CS228512B2 - Method for the production of new makrolide - Google Patents

Method for the production of new makrolide Download PDF

Info

Publication number
CS228512B2
CS228512B2 CS815397A CS539781A CS228512B2 CS 228512 B2 CS228512 B2 CS 228512B2 CS 815397 A CS815397 A CS 815397A CS 539781 A CS539781 A CS 539781A CS 228512 B2 CS228512 B2 CS 228512B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
domm
dihydro
doml
medium
esters
Prior art date
Application number
CS815397A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard H Baltz
Gene M Wild
Eugene T Seno
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of CS228512B2 publication Critical patent/CS228512B2/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/08—Oxygen as only ring hetero atoms containing a hetero ring of at least seven ring members, e.g. zearalenone, macrolide aglycons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C12R2001/54—Streptomyces fradiae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Vynález se týká způsobu výroby makrolidů, zejména sloučenin, svojí strukturou podobných známému antibiotiku tylosinu, které bylo popsáno například v publikaci Tetrahedron Letters, 2339 (1970).
Přestože tylosin je velmi cennou látkou, je zapotřebí nacházet nová antibiotika již proto, že se mohou vyvinout odolné kmeny. Mimoto mohou změny struktury antibiotika vést ke změnám ve spektru citlivých mikroorganismů. Na neštěstí jsou chemické modifikace struktury makrolidových látek typu tylosinu neobyčejně obtížné. Například v publikaci J. Org. Chem. 44 (12), 2050 až 2052 (1979) jsou uváděny problémy, spoje
né se štěpením mycenosylového glykosidu od tylosinu chemickým způsobem. V převážné většině případů se tedy výzkum věnuje nacházení nových mikroorganismů, a to přírodně se vyskytujících nebo syntetických, jejichž pěstováním by bylo možno získat příbuzné struktury.
Nyní bylo zjištěno, že sloučeniny se strukturou podobnou tylosinu je možno získat tak, že se pěstují některé kmeny Streptomyces fradiae v submerzní kultuře za aerobních podmínek.
Předmětem vynálezu je způsob výroby nového makrolidu obecného vzorce I kde
Q znamená skupinu —CHO nebo —CH2OH,
Y znamená hydroxylovou nebo mykarosyloxyskupinu, jakož i z framaceutického hlediska přijatelných solí nebo esterů těchto látek, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Streptomyces fradiae v submerzní kultuře za aerobních podmínek do nahromadění antibiotika za předpokladu, že v případě, že běží o výrobu sloučeniny, v níž Y znamená hydroxylovou skupinu, provádí se kultivace v mírně kyselém prostředí, načež se získaný produkt popřípadě převede na sůl nebo ester, přijatelný z farmaceutického hlediska.
Mykarosyloxyskupinu je možno vyjádřit vzorcem
Sloučeniny obecného vzorce I jsou 2“‘-O-demethylmakrocin, který bude dále popisován jako „demethylmakrocin“ nebo „DOMM“ se vzorcem II:
Dihydroxyderiyát DOMM, to jest 20-dihydro-2“‘-O-demethylmakrocin, dále uváděný jako „dihydro DOMM“ se strukturním vzorcem III
CH3
2‘‘‘-de-O-methylactenocin, dále uváděný jako „DOML“ se strukturním vzorcem IV
a 20-dihydrO-2“‘-de-O-methylaktenocin, dále uváděný jako „dihydro-DOML“ se strukturním vzorcem V
jakož i soli a estery těchto sloučenin.
Stereochemie těchto látek je totožná se stereochemií makrolidového antibiotika tylosinu a je popsána například v publikaci Tetrahedron Letters, 4737 (1970). Aminocukr je mykaminóza, neutrální cukr na levé straně je 6-desoxy-D-allóza a neutrální cukr ve vzorci II a III je mykaróza.
Hydroxylové skupiny DOMM a dihydro-DOMM v polohách 2‘, 4“, 3“, 2‘“, 3‘“, 4‘“ a 3 mohou být esterifikovány za vzniku acylesterových derivátů. ' Hydroxylové skupiny DOML a dihydro-DOML v polohách 2‘, 4‘, 2‘“, 3‘“, 4'“ a 3 je možno e^l^i^irifikovat za vzniku acylesterových derivátů. Mimoto je možno esterifikovat dihydro-DOMM a dihydro-DOML na hydroxylové skupině v poloze 20. Esterifikace hydroxylové skupiny v poloze 2“ v případě DOMM a dihydro-DOMM je snadná. Hydroxylové skupiny DOML a dihydro-DOML v poloze 2“ a 4‘ se rovněž snadno esterifikují. Typickými estery jsou estery monokarboxylových kyselin a hemiestery dikarboxylových kyselin o 2 až 18 atomech uhlíku.
DOMM, dihydro-DOMM, DOML, dihydro-DOML a jejich acylesterové deriváty jsou zásadité látky, které při reakci s kyselinami vytvářejí adiční soli. Tyto adiční soli jsou rovněž předmětem vynálezu. V případě použití termínu „sloučenina typu DOMM“ znamená DOMM, dihydro-DOMM, DOML, dihydro-DOML a acylesterové ' deriváty těchto· látek, jakož i z farmaceutického hlediska přijatelné adiční soli DOMM, dihydro-DOMM, ' DOML, dihydro-DOML a jejich acylesterových derivátů s kyselinami.
Nové makrolidy obecného vzorce I je způsobem podle vynálezu možno získat tak, že se pěstuje kmen Streptomyces fradiae ' v submerzní kultuře za aerobních podmínek do nahromadění antibiotika za předpokladu, že v případě výroby sloučenin vzorce IV nebo V je zapotřebí kultivaci provádět v mírně kyselém prostředí.
Výhodným kmenem Streptomyces fradiae je kmen NRRL 31669.
DOMM je sloučenina, která je rozpustná ve vodě a ve většině polárních organických ' rozpouštědel jako je aceton, methanol, ethanol, chloroform, dimethylformamid a dimethylsulfoxid. Adiční soli DOMM s kyselina228512 mi jsou rozpustnější ve vodě než volná sloučenina.
DOMM je možno odlišit od tylosinu chromatografií na papíře nebo na tenké vrstvě. Přibližně hodnoty Rf a Rx pro DOMM a pro tylosin jsou uvedeny v následujících tabul kách 1 a 2. V tabulce 2 jsou hodnoty Rx poměrem mezi pohyblivostí DOMM vzhledem к tylosinu, jehož hodnota byla stanovena na 1,0. Pro detekci antibiotik byl užit mikroorganismus Bacillus subtilis.
TABULKA 1
Chromatografie DOMM na tenké vrstvě3
Sloučenina Ab Hodnoty Rf В c
tylosin 0,53 0,53 0,67
DOMM 0,05 0,44 0,44
“prostředí: (Merck, Darmstadt —) silikagel 60 brozpouštědlo: A = směs ethylacetátu a diethylaminu v poměru 96 : 4 В = směs acetonu a ethanolu v poměru 2 :1 C = směs chloroformu a methanolu v poměru 3 :1.
TABULKA 2
Chromatografie DOMM na papíře3
Sloučenina Rx
Db E
tylosin 1,0 1,0
DOMM 0,17 0,88
“papír (Whatman č. 1) po předběžném zpracování 0,75 Μ KH2PO4 jako pufrem při pH 4,0 a následném usušení brozpouštědlo: D = ethylacetát nasycený vodou
E = n-butanol nasycený vodou.
Dihydroderivát DOMM je možno získat chemickou redukcí nebo fermentací. V případě, že se dihydro-DOMM připravuje chemickou redukcí, je možno užít známých způsobů, například se na DOMM působí přibližně stechiometrickým množstvím borohydridu sodíku v alkoholovém rozpouštědle. Dihydro-DOMM je možno získat také pěstováním S. fradiae NRRL 31669 za řízených podmínek fermentace.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby DOML a dihydro-DOML hydrolýzou v mírně kyselém prostředí, přičemž hydrolýza se podrobí DOML a díhydro-DOML. Dihydro-DOML je také možno získat
1. hydrolýzou DOMM za mírně kyselých podmínek za vzniku DOML a
2. redukcí takto získaného DOML za vzniku dihydro-DOML.
Provádění hydrolýzy v mírně kyselém prostředí je známo. К provádění hydrolýzy je možno užít vodných roztoků o pH 4 nebo nižším. Užívá se teplot 20 až 100 °C. Reakční doba pro provádění hydrolýzy se mění v závislosti na pH reakční směsi a na použité teplotě. Při vyšším pH je reakční rychlost menší, při vyšší teplotě probíhá reakce rychleji. Při pH 2 a při teplotě místnosti je reakční doba přibližně 6 až 24 hodin. Reakce se provádí tak, že se na DOMM nebo dihydro-DOMM působí mírně kyselým roztokem po dobu, dostatečnou к odstraně ní mykarosylové skupiny za vzniku DOML nebo dihydro-DOML.
Je také možno postupovat tak, že se DOML nebo dihydro-DOML získá přímým zpracováním DOMM nebo dihydro-DOMM ve fermentačním prostředí, v němž tyto látky vznikly za mírně kyselých podmínek, tak jak bylo svrchu popsáno po dobu dostatečnou pro přeměnu DOMM nebo dihydro-DOMM na DOML nebo dihydro-DOML. V některých případech je tento způsob nejvýhodnější. Takto získaný DOML nebo dihydro-DOML je pak možno izolovat z fermentačního prostředí známým způsobem.
DOMM a dihydro-DOMM je možno esterifikovat na hydroxylových skupinách v polohách 2‘, 4“, 3“, 2‘“, 3‘“, 4‘“ a 3 za vzniku acylesterových derivátů, že se na tyto látky působí acylačními činidly známým způsobem. DOML a dihydro-DOML je možno esterifikovat v polohách 2‘, 4‘, 2‘“, 3‘“, 4‘“ a 3 obdobným způsobem. Mimoto je možno esterifikovat dihydro-DOMM a dihydro-DOML v poloze 20. Esterlfikace hydroxylové skupiny v poloze 2‘ v případě DOMM a dihydro-DOMM je snadná. Hydroxylové skupiny v poloze 2‘ a 4‘ DOML a dihydro-DOML se rovněž snadno esterifikují. Typickými acylačními činidly jsou anhydridy, halogenldy, obvykle v kombinaci se zásadou nebo jinou látkou, která váže kyselinu a aktivní estery organických kyselin. Acylaci je možno také provádět při použití směsi organické kyseliny a dihydratačního činidla, například N,N‘-dicyklohexylkarbodiimidu. Acylaci je rovněž možno provést enzymaticky, tak jak bylo popsáno Okamotem a dalšími v US patentu č. 4 092 473. Vzniklé acylové deriváty je možno oddělit a čistit známým způsobem.
2‘-monoesterové deriváty DOMM a dihydro-DOMM je možno získat běžnou selektivní esterifikací, například tak, že se na antibiotikum působí stechiometrickým množstvím nebo malým přebytkem acylačního činidla, například anhydridu kyseliny při teplotě 0 °C až teplotě místnosti po dobu 1 až 24 hodin do ukončení esterifikace. 2‘-monoester je možno z reakční směsi izolovat běžným způsobem, například extrakcí, chromatografií a krystalizaci.
Použitelnými estery jsou estery organických kyselin, a to alifatických, cykloalifatických, arylkarboxylových, aralkylkarboxylových, heterocyklických karboxylových kyselin, kyselin sulfonových a alkoxykarbonylových o 2 až 18 atomech uhlíku i estery anorganických kyselin, například kyseliny sírové a fosforečné.
Vhodnými estery jsou například estery organických kyselin, jako jsou kyselina octová, chloroctová, propionové, máselná, isovalerová, alkoxykarbonylová, stearová, cyklopropankarboxylová, cyklohexankarboxylová, β-cyklohexylprcpionová, 1-adamantankarboxylová, benzoová, fenyloctová, fenoxyoctová, mandlová a 2-thienyloctová, jakož i kyseliny alkylsulfonové, arylsulfonové a aralkylsulfonové, přičemž kyseliny, obsahující arylové a aralkylové skupiny mohou nést na aromatickém jádře další substituenty, například atom halogenu, nitroskupinu, nižší alkoxyskupinu a podobně.
Vhodnými estery jsou rovněž poloestery odvozené od dikarboxylových kyselin, jako kyseliny jantarové, maleinové, fumarové, malonové a ftalové.
Výhodnou skupinu tvcří estery, přijatelné z farmaceutického hlediska, které jsou netoxické pro teplokrevné živočichy. Ostatní estery je však možno, také použít jako meziprodukty.
DOMM, dihydro-DOMM, DOML, dihydro-DOML a deriváty těchto látek vytváří adiční soli s kyselinami. Tyto adiční soli DOMM, dihydro-DOMM, DOML, dihydro-DOML a acylderiváty s kyselinami jsou také předmětem vynálezu. Tyto soli jsou užitečné například pro izolaci, čištění a krystalizaci DOMM, dihydro-DOMM, DOML, dihydro-DOML a acylderiváty těchto látek. Mimoto mají tyto. soli lepší rozpustnost ve vodě.
Příkladem vhodných solí mohou být soli, vytvářené s organickými a anorganickými kyselinami, jako jsou kyselina sírová, ' chlorovodíková, fosforečná, octová, jantarová, citrónová, mléčná, maleinová, fumarová, palmitová, žlučová, pamoová, mucinová, D-glutamová, d-kamfrová, glutarová, glyko lová, ftalová, vinná, mravenčí, laurová, ' stearová, salicylová, methansulfonová, benzensulfonová, scrbitová, pikrová, ' benzoová, skořicová a podobně.
Výhodnou skupinou solí jsou adiční ' ' soli s kyselinami, přijatelné z farmaceutického hlediska. Pod tímto pojmem se ' rozumí ’ soli, ’ které nemají toxické účinky pro teplokrevné živočichy.
Sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu, se obvykle podávají ve formě ' veterinárních prostředků, které obsahují běžné nosiče a další pomocné látky, a to organiccké·· i anorganické, vhodné pro enterální, parenterální nebo místní podání, přičemž tyto látky nesmí nevhodným způsobem reagovat s účinnými látkami.
Vhodnými nosiči, přijatelnými z farmaceutického hlediska jsou například voda, roztoky solí, alkoholy, rostlinné oleje, polyethylenglykoly, želatina, mléčný ' cukr, amylóza, stearan horečnatý, mastek, kyselina křemičitá, parafiny, volné oleje, monoglyceridy ' a diglyceridy alifatických kyselin a hydroxymethylcelulóza. Farmaceutické ' prostředky je možno sterilizovat a popřípadě mísit s dalšími pomocnými činidly, například kluznými látkami, konzervačními látkami, stabilizátory, smáčedly, emulgátory, barvivý a chuťovými látkami, které nereagují s účinnou látkou.
Sloučeniny, vyrobené způsobem podle vynálezu je možno užít jako přídatných krmiv nebo jako premixu, který se přidává do běžného krmivá obvyklým způsobem.
Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat veterinární prostředek, který obsahuje 0,1 až 90 hmotnostních % ' sloučeniny obecného vzorce I, jejího ' esteru nebo . soli, přijatelné z farmaceutického hlediska spolu s jedním nebo. větším počtem nosičů a pomocných látek, přijatelných z farmaceutického hlediska.
Sloučeniny obecného vzorce I je možno získat svrchu uvedeným způsobem, je však ’ také možno získat 5-O-mykaminosyltylonolid (OMT) a 20-dihydro-5-0-mykaminosyltylonolid (dihydro-OMT). Tyto. látky byly popsány Gormanem a dalšími v US patentu č. 3 459 853. V tomto patentovém spisu se získává OMT a dihydro-OMT . tak, že se odstraní . neutrální cukr řízenou hydrolýzou tylosinu, desmykosinu, makrocinu a lakte- nocinu a . dihydroderiváty těchto. sloučenin v kyselém prostředí. Způsobem podle vynálezu se totiž získávají nové výchozí látky, z nichž je možno připravit OMT a dihydroOMT. Je tedy možno způsobem podle US patentu č. 3 459 853 užít DOMM a DOML k přípravě OMT a dihydro-DOMM a dihydro-DOML k přípravě dihydro-OMT.
DOMM . a dihydro-DOMM je možno. získat tak, že se pěstuje kmen Streptomyces fradiae, který produkuje tyto látky v submerzní kultuře za aerobních podmínek ve vhodném živném prostředí do nahromadění an228512 tibiotika. Při fermentaci se nejprve vytváří DOMM, jakmile se však fermentace provádí delší dobu, začne se vytvářet i dihydro-DOMM, protože DOMM, přítomné v živném prostředí se enzymaticky redukuje.
Živné prostředí užité k pěstování Streptomyces fradiae NRRL 31669 je možno volit z velkého počtu živných prostředí. Pro hospodárnost výroby, optimální výtěžek a snadnou izolaci produktu jsou však výhodnější některá živná prostředí. Výhodnými zdroji uhlíku pro fermentaci ve větším měřítku jsou například uhlohydráty jako dextrin, glukóza, škrob, kukuřičná mouka a oleje, jako sójový olej. Výhodnými zdroji dusíku jsou kukuřičná mouka, sójová mouka, rybí mouka, aminokyseliny a podobně. Z anorganických solí, které je možno včlenit do živného prostředí, jde zejména o běžné rozpustné soli, které obsahují železo, draslík, sodík, hořčík, vápník, amonný ion, chloridový' ' ion, ion uhličitanový, síranový, dusičnanový a podobně.
Živné prostředí by také mělo obsahovat základní stopové prvky, které jsou nutné pro růst a vývoj produkčního organismu. Tyto stopové prvky se však běžně vyskytují jako ' nečistoty v dalších složkách živného prostředí v množství, které je dostatečné pro' růstové požadavky mikroorganismu. V některých případech však může být nutné přidat malé množství, obvykle 0,2 ml/1 protipěnivého ' činidla, například polypropylenglykolu s molekulovou hmotností přibližně 2000, a to zejména při fermentaci ve velkém měřítku, kde pěnění je velkým problémem.
Pro produkci většího množství DOMM nebo ' dihydro-DOMM je výhodná submerzní kultura za aerobních podmínek v tanku. Malé množství DOMM nebo dihydro-DOMM je možno získat také v třepacích lahvích. Protože při očkování velkých tanků sporami mikroorganismu je nutno vyčkat přes období lag, je výhodné užít vegetativního očkovacího materiálu. Vegetativní očkovací materiál se získá tak, že se malý objem živného prostředí naočkuje sporami nebo fragmenty mycelia mikroorganismu, čímž se získá čerstvá, aktivně rostoucí kultura. Tento vegetativní očkovací materiál se pak užije k naočkování většího tanku. Živné prostředí, užité k získání očkovacího materiálu, může být totéž prostředí, jakého se užívá při fermentaci ve větším měřítku, je však možno užít i jiného prostředí.
S. fradiae NRRL 31669 je možno pěstovat v teplotním rozmezí 10 až 37 °C. K optimální produkci antibiotika dochází při teplotě přibližně 28 °C.
Jak je to obvyklé při fermentaci v submerzní kultuře za aerobních podmínek, nechá se živným prostředím probublávat sterilní vzduch. Pro účinnou produkci antibiotika má být při fermentaci v tanku nasyce ní živného prostředí vzduchem 30 °/o nebo více při teplotě 28 °C a při atmosférickém tlaku.
Produkci antibiotika je možno v průběhu fermentace sledovat tak, že se odebírají vzorky živného prostředí a zkoušejí se pomocí organismů, které jsou citlivé na produkované antibiotikum. Vhodným organismem je například Staphylococcus aureus ATCC 9144. Biologická zkouška se obvykle provádí automaticky při použití turbidimetrické metody. Mimoto je možno produkci antibiotika sledovat absorpcí ultrafialového světla v extraktu živného prostředí. K tomuto účelu je také možno' užít vysokotlaké kapalinové chromatografie s detekcí ultrafialovým světlem, jak bylo popsáno například v publikaci J. H. Kennedy v J. Chromatographic Science, 16, 492 až 295 (1978).
Po skončené fermentaci za submerzních podmínek v aerobní kultuře je možno DOMM nebo dihydro-DOMM izolovat do fermentačního prostředí obvyklým způsobem. Izolace DOMM nebo dihydro-DOMM se obvykle provádí počáteční filtrací fermentačního prostředí. Zfiltrované živné prostředí je pak možno' dále čistit za získání požadovaného antibiotika. Antibiotikum ' je možno' čistit různým způsobem. Výhodný způsob čištění spočívá v tom, že se pH zfiltrovaného živného prostředí upraví na 9 a živné prostředí se extrahuje vhodným rozpouštědlem, jako ethylacetátem, amylacetátem, methylisobutylketonem, organická fáze se pak extrahuje okyseleným vodným roztokem a antibiotikum se vysráží alkalizací vodného roztoku. Další čištění je možno provést extrakcí, adsorpcí a/nebo krystalizací.
Tak jako tomu je i u jiných mikroorganismů, mohou se vlastnosti Streptomyces fradiae NRRL 31669 měnit. je například možno získat umělé varianty nebo mutanty kmene NRRL 31669 působením různých známých fyzikálních a chemických mutagenů, například ultrafialového světla, paprsků X, paprsků gamma nebo' N-methyl-N‘-nitro-N-nitrosoguanidinu. Všechny přírodní nebo umělé varianty, mutanty a rekombinanty kmene Streptomyces fradiae NRRL 31669, které si uchovávají svou základní schopnost produkce DOMM, je možno užít při provádění způsobu podle vynálezu.
Sloučeniny typu DOMM brzdí ' růst patogenních bakterií, zvláště gram-pozitivních bakterií a čeledi Mycoplasma.
Při použití sloučenin, vyrobených způsobem podle vynálezu je tedy možno předcházet infekcím nebo' léčit různé mikrobiální infekce, zvláště ty, které byly způsobeny gram-pozitivními bakteriemi a čeledí Mycoplasma.
V následující tabulce 3 jsou uvedeny minimální inhibiční koncentrace (MIC), jak byly získány při standardním ředění na agaru pro DOMM ve volné formě.
TABULKA 3
Účinnost DOMM ve vodné formě in vitro
Organismus MIC (^g/ml)
Streptococcus pyogenes C2030,25
Streptococcus pneumoniae Park I 0,25 Streptococcus sp. (skupina D) 282 4,0 Pasteurella multocida12,50
Pasteurella hemolytica50,0
Mycoplasma gallisepticum0,78
Mycoplasma hyopneumoniae0,78
Mycoplasma hyorhinis3,12
Sloučeniny typu DOMM mají účinnost in vivo proti experimentálním bakteriálním in* fekcím. Při podání dvou dávek zkoumané látky myším s pokusnou infekcí byla měřena účinnost jako EDso, to jest dávka v mg/ /kg, chránící 50 % pokusných zvířat, metoda je uvedena v publikaci Warren Wick a další, J. Bacteriol. 81, 233 až 235 (1961). Hodnoty EDso pro DOMM jsou uvedeny v tabulce 4.
TABULKA 4
Hodnoty EDso v mg/kg x 2 pro DOMM při podkožním podání
Sloučenina
Streptococcus Streptococcus Staphylococcus pyogenes C203 pneumoniae Park I aureus 3055
DOMM bakteriál. infekce x LDso
1,1
133
37,5 3,8
41,2 139
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
A. Fermentace DOMM v třepací láhvi
Lyofilizovaná peleta Streptomyces fradiae NRRL 31669 se disperguje v 1 až 2 ml sterilizované vody. 0,5 ml tohoto roztoku se užije к naočkování 150 ml vegetativního živného prostředí následujícího složení.
Složka Množství v %
kukuřičný výluh 1,0
extrakt z kvasnic 0,5
drť ze sójových bobů 0,5
uhličitan vápenatý 0,3
surový sójový olej 0,45
deionizovaná voda 97,25
Je také možno postupovat tak, že se vegetativní kultura S. fradiae NRRL 31669, uchovávaná po objemu 1 ml v kapalném dusíku rychle rozmrazí a užije к naočkování vegetativního živného prostředí. Vegetativní živné prostředí se po naočkování inkubuje v Erlenmeyerových baňkách o objemu 500 ml při teplotě 29 °C po dobu 48 hodin v uzavřené třepačce při 300 výkyvech za minutu.
0,5 takto inkubovaného vegetativního prostředí se užije к naočkování 7 ml produkčního prostředí následujícího složení:
Složka Množství v %
řepná melasa 2,0
kukuřičná mouka 1,5
rybí mouka 0,9
kukuřičný gluten 0,9
chlorid sodný 0,1
hydrogenfosforečnan amonný 0,04
uhličitan vápenatý 0,2
surový sójový olej 3,0
deionizovaná voda 91,36
Naočkované fermentační prostředí se in kubuje v lahvích o objemu 50 ml při teplo
tě 29 °C po dobu 6 dnů v uzavřené třepačce při 300 výkyvech za minutu.
B. Fermentace DOMM v tanku
Aby bylo možno získat větší objem očkovacího materiálu, užije se 60 ml inkubovaného vegetativního prostředí, připraveného podle odstavce А к naočkování 40 litrů vegetativního růstového prostředí druhého stupně následujícího složení:
Složka Množství v
kukuřičný výluh 1,0
sójová mouka 0,5
extrakt z kvasnic 0,5
uhličitan vápenatý 0,3
surový sójový olej 0,5
surový lecithin 0,015
voda 97,185
Roztok sé upraví ria pH 8,5 přidáním 50% roztoku hydroxidu sodného.
Toto vegetativní živné prostředí druhého stupně se pak inkubuje v tanku o objemu 68 litrů po dobu 40 hodin při teplotě 29 CC za současného provzdušňování a míchání.
litry takto inkubovaného živného prostředí se užijí к naočkování 44 litrů sterilního produkčního prostředí následujícího složení:
Složka Množství v %
rybí mouka 0,875
kukuřičná mouka 1,5
kukuřičný gluten 0,875
uhličitan vápenatý 0,2
chlorid sodný 0,1
hydrogenfosforečnan amonný 0,04
řepná melasa 2,0
surový sójový olej 3,0
lecithin 0,09
voda 91,32
Roztok se upraví na pH 7,2 přidáním 50procentního roztoku hydroxidu sodného.
Naočkované produkční živné prostředí se inkubuje v tanku o objemu 68 litrů přibližně 4 dny při teplotě 28 °C. Fermentační živné prostředí se provzdušňuje sterilním vzduchem tak, aby se obsah rozpuštěného kyslíku udržoval v rozmezí 30 až 50 % za stálého míchání běžnými míchadly při 250 otáčkách za minutu.
Příklad 2
Izolace DOMM litrů živného prostředí, získaného způsobem podle příkladu 1 se zfiltruje při použití pomocného prostředku. Myceliální koláč se promyje vodou a promývací voda se pak přidá к filtrátu.
Filtrát se upraví na pH 9,1 při použití 25% vodného roztoku hydroxidu sodného. Pak se filtrát dvakrát extrahuje, a to 9 litry a 5 litry ethylacetátu. К ethylacetátovému extraktu se přidá 3500 ml deionizované vody. Roztok se upraví na pH 4,1 při použití 28% roztoku kyseliny fosforečné (2 díly vody na 1 díl koncentrované kyseliny fosforečné). Po extrakci se vodná fáze oddělí, ethylacetátový extrakt se znovu extrahuje 3500 ml vody stejným způsobem. Oba vodné extrakty se pak slijí.
Vodné extrakty se upraví na pH 8,5 přidáním hydroxidu sodného a pak se dvakrát extrahují 3000 a 1200 ml chloroformu. Chloroformové extrakty se vysuší ve vakuu, čímž se získá přibližně 40 g surového DOMM. Tento DOMM ve volné formě se čistí krystalizací ze směsi vody a acetonu, čímž se získá přibližně 30 g DOMM ve volné formě.
DOMM je bílá pevná látka, která krystalizuje ze směsi acetonu a vody. DOMM měkne při teplotě 135 až 140 °C a úplně taje při teplotě 160 °C. Elementární analýza DOMM ukazuje, že tato látka má následující přibližné procentuální složení:
uhlík 59,5 %, vodík 8 %, dusík 2 %, kyslík.
30,5 %. DOMM má empirický vzorec C-44H73NO17 a molekulovou hmotnost přibližně 888 (887, podle stanovení hmotnostní spektrometrií).
Infračervené absorpční spektrum DOMM ve volné formě je znázorněno na přiloženém výkrese. Je zřejmé, že pozorovatelná absorpční maxima jsou na následujících frekvencích 5cm_1): 3679 (malé), 3604 (hrb), 3486 (široké), 3012 (hrb), 2979 (intenzívní), 2938 (intenzívní), 2880 (hrb), 2821 (hrb), 2794 (velmi malé), 2735 (velmi malé), 1723 (intenzívní), 1678 (střední), 1627 (malé), 1593 (intenzívní), 1477 (hrb), 1459 (střední), 1409 (střední), 1373 (střední), 1333 (hrb), 1316 (střední), 1273 (malé), 1183 (hrb), 1161 (intenzívní), 1114 (střední), 1080 (intenzívní), 1048 (intenzívní), 1013 (střední), 996 (střední), 984 (hrb), 960 (hrb), 924 (velmi malé), 902 (malé), 865 (velmi malé) a 841 (malé).
Spektrum DOMM v ultrafialovém světle v neutrálním ethanolu má absorpční maximum při 283 nm (e 22 550).
DOMM ve volné formě má následující specifickou otáčivost:
[α]η25 —39,69° (c = 1, СНзОН).
Elektrometrická titrace DOMM v 66%. vodném dimethylformamidu prokazuje přítomnost titrovatelné skupiny s hodnotou pK» 7,14.
P ř í к 1 a d 3
Příprava DOML
DOMM, připravená způsobem podle příkladu 2 se rozpustí ve zředěném roztoku kyseliny chlorovodíkové (kyselina chlorovodíková se přidává do vody do pH roztoku 1,8). Výsledný roztok se nechá stát 8 hodin při teplotě místnosti a pak se upraví na pH 9,0 přidáním hydroxidu sodného. Tento alkalický roztok se pak extrahuje ethylacetátem, dichlormethanem nebo chloroformem. Extrakt se vysuší ve vakuu, čímž se získá DOML ve volné formě, teplota měknutí 115 až 120 °C, teplota tání 134 až 140° Celsia.
Příklad 4
Příprava dihydro-DOMM mg DOMM, připraveného způsobem podle příkladu 2 se rozpustí ve 25 ml přibližně 40% vodného roztoku isopropylalkoholu.
mg borohydridu sodíku se rozpustí v 10 ml 30% vodného roztoku isopropylalkoholu. 1 ml borohydridu sodíku se přidá к roztoku, který obsahuje DOMM. Výsledná směs se 5 minut míchá, pak se upraví na pH 7,5 přidáním kyseliny fosforečné a zahustí se ve vakuu к odstranění isopropylalkoholu. К výslednému vodnému koncentrátu se přidá voda do objemu 25 ml, načež se přidá ještě 50 ml chloroformu. Pak se pH vodné fáze upraví na 7,5. Po extrakci se chloroform oddělí a odpaří do sucha ve vakuu, čímž se získá dihydro-DOMM.
Příklad 5
Příprava dihydro-DOML
Dihydro-DOMM, připravený způsobem podle příkladu 4 se zpracovává obdobným způsobem jako v příkladu 3, čímž se získá dihydro-DOML.
Příklad 6
Další možný způsob přípravy DOML
DOML se připraví z DOMM tak, že se zpracovává DOMM přímo ve fermentačním prostředí, v němž byl získán působením mírně kyselého prostředí stejně jako v příkladu 3. Izolace DOML se provádí obdobným způsobem jako izolace DOMM v příkladu 2.
Příklad 7
Další možný způsob přípravy dihydro-DOML
DOML, získaný způsobem podle příkladu 3 se redukuje při použití způsobu, popsaného v příkladu 4 za vzniku dihydro-DOML.
Příklad 8
2‘-O-propionyl-DOMM
DOMM se rozpustí v acetonu a zpracovává se působením 1,2 ekvivalentů anhydridu kyseliny propionové při teplotě místnosti po dobu 6 hodin, čímž se získá 2‘-O-propionyl-DOMM.
Příklad 9
2‘-O-isovaleryl-DOMM je možno získat obdobným způsobem jako v příkladu 8, avšak při použití anhydridu kyseliny isovalerové.
Příklad 10
2‘-0-benzoyl-DOMM je možno získat obdobným způsobem jako v příkladu 8, avšak při použití anhydridu kyseliny benzoové.
Příklad 11
2‘-O-(n-butyryl]-DOMM je možno získat obdobným způsobem jako v příkladu 8, avšak při použití anhydridu kyseliny n-máselné.
Příklad 12
2*,4‘-di-O-propionyl-DOML
DOML se rozpustí v acetonu a zpracovává se působením o něco více než 2 ekvivalentů anhydridu kyseliny propionové při teplotě místnosti po dobu přibližně 6 hodin, čímž se získá 2‘,4‘-di-0-proplonyl-DOML.
Příklad 13
2‘,4‘-di-0-isovalery-D0ML je možno získat způsobem podle příkladu 12 při použití anhydridu kyseliny isovalerové.
Příklad 14
2‘,4‘-di-O-benzoyl-DOML je možno získat způsobem podle příkladu 12 při použití anhydridu kyseliny benzoové.
Příklad 15
2‘,4‘-di-O-(n-butyryl]-DOML je možno získat způsobem podle příkladu 12 při použití anhydridu kyseliny n-máselné.

Claims (2)

1. Způsob výroby nnového makrolidu obecného vzorce I kde
Q znamená skupinu —CHO nebo —CH2OH,
Y znamená hydroxylovou nebo mykarosyloxyskupinu, jakož i z farmaceutického hlediska přijatelných solí nebo esterů těchto látek, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Streptomyces fradiae v submerzní kultuře za aerobních podmínek za předpokladu, že v pří padě, že běží o výrobu sloučeniny, v níž Y znamená hydroxylovou skupinu, provádí se kultivace v mírně kyselém prostředí, načež se získaný produkt popřípadě převede na sůl nebo ester, přijatelný z farmaceutického hlediska.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se použije kmen Streptomyces fradiae ATCC 31 669.
CS815397A 1980-07-24 1981-07-14 Method for the production of new makrolide CS228512B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8024211 1980-07-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS228512B2 true CS228512B2 (en) 1984-05-14

Family

ID=10514997

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS815397A CS228512B2 (en) 1980-07-24 1981-07-14 Method for the production of new makrolide

Country Status (23)

Country Link
EP (1) EP0045157B1 (cs)
JP (1) JPS5750998A (cs)
KR (1) KR840001193B1 (cs)
AR (1) AR227325A1 (cs)
AU (1) AU7286281A (cs)
CA (1) CA1174994A (cs)
CS (1) CS228512B2 (cs)
DD (1) DD202452A5 (cs)
DE (1) DE3163204D1 (cs)
DK (1) DK313081A (cs)
ES (1) ES503957A0 (cs)
FI (1) FI812209L (cs)
GB (1) GB2080798B (cs)
GR (1) GR74509B (cs)
HU (1) HU189519B (cs)
IE (1) IE51619B1 (cs)
IL (1) IL63312A (cs)
PH (1) PH18089A (cs)
PL (1) PL232190A1 (cs)
PT (1) PT73370B (cs)
RO (1) RO81671B (cs)
YU (1) YU173981A (cs)
ZA (1) ZA814789B (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4411892A (en) * 1982-05-03 1983-10-25 Pfizer Inc. Tylosin macrolide antibiotics from streptomyces
US4443436A (en) * 1982-09-13 1984-04-17 Eli Lilly And Company C-20-Modified macrolide derivatives of the macrolide antibiotics tylosin, desmycosin, macrocin, and lactenocin
US4820694A (en) * 1986-09-29 1989-04-11 Eli Lilly And Company Modifications of 3-O-demethylmycinose in macrocin and lactenocin

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4201843A (en) * 1975-08-01 1980-05-06 Sanraku Ocean Co., Ltd. Process for manufacturing tylosin derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
RO81671B (ro) 1983-04-30
DK313081A (da) 1982-01-25
ES8206622A1 (es) 1982-05-16
KR840001193B1 (ko) 1984-08-18
HU189519B (en) 1986-07-28
IE811581L (en) 1982-01-24
EP0045157B1 (en) 1984-04-18
EP0045157A1 (en) 1982-02-03
IL63312A0 (en) 1981-10-30
GR74509B (cs) 1984-06-29
DD202452A5 (de) 1983-09-14
PT73370B (en) 1982-08-09
GB2080798A (en) 1982-02-10
FI812209L (fi) 1982-01-25
PT73370A (en) 1981-08-01
PL232190A1 (cs) 1982-03-29
PH18089A (en) 1985-03-20
IE51619B1 (en) 1987-01-21
GB2080798B (en) 1984-07-25
RO81671A (ro) 1983-04-29
IL63312A (en) 1985-04-30
YU173981A (en) 1983-09-30
ES503957A0 (es) 1982-05-16
AR227325A1 (es) 1982-10-15
CA1174994A (en) 1984-09-25
AU7286281A (en) 1982-01-28
JPS5750998A (en) 1982-03-25
ZA814789B (en) 1983-02-23
DE3163204D1 (en) 1984-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4321361A (en) Demycinosyltylosin and process for its production
KR850001666B1 (ko) 마크로라이드 항생물질의 제조방법
CS228517B2 (en) Method for the production of macrolide
CS228512B2 (en) Method for the production of new makrolide
US4247542A (en) A-40104 Antibiotics and process for production thereof
US4385116A (en) Demethylmacrocin and process for its production
KR840001957B1 (ko) 데(마이시노실옥시)타일로신의 제조방법
US4975370A (en) Process for preparing 14-hydroxy-6-O-methyl-erythromycin A
CA1211731A (en) De(mycinosyloxy)tylosin derivatives
US4129721A (en) A-40104 antibiotics and process for production thereof
US4486584A (en) Demethylmacrocin compounds and derivatives thereof
US4419508A (en) 20-Dihydro-20-deoxy-23-demycinosyltylosin and process for its production
US4419447A (en) Fermentation process for producing demycinosyltylosin
US4656258A (en) Macrocin derivatives
US4334019A (en) Process for producing de(mycinosyloxy)tylosin
US4537957A (en) Process for the production of mycaminosyltylonolide
US4293649A (en) Process for production of antibiotic A-33853
CA1175423A (en) Method of preparing 23-deoxy-5-0- mycaminosyltylonolide
US4329472A (en) Antibiotic A-33853 and the tetraacetyl derivative thereof
CA1175422A (en) Method of preparing 5-0-mycaminosyl-tylonolide