DE3650553T2

DE3650553T2 - Verfahren zur Herstellung biologisch aktiver Rinder- und Schweine-Wachstumshormone und Mischung mit biologisch aktivem Schweine-Wachstumshormon

Info

Publication number: DE3650553T2
Application number: DE3650553T
Authority: DE
Inventors: Gwen Grabowski St. Louis Mi 63132 Krivi
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1985-02-22
Filing date: 1986-02-21
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2006-02-22
Also published as: IL112402A0; LTIP1819A; PT82070B; ES552234A0; ATE141327T1; EP0193515B1; AU596575B2; RU2072393C1; HUT40701A; IL77950A; DK80886A; RU2094439C1; EP0193515A3; JP2583214B2; JPH07304687A; CN1100272A; KR920000849B1; AU632293B2; DE3650553D1; IE80663B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression heterologer DNA-Sequenzen (z.B. eukaryotischer Gene) in prokaryotischen Organismen. Mehr im einzelnen betrifft die Erfindung die Produktion von reifem Rinder-Wachstumshormon oder reifem Schweine-Wachstumshormon mit einem N-terminalen Alanin in E. coli.
Während bei der Expression von Genen durch Eurkaryoten und Prokaryoten die prinzipiellen Schritte der Gentranskription in Boten-RNA (mRNA) und der anschließenden Translation dieser mRNA in Proteine gleich sind, werden verschiedene Gruppen intrazellulärer Kontrollen für diese Schritte verwendet.
Außerdem werden in Eukaryoten viele reife Proteine zuerst als Präproteine translatiert, d.h. Polypeptide, die aus der reifen Proteinsequenz, fusioniert mit einer Leader- oder Signalsequenz, bestehen. Eukaryotische mRNA codiert für das gesamte Präprotein, das nach der Translation prozessiert wird, um die Leader-Sequenz zu entfernen, und das reife Protein zur Verfügung zu stellen. Während eukaryotische Zellen für die spezifische Prozessierung derartiger Präproteine zu reifen Proteinen ausgerüstet sind, können prokaryotische Zellen allgemein nicht die in eukaryotischen Proteinen vorliegenden Prozessierungssignale erkennen. Wenn vollständige komplementäre DNA (cDNS)-Transkripte eukaryotischer mRNA als DNA-Sequenzen für eine Expression in Prokaryoten verwendet werden, wird daher das Präprotein und nicht das reife Protein gefunden. Es ist möglich, Präproteine in vitro in reife Proteine überzuführen, jedoch nicht ohne signifikante Kosten.
In dem Fall, in dem die für das reife Protein codierende DNA-Sequenz für die reife Proteinexpression in Prokaryoten verwendet wird, fehlen dieser Sequenz die eukaryotischen Translations- und Posttranslations-Prozessierungssignale, die üblicherweise in der DNA für die Leader-Sequenz enthalten sind. Daher hat es sich für die Expression klonierter eukaryotischer Gene oder anderer heterologer DNA-Sequenzen in prokaryotischen Systemen aus Gründen der Effizienz als zweckmäßig erwiesen, prokaryotische Steuersignale zu verwenden, da eukaryotische Signale von einer prokaryotischen Wirtszelle nicht erkannt werden können.
Der Ausdruck "heterologe DNA" bedeutet hier DNA, von der zumindest ein Teil normalerweise nicht im Genom der Wirtszelle enthalten ist. Beispiele heterologer DNA schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf virale und eukaryotische Gene, Genfragmente, Allele und synthetische DNA-Sequenzen. Der Ausdruck "heterologes Protein" oder "heterologes Polypeptid" ist hier als Protein oder Polypeptid definiert, von dem für zumindest einen Teil im Genom der Wirtszelle nicht codiert wird.
Die prokaryotischen Steuersignale enthalten einen Promotor, der die Initiation der Transkription signalisiert, und Translations-Steuersignale, die eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translations-Startsignal und ein Translations-Stopsignal enthalten. Alle diese Signale mit Ausnahme des Translations-Stopsignals müssen vor dem eukaryotischen Gen oder anderer DNA, die zu exprimieren sind, angeordnet sein.
Im Stand der Technik wurden einige Ansätze für die Expression heterologer DNA (z.B. eukaryotischer Gene) in Prokaryoten verwendet. In einem Ansatz wird das DNA-Segment, das für das erhaltene Protein codiert, mit der DNA ligiert, die für das gesamte oder einen Teil eines Bakterienproteins unter der Kontrolle seines Bakterienpromotors codiert. Die endogene prokaryotische DNA enthält notwendigerweise auch die Ribosomenbindungsstelle und das Translations-Startsignal. Die Expression derartiger ligierter DNA führt zu einem sogenannten Fusionsprotein, das ein eukaryotisches Polypeptid, gebunden an oder fusioniert mit einem ganzen oder einem Teil eines Bakterienproteins, umfaßt. Die Isolierung des eukaryotischen Proteins kann dann durch ortsspezifische enzymatische oder chemische Spaltung an der Fusionsstelle des endogenen und des eukaryotischen Proteins oder durch selektiven Abbau der prokaryotischen Polypeptidsequenzen erzielt werden.
Beispiele veröffentlichter Arbeiten über die Produktion eukaryotischer Fusionsproteine in Bakterien schließen ein: die EP-47 600-A (veröffentlicht am 17. März 1982), welche Fusionsund Nicht-Fusionsproteine betrifft, die Rinder-Präwachstumshormon oder Rinder-Wachstumshormon ("bHG") am Carboxy (C)-Terminus mit oder ohne einen Teil eines prokaryotischen Proteins am Amino (N)-Terminus umfassen; die GB-2 073 254-A (veröffentlicht am 14. Oktober 1981), welche Fusionsproteine von bGH und E. coli-β-Lactamase betrifft; E. Keshet et al., Nucleic Acid Research, 9:19-20 (1981), welche ein Fusionsprotein von bGH und E. coli-β-Lactamase betrifft; die EP-95 361-A (veröffentlicht am 30. November 1983), welche ein Fusionsprotein betrifft, das sequentiell ein endogenes Protein am N-Terminus, eine Translations-Startsignal-Aminosäure, eine Enterokinase-Spaltstelle und ein exogenes Protein (z.B. Wachstumshormon) am C-Terminus umfaßt. Dieser Fusionsprotein-Ansatz ist jedoch insofern mühevoll, als er eine in vitro-Prozessierung nach der Reinigung erfordert, und die Kosten des (der) Enzyms (Enzyme) für die Prozessierung kommerzieller Mengen können ein Hindernis darstellen.
Fusionsproteine wurden jedoch zu einem attraktiven System für die Expression einiger eukaryotischer Gene oder anderer heterologer DNA in prokaryotischen Zellen, da das Fusionprodukt einige der erhaltenen heterologen Proteine gegen einen intrazellulären Abbau zu schützen scheint. Bakterienzellen scheinen einige darin erzeugte eukaryotische Proteine als fremd zu erkennen, und bauen diese Proteine folglich als fremd ab, sobald die Proteine erzeugt werden oder kurz danach. Für Schutzzwecke ausgebildete Fusionsproteine können endogene Polypeptidsequenzen entweder am Amino- oder Carboxy-Terminus des heterologen Proteins verwenden. Ein Beispiel des letzteren Ansatzes ist in der EP-111 814-A (veröffentlicht am 27. Juni 1984) zu finden, welche Fusionsproteine beschreibt, die eine Form von bGH mit einem synthetischen vorderen Ende (Amino-Terminus) und E. coli-β-Galactosidase am C-Terminus umfassen. Die Vorteile werden wiederum durch die Notwendigkeit der nachfolgenden Spaltung des heterologen Proteins vom endogenen Polypeptid beeinträchtigt, wie vorstehend angegeben.
In einem weiteren Ansatz ist das Translations-Startsignal, ATG, unter der Kontrolle eines Bakterienpromotors unmittelbar vor der DNA-Sequenz angeordnet, die für ein heterologes (z.B. eukaryotisches) Protein codiert, das sowohl am N- als auch C- Terminus des erzeugten Proteins frei ist von endogenem Protein. Obwohl die von derartigen Gen-Konstrukten hergestellten Proteine keine nachfolgende Spaltung zur Erzeugung des gewünschten Proteins erfordern, enthalten sie typischerweise ein Methionin (in einigen Fällen ein Formylmethionin) am N-Terminus, da das ATG-Startsignal auch ein Methionin-Codon ist. Wenn das gewünschte reife Protein nicht mit Methionin beginnt, wird daher der N-Terminus des Proteins durch den Einschluß dieses Methioninrests verändert.
Beispiele derartiger Gen-Konstrukte schließen ein: Guarente et al., Cell (1980), 20:543-553, worin das Kaninchen-β-Globingen, das ein N-terminales Valin aufweist, in E. coli unter Verwendung des eben beschriebenen Gen-Konstrukts exprimiert wird. Die Untersucher haben gefunden, daß, während "in Kaninchen-β- Globin kein Amino-terminales Methionin vorliegt, und Leucine in den Positionen 3, 14, 28, 31, 32 zu finden sind, ... im markierten Protein Leucine an den Positionen 4, 15, 29, 32 und 33 gefunden wurden, und ein Methionin in der Position 1 gefunden wurde. Dieses Ergebnis zeigt, daß das Protein Kaninchen-β- Globin plus ein Amino-terminales Methionin ist, das in E. coli nicht entfernt wird", id. 546-547.
Ein weiteres Beispiel betrifft die Produktion von Wachstumshormonen in Bakterien unter Verwendung des oben beschriebenen Gen-Konstrukts. Schoner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984), 81: 5403-5407, beschreiben ein hochgradiges Expressionssystem in Bakterien zur Erzeugung von bGH, das zur Produktion eines N-Methionyl-bGH führt; das heißt, einer Verbindung mit einer Aminosäuresequenz wie jener der natürlich vorkommenden bGH-Art plus ein Methionin an ihrem N-Terminus. Das Anfügen eines N-terminalen Methionins an verschiedene Wachstumshormon- Arten, die in Bakterien produziert werden, wird wiederum in der EP-103 395-A (veröffentlicht am 21. März 1984) und EP-75 444-A (veröffentlicht am 30. März 1983) für bGH, und Seeburg et al., DNA (1983), 2: 37-45, für bGH und Schweine-Wachstumshormon ("pGH") angegeben.
G. Gray et al., Gene 32, S. 21-30, 1984, sind von Interesse, da sie das Weglassen des Alanin-Codons nach dem Translations-Initiationscodon zur Erhöhung der bGH-Ausbeute in E. coli empfehlen. Gray et al. behandeln vor allem die Expression von bGH in Streptomyces lividans.
Die EP-0 123 811-A offenbart ein neues DNA-Segment, das einen GAL1-Promotor, gebunden an ein anderes Gen als das Galactokinase-Gen, zur Steuerung der Expression des Gens in einer Hefezelle enthält, und offenbart die Verwendung eines derartigen DNA-Segments bei einem Verfahren zur Expression heterologer Polypeptide, einschließlich bGH, in Hefe.
Das Anfügen eines N-terminalen Methionins an den natürlichen N-Terminus kann aus einigen Gründen unzweckmäßig sein. Erstens ist es möglich (obwohl es derzeit für unwahrscheinlich gehalten wird), daß das Methionin dazu tendieren kann, das Protein zu einem Antigen in einem Organismus zu machen, in dem das Protein ohne das N-Methionin endogen ist. Zweitens kann das Anfügen von Methionin an den N-terminalen Teil des Proteins eine unerwünschte Wirkung auf seine Bioaktivität oder seine physikalischen Eigenschaften ausüben. Drittens kann diese veränderte Form des Proteins wissenschaftliche Bemühungen zur Bestimmung der Beziehung der Funktionen des natürlichen Proteins zu seiner Struktur behindern. Ferner kann es vorteilhaft sein, über ein biosynthetisches Protein zu verfügen, das strukturell einem natürlich auftretenden Protein so nahe wie möglich kommt, wenn um eine Regierungsgenehmigung für medizinische oder veterinäre Anwendungen angesucht wird.
Die Fähigkeit derartiger Prokaryoten, wie Bakterien, das N- terminale Methionin aus Proteinen entweder während ihrer Produktion oder danach zu entfernen, war ein Thema von erheblichem Interesse. Beispielsweise untersuchte Waller, J. Mol. Biol. (1963), 7: 483-496, die N-terminale Aminosäurezusammensetzung "löslicher" und ribosomaler Proteine in einem zellfreien Extrakt von E. coli, und die EP-103 395-A (veröffentlicht am 21. März 1984) offenbart die Entfernung eines N-terminalen Methionins aus einem in E. coli hergestellten eukaryotischen Protein. Spezifisch wird Methionin aus einem von zwei bakteriell erzeugten bGH-Proteinen entfernt, von denen beide einen Serinrest unmittelbar nach dem ursprünglich vorliegenden N-terminalen Methionin enthalten. Das in diesen Untersuchungen verwendete Gen-Konstrukt umfaßte jedoch eine synthetische Startsequenz, die für 5'- Methionin-Serin-Leucin-3' codierte, und die unmittelbar benachbart dem 5'-Ende einer bGH-Codiersequenz insertiert wurde, worin für die ersten 4 oder 9 natürlich vorkommenden Aminosäuren codierende Basen deletiert worden waren. Daher war das in E. coli hergestellte erhaltene Protein ein nicht natürlich vorkommendes Protein. Die GB-2 073 245-A (veröffentlicht am 14. Oktober 1981) offenbart, daß, wenn met pro im reifen bGH-Protein ala ersetzt, "Met durch Bakterien prozessiert werden kann, wobei modifiziertes bGH, beginnend mit der Aminosäuresequenz Pro Phe Ala Pro, erhalten wird".
Daher besteht ein Bedarf an der Entwicklung eines wirtschaftlichen und vorhersehbaren Mittels zur Herstellung heterologer (z.B. eukaryotischer) Proteine, die kein N-terminales Methionin aufweisen, in derartigen Mikroorganismen, wie Bakterien. Spezifisch ist es besonders erwünscht, ein Verfahren zu entwickeln, durch das derartige in Bakterien produzierte Proteine keine in vitro-Postfermentations-Prozessierung erfordern, und kein zusätzliches, nicht natürlich vorkommendes N-terminales Methionin enthalten.
Wachstumshormone (auch als Somatotropine bezeichnet) sind Polypeptide, die von Zellen der Hypophyse produziert und sezerniert werden und großteils artspezifisch in ihren Wirkungen sind. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Förderung des Skelettwachstums beeinflussen Wachstumshormone verschiedenste metabolische Prozesse, welche die Stimulation der Laktation, eine erhöhte Insulin-Freisetzung aus der Pankreas und Glucagon-Sekretion einschließen, und sie üben einen Lipid-Mobilisationseffekt aus. Beispielsweise wurde gezeigt, daß die exogene Verabreichung von bGH an Rinder die Milchproduktion, die Futtereffizienz und/oder Wachstumsrate erhöht, die Zeit zum Ansetzen von Fett verringert und das Fleisch-Fett-Verhältnis erhöht. Es ist jedoch noch immer nicht vollständig geklärt, wie das Hormon diese mehrfachen Wirkungen ausübt.
Durch umfassende Arbeiten mit menschlichem Wachstumshormon (hGH) wurde festgestellt, daß das Hormon, wie es von der menschlichen Hypophyse sezerniert wird, keine einzelne Moleküleinheit, sondern eine Mischung von Polypeptiden ist. Die Fraktionierung der verschiedenen hGH-Arten führte zur Herstellung einiger hGH- Fraktionen weder mit diabetogenen noch lipolytischen Wirksamkeiten.
Ähnlich wird bGH von Rindern in mehrfachen Formen produziert. Spezifisch werden vier Formen von bGH erzeugt, die sich an zwei Positionen des Proteins unterscheiden. Die N-terminale Aminosäure kann aufgrund einer angenommenen Ambiguität bei der Entfernung der Signalpeptid (Leader)-Sequenz variieren, so daß das reife Protein entweder mit NH&sub2;-phe-pro oder NH&sub2;-ala-phe-pro beginnt. Außerdem besteht eine Heterogenität an der Aminosäure 126, die entweder ein Leucin oder ein Valin ist. Dies ist anscheinend auf eine Allelenvariation in der Rinderpopulation zurückzuführen; Wallis (1969), FEBS Letters 3: 118-120; Fellows und Rogol (1969), J. Biol. Chem. 244: 1567-1575; Fernandes et al. (1971), FEBS Letters 18: 53-54; Fellows (1973), Personal Comments in Recent Progress in Hormone Research 29: 404; Santome (1973), Eur. J. Biochem. 37: 164-170; Graf und Li (1974), Biochem. Biophys. Res. Comm. 56: 168-176. Die vier Molekülformen (Arten) von Hypophysen-bGH sind hier wie folgt bezeichnet und abgekürzt:
Die bGH(A,V)- und bGH(V)-Arten werden hier manchmal kollektiv als "Valin-Allelen-bGH-Art" oder "Valin-bGH-Art" bezeichnet. Ähnlich werden die bGH(A,L)- und bGH(L)-Arten hier manchmal kollektiv als "Leucin-Allelen-bGH-Art" oder "Leucin-bGH-Art" bezeichnet. Die Nummern, die den Aminosäuren in den wie oben abgekürzten bGH-Proteinen zugeordnet sind, dienen nur Identifikations- und Referenzzwecken.
Mills et al. (1979), J. Biol. Chem. 245: 3407-3415, schlossen versuchsweise aus der Analyse von Cyanogenbromid-Fragmenten, daß Schweine-Wachstumshormon N-terminale Heterogenität zeigte und entweder ein N-termininales Phenylalanin, wie früher angegeben, oder ein N-terminales Alanin aufweisen konnte. Der Alaninrest, von dem Mills et al. versuchsweise schlossen, daß er ein N-terminaler Rest war, war jedoch ein Teil eines ala-met- Dipeptids, das tatsächlich in Schweine-Wachstumshormon in den Aminosäure-Positionen 3 und 4 vorkommt.
Die gesamten DNA-Codiersequenzen und entsprechenden Aminosäuresequenzen für bGH(L) und pGH(P), d.h. Schweine-Wachstumshormon mit einem N-terminalen Phenylalanin, wurden von Seeburg et al., DNA (1983) 2: 37-45, veröffentlicht. Wenn dem Phenylalanin des Schweine-Wachstumshormons gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein zusätzliches Alanin vorausgeht (siehe nachstehende Beispiele), wird es hier als pGH(A) bezeichnet.
Allgemein wurde gefunden, daß Hypophysen einzelner Rinder eine Mischung von zumindest bGH(A,L) und bGH(L) oder bGH(A,V) und bGH(V) enthalten. Die N-terminale Analyse von in kultivierten Hypophysen-Zellen erzeugten bGH-Proteinen zeigt eine ungefähr 50:50 Mischung von Molekülen, die entweder ein N-terminales Phenylalanin (phe) oder ein N-terminales Alanin (ala) enthalten.
Im Handel erhältliche Zubereitungen, die aus gepoolten Hypophysen vieler Rinder hergestellt wurden, enthalten allgemein alle vier Molekülformen von Hypophysen-bGH. Ferner wurde angegeben, daß etwa 30 % der Moleküle in aus gepoolten Drüsen erhaltenen bGH-Zubereitungen Valin aufweisen, das Leucin in Position 126 ersetzt; Ferandez et al. (1971), FEBS Letters 18: 53-54. Standard-Biochemieverfahren zur Trennung der vier bekannten bGH- Formen ermöglichen keine Produktion jeder oder einer beliebigen dieser Arten im kommerziellen Maßstab. Unterschiedliche biologische Wirksamkeiten dieser vier Formen von bGH wären zweckmäßig zu untersuchen und kommerziell verfügbar zu machen, wobei jede der Formen im wesentlichen frei von einer oder mehreren der anderen drei Formen und/oder frei von anderen Proteinen, die von Rindern stammen, verwendet wird. Der hier zur Beschreibung eines oder mehrerer spezifischer Proteine verwendete Ausdruck "im wesentlichen rein" bedeutet im wesentlichen frei von Proteinen und/oder anderen Substanzen, mit denen das (die) Protein(e) in einer natürlichen Umgebung oder Quelle assoziiert sind. Für diese und andere Zwecke schließen die Ziele dieser Erfindung ein Verfahren ein, durch das zumindest einige dieser einzelnen bGH- Formen zweckmäßig hergestellt werden können.
Demgemäß erfordert das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem daher keine in vitro-Prozessierung zur Entfernung eines Methionins vom N-Terminus, um in Prokaryoten reifes Rinder- und/oder Schweine-Wachstumshormon zu produzieren, das keinen Methioninrest am N-Terminus aufweist.
Dieses technische Problem wird durch das Vorsehen der in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst. Demgemäß betrifft die Erfindung auch die Produktion eukaryotischer oder anderer heterologer Peptide, welche die im wesentlichen gleiche Aminosäuresequenz wie natürlich vorkommendes reifes Rinder- und/oder Schweine-Wachstumshormon haben, das kein N- terminales Methion aufweist, in Prokaryoten.
Weiters sieht die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Polypeptiden mit der Aminosäuresequenz, die in reifen eukaryotischen Polypeptiden, wie bGH(A,L), bGH(A,V) und pGH(A), zu finden ist, in Prokaryoten vor.
Die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten bGH-Polypeptide liefern ein Mittel zur Potenzierung von Somatotropin-Wirksamkeiten, wie erhöhter Milchproduktion, Wachstumsrate und/oder Futtereffizienz.
Die Ausführungsformen der Erfindung werden durch die folgende allgemeine und detaillierte Beschreibung der Erfindung besser verständlich.
In einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines reifen Rinder-Wachstumshormon (bGH)- oder eines reifen Schweine-Wachstumshormon (pGH)- Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist, in E. coli vor, welches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Bewirken der Expression einer DNA-Codiersequenz für das reife bGH- oder pGH-Polypeptid mit einem N-terminalen Alanin in E. coli, welche DNA weiters unmittelbar vor dem Codon für das N- terminale Alanin ein Methionin/Startcodon enthält, wobei die E. coli reifes bGH oder pGH, das ein N-terminales Alanin aufweist, erzeugen;
(b) Gewinnen des reifen bGH- oder pGH-Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines reifen bGH- oder pGH- Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist, in E. coli vor, welches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Selektieren einer DNA-Codiersequenz für das bGH- oder pGH-Polypeptid, wobei das Initialcodon für das N-terminale Alanin codiert;
(b) Insertieren dieser DNA-Codiersequenz in einen Expressionsvektor, wobei eine Gensequenz erhalten wird, die einen in E. coli operativen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translations-Startsignal mit einem Methionin-Codon unmittelbar vor der DNA-Codiersequenz und ein Translations-Stop-Codon aufweist;
(c) Einführen des diese Gensequenz tragenden Expressionsvektors in E. coli,
(d) Kultivieren von E. coli unter Bedingungen, die eine Expression dieser DNA und die Erzeugung des bGH- oder pGH-Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist, ermöglichen; und
(e) Gewinnen des das N-terminale Alanin aufweisenden Polypeptids.
Weitere Ausführungsformen und bevorzugte Ausführungsformen sind in den Ansprüchen charakterisiert.
Andere Ausführungsformen schließen verschiedene Gene, DNA- Verfahren und transformierte Bakterien ein, die in den oben angegebenen Methoden verwendet werden können.
In den folgenden schematischen Darstellungen bedeutet der schraffierte Bereich die DNA-Codersequenz für einen Bakterien- Promotor, der schwarz ausgefüllte Bereich bedeutet eine heterologe DNA-Codiersequenz, die Balken bedeuten zusätzliche DNA- Codiersequenzen, wie angegeben, und der Richtungspfeil bedeutet die Orientierung von 5' nach 3' der DNA-Codiersequenzen. Relevante Restriktionsendonucleasestellen sind auch gezeigt. Die so bezeichneten DNA-Regionen dienen nur der schematischen Darstellung und sind nicht maßstabgetreu gezeichnet.
Fig.1 zeigt die Konstruktion von M13mp8/XbaI mit einem M13mp8-Vektor, der an der SmaI-Restriktionsendonucleasestelle insertiert eine XbaI-Restriktionsendonucleasestelle aufweist.
Fig.2 zeigt die Konstruktion von M13mp8/bGHex-1 mit M13mp8/XbaI, der eine bGH(L)-DNA-Codiersequenz trägt.
Fig.3 zeigt die Erzeugung einer bGH(A,L)-DNA-Codiersequenz durch Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese.
Fig.4 zeigt die Erzeugung einer bGH(A,V)-DNA-Codiersequenz durch Oligonucleotid-gesteuerte gesteuerte ortsspezifische Mutagenese.
Fig.5 zeigt die Konstruktion eines pMON3209-Expressionsvektors mit pBGHex-1, der eine bGH(A,L)-DNA-Codiersequenz anstelle einer bGH(L)-DNA-Codiersequenz trägt.
Fig.6 zeigt die Konstruktion eines pMON3215-Expressionsvektors mit pBGHex-1, der eine bGH(A,V)-DNA-Codiersequenz anstelle einer bGH(L)-DNA-Codiersequenz trägt.
Fig.7 zeigt die Konstruktion von M13mp9/pGHex-1 mit M13mp9, der eine pGH(P)-DNA-Codiersequenz trägt.
Fig.8 zeigt die Erzeugung einer pGH(A)-DNA-Codiersequenz durch Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese.
Fig.9 zeigt die Konstruktion von pBGHex-1* mit pBGHex-1, worin die stromaufwärts vom 5'-Ende der prtp-DNA-Sequenz angeordnete EcoRI-Restriktionsendonucleasestelle entfernt wurde.
Fig.10 zeigt die Konstruktion eines pMON3213-Expressionsvektors mit pBGHex-1*, der eine pPGH(A)-DNA-Codiersequenz anstelle einer bGH(L-)-DNA-Codiersequenz trägt.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erzeugung reifer Rinder-Wachstumshormon- oder reifer Schweine-Wachstumshormon-Polypeptide, die ein N-terminales Alanin aufweisen, in E. coli vor. Daher werden die Polypeptide ohne ein N-terminales Methionin produziert, und die Notwendigkeit einer in vitro-Prozessierung zur Herstellung eines derartigen Polypeptids ohne ein N-terminales Methionin wird eliminiert. Die konsistente Erzeugung eines derartigen Polypeptids ohne ein in der Gen-Codiersequenz vorliegendes N-terminales Methionin ist ein neues und ziemlich unerwartetes Ergebnis.
Die vorliegende Erfindung sieht ein wertvolles Verfahren zur Erzeugung im wesentlichen reiner reifer Rinder-Wachstumshormon- oder reifer Schweine-Wachstumshormon-Proteine vor, die ein N-terminales Alanin aufweisen. Derartige Proteine schließen gegebene Arten von Rinder- und Schweine-Somatotropin und Varianten hievon ein.
In den Beispielen der vorliegenden Erfindung, in denen im wesentlichen reine Arten von bGH oder pGH von Bakterienzellen erzeugt werden, fehlen eindeutig Hinweise und Lehren für die Entfernung des N-terminalen Methionins. Tatsächlich geben alle Berichte über eine bGH-Expression durch Bakterienzellen, worin der N-Terminus eine N-terminale Aminosäuresequenz umfaßt, die zu natürlich auftretenden bGH-Arten homolog ist, das Vorliegen eines N-terminalen Methionins an. In Seeburg et al., DNA (1983) 2: 37-45, wurde die Gensequenz für die N-terminalen Phenylalanin-Arten von bGH, z.B. bGH(L), absichtlich für eine Expression in E. coli ausgewählt, teilweise um das erwartete Anfügen einer zweiten hydrophoben Aminosäure (Methionin) an das hydrophobe N-terminale Alanin der anderen bGH-Arten, z.B. bGH(A,L), zu vermeiden. Daher lehren bisher verfügbare Untersuchungen eine Retention des N-terminalen Methionins in bakteriell erzeugten bGH-Arten. Ungeachtet dieser Berichte wurde festgestellt, daß aus den oben diskutierten Gründen eine Notwendigkeit zur Erzeugung jeder der beiden bGH-Arten, bGH(A,L) und bGH(A,V), und der pGH-Art pGH(A) besteht. Versuche zur Produktion dieser Somatotropin-Arten in Bakterien wurden jedoch mit der Erwartung unternommen, daß die erzeugten Polypeptide ein N-terminales Methionin enthalten würden.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung detailliert angegeben, war der Ansatz zur Produktion von bGH(A,L), bGH(A,V) und pGH(A) in Bakterien kurz gefaßt wie folgt. Die DNA- Codiersequenzen für die oben angeführten Proteine wurden durch Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese der DNA- Codiersequenzen für Rinder- und Schweine-Somatotropin-Arten konstruiert, die ein N-terminales Phenylalanin enthielten, wie in Fig.3, 4 und 8 gezeigt. Danach wurden bGH(A,L)-, bGH(A,V)- und pGH(A)-Codiersequenzen in Expressionsvektoren insertiert, so daß die End-Gensequenz sequentiell einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, ein ATG-Start/Methionin-Codon unmittelbar benachbart der DNA-Codiersequenz für entweder bGH(A,L), bGH(A,V) oder pGH(A) und ein Translations-Stop-Codon umfaßte. Anschließend wurden E. coli mit einem gegebenen Expressionsvektor transfiziert, der die gewünschte Gensequenz trug, und unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression der gewünschten heterologen DNA und die Produktion des gewünschten heterologen Proteins ermöglichen. Die so produzierten Proteine wurden dann sequenziert und auf ihre geeignete biologische Wirksamkeit getestet.
Daher wurde hier gefunden, daß, wenn eine DNA-Sequenz, die ein Startsignal/Methionin-Codon, unmittelbar gefolgt von den Codons für ein heterologes N-Alanyl-Polypeptid, enthält, exprimiert wird, das aus dem prokaryotischen Organismus gewonnene Protein tatsächlich ein Alanin und kein Methionin am N-Terminus aufweist. Es wird angenommen, daß ein ähnliches Ergebnis erhalten werden kann, wenn dem Alanin-Codon unmittelbar bis zu etwa drei angrenzende Methionin-Codons vorausgehen, die das Startsignal für die Translation der für das gewünschte Polypeptid- Produkt codierenden mRNA enthalten. Beispielsweise kann die das Translations-Startsignal und die Codons für das gewünschte Polypeptid-Produkt enthaltende DNA eine beliebige Sequenz enthalten, die geeignet für met ala, met met ala, met met met ala oder irgendein funktionelles Äquivalent hievon codiert.
Ein N-Alanyl-Polypeptid ist hier als Polypeptid definiert, das ein Alanin an seinem Amino-Terminus aufweist. Obwohl die Anmelder nicht wünschen, an die folgende Theorie eines Mechanismus gebunden zu sein, wird angenommen, daß nach der Translation das N-terminale Methionin des Polypeptids vom Prokaryoten enzymatisch entfernt wird, wenn die nächste Aminosäure Alanin oder eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften (z.B. Polarität oder Hydrophobizität) ist, die eine derartige Entfernung des N-Methionins erleichtern. Ferner wird angenommen, daß viele Prokaryoten N-terminale Methionine aus heterologen und/oder endogenen Polypeptiden entfernen können, wenn die N- terminalen Methionine unmittelbar von einem Alanin gefolgt werden.
Diese Prokaryoten (z.B. verschiedene bekannte und von anerkannten Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen, wie ATCC, oder auf andere Weise öffentlich erhältliche Bakterien) schließen E. coli und verschiedene Stämme hievon ein, es wird jedoch angenommen, daß sie nicht darauf beschränkt sind. Tatsächlich wird angenommen, daß ein beliebiger Prokaryot, der ein Polypeptid mit einem N-terminalen Alanin aus einer DNA-Codiersequenz produzieren kann, die mit einem bis etwa drei angrenzenden Methionin- Codons beginnt, unmittelbar gefolgt von einem Alanin-Codon, potentiell bei der Durchführung der hier geoffenbarten Erfindung verwendbar ist. Kommerziell und auf andere Weise erhältliche prokaryotische Organismen können auf ihre Fähigkeit zur Produktion derartiger N-Alanyl-Polypeptide gescreent werden, indem in das Genom dieser Organismen ein Gen insertiert wird, das sequentiell einen in diesem Organismus operativen Promotor, für eine Ribosomenbindungsstelle codierende DNA, ein bis etwa drei angrenzende Methionin-Codons, die ein Translations-Startsignal enthalten, unmittelbar gefolgt von den Codons für ein heterologes N-Alanyl-Polypeptid, und ein Translations-Stopsignal umfaßt, danach die Expression dieses Gens bewirkt wird, und dann die N-terminale Aminosäuresequenz des so erzeugten heterologen Polypeptids bestimmt wird. Wenn gefunden wurde, daß ein derartiger prokaryotischer Organismus intern ein derartiges heterologes N-Alanyl-Polypeptid produziert, liegt dieser Organismus in der für Zwecke der vorliegenden Offenbarung und Ansprüche als "selektiert" definierten Klasse.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigen drei verschiedene Isolate des E. coli-Stamms K12, die alle bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt wurden und die Zugangsnummern ATCC 39936, 53010 und 53009 erhielten, eine Fähigkeit zur Entfernung N-terminaler Methionine, wenn diese N-terminalen Methionine unmittelbar von einem Alanin gefolgt werden.
Die vorliegenden Ergebnisse sind signifikant, da sie ein Verfahren zur Herstellung heterologer Polypeptide, die N-terminale Alanine aufweisen, in Prokaryoten vorsehen.
In einer der bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, um zwei bGH-Arten, bGH(A,L) und bGH(A,V), sowie eine pGH-Art, pGH(A), zu erzeugen, die frei sind von anderen Rinder- oder Schweine-Proteinen und/oder anderen bGH- oder pGH-Arten. Spezifisch sieht das Verfahren die Erzeugung von bGH(A,L), bGH(A,V) oder pGH(A) als einzelne Arten vor. Die Fähigkeit zur Produktion einer einzelnen bGH- oder pGH-Art mit Aminosäuresequenzen, die zu natürlich vorkommendem Somatotropinen homolog sind, ist von größter Bedeutung zur Bestimmung der genauen Bioreaktivität jeder bGH- oder pGH- Art angesichts der allgemein wie oben angegebenen zahlreichen Potenzierungseffekte von bGH und pGH. Tatsächlich wurde gefunden, daß die Verabreichung einer der beiden N-Alanyl-bGH-Arten eine Potenzierung von bGH-Funktionen, wie der Milchproduktion, ergibt. Ferner wurde gefunden, daß die Verabreichung einer die Laktation verstärkenden Menge an gemäß der vorliegenden Erfindung hergestelltem bGH(A,V) die Milchproduktion bei Milchkühen in einem statistisch (z.B. p< 0,05) größeren Ausmaß erhöht als ähnlich hergestelltes bGH(A,L). Bis heute gibt es keine Lehren über die relative Effizienz spezifischer bGH-Formen (Arten) bei der Verstärkung der Milchproduktion bei laktierenden Säugern. Außerdem gibt es keine früheren Ergebnisse, weder in vivo noch in vitro, die darauf schließen lassen, daß ein Unterschied in der Bioaktivität zwischen bGH-Arten festzustellen wäre. Unterschiede der relativen Effizienz von bGH-Arten bei der Potenzierung von anderen Eigenschaften von Wachstumshormonen, wie erhöhter Futtereffizienz und Wachstumsstimulierung, können ähnlich definiert werden. Daher können nun unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, welche die Produktion von zumindest zwei Molekülformen von Hypophysen-bGH in im wesentlichen reiner Form in Bakterien ermöglichen, und/oder unter Verwendung anderer verfügbarer Technologien die beim Erzielen einer durch ein spezifisches Wachstumshormon induzierten Reaktion effizientesten bGH-Arten hergestellt werden. Derartige andere verfügbare Technologien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die chemische Synthese von ganzen bGH-Proteinen oder Fragmenten hievon und/oder die Produktion in anderen Mikroorganismen, wie Hefe, oder in Säugerzellen unter Verwendung bekannter rekombinanter DNA-Techniken.
Sobald die Bioaktivität jeder natürlich vorkommenden Art bestimmt wurde, wird es außerdem für durchführbar gehalten, Polypeptid-Varianten jeder derartigen Art zu erzeugen, die ihre Somatotropin-Wirksamkeit weiter erhöhen würden. Daher wird angenommen, daß die Erzeugung von Somatotropin-Varienten durch Nucleotid- oder Aminosäure-Deletion, -Substitution und/oder -Addition verschiedene nützliche Äquivalente der hier geoffenbarten Zusammensetzungen vorsehen wird.
Die vorliegende Erfindung ist eine Verfeinerung der Verwendung einer rekombinanten DNA-Technologie zur direkten Erzeugung von reifem Rinder-Wachstumshormon und reifem Schweine-Wachstumshormon in E. coli. Daher setzt die Beschreibung der Erfindung Kenntnisse über die Grundtechniken voraus, die in der rekombinanten DNA-Technologie zur Isolierung und Klonierung von für Polypeptide codierenden DNA-Sequenzen verwendet werden, über die Umordnung oder Veränderung klonierter DNA-Sequenzen und die Expression klonierter oder modifizierter DNA-Sequenzen in transformierten Mikroorganismen. Derartige Techniken sind bekannt (siehe z.B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Maniatis, Fritsch & Sambrook Hrg., 1982).

ISOLIERUNG UND/ODER KONSTRUKTION HETEROLOGER DNA

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die für das gewünschte, im Prokaryoten herzustellende heterologe Polypeptid codierende DNA-Sequenz ausgewählt und isoliert, oder es wird eine hierfür codierende DNA-Sequenz konstruiert oder chemisch synthetisiert. In vielen wichtigen Ausführungsformen ist das Polypeptid ein eukaryotisches Protein. Wenn das Polypeptid klein und die vollständige Aminosäuresequenz bekannt ist, kann ein synthetisches DNA-Molekül oder eine für das Polypeptid codierende Sequenz konstruiert werden. Wenn die Aminosäuresequenz des Polypeptids unbekannt ist oder ihre Größe für die Synthese einer entsprechenden DNA-Sequenz aus praktischen Gründen zu groß ist, kann eine cDNA-Sequenz durch reverse Transkription aus entsprechender mRNA hergestellt werden, die aus das Polypeptid exprimierenden Geweben oder Zellen erhalten wurde. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise die Sequenz für bGH so aus Rinder-Hypophysen bereits durch Routine-Verfahren erhalten werden, die von Goodman et al., Methods in Enzymology 68: 75-90 (1979) beschrieben werden. Alternativ dazu kann eine cDNA-Sequenz aus mRNA hergestellt werden, welche aus Zellen isoliert wurde, die mit genomischer DNA transformiert wurden, welche aus einer nativen Genbank mit einer geeigneten Sonde isoliert wurde. Genomische DNA kann auch in verschiedenen Vektorsystemen modifiziert werden, so daß die DNA in Prokaryoten exprimiert werden kann. Diese Techniken sind bekannt.
Sobald eine heterologe DNA-Sequenz, welche die Codons für das gewünschte Polypeptid enthält, erhalten wird, kann es wünschenswert sein, bestimmte Modifikationen der Nucleotidsequenz des Moleküls vorzunehmen. Wenn das Molekül beispielsweise durch reverse Transkription aus einem mRNA-Template hergestellt wurde, enthält es häufig zumindest einen Teil der für die Leader-Sequenz des Präproteins codierenden DNA. Daher ist es notwendig, die gesamte Leader-Sequenz-DNA vor dem ersten Codon des gewünschten Proteins zu entfernen. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, ein Alanin-Codon am Beginn der für das gewünschte Protein codierenden Sequenz anzufügen oder zu substituieren, wenn nicht bereits ein N-terminales Alanin-Codon vorliegt. Dann wird ein Translations-Startsignal (das auch ein Methionin-Codon ist) stromaufwärts vom und unmittelbar benachbart dem Alanin-Codon eingeführt. Während das Startsignal/Methionin-Codon üblicherweise (und vorzugsweise) die Nucleotidsequenz ATG ist, kann die Sequenz GTG gelegentlich auch als Startinitiationssignal/Methionin-Codon dienen. Außerdem wird davon ausgegangen, daß das Vorliegen von mehr als einem Methionin-Codon, z.B. zwei, drei oder möglicherweise mehreren angrenzenden Codons für Methionin, äquivalent ist zum Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Wenn es nicht bereits vorhanden ist, sollte zumindest ein Translations-Stopsignal nach dem Codon für die C-terminale Aminosäure eingeführt werden. Beispiele von Translations-Stopsignalen schließen die Desoxynucleotid-Tripletts TAA, TGA und TAG ein. Im wesentlichen werden daher rekombinate DNA-Techniken zur Konstruktion einer rekombinanten DNA-Sequenz verwendet, die sequentiell ein Translations-Startsignal/Methionin-Codon, die Codons für das gewünschte Polypeptid mit dem N-terminalen Alanin-Codon benachbart dem Startsignal und zumindest ein Translations-Stopsignal benachbart dem Codon für die C-terminale Aminosäure enthält.
Es wurde gefunden, daß eine effiziente mRNA-Expression durch Sekundärstrukturen behindert werden kann, die durch die Wasserstoff-Bindung von zwei komplementären Nucleotidserien innerhalb der mRNA gebildet werden. Die Eliminierung dieser komplementären Sequenzen, insbesondere in jenem Teil des Moleküls, der für den N-Terminus codiert, erleichtert die Bindung von Ribosomen an die mRNA und erhöhte Expressionsraten. Es kann daher zeckmäßig sein, Codons, die an der Bildung derartiger Sekundärestrukturen teilnehmen, durch Codons für die gleiche Aminosäure, die jedoch aus einem unterschiedlichen Nucleotid- Triplett bestehen, zu ersetzen; siehe EP-75 444-A (veröffentlicht am 30. März 1983; Seeburg et al. (1983), DNA 2: 37-45; und Schoner et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5403-5407.
Andere Ansätze zur Konstruktion der heterologen DNA-Sequenzen sind Fachleuten bekannt. Wenn beispielsweise ein DNA-Molekül verfügbar ist, welches für ein Polypeptid codiert, das mit einer N-terminalen Struktur von NH&sub2;-met-x-y... exprimiert wird, wobei x eine andere Aminosäure als Alanin bedeutet, kann ein Alanin- Codon zwischen dem Translations-Startsignal/Methionin-Codon und dem Codon für x insertiert werden. Alternativ dazu kann das Codon für x deletiert und ein Alanin-Codon anstelle davon insertiert werden. Daher wird im Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Protein mit der N-terminalen Struktur NH&sub2;-ala-x-y... oder NH&sub2;-ala-y... erzeugt.
Ähnlich können Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen in einem beliebigen Aminosäure-Codon in einer gegebenen Gensequenz vorgenommen werden, so daß eine Polypeptid-Variante im Verfahren der vorliegenden Erfindung exprimiert wird. Eine Polypeptid-"Variante" wird hier derart definiert, daß sie einzelne oder mehrfache Aminosäure-Deletionen, -Substitutionen und/oder -Additionen verglichen mit der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz eines gegebenen Polypeptids aufweist. Diese Polypeptid-Varianten sind derart konstruiert, daß sie eine Aminosäuresequenz im wesentlichen gleich wie jene eines natürlich vorkommenden Polypeptids aufweisen, solange die biologische Wirksamkeit nicht auf ein unannehmbares Ausmaß verringert wird. Die Erzeugung und Expression von Polypeptid-Varianten kann zweckmäßig sein, um eine erhöhte Akkumulation und erhöhte Proteinstabilität zu erzielen, die Polypeptid-Reinigung zu erleichtern, und/oder die biologische Wirksamkeit zu optimieren.
Die obigen Modifikationen des für das gewünschte Polypeptid codierenden DNA-Moleküls können unter Verwendung von Restriktionsenzymen, Exonucleasen, Endonucleasen, etc., gemäß bekannten Techniken erzielt werden. Die allgemeinen Techniken der Oligonucleotid-gesteuerten ortsspezifischen Mutagenese können auch zum Bewirken der obigen Modifikationen in der Struktur oder Sequenz des DNA-Moleküls verwendet werden und sind Fachleuten bekannt; siehe z.B. Zoller & Smith (1982), Nuc. Acids Res. 10: 6487-6500; Zoller & Smith (1983), Meth. Enzymol. 100: 468-500; Norris et al. (1983), Nuc. Acids Res. 11: 5103-5112.
Sobald die gewünschte heterologe DNA-Sequenz erhalten wurde, wird dann gemäß rekombinanten DNA-Techniken die Sequenz in einen geeigneten Klonierungsvektor insertiert, der ein Mittel für die Replikation der DNA-Sequenz vorsieht. Ein beliebiger geeigneter Klonierungsvektor kann verwendet werden, der vorzugsweise eine Markerfunktion enthält, beispielsweise E. coli- Plasmidvektoren, die einschließen: ColEI, Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974) 71: 3455; pBR322, Bolivar et al., Gene (1977) 2: 95; pBR325, Soberon et al., Gene (1978) 4: 121; und pkc7, Rao et al., Gene (1979) 7: 79; und E. coli-Bakteriophagenvektoren, die einschließen: Charon λL47.1, Loenen et al., Gene (1980) 10: 249; und M13mp8 und M13mp9, Messing et al., Gene (1982) 19: 269. Die allgemeinen Techniken zur Insertion dieser DNA-Sequenz in einen Klonierungsvektor, um einen rekombinanten Vektor zu erzeugen, sind bekannt; siehe z.B. Molecular doning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Hrg. (1982).
Sobald mehrfache Kopien der gewünschten heterologen DNA- Sequenz erhalten wurden, können diese Sequenzen aus den rekombinanten Vektoren entfernt und in ein Expressionssystem zur Erzeugung und Isolierung des gewünschten heterologen Proteins insertiert werden, wie nachstehend genauer beschrieben. Modifikationen der heterologen DNA-Sequenz durch Fachleuten bekannte Verfahren können vor der Insertion dieser DNA-Sequenzen in einen Expressionsvektor oder nach dieser Insertion vorgenommen werden.
In den Beispielen der vorliegenden Erfindung wurde M13mp8, der von Messing et al., Gene (1982) 19: 269, beschrieben und modifiziert wurde, um eine XbaI-Restriktionsstelle zu enthalten, wie in Beispiel 1 gezeigt, zusammen mit M13mp9, id., als Klonierungsvektor ausgewählt. Die M13mp8- und M13mp9-Vektoren, gemeinsam als "M13-Vektoren" bezeichnet, ermöglichen die Isolierung rekombinanter Vektoren sowohl in doppelsträngiger (ds) als auch replikativer Form (RF) und einzelsträngiger (ss) DNA- Formen. Die Isolierung von rekombinanten RF DNA-Vektoren erleichtert die nachfolgende Insertion der gewünschten replizierten DNA-Sequenzen in Expressionsvektoren, wie in Fig.5, 6 und 10 gezeigt. Alternativ dazu erleichtert die Isolierung der einzelsträngigen Form dieser rekombinanten Vektoren sowohl die Isolierung rekombinanter Vektoren, welche die gewünschte DNA-Sequenz in einer richtigen Orientierung von 5' nach 3' enthalten, für eine Expression als auch die Erzeugung einer beliebigen DNA- Sequenzmodifikation durch Techniken, wie Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezfische Mutagenese, wie in Fig.3, 4 und 8 gezeigt. Außerdem können diese M13-Vektoren DNA-Fragmente oder Gene mit einer Länge von bis zu 4 kb aufnehmen, wodurch die Klonierung einer typischen, ganzen, eukaryotischen Gensequenz sichergestellt wird.
Die in den M13-Vektoren verwendete Markerfunktion, wie von Messing et al., Gene (1982) 19: 269, beschrieben, involviert das Enzym für β-Galactosidase. Spezifisch wird die gewünschte heterologe DNA-Sequenz in das lacZ-Genfragment insertiert, das vom M13-Vektor getragen wird, wodurch die normale Komplementation des vom M13-Vektor getragenen lacZ-Genfragments mit dem teilweisen lacZ-Genfragment, das von der chromosomalen DNA der Wirtszelle (z.B. E. coli-JM101) getragen wird, gestört wird, so daß diese Wirtszelle nicht länger in der Lage ist, im Bakterien- Wachstumsmedium vorliegende Lactose zu metabolisieren. E. coli, welche mit M13-Vektoren infiziert sind, die keine in das vom Vektor getragene lacZ-Genfragment insertierte Fremd-Gensequenz aufweisen, können im Bakterien-Wachstumsmedium vorliegende Lactose metabolisieren und ergeben charakteristische blaue Plaques, wenn die Bakterien auf Agar gezüchtet werden, der 1 x YT-Medium enthält, das 0,8 % (M/V) Trypton, 0,5 % (M/V) Hefe-Extrakt, 0,5 % (M/V) NaCl und einen Farbindikator für β-Galactosidase umfaßt. Die Plaque-Farbe von E. coli, welche mit rekombinanten Vektoren infiziert sind, die eine in das M13-lacZ- Genfragment insertierte heterologe DNA-Sequenz tragen, ist klar oder farblos, wenn die Bakterien auf diesem Medium gezüchtet werden. Daher ist eine positive Insertion der heterologen DNA- Sequenz in diese Klonierungsvektoren durch eine farblose Plaque- Bildung nach der Infektion der E. coli-Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor definiert. Die Insertion der für bGH(L) und pGH(P) codierenden DNA-Sequenzen in M13-Vektoren ist in Fig.2 bzw. 9 gezeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden für bGH(L) und pGH(P) codierende DNA-Sequenzen, die von Bakterienplasmiden pBGHex-1 bzw. pPGHex-1 getragen werden, wie in Seeburg et al., DNA (1983) 2(1): 37-45, aus diesen Plasmiden durch ortsspezifische Restriktionsendonuclease-Spaltung isoliert. Es ist zu beachten, daß Bakterien, die mit Bakterienplasmiden pBGHex-1 bzw. pPGHex-1 transfiziert und anschließend unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression der bGH(L)- und pGH(P)-Codiersequenzen ermöglichen, Somtotropine mit einem N-terminalen Methionin (z.B. met-bGH(L) bzw. met-PGH(P)) erzeugen. Dann wurden die entsprechenden Sequenzen in RF DNA eines modifizierten M13mp8-Vektors (M13mp8/XbaI) und M13mp9-Vektors insertiert, wie in Fig.2 bzw. 7 gezeigt. Die Insertion der gewünschten bGH(L)- und pGH(P)-DNA-Sequenzen in M13mp8/XbaI- und M13mp9- RF DNA wurde durch ortsspezifische Restriktionsendonuclease- Spaltung bestätigt, wie wiederum in Fig.2 bzw. 7 dargestellt. Anschließend wurden E. coli-JM101 mit einem dieser rekombinanten Vektoren transfiziert, wie von Messing et al., Methods in Enzymology (1983) 101: 20 beschrieben, und die ssDNA der rekombinanten Vektoren wurde isoliert,.wie von Messing et al., Gene (1982) 19: 269, beschrieben.
Nach der Isolierung wurden die ssDNAs dieser rekombinanten Vektoren durch Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese modifiziert, wobei die DNA-Codiersequenzen für bGH(A,V), bGH(A,L), bGH(V) und pGH(A) erzeugt wurden. Spezifisch wurde bGH(L) modifiziert, um ein Codon für Alanin, z.B. GCC, an das 5'-Ende der bGH(L)-Codiersequenz anzufügen, wie in Fig.3 gezeigt. Es wird davon ausgegangen, daß jedes der vier Codons für Alanin so angefügt werden kann. Das bevorzugte Alanin-Codon für eine optimale Somatotropin-Ausbeute im hier verwendeten Expressionssystem ist GCC. Die Bestätigung der Addition eines Alanin- Codons zur Erzeugung einer bGH(A,L)-Codiersequenz wurde durch DNA-Sequenzanalyse der gesamten oder des 5'-Endes der bGH(A,L)- DNA-Sequenz gemäß dem Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463, erzielt.
Die bGH(A,V)-Codiersequenz wurde durch Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese der bGH(A,L)-Codiersequenz erzeugt, wie in Fig.4 gezeigt, indem das Leucin-Codon in der Aminosäure-Position 127 [in bGH(A,L)] in ein Valin-Codon, z.B. GTG, übergeführt wurde. Wiederum wird davon ausgegangen, daß jedes Codon für Valin in dieser Überführung verwendet werden kann. Die Erzeugung einer bGH(A,V)-Codiersequenz wurde erneut durch DNA-Sequenzanalyse der erhaltenen bGH(A,V)-DNA-Codiersequenz bestätigt.
Die Erzeugung einer pGH(A)-Codiersequenz durch Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese der pGH(P)-Codiersequenz wurde ähnlich durchgeführt, wie in Fig.8 dargestellt und nachstehend genauer beschrieben, und durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
Nach der Isolierung und Konstruktion der gewünschten heterologen DNA-Sequenzen, wie als Beispiel für bGH(A,L), bGH(A,V) und pGH(A) angegeben, können diese Sequenzen repliziert und große Kopienzahlen durch die Propagation der entsprechenden rekombinanten Vektoren gemäß Fachleuten bekannten und oben angeführten Verfahren erzeugt werden. Diese heterologen DNA- Sequenzen können nun in einen beliebigen geeigneten Expressionsvektor insertiert werden, um die gewünschten heterologen Polypeptide in Prokäryoten zu produzieren.

PRODUKTION N-TERMINALER ALANIN-POLYPEPTIDE

Wie vorstehend erläutert, sollte ein geeigneter Expressionsvektor die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale für die Produktion eines heterologen Proteins in einer ausgewählten Wirkszelle zusammen mit einer Markerfunktion für die Identifikation jener Expressionsvektoren enthalten, in welche die gewünschte heterologe DNA-Sequenz insertiert wurde. Durch die Verwendung eines prokaryotischen Expressionsvektors können die rekombinanten DNA-Sequenzen an das genetische Komplement eines prokaryotischen Organismus über eine Transduktion, Transformation oder Transfektion (hier kollektiv als "Transfektion" bezeichnet) angefügt werden, und dann kann dieser Organismus unter Bedingungen (allgemein in Abhängigkeit vom verwendeten Promotor und Wirt) kultiviert werden, welche die Erzeugung des gewünschten Polypeptids bewirken. Daher enthält die "genomische" DNA der in dieser Erfindung verwendeten Organismen sowohl chromosomale als auch episomale DNA.
Eine Reihe von Expressionsvektoren wurde für die heterologe Genexpression und heterologe Proteinproduktion in prokaryotischen Wirtszellen beschrieben und ist Fachleuten bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden die Expressionsvektoren pBGHex-1, siehe Seeburg et al., DNA (1983) 2(1): 37-45, und pBGHex-1*, der einen modifizierten pBGHex-1-Vektor umfaßt, verwendet.
Der bGHex-1-Expressionsvektor ist ein pBR322-Bakterienplasmid, das ein Gen für bGH(L) trägt. Das Gen umfaßt sequentiell einen Tryptophan-Promotor (ptrp), eine Shine-Delgarno- Sequenz, ein ATG-Translations-Start/Methionin-Codon unmittelbar benachbart der N-terminalen Phenylalanin-Codiersequenz, die erste Aminosäure des bGH(L)-Polypeptids, die bGH(L)-Codiersequenz und ein Translations-Stop-Codon. Die Markerfunktion des pBGHex-1-Expressionsvektors ist eine Antiobiotikaresistenz. Spezifisch trägt pBGHex-1 zwei Antiobiotikaresistenz-Gene, eines für Ampicillin- (ampr) und das zweite für Tetracyclin-Resistenz (tetr), die ansonsten empfindlichen Wirtszellen, die stabil mit dem Expressionsvektor transformiert wurden, eine spezifische Antiobiotikaresistenz verleihen. Daher können stabile Transformanten durch das Wachstum in Medien selektiert werden, die entweder Tetracyclin, Ampicillin oder beide Antibiotika enthalten.
In den Beispielen der vorliegenden Erfindung wurden Expressionsvektoren pMON3209 und pMON3215 erzeugt, die bGH(A,L)- bzw. bGH(A,V)-Codiersequenzen anstelle der bGH(L)-Codiersequenz tragenden pBGHex-1 umfassen, wie in Fig.5 bzw. 6 gezeigt. Ein Bakterium, wie E. coli, wurde dann mit einem dieser Expressionvektoren stabil transformiert und Transformanten durch das Wachstum auf das geeignete Antibiotikum enthaltenden Medien selektiert. Anschließend wurden die in den transformierten Bakterien enthaltenen Expressionsplasmide auf das Vorliegen der bGH(A,L)- und bGH(A,V)-Codiersequenzen in der richtigen Orientierung von 5' nach 3' durch Restriktionsenzym-Spaltung gescreent.
In einem Beispiel der vorliegenden Erfindung wurde pBGHex-1* verwendet, welcher den pBGHex-1-Vektor umfaßt, der durch die Entfernung der stromaufwärts vom 5'-Ende der ptrp-Codiersequenz angeordneten EcoRI-Restriktionsstelle modifiziert wurde, um den Expressionsvektor pMON3213 zu erzeugen, der die pGH(A)-Codiersequenz anstelle der bGH(L)-Codiersequenz trägt. Der erhaltene pBGHex-1*-Vektor enthält nur eine einzige EcoRI- Stelle, wie in Fig.9 dargestellt. Das Ersetzen der pGH(A)-Codiersequenzen für die bGH(L)-Codiersequenz in pBGHex-1* zur Erzeugung des Expressionsvektors pMON3213 ist in Fig.10 gezeigt. Dann wurden E. coli mit dieser Mischung transformiert und Transformanten durch das Wachstum in Antibiotika enthaltenden Medien selektiert. Die in den transformierten Bakterien enthaltenen Expressionsplasmide wurden dann auf das Vorliegen der pGH(A)-Codiersequenzen durch Restriktionsspaltung gescreent.
Die Produktion von bGH(A,L), bGH(A,V) oder pGH(A) in E. coli wurde erzielt, indem entweder E. coli-W3110, E. coli LE393 oder der E. coli-Stamm 294, die hinterlegt wurden und die ATCC-Zugangsnummern 39936, 53010 bzw. 53009 aufweisen, mit einem der Expressionsvektoren pMON3209, pMON3215 oder pMON3213 gemäß dem nachstehend umfassender beschriebenen Verfahren transformiert wurde. Dann wurden die transformierten E. coli-W3110 unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression der Somatotropin- Gene und die Produktion der gewünschten heterologen Polypeptide ermöglichen.
Die Reinigung des erzeugten heterologen Peptids ist sowohl von dem gewählten Protein als auch der gewählten Wirtszelle abhängig. Beispielsweise wurde festgestellt, daß die in Bakterien wie E. coli produzierten heterologen Proteine häufig in der Zelle in Form "lichtbrechender" Körper ausgefällt werden. Der Ausdruck "lichtbrechend" wird verwendet, da diese Körper unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops tatsächlich sichtbar sind. Ein zur Gewinnung heterologer Proteine in biologisch aktiver Form verwendbares Verfahren ist in der EP-114 506-A (veröffentlicht am 1. August 1984) beschrieben. Kurz gesagt umfaßt dieses Reinigungsverfahren das Konzentrieren der Wirtszellen, Lysieren dieser Zellen zur Erzeugung eines Zell-Extrakts oder -Homogenats und anschließend Isolieren der lichtbrechenden Körper durch Differentialzentrifugation, wobei alle Schritte Fachleuten bekannt sind. Die isolierten lichtbrechenden Körper werden in einem starken Denaturierungsmittel, wie Guanidinhydrochlorid, gelöst, und dann wird das solubilisierte Protein in einem geeigneten Lösungsmittel (beispielsweise Harnstoff) ausgetauscht, durch chromatographische Mittel gereinigt und schließlich biologisch aktiviert, d.h. seine aktive Konfiguration annehmen gelassen, und dann oxidiert, so daß eine derartige Konfiguration durch Disulfid-Bindungen zwischen ihren geeigneten Cysteinresten aufrechterhalten wird, wie in der EP-114 506-A beschrieben. Eine detailliertere Reinigung derartiger heterologer Proteine ist in zwei gleichzeitig eingereichten US-Anmeldungen beschrieben, einer von S.B. Storrs mit dem Titel "Method of Somatotropin Solubilization" (Verfahren zur Solubilisierung von Somatotropin), erteilt als US-4 731 440-A, und der zweiten von L.A. Bentle, S.B. Storrs und J.W. Mitchell mit dem Titel "Method of Somatotropin Naturation" (Verfahren zur Naturierung von Somatotropin), erteilt als US-4 652 630-A. Diese beiden gleichzeitig eingereichten US-Patentanmeldungen und die vorliegende Anmeldung wurden alle gemeinsam der Monsanto Company erteilt. Die nachfolgende Reinigung des heterologen Polypeptids, um es von verunreinigenden Bakterienproteinen zu befreien, kann durch herkömmliche chromatographische Mittel, wie Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie, erzielt werden. Typischerweise enthalten die erhaltenen gereinigten Zusammensetzungen, bezogen auf die Masse, etwa 90 % bis etwa 99,5 % des N-Alanyl-Polypeptids und etwa 0,5 % bis etwa 10 % Protein, das vom Bakterium oder anderen prokaryotischen Wirt, in dem das Polypeptid produziert wurde, stamt.
Es wurde gefunden, daß üblicherweise zumindest etwa 80 % des durch das Verfahren dieser Erfindung exprimierten heterologen Polypeptids eine N-terminale Struktur von NH&sub2;-ala ... aufweisen. Das übrige Polypeptid ist typischerweise in der Methionyl-Form mit einer N-terminalen Struktur von NH&sub2;-met-ala ... .Durch das Variieren der Wachstumsbedingungen und/oder des Zeitpunktes der Induktion der Genexpression ist es jedoch möglich, den Anteil an Polypeptid mit Alanin am N-Terminus auf zumindest etwa 95 % oder mehr zu erhöhen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, daß die wie oben beschrieben produzierten und isolierten Somatotropin-Polypeptid-Arten Somatotropin ähnliche biologische Wirksamkeit aufweisen, wie im Kaninchen-Leberrezeptor-Assay, der wie von Tsushima und Friesen, J. Clin. Endocrinol. Metab. (1973) 37: 334-337 beschrieben durchgeführt wurde, und einem Ratten-Gewichtszunahme-Bioassay getestet. Im letzteren Assay wurden die Bioaktivitäten der von E. coli produzierten Somatotropine relativ zu einer bekannten Somatotropin-Charge (z.B. Rinder- oder Schweine-Hypophysen- Somatotropin) getestet, indem das Ausmaß der Gewichtszunahme hypophysektomierter Ratten mit variierenden Mengen an injizierter Verbindung in Beziehung gebracht wurde. Spezifisch werden titrierte Dosierungen (zwischen 0 und 60 µg) der unbekannten oder Standard-Somatotropin-Quelle hypophysektomierten Ratten (95 bis 135 g) auf täglicher Basis während 7 oder mehr Tagen injiziert. Unter Verwendung einer mehrfachen Regression werden Körpergewichtszunahmen der Tiere, welche die bekannten und unbekannte Hormon-Chargen erhalten, auf log-transformierten Dosierungen regressiert. Die Steigungen werden getestet, um einen Nicht-Parallelismus sicherzustellen und die Kommonalität zu unterbrechen. Bioaktivitäten werden als Verhältnis der Steigungen mal der Aktivität des Standards angegeben.
Die Verwendung der N-Alanin-bGH-Produkte dieser Erfindung erhöht die Milchproduktion von Kühen, und es wird angenommen, daß sie die für eine gegebene Milchleistung derartiger Kühe erforderlichte Futtermenge senken. Derartige Produkte dieser Erfindung können Kühen durch Injektion, Infusion oder Implantation in Polymeren oder anderen Medien verabreicht werden, von denen bekannt ist, das sie die Abgabe einer erforderlichen Dosierung in das Kreislaufsystem erzielen. Pharmazeutisch annehmbare basische Formulierungen, wie Lösungen, Emulsionen oder Gele, können entweder eingekapselt oder nicht verwendet werden. Diese Formulierungen können eine einzelne bGH-Art oder Variante hievon, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, oder irgendeine vorgegebene Kombination der Polypeptid- Varianten [z.B. eine Mischung von bGH(A,V) und bGH(A,L)] enthalten. Dosierungen können im Bereich von zumindest etwa 0,005 mg bis etwa 200 mg pro Tier pro Tag und vorzugsweise etwa 5 mg bis etwa 40 mg pro Tier pro Tag liegen. Die zur Erhöhung der Milchproduktion und/oder Futter-Milch-Effizienz effektivste Menge kann durch Routineversuche bestimmt werden. Die tatsächliche bevorzugte Dosierung von bGH ist von Variablen abhängig, wie der Größe, dem Allgemein- und Ernährungszustand des spezifischen Tieres. Obwohl die Milchproduktion zur Feststellung des Effekts von bGH auf Kühe verwendet werden kann, können auch andere Produktionseigenschaften der Kühe, wie die allgemeine Wachstumsrate und Fleischproduktion, verwendet werden. bGH kann gewünschtenfalls Kühen mit anderen vorteilhaften Mitteln, wie anderen biologisch wirksamen Proteinen, Antigenen oder dgl., verabreicht werden, und dadurch verstärkte Wirkungen hervorrufen.
Wie vorstehend angegeben, sieht die Erfindung auch die Erzeugung von bGH-Varianten vor, die ein N-terminales Alanin aufweisen, die jedoch Deletionen, Additionen, Inversionen und/oder Substitutionen entlang der Polypeptidkette haben. Derartige Modifikationen mit gewünschten die Laktation und/oder das Wachstum verstärkenden Eigenschaften können durch Routinetests bei Kühen identifiziert werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Während diese Erfindung in bezug auf ihre bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, gehen für Fachleute aus dieser Anmeldung verschiedene Modifikationen hervor.

Mikroorganismen und Plasmide

Die folgenden Mikroorganismen sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA, erhältlich:
ATCC 39936 - E. coli-W3110
ATCC 53010 - E. coli-LE392
ATCC 53009 - E. coli-Stamm 294
ATCC 53024 - E. coli-W3110 (pMON3209)
ATCC 53022 - E. coli-W3110 (pMON3215)
ATCC 53023 - E. coli-W3110 (pMON3213)

Beispiel 1:

Alle Oligonucleotide wurden im Department of Biological Sciences, Monsanto, unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA-Synthesizers gemäß dem vom Hersteller, Applied Biosystems, Inc., Foster City, Californien, angegebenen Verfahren synthetisiert. Restriktionsenzyme und DNA-Modifikationsenzyme wurden von New England Biolabs (Beverly, Massachussetts), New England Nuclear (Boston, Massachussetts) und Bethesda Reserach Laboratoreis (BRL) (Gaithersburg, Maryland) erworben. Ein XbaI-Linker wurde von Collaborative Research, Inc. (Lexington, Massachussetts), erhalten. T4-DNA-Ligase wurde von New England Biolabs (Beverly, Massachussetts) erworben. ³²P-markierte Nucleotide wurden von Amersham (Arlington Heights, Illinois) gekauft. E. coli-DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment, wurde von New England Nudear (Boston, Massachussetts) erworben. E. coli-JM101 wurde von Dr. Joachim Messing, University of Minnesota (St. Paul, Minnesota) erhalten.
Restriktionsenzym-Verdaue, die T4-DNA-Ligasereaktionen und Reaktionen von E. coli-DNA-Polymerase 1, Klenow-Fragment, können gemäß den von den Herstellern angegebenen Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugte Puffer für die folgenden Restriktionsenzyme sind wie folgt: für XbaI: 100 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgSO&sub4;; für EcoRI, HindIII und SmaI: 50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgSO&sub4;. T4-DNA-Ligasereaktionen wurden in Puffern durchgeführt, die 25 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit (DTT), 2 mM Spermidin und 0,2 mM ATP enthielten. E. coli- DNA-Polymerase 1, Klenow-Fragment, wurde in einem Puffer verwendet, der 20 mM Tris, pH 7,2, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP und jeweils 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP enthielt. α-³²P-dATP (400 ci/mmol) wurde der Klenow-Reaktion zugesetzt, wenn eine Markierung des neu synthetisierten DNA-Strangs erwünscht war.
Oligonucleotide wurden unter Verwendung von γ-³²P-ATP (sp. Akt. mehr als 5000 ci/mmol) und T4-DNA-Kinase in 100 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT markiert.
Die DNA-Codiersequenzen für bGH(L) und pGH(P) tragenden Plasmide (pBGHex-1 bzw. pPGHex-1) wurden von Genentech., Inc., So. San Francisco, Californien, erhalten. Diese Plasmide können wie in der EP-75 444-A (veröffentlicht am 30. März 1983); Seeburg et al., DNA (1983) 2(1): 37-45; Goeddel et al., Nature (1979) 281: 544-548; Deboer et al., in Promoters: Structure and Function (1982); M.J. Chamberlin und R. Rodriguez, Hrg., Kapitel 293; Miozzari und Yanofsky, J. Bacteriol. (1978) 133: 1457-1466; und Rosenberg und Court, Annual Review of Genetics 13: 319-353, beschrieben hergestellt werden. Wie in der EP-75 444-A (DeBoer et al.) gezeigt, sind die ersten 21 translatierten Codons in der DNA für bGH(L) ATG TTC CCA GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGT GCT CAG CAT CTT oder funktionelle Äquivalente hievon. (Selbstverständlich können alternativ dazu funktionelle Äquivalente dieser Codons verwendet werden). Andere relevante Teile dieser Veröffentlichung sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
M13mp8 und M13mp9 wurden von Dr. Joachim Messing, University of Minnesota (St. Paul, Minnesota) erhalten.
Alle bakteriellen Wachstumsmedien-Komponenten und Antibiotika wurden entweder von Sigma (St. Louis, MO) oder Difco Laboratoreis (Detroit, Michigan) erhalten.

Beispiel 2:

Das folgende Beispiel zeigt die Konstruktion von drei DNA- Codiersequenzen, die bei der Expression die direkte Produktion von ein N-terminales Alanin enthaltenden Polypeptiden in Bakterien vorsehen. Spezifisch wurden die DNA-Codiersequenzen derart konstruiert, daß das Tranlations-Initiationsstart/Methionin- Codon (ATG) unmittelbar gefolgt wird von einem Alanin-Codon (Z.B. GCC). Die drei DNA-Codiersequenzen, die bGH(A,L), bGH(A,V) und pGH(A) umfaßten, wurden durch Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese vorher isolierter Somatotropin-DNA- Sequenzen konstruiert. Dieses Beispiel zeigt auch die Konstruktion einer bGH(V)-DNA-Codiersequenz, die bei der Expression in Bakterien die Erzeugung von met-bGH(V) bewirkt.

a. Konstruktion einer bGH(A,L)-DNA-Codiersepuenz

Die Somatotropin-bGH(L)-DNA-Codiersequenz wurde aus pGHex-1 als XbaI-Fragment herausgeschnitten und in die XbaI-Stelle eines modifizierten M13mp8-Vektors (M13mp8/XbaI) kloniert. Die Konstruktion des M13mp8/XbaI-Vektors, der einen XbaI-Linker in der ursprünglichen SmaI-Stelle enthält, ist in Fig.1 gezeigt. Wie in Fig.2 dargestellt, spaltet XbaI an beiden Enden der bGH(L)-DNA- Codiersequenz, wodurch die vollständige bGH(L)-Codiersequenz herausgeschnitten wird. Das mit XbaI geschnittene pBGHex-1- Plasmid wurde in Anwesenheit von T4-DNA-Ligase mit RF M13mp8/XbaiI-DNA, linearisiert durch XbaI-Restriktionsenzym-Spaltung, gemischt und mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelt. Dann wurde die Mischung über Nacht bei 14ºC inkubiert. Die Behandlung mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase verhindert die Rezirkularisation des M13mp8/XbaI-Vektors. Die Insertion der bGH(L)-DNA-Codiersequenz in den M13mp8/XbaI-Vektor zur Erzeugung des rekombinanten Vektors M13mp8/BGHex-1 wurde anfänglich durch die farblose Plaque-Bildung auf einem Bakterienrasen, E. coli- JM101, gezüchtet auf 1 x YT-Medium, unter Verwendung des Weichagar-Überschichtungsverfahrens festgestellt, das in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Hrg. (1982), S. 64, beschrieben ist, enthaltend: 10 µl 100 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) und 50 µl 2 % (M/V) X-GAL (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) in 3 ml Top- Agar, und sie wurde mit diesem rekombinanten Vektor transfiziert, wie vorstehend beschrieben. Die Insertion der bGH(L)-Codiersequenz wurde durch Spaltung isolierter RF DNA, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Hrg. (1982), Kapitel 3, des rekombinanten Vektors mit XbaI bestätigt, wodurch ein 590 bp Fragment erhalten wird, das die insertierte Sequenz umfaßt. Das 590 bp Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese in 1 % (M/V) Agarose identifiziert, wie in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Hrg. (1982), beschrieben. Alle nachfolgenden Restriktionsfragmente wurden durch dieses angegebene Verfahren identifiziert. Die Orientierung der insertierten bGH(L)-Codiersequenzen wurde durch Spaltung des RF rekombinanten Vektors mit SmaI und HindIII ermittelt. Wenn die Codiersequenzen in der richtigen Orientierung von 5' nach 3' vorliegen, sollte die Spaltung mit diesen Restriktionsenzymen ein 207 bp Fragment ergeben. Die Isolierung von ss-Phagen-DNA wurde gemäß dem Verfahren von Messing et al., Gene (1982) 19: 269, durchgeführt. Dann wurde der M13mp8/BGHex-1-Vektor als Template in der Oligonucleotid-gesteuerten ortsspezifischen Mutagenese verwendet, im wesentlichen wie von Zoller und Smith, Nuc. Acids Res. (1982) 10: 6487-6500, Zoller und Smith, Methods in Enzymol. (1983) 100: 468-500; Norris et al., Nuc. Acid Res. (1983) 11: 5103-5112, beschrieben, deren relevante Teile hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Fig.3 zeigt schematisch das Mutagenese-Verfahren zur Erzeugung einer DNA-Codiersequenz für bGH(A,L) aus der bGH(L)-Codiersequenz. Kurz gefaßt wird ein Oligonucleotid-Primer (siehe nachstehende Tabelle 1), der die Sequenz der gewünschten Mutation enthält, zur Auslösung der Synthese einer geschlossenen kreisförmigen DNA-Kopie des ssDNA-M13mp8/BGHex-1-Templates verwendet. Die so erzeugten, geschlossenen kreisförmigen dsDNA- Moleküle werden von unvollständigen und ssDNA-Kreisen durch Zentrifugation auf einem alkalischen Saccharose-Gradienten getrennt, wie von Zoller und Smith, Methods in Enzymol. (1983) 100: 468-500, beschrieben. Dann werden die geschlossenen kreisförmigen dsDNA-Moleküle zur Transformation von E. coli-JM101 verwendet, wie von Messing et al., Gene (1982) 19: 269-276, beschrieben, und die erhaltenen farblosen Plaques werden auf Pall- Filter gegeben, die von Pall Ultrafine Filtration Corp. (Glen Cove, New York) erhalten werden, und auf eine Hybridisierung an eine ³²P-markierte Form des Oligonucleotid-Primers gescreent, der zum Bewirken der ortsspezifischen Mutagenese verwendet wird. Das Aufbringen der Plaques wurde gemäß den vom Pall-Filterhersteller beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das Hybridisierungs-Screening wurde unter Verwendung von Nylon-Biodyne-Filtern durchgeführt, wie von Pall Ultrafine Filtration Corporation (Glen Cove, New York) in ihrem "Protocol Guide for DNA-Transfer to Pall Biodyne A Nylon Filters" (1983) beschrieben. Die Filter wurden bei zunehmenden Temperaturen gewaschen, bis das radioaktiv markierte Signal von einem Kontrollfilter entfernt wurde, das mit M13mp8/bGHex-1-Phagen hergestellt wurde. Bei einem typischen Filterwaschprotokoll wurde eine Raumtemperatur- Waschung in 6 x SSC (0,9 M NaCl und 0,09 M NaCitrat) während 10 min verwendet, gefolgt von einer 50ºC Waschung in 6 x SCC während 5 min und nachfolgenden Waschungen bei sich um 5 ºC erhöhenden Temperaturen. Es wurde angenommen, daß Plaques, die an radioaktiv markierten Oligonucleotid-Primer bei höheren Temperaturen als die Kontroll-Phagen hybridisierten, die neu erzeugte bGH(A,L)-Codiersequenz enthielten, und sie wurden als potentielle Positive bezeichnet. Alternativ dazu wurden einzelne farblose Plaques von E. coli-Transformationen abgenommen und in 5 ml 2 x YT-Medium (1,6 % (M/V) Trypton, 1,0 % (M/V) Hefe-Extrakt, 0,5 % (M/V) NaCl) über Nach bei 37ºC unter Belüftung gezüchtet. Phagen-DNA, die gemäß Messing et al., Gene (1982) 19: 269, hergestellt wurde, wurde dann auf Nitrocellulose punktförmig aufgebracht, mit radioaktiv markiertem Primer hybridisiert und bei zunehmenden Temperaturen gewaschen, wie oben beschrieben. Phagen-DNAs, die höhere Hybridisierungstemperaturen aufwiesen als M13mp8/BGHex-1-Kontroll-Plaques, wurden ähnlich als potentielle Positive bezeichnet. Potentiell positive Plaques aus beiden Screening-Verfahren wurden wie oben beschrieben gezüchtet und zur Herstellung von ss Phagen-DNA verwendet, die dann gemäß dem Verfahren von Sanger et al., Prot. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 74: 5463, sequenziert wurde, um zu bestätigen, daß sie die bGH(A,L)-Codiersequenz trugen. Die RF DNA von M13mp8/BGHex-1(ala) wurde auch durch Restriktionsenzymanalyse mit HaeIII gescreent, um die Addition des Alanin-Codons nach dem Startsignal/Methionin-Codon ATG zu bestätigen, da das Alanin- Codon eine zusätzliche HaeIII-Restriktionsstelle erzeugt. Die Frequenz der Addition des Alanin-Codons betrug etwa 2 % der bGH(L)-DNA-Codiersequenz.

b. Konstruktion einer bGH(A,V)-DNA-Codiersequenz

Die Konstruktion der bGH(A,V)-DNA-Codiersequenz, das Screening und die Sequenz-Bestätigung wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie oben durchgeführt, außer daß das Template M13mp8/BGHex-1(ala) war, wie in Fig.4 gezeigt, und der Oligonucleotid-Primer wie in nachstehender Tabelle 1 dargestellt war. Die Frequenz der Überführung des Leucin-Codons in ein Valin-Codon betrug etwa 10 %.

c. Konstruktion einer bGH(V)-DNA-Codiersequenz

Die Konstruktion der bGH(V)-DNA-Codiersequenz, das Screening und die Sequenz-Bestätigung wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie oben durchgeführt. Das Template war M13mp8/BGHex-1, und der Oligonucleotid-Primer war gleich wie der zur Erzeugung von bGH(A,V) erzeugte. Die Frequenz der Überführung des Leucin-Codons in ein Valin-Codon betrug erneut etwa 10 %.

d. Konstruktion einer pGH(A)-DNA-Codiersepuenz

Die Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese wurde ähnlich verwendet, um ein Alanin-Codon an die pGH(P)-DNA- Codiersequenz anzufügen, wie von Seeburg et al., DNA (1983) 2(1): 37-45, beschrieben. Das wie in Fig.8 schematisch dargestellte Mutagenese-Verfahren wurde wie folgt durchgeführt.
Die auf dem pPGHex-1-Plasmid getragene 590 bp pGH(P)-DNA- Codiersequenz wurde aus dem Plasmid durch Restriktionsenzym- Spaltung mit EcoRI und HindIII entfernt, die das Plasmid am 5mu - bzw. 3'-Ende der pGH(P)-Codiersequenz spalten, wie in Fig.7 gemu zeigt. Das geschnittene pPGHex-1-Plasmid wurde dann mit M13mp9- RF DNA gemischt, die ähnlich mit EcoRI und HindIII gespalten, jedoch zusätzlich mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase vorbehandelt wurde, um eine Religation der M13mp9-Restriktionsfragmente zu verhindern. T4-DNA-Ligase wurde anschließend dieser Mischung zugesetzt. Aufgrund der abweichenden Enden sowohl an der RF Phagen-DNA- als auch pGH(P)-DNA-Codiersequenz, die durch die Verwendung von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen erzeugt wurden, wird die pGH(P)-DNA selektiv in die RF Phagen-DNA insertiert und wird in der richtigen Orientierung von 5' nach 3' insertiert, wie in Fig.7 gezeigt. Dann wurden E. coli-JM101, wie oben für M13mp8/BGHex-1 beschrieben, mit dem rekombinanten M13mp9/pGHex-1-Vektor transformiert, der die pGH(P)-DNA-Codiersequenz enthielt. Die transformierten E. coli-JM101 wurden anschließend auf 1 x YT-medium gezüchtet, das kolorimetrische Reagentien enthielt, und durch farblose Plaque-Bildung selektiert, wie vorstehend beschrieben. Die Insertion der pGH(P)-DNA- Codiersequenzen wurde wie folgt bestätigt. Farblose Plaques wurden abgenommen, und dann wurde RF M13mp9/PGHex-1-DNA, die wie vorstehend beschrieben isoliert wurde, mit EcoRI und HindIII gespalten und einer Agrose-Gelelektrophorese unterworfen, wobei ein 590 bp Fragment erhalten wurde, das die insertierte pGH(P)- DNA enthielt. M13mp9/pGHex-1-Phagen wurden dann in E. coli-JM101 propagiert, und die ss Phagen-DNA wurde wie oben beschrieben isoliert.
Dann wurde die M13mp9/pGHex-1-DNA als Template für die Oligonucleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese, wie in Fig.8 gezeigt, gemäß dem oben zur Erzeugung einer bGH(A,L)-Codiersequenz beschriebenen Verfahren verwendet, wobei ein spezifischer Primer verwendet wurde (siehe nachstehende Tabelle 1). Die Frequenz der Addition eines Alanin-Codons, hier GCC, an die pGH(P)-Codiersequenz betrug ungefähr 12 %. Die erhaltene pGH(A)- Codiersequenz wurde erneut durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Tabelle 1 Erzeugung von N-terminalen N-Alanin-Somatotropin-Codiersequenzen
1. Die unterstrichtenen Basen in der Primer-Sequenz codieren für die gewünschte Addition oder Mutation.
2. Die Bezeichnungen beziehen sich auf die End-Plasmide, die für die direkte Herstellung der N-terminales Alanin enthaltenden Polypeptide in E. coli verwendet werden.

Beispiel 3:

Diese Beispiel zeigt die Konstruktion und Expression von drei rekombinanten Expressionsvektoren, welche die direkte Produktion von Polypeptiden, die in N-terminales Alanin aufweisen, in Bakterien vorsehen. Die drei so erzeugten Polypeptide sind die Somatotropin-Arten bGH(A,L), bGH(A,V) und pGH(A). Dieses Beispiel zeigt auch die Konstruktion und Expression von bGH(V) und die Expression von bGH(L). Die so erzeugten Polypeptide sind met-bGH(V) bzw. met-bGH(L).

a. Expression von bGH(A,L), bGH(A,V), bGH(L) und bGH(V)

Die bGH(A,L)-, bGH(A,V)- und bGH(V)-DNA-Codiersequenzen, die auf den rekombinanten Vektoren M13mp8/BGHex-1(ala), M13mp8/BGHex-1(ala,val) bzw. M13mp8/bGHex-1(val) getragen werden, wurden verwendet, um die bGH(L)-DNA-Codiersequenz, die auf dem pBGHex-1-Expressionsplasmid getragen wird, zu ersetzen (siehe Fig.5 und 6). Dies wurde durch den Verdau der entsprechenden M13 RF DNAs mit XbaI durchgeführt. Das pBGHex-1-Expressionsplasmid wurde auch mit XbaI verdaut und anschließend mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelt, um eine Religation der Restriktionsfragmente zu verhindern. Jede der verdauten RF DNAs wurde dann getrennt mit der verdauten und behandelten pBGHex-1-DNA gemischt, und wie oben beschrieben über Nacht bei 14ºC ligiert. Die so gebildeten rekombinanten Expressionsvektoren wurden als pMON3209, pMON3215 und pMON3214 bezeichnet, die bGH(A,L)-, bGH(A,V)- bzw. bGH(V)-DNA-Codiersequenzen trugen. Dann wurden E. coli-W3110 mit der Ligationsmischung transformiert, die pMON3209 oder pMON3215 oder pMON3214 oder pBGHex-1 enthielten, und in Luria-Nährlösung (Luria Broth; LB) gezüchtet, die 1 % (M/V) Trypton, 0,5 % (M/V) Hefe-Extrakt und 0,5 % (M/V) NaCl umfaßte, und 12,5 µg/ml Tetracyclin und 200 µg/ml Ampicillin enthielt. pMON3209 enthaltende E. coli-W3110 haben die Zugangsnummer 53024. pMON3215 enthaltende E. coli-W3110 haben die Zugangsnummer 53022. Die Transformation wurde kurz gefaßt wie folgt durchgeführt. Ungefähr 50 ml E. coli-W3110 wurden in LB-Medium auf eine OD 600 = 0,60 gezüchtet. Dann wurden die Zellen pelletiert und in 10 ml Puffer A resuspendiert, der 25 mM Tris, pH 7,6, und 10 mM NaCl enthielt. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und in 1 ml Puffer A resuspendiert, dem 14 ml Puffer B zugesetzt wurden, der 25 mM Tris, pH 7,6, 10 mM NaCl, 50 mM CaCl&sub2; umfaßte, und die Suspension wurde 30 min lang auf Eis inkubiert. Dann wurden die Zellen pelletiert und in 3 ml Puffer B resuspendiert. Eine aliquote Menge von 0,2 ml resuspendierten Zellen wurde anschließend mit 0,1 ml Puffer B und 0,1 bis 0,5 µg des gewünschten rekombinanten Expressionsvektors (pMON3209 oder pMON3215 oder pMON3214 oder BGHex-1) gemischt und 60 min lang auf Eis inkubiert. Dann wurde die inkubierte Mischung 1 min lang auf 37ºC erhitzt, nach welcher Zeit 3 ml LB-Medium zugesetzt wurde, und die erhaltene Mischung wurde anschließend 60 min lang bei 37ºC inkubiert. Dann wurden die Zellen pelletiert, in 300 ml LB-Medium resuspendiert und auf Antibiotika enthaltenden LB-Platten gezüchtet, wie oben beschrieben. Resistente Kolonien wurden anschließend selektiert und die pMON3209-, pMON3215-, pBGHex-1 und pMON3214-Expressionsvektor-DNAs gemäß dem in Molecular Clonings: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Hrg. (1982), beschriebenen Verfahren isoliert. Die pMON3209-, pMON3215-, pBGHex-1 und pMON3214-DNAs wurden auf das Vorliegen eines 590 bp XbaI-Fragments und eines 200 bp HindIII/ SmaI-Fragments gescreent, wobei die Anwesenheit der bGH(A,L)-, bGH(V)- und bGH(A,V)-DNA-Codiersequenzen in der richtigen Ausrichtung gezeigt wurde. Die pMON3209- und pMON3215-Expressionsplasmide wurden durch Restriktionsanalyse mit HaeIII weiter gescreent, um das Vorliegen einer neuen HaeIII-Stelle zu bestätigen, die durch die Addition eines GCC(Alanin)-Codons entsteht. Schließlich wurde das 590 bp XbaI- Fragment aus den pMON3209-, pMON3214- und pMON3215-Vektoren teilweise sequenziert, wie vorstehend beschrieben, um das Vorliegen der bGH(A,L)-, bGH(V)- und bGH(A,V)-DNA-Codiersequenzen in diesen Expressionsvektoren zu bestätigen.
Einzelne Kolonien von E. coli-W3110, die pMON3209, pMON3214, bGHex-1 oder pMON3215 trugen, wurden getrennt in 5 ml LB, das 12,5 µg/ml Tetracyclin enthielt, beimpft und über Nacht bei 37ºC unter Belüftung gezüchtet. 0,5 ml der über Nacht angelegten Kulturen wurden dann verwendet, um getrennt 25 ml M9- Medium zu beimpfen, das (pro 1 Medium) 100 ml 10X-Salze (70 g Na&sub2;HPO&sub4;, 30 g KH&sub2;PO&sub4;, 5 g NaCl, 10 g NH&sub4;Cl pro 1000 ml Gesamtvolumen), 1,2 ml 1 M MgSO&sub4;, 0,25 ml 0,1 % R&sub1;, 12,5 ml 20 % (M/V) Glucose, 0,025 ml 1 M CaCl&sub3;, ergänzt mit 0,5 % (M/V) Casaminosäuren und 6,25 µg/ml Tetracyclin, in 250 ml Kolben umfaßten. Das Impfmaterial wurde dann jeweils unter Belüftung bei 37ºC gezüchtet, bis eine OD 600 (optische Dichte bei 600 nm) = 1,0 erzielt wurde. Als nächstes wurde eine aliquote Menge von 0,2 ml aus jedem dieser Kolben entfernt, einzeln in Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophores (PAGE)-Puffer lysiert und durch SDS-PAGE gemäß Laemmli, Nature (1970) 227: 680- 685, getestet. 22 Dalton-Proteine waren in E. coli-W3110 aus beiden Gen-Konstrukten in hoher Konzentration vorhanden. Ferner banden beide 22 000 Dalton-Proteine in Western-Blot-Tests (siehe Krive und Rowold, Hybridoma (1984) 3: 252-262) an einen monoklonalen Antikörper, F11-A1-B6 (siehe id.), der gegen Rinder- Hypophysen-Somatotropin erzeugt wurde, wodurch bestätigt wurde, daß die Polypeptide mit Hypophysen-Somatotropin verwandt sind. E. coli-W3110-Zellen, die das Eltern-pBR322-Plasmid tragen, erzeugen kein 22 000 Dalton-Protein, das an Anti-Somatotropin- Antikörper bindet.
Die Expressionsplasmide pMON3209, pMON3214, pBGHex-1 und pMON3215 tragende Bakterien wurden wie folgt gelagert. Eine einzelne E. coli-W3110-Kolonie, transformiert mit einem der Plasmide (pMON3209 oder pMON3215 oder pMON3214 oder pBGHex-1), wurde über Nacht bei 37ºC in 5 ml LB plus 12,5 µg/ml Tetracyclin unter Belüftung gezüchtet. Eine aliquote 1 ml Menge jeder über Nacht angelegten Kultur wurde getrennt den einzelnen Kolben zugesetzt, die 25 ml LB plus 12,5 µg/ml Tetracyclin enthielten, und auf eine OD 600 = 1,0 gezüchtet. Die Zellen aus jedem Kolben wurden dann durch Zentrifugieren bei 6000 x g bei 4ºC während 5 min geerntet. Die Pellets wurden einzeln in 12 ml LB plus 7,5 % (V/V) DMSO resuspendiert und sofort auf Trockeneis in aliquoten 1 ml Mengen eingefroren. Anschließend wurden die Zellen in einem Flüssigstickstoff-Gefrierbehälter gelagert. Außerdem wurden etwa 10 µg gereinigte Plasmid-DNA bei -80ºC gelagert.

b. Expression der pGH(A)-Codiersequenz

Wie in Fig.10 gezeigt, wurde die auf dem rekombinanten Vektor M13mp9/PGHex-1 (ala) getragene pGH(A)-Codiersequenz verwendet, um die auf einem modifizierten pBGHex-1-Expressionsvektor getragene bGH(L)-DNA-Codiersequenz zu ersetzen. Der modifizierte Expressionsvektor pBGHex-1* umfaßt einen pBGHex-1-Expressionsvektor, worin die EcoRI-Restriktionsstelle, die stromaufwärts vom Tryptophan-Promotor (ptrp) angeordnet ist, entfernt wurde (siehe Fig.9). Der modifizierte Expressionsvektor pBGHex-1* wurde durch teilweisen EcoRI-Verdau von pBGHex-1*, gefolgt von SI-Nuclease-Behandlung zur Entfernung der klebrigen Enden, erzeugt. Der geschnittene pBGHex-1-Vektor wurde dann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase rezirkularisiert und zur Transformation von E. coli-JM101 verwendet, alles wie oben beschrieben. Plasmid-DNA einzelner Kolonien wurde als nächstes auf ein die pGH(A)-Codiersequenz tragendes 590 bp EcoRI/HindIII-Fragment und ein die ptrp-Sequenz tragendes 1050 bp EcoRI/PstI-Fragment gescreent (siehe Fig.9). Die Entfernung dieser EcoRI-Restriktionsstelle erleichtert die ortsspezifische Insertion der pGH(A)-Codiersequenz in den pBGHex-1*-Expressionsvektor in der richtigen Orientierung, wie in Fig.10 gezeigt. Der so gebildete rekombinante Expressionsvektor wird nachstehend als pMON3213 bezeichnet. Die pMON3213 enthaltende Mischung wurde dann zur Transformation von E. coli-W3110 verwendet, und die Transformanten wurden gezüchtet und selektiert, wie oben beschrieben. pMON3213 enthaltende E. coli-W3110 haben die ATCC-Zugangsnummer 53023. Das Ersetzen der pBGH(L)-Codiersequenz durch eine pGH(A)-Codiersequenz im pBGHex-1*-Expressionsvektor wurde durch die Isolierung von pMON3213-DNA und anschließendes Spalten dieses Expressionsvektors mit EcoRI und HindIII, wobei ein 590 bp Fragment erhalten wurde, und Spalten mit HaeIII bestätigt, wobei das Vorliegen eines zusätzlichen HaeIII-Restriktionsfragments gezeigt wurde, das durch die Anwesenheit eines Alanin-Codons in der pGH(A)-DNA-Codiersequenz erzeugt wurde. Die abschließende Bestätigung des Vorliegens der pGH(A)-DNA-Codiersequenz im pMON3213- Expressionsvektor erfolgte durch teilweise Sequenzierung des 590 bp EcoRI/HindIII-Fragments, wie vorstehend beschrieben.
Die Expression der pGH(A)-DNA-Codiersequenz und die Produktion von pGH(A) in E. coli-W3110 wurde auf die Weise erzielt, die für die bGH(A,L)- und bGH(A,V)-Erzeugung oben angegeben ist. Ähnlich wurde hohe Konzentrationen eines 22 000 Dalton-Proteins erzielt, das durch SDS-PAGE nachweisbar ist, wie oben beschrieben.
Den pMON3213-Expressionsvektor tragende E. coli-W3110 wurden wie oben beschrieben gelagert und für die Produktion von pGH(A) im großen Maßstab (10 bis 100 l Fermentation) verwendet, auch wie vorstehend beschrieben. Der pGH(A)-Proteingehalt in der 100 l Chargen-Fermentation betrug erneut ungefähr 1 g/l Nährlösung gemäß dem Radioimmunassay von Rosner et al., J. Immunol. Methods (1982) 52: 175-181.

Beispiel 4:

Dieses Beispiel wurde zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz der heterologen Proteine bGH(A,L), bGH(A,V), met-bGH(V)*, met-bGH(L)* (*Vergleichsbeispiel) und pGH(A) durchgeführt, die in Bakterien als Beispiele der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden.
Die in E. coli produzierten Somatotropin-Polypeptide wurden aus rohen solubilisierten lichtbrechenden Körpern, die entweder bGH(A,L), bGH(A,V), met-bGH(V), met-bGH(L) oder pGH(A) enthielten, durch Immunadsorptionschromatographie gereinigt, wie von Krivi & Rowold, Hybridoma (1984) 3: 151-161, beschrieben. Alle drei durch Immunadsorptionschromatographie gereinigten Somatotropin-Arten schienen gemäß SDS-PAGE-Analyse von 1 µg gereinigtem Protein auf einem 715 bis 15 % (V/V) Gradienten-Gel, die gemäß dem Verfahren von Laemmli, Nature (1970) 227: 680-685, durchgeführt wurde, mehr als 95 % rein zu sein. Protein-Konzentrationen der gereinigtem bGH-Arten wurden durch Routine-Hochleistungs-Flüssigchromatographie bestimmt.
Durch Immunaffinitätschromatographie gereinigte Proteine zur Verwendung in der N-terminalen Sequenzanalyse wurden umfassend gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Vor der N-terminalen Sequenzanalyse wurden die gereinigten Proteine in Ammoniumbicarbonat-Puffer resuspendiert, der 50 mM Ammoniumbicarbonat plus 1,0 % (M/V) SDS enthielt, und gegen den gleichen Puffer dialysiert, um verbleibendes Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-(tris) und Glycin zu entfernen. Ein Applied Biosystems Protein-Sequenzer Modell 470A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) wurde dann für alle N-terminalen Sequenzierungsanalysen verwendet, wie von Hunkapiller et al. (1983), Methods in Enzymol. 91: 399-413, und Hunkapiller et al. (1983), Methods in Enzymol. 91: 486-493, beschrieben.
Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Sequenzanalysen für einige Zubereitungen von bGH(A,L)-, bGH(A,V)-, met-bGH(V)*-, met-bGH(L)*- (*Vergleichsbeispiel) und pGH(A)- Polypeptiden. Die Menge an Protein mit N-terminalem Methionin ist in der Tabelle als Prozentsatz des gesamten Somatotropins in der Probe gezeigt. Zwei Verfahren wurden zur Methionin-Quantifizierung verwendet. Mit dem indirekten Verfahren wurde die Menge an NH&sub2;-met-ala-phe... in einer vorwiegend NH&sub2;-ala-phe...-Population aus den Unterschieden in den lag-Signalen berechnet. Da dieses Verfahren von einer Schätzung des "normalen" Sequenz-lags abhängig ist, der von Zyklus zu Zyklus variiert, ist dies nur eine grobe Schätzung der vorliegenden Sequenz NH&sub2;-ala-phe... . Das direkte Verfahren umfaßt eine in einer Edman-Abbaureaktion verglichene Signalstärke von PTH-met mit PTH-ala nach der Trennung von PTH-met von chemischem Rauschen durch Hochleistungs- Flüssigchromatographie (HPLC). "PTH" betrifft Phenylthiohydantoin. Spezifisch besteht die Edman-Abbau-Sequenzierungsreaktion aus dem Umsetzen der N-terminalen Aminosäure mit einem Reagens, das die Spaltung dieser Aminosäure und ihre anschließende Freisetzung als PTH-Derivat dieser Aminosäure bewirkt. Das letztere Verfahren führt zu einer guten Abschätzung von % met-ala-phe..., solange die Verunreinigung mit freier Aminosäure gering ist.
Wie durch die in nachstehender Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse der N-terminalen Sequenzierung gezeigt, ist kein Nachweis für eine Methionin-Prozessierung ersichtlich, wenn das N-terminale Methionin von Phenylalanin gefolgt wird. Es haben jedoch 80 % oder mehr der aus den MBS(A,L)- und MBS(A,V)-Genkonstrukten produzierten Moleküle Alanin anstelle von Methionin am N-Terminus. Das Ausmaß der N-terminalen Methionin-Prozessierung ist in Zellen aus unterschiedlichen Fermentationsläufen variabel, tritt jedoch immer in zumindest 80 % der Somatotropin-Moleküle auf. Außerdem wurden Produktionswerte von ungefähr 10 bis 15 % des gesamten Bakterienproteins für die in den transformierten Mikroorganismen produzierten Somatotropine erzielt. Tabelle 2 N-terminale Sequenzanalyse von met-bGH(L) *-, bGH(A,L)-, bGH(A,V)- und pGH(A)-Proteinen
1. Die Menge an Protein mit N-terminalem Methioin ist als % des gesamten Somatotropins in einer Probe angegeben.
2. Die beiden Zahlen repräsentieren die Daten für aus 2 unabhängigen Fermentationen gereinigtes Protein.
* zum Vergleich

Beispiel 5:

Dieses Beispiel wurde zur Bestimmung der Fähigkeit der in Bakterien produzierten bGH-Arten zur Stimulation der Milchproduktion bei Milchkühen durchgeführt. Wie in nachstehender Tabelle 3 gezeigt, stimulierte bGH(A,V) die Milchproduktion in einem größeren Ausmaß als das entsprechende Leucin-enthaltende analoge bGH(A,L).
Kurz gefaßt wurde die Untersuchung wie folgt durchgeführt. Holstein-Kühe in ihrem zweiten oder dritten Laktationstrimester erhielten täglich 5 ml Natriumbicarbonat-Lösung, pH 9,8 ± 0,5, allein (hier als "Kontrollprobe" bezeichnet) oder enthaltend etwa 25 mg bGH(A,V) oder bGH(A,L) (hier kollektiv als "Test- Somatotropine" bezeichnet). Alle Test-Somatotropine und Kontrollproben wurden täglich parenteral durch intramuskuläre Injektion in den semitendinösen Muskel während 21 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Die einzelne Milchproduktion jeder Kuh wurde bei jedem Melken am Vormittag und Nachmittag, beginnend sechs Tage vor der ersten täglichen Injektion bis zum 21. Tag der Injektion, aufgezeichnet. Milchfett, Protein und somatische Zellen wurden wöchentlich durch das DHIA-Testlaboratorium im DHIA Testing Center, Springfield, Missouri, 65803, analysiert. Die in nachstehender Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Erhöhung der Milchproduktion, die sich aus der Verabreichung von bGH(A,V) an Kühe ergibt, etwa 50 % größer war als die unter Verwendung von bGH(A,L) erhaltene. Derartige unerwartete Produktivitätsvorteile, die von der Valin-bGH-Art dieser Erfindung vorgesehen werden, sind eindeutig von sehr großem potentiellen wirtschaftlichen Interesse für Milchbauern. Tabelle 3 Mit der Injektion solubilisierter bGH-Arten assoziierte Reaktion der Milchproduktion bei Kühen
a. Werte basieren auf dem Mittel der kleinsten Quadrate von kg pro Tag, eingestellt auf eine Vorbehandlung mit Milch korrigiert hinsichtlich 3,5 % Fett
b. "N" bedeutet die Anzahl von in jeder Behandlung verwendeten Kühen.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung eines reifen Rinder-Wachstumshormon-(bovine growth hormone, bGH)-Polypeptids, das ein N- terminales Alanin aufweist, in E. coli, welches die folgenden Schritte umfaßt:

(a) das Bewirken der Expression einer DNA-Codiersequenz für das reife bGH-Polypeptid mit einem N-terminalen Alanin in E. coli, welche DNA weiters unmittelbar vor dem Codon für das N-terminale Alanin ein Methionin-Startcodon inkludiert, wobei die E. coli reifes bGH, das ein N-terminales Alanin aufweist, erzeugen;

(b) die Gewinnung des reifen bGH-Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist.

2. Verfahren zur Erzeugung eines reifen bGH-Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist, in E. coli, welches die folgenden Schritte umfabt:

(a) die Selektion einer DNA-Codiersequenz für das bGH-Polypeptid, wobei das Initialcodon für das N-terminale Alanin codiert;

(b) die Insertion dieser DNA-Codiersequenz in einen Expressionsvektor, wobei eine Gensequenz erhalten wird, die einen in E. coli wirksamen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translations-Startsignal mit einem Methionin-Codon unmittelbar vor der DNA-Codiersequenz, und ein Translations-Stop- Codon aufweist;

(c) das Einführen des diese Gensequenz tragenden Expressionsvektors in E. coli;

(d) die Züchtung von E. coli unter Bedingungen, die eine Expression dieser DNA und die Erzeugung des bGH-Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist, ermöglichen und

(e) die Gewinnung des das N-terminale Alanin aufweisenden Polypeptids.

3- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Codiersequenz eine modifizierte, in den N-terminalen Codierteil des Polypeptids eingeführte Nucleotidsequenz enthält, die eine in bezug auf die vom nativen Gen erzeugte cDNA erhöhte Menge an Expression des Polypeptids bewirkt, wobei die modifizierte Nucleotid-Sequenz für dieselbe Aminosäuresequenz codiert wie die aus dem nativen Gen erzeugte cDNA.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zumindest etwa 80 Gew.-% des reifen, von E. coli durch Expression dieser DNA erzeugten bGH-Polypeptids das N-terminale Alanin enthalten.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei zumindest etwa 95 Gew.-% des reifen, von E. coli durch Expression dieser DNA erzeugten bGH-Polypeptids das N-terminale Alanin enthalten.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Expression zu lichtbrechenden Körpern in E. coli führt, die unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops sichtbar sind und das reife bGH-Polypeptid mit einem N-terminalen Alanin aufweisen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in E. coli intrazellulär der Methionin-Rest aus dem resultierenden Polypeptid entfernt wird, der aus der Expression des Start- Signal-Codons resultiert, wobei das resultierende Polypeptid mit dem N-terminalen Alanin zurückbleibt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei E. coli ein Stamm, welcher als ATCC 39936, 53010, 53024 oder 53022 hinterlegt ist, oder eine Mutante eines dieser Stämme ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die DNA von einem Plasmid getragen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Plasmid pMON 3209 oder pMON 3215 ist, wie es in transformierter E. coli, hinterlegt als ATCC 53024 bzw. 53022, enthalten ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das resultierende bGH-Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die im wesentlichen dieselbe wie die von natürlich vorkommendem, reifem bGH-Polypeptid ist

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das bGH-Polypeptid Somatotropinaktivität aufweist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Polypeptid eine laktationsverbessernde Aktivität aufweist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das resultierende Polypeptid bGH (A,V) ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das resultierende Polypeptid bGH (A,L) ist.

16. Verfahren zur Erzeugung eines reifen Schweine-Wachstumshormon-(porcine growth hormone, pGH)-Polypeptids, das ein N- terminales Alanin aufweist, in E. coli, welches die folgenden Schritte umfaßt:

(a) das Bewirken der Expression einer DNA-Codiersequenz für das reife pGH-Polypeptid mit einem N-terminalen Alanin in E. coli, welche DNA weiters unmittelbar vor dem Codon für das N-terminale Alanin ein Methionin-Startcodon inkludiert, wobei die E. coli reifes pGH, das ein N-terminales Alanin aufweist, erzeugen;

(b) die Gewinnung des reifen pGH-Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist.

17. Verfahren zur Erzeugung eines reifen pGH-Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist, in E. coli, welches die folgenden Schritte umfaßt:

(a) die Selektion einer DNA-Codiersequenz für das pGH-Polypeptid, wobei das Initialcodon für das N-terminale Alanin codiert;

(d) die Züchtung von E. coli unter Bedingungen, die eine Expression dieser DNA und die Erzeugung des pGH-Polypeptids, das ein N-terminales Alanin aufweist, ermöglichen und

(e) die Gewinnung des das N-terminale Alanin aufweisenden Polypeptids.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei die DNA-Codiersequenz eine modifizierte, in den N-terminalen Codierteil des Polypeptids eingeführte Nucleotidsequenz enthält, die eine in bezug auf die vom nativen Gen erzeugte cDNA erhöhte Menge an Expression des Polypeptids bewirkt, wobei die modifizierte Nucleotid-Sequenz für dieselbe Aminosäuresequenz codiert wie die aus dem nativen Gen erzeugte cDNA.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei zumindest etwa 80 Gew.-% des von E. coli durch Expression dieser DNA erzeugten pGH-Polypeptids das N-terminale Alanin enthalten.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei zumindest etwa 95 Gew.-% des reifen, von E. coli durch Expression dieser DNA erzeugten pGH-Polypeptids das N-terminale Alanin enthalten.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei die Expression zu lichtbrechenden Körpern in E. coli führt, die unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops sichtbar sind und das reife pGH-Polypeptid mit einem N-terminalen Alanin aufweisen.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei in E. coli intrazellulär der Methionin-Rest aus dem resultierenden Polypeptid entfernt wird, der aus der Expression des Start- Signal-Codons resultiert, wobei das resultierende Polypeptid mit dem N-terminalen Alanin zurückbleibt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei E. coli ein Stamm, welcher als ATCC 53009 oder 53023 hinterlegt ist, oder eine Mutante eines dieser Stämme ist.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei die DNA von einem Plasmid getragen wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Plasmid pMON 3213 (ATCC 53023) ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 25, wobei das resultierende Polypeptid eine Aminosäuresequenz enthält, die im wesentlichen dieselbe wie die von natürlich vorkommendem Schweine-Wachstumshormon-Polypeptid ist.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 26, wobei das Polypeptid Somatotropinaktivität aufweist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 26, wobei das resultierende Polypeptid pGH(A) ist.

29. Gen, welches einen in E. coli funktionierenden Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle, ein Methionin/Start-Codon unmittelbar gefolgt von einer DNA-Sequenz, die für reifes pGH mit einem N-terminalen Alanin codiert, gefolgt von einem Translations-Stop-Signal, aufweist.

30. Gen nach Anspruch 29, wobei die DNA-Codiersequenz eine im N-terminalen Codierteil eingeführte modifizierte Nucleotid- Sequenz aufweist, die eine in bezug auf aus dem nativen Gen erzeugte c-DNA erhöhte Menge an Expression des Polypeptids bewirkt.