung von pSGH-Δ7 in E.Coli HB101 bevorzügt, um die erfindungsgemäßen SGH-ähnlichen Polypeptide herzustellen, weil wesentlich höhere Ausbeuten erhalten werden. * Es sollte klar sein, daß jede Aminosäure, die nicht Teil des reifen SGH oder der für die Aktivität unwesentlichen Aminosäuren des SGH selbst ist, während der Expression oder daraufffolgend entfernt werden kann, bevor das Polypeptid zue Behandlung von Tieren verwendet wird.
Ein Verfahren, das zur Herstellung einer Konstruktion nützlich ist, die f-Met-reifes SGH codiert, ist in den Figuren 9-10 dargestellt. In dieser Ausführungsform wurde pSGH-9D mit Hae II restringiert, und es wurden die Nukleotide, die vor dem die Aminosäure 1 des reifen SGH codierenden TTC Codon verblieben sind, entfernt und das verbleibende Fragment mit Ava I gespalten, um ein 5'-codierendes Ende des reifen SGH, beginnend mit TTC zu isolieren. Dann wurde dieses Fragment mit einem Ava I-Bam HI-Fragment von pSGH-Δ7, das 3'-codierende Ende des reifen SGH codierend, kombiniert. Anschließend wurde dieses Fragment so in einen Clonierungsvektor, der dem vorher beschriebenen pBGH-Δ9 (Ser) entstammt, eingefügt, daß das TTC codon mit stumpfen Enden mit einem ATG Codon verknüpft wurde. Entsprechend ermöglicht diese Konstruktion (pSGH-(Met- Phe)) die Herstellung von f-Met-reifem SGH in geeigneten Wirten. Es wurde unter Verwendung von vor stehend beschriebenen Techniken ferner ein Δ3-SGH hergestellt.
Es sollte klar sein, daß nicht sämtliche derartigen Konstruktionen bei der Herstellung der gewünschten erfindungsgemäßen SGH-ähnlichen Polypeptide gleich effektiv sein können. Jedoch kann ein Fachmann leicht eine Konstruktion und ein für ein(e/n) spezielle(s/n) Expressionssystem, Wirt und Anwendung geeignetes Polypeptid unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Untersuchungen auswählen.
Die vorstehend beschriebenen SGH-ähnlichen Polypeptide können nach der Reinigung eingesetzt werden, um Schweine zu behandeln, wobei an sich bekannte Mittel und Verfahren zur Verabreichung von Wachstumshormonen an Tiere [z.B. E. J. Turman, supra], angewendet werden, um ihre Wachstumsrate und Fleischproduktion zu verbessern. Zum Beispiel hat SGH- Δ7, wie vorstehend beschrieben hergestellt, eine Gewichtszuwachs-erhöhende Aktivität gezeigt, ähnlich der des natürlichen SGH in Rattentests.
Mikroorganismen und rekombinante DNA-Moleküle, hergestellt nach den erfindungsgemäßen Verfahren werden beispielhaft dargestellt durch Kulturen, die in der Kultursammlung American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, am 15. September 1982 hinterlegt wurden und als SGH-A und B ausgewiesen sind:
A: E.coli K12 MC1061 (pSGH-9D)
B: E.coli K12 λ (pSGH-Δ7)
Diesen Kulturen wurden die Hinterlegungsnummern ATCC 39191 bzw. 39192 zugewiesen.
Während eine Anzahl von erfindungsgemäßen Ausführungsformen hier vorstehend dargelegt wurde, wird darauf hingewiesen, daß unsere Grundkonstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungsformen bereitzustellen, die die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen benutzen. Daher sollte selbstverständlich sein, daß der Schutzbereich dieser Erfindung eher durch die angehängten Ansprüche definiert werden soll, als durch die bestimmten Ausführungsformen, die vorher an Hand von Beispielen dargelegt wurden.

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die ein aus Polypeptiden der Formeln Met-AA&sub8; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH und AA&sub8; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH ausgewähltes Polypeptid codiert, wobei SGH die in den Figuren 4-5 der Abbildungen dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

2. Rekombinantes DNA-Molekül, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die ein aus Polypeptiden der Formeln Met-AA&sub1; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH und AA&sub1; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH ausgewähltes Polypeptid codiert, wobei SGH die in den Figuren 4-5 der Abbildungen dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül in dem transformierten E.coli K12 λ-Stamm mit der Hinterlegungs-Nummer ATCC 39192 enthalten ist.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül pSGH-(Met-Phe) ist, wobei das Molekül mit rekombinanten DNA-Molekülen hergestellt wird, die in transformierten E.coli K12-Stämmen mit den Hinterlegungs-Nummern ATCC 39191, ATCC 39192 und ATCC 39174 enthalten sind, wie in den Figuren 9-10 der Abbildungen dargestellt.

5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine Expressionskontrollsequenz, wobei die Expressionskontrollsequenz funktionell mit der DNA-Sequenz verknüpft ist.

6. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskontrollsequenz aus der Gruppe, bestehend aus dem lac-System, dem trp-System, den Hauptoperator- und Promotorbereichen des Phagen λ und dem Kontrollbereich des fd- Hüllproteins, ausgewählt ist.

7. Polypeptid, ausgewählt aus Polypeptiden der Formeln: Met-AA&sub8; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH und AA&sub8; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH, wobei SGH die in den Figuren 4-5 der Abbildungen dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

8. Polypeptid, ausgewählt aus Polypeptiden der Formeln: Met-AA&sub1; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH und AA&sub1; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH, wobei SGH die in den Figuren 4-5 der Abbildungen dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend den Schritt der Züchtung eines aus Bakterien, Hefen und tierischen Zellen in Kultur ausgewählten Wirts, transformiert durch ein rekombinantes DNA-Molekül, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die ein aus Polypeptiden der Formeln: Met-AA&sub8; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH und AA&sub8; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH ausgewähltes Polypeptid codiert, wobei SGH die in den Figuren 4-5 der Abbildungen dargestellte Aminosäuresequenz aufweist, und wobei die DNA-Sequenz funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül verknüpft ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend den Schritt der Züchtung eines aus Bakterien, Hefen und tierischen Zellen in Kultur ausgewählten Wirts, transformiert durch ein rekombinantes DNA-Molekül, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die ein aus Polypeptiden der Formeln: Met-AA&sub1; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH und AA&sub1; bis AA&sub1;&sub9;&sub0; von SGH ausgewähltes Polypeptid codiert, wobei SGH die in den Figuren 4-5 der Abbildungen dargestellte Aminosäuresequenz aufweist, und wobei die DNA-Sequenz funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül verknüpft ist.

11. Zusammensetzung zur Behandlung von Tieren, gekennzeichnet durch ein Polypeptid nach Anspruch 7 oder 8.