CZ301680B6 - Zpusob produkce fytasy v kvasinkách, protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou, kvasinkový kmen a vektor obsahující appA gen a zpusob konverze fytátu na inositol a anorganický fosfor - Google Patents

Abstract

Zpusob produkce fytasy v kvasinkách, pri nemž se z bakteriálních bunek izolovaný appA gen kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou exprimuje v kvasinkovém kmeni a izoluje se exprimovaný protein nebo polypeptid. Protein nebo polypeptid pripravitelný tímto zpusobem mající fytasovou aktivitu s optimem aktivity pri teplote v rozmezí od 57 do 65 .degree.C a pri pH v rozmezí od 2,5 do 3,5 nebo od 5 do 5,5. Kvasinkový kmen a vektor obsahující tento appA gen. Zpusob konverze fytátu na inositol a anorganický fosfor, pri nemž se výše uvedeným zpusobem exprimovaný protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou kontaktuje s fytátem pro katalýzu konverze fytátu na inositol a anorganický fosfor.

Description

Způsob produkce fytasy v kvasinkách, protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou, kvasinkový kmen a vektor obsahující appA gen a způsob konverze fytátu na inositol a anorganický fosfor

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu produkce fytasy v kvasinkách, proteinu nebo polypeptid s fytasovou aktivitou, kvasinkového kmene obsahující appA gen, který kóduje tento protein nebo polypeptid, io vektoru obsahujícího tento appA gen a způsobu konverze fytátu na inositol a anorganický fosfor pomocí tohoto proteinu nebo polypeptídu,

Dosavadní stav techniky

Fytasy je specifická skupina monoester fosfatas, která je potřebná k počátečnímu uvolnění fosfátu („P“) z fytinu (myoinositolhexafosfátu). Fytin je hlavní zásobní formou P v potravinách a jídlech obsahujících obilniny (Reddy N.R. et al, „Phytates in Legumes and Cereals.“ Advances in Food Research, 28:1 (1982)), Protože živočichové s jednoduchým žaludkem jako např. prase a drůbež Či také Člověk mají v gastrointestinálním traktu jen malou fytasovou aktivitu, je téměř všechen přijatý fytinový fosfát nestráven. To vede k potřebě doplňovaní anorganického fosfátu pomocí drahých a neobnovitelných živin dodávaných do stravy těchto zvířat. Nežádoucí je též znečišťování přírodního prostředí fosfáty vyměšovaným nestráveným fytinovým fosfátem skrze hnůj výše uvedených zvířat (Cromwell G.L. et ak, „P-A Key Essential Nutrient. Yet a Possible

Major Pollutant - Its Central Role in Animal Nutrition.“ Biotechnology In the Feed índustry, Proceedings Altech 7th Annual Symposium, p. 133 (1991)). Na fytin se dále váží esenciální stopové prvky jako je zinek, čímž fytin způsobuje výživové nedostatečnosti jako jsou růstová a mentální retardace u dětí přijímajících hlavně rostlinou stravu, ze které nebyl odstraněn fytin.

Dvě fytasy - phyA a phyB z Aspergillus niger NRRL3135 byly klonovány a sekvenovány (Ehrlich K.C. et ak, „Identification and Cloning of a Second Phytase Gene {phys) from Aspergillus niger {ficuum)“ Biochem. Biophys. Res. Commun., 195: 53-57 (1993); Piddington C.S. et ak, „The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase {phy) and pH 2.5 - optimum Acid Phosphatase (qpA) from Aspergillus niger var. awamoi.“ Gene, 133: 56 - 62 (1993)). Nedávno byly izolovány nové geny fytasy z Aspergillus terreus a Mycellophthora ihermophila (Mitchell et ak, „The Phytase Subfamily of Histidine Acid Phosphatases: Isolation of Genes for Two Novel Phytases From the Fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora íhermophila“ Microbiology 143: 245 - 252 (1997)), Aspergillus jumigatus (Pasamotes et ak „Gene Cloning. Purification and Characterization of a Heat-Stable Phytase from the Fungus

Aspergillus jumigatus“Appl. Environ. Mícrobiok 63: 1696 - 1700 (1997)), Emericella nidulans a Talaromyces thermophÚus (Pasamontes et ak „Cloning of the Phytase from Emericella nidaluans and the Thermophilic Fungus Talaromyces thermophilus“ Biochim. Biophys. Acta 1353: 217 - 223 (1997) a kukuřice (Maugenest et ak „Cloning and Characterization of cDNA Encoding a Maize Seedling Phytase.“ Biochem. J. 322:511 -517 (1997)).

Různé typy fytas byly izolovány a (nebo) puntíkovány z Enterobacter sp.4 (Yoon et al. „Isolation and Identification of Phytase-Producing Bacterium. Enterobacter sp. 4 and Enzymatic Properties of Phytase Enzyme.“ Enzyme and Microbila Technology 18: 449-454 (1996)), Kiebsiella terrigena (Greiner et ak „Purification and Characterization of Phytase from KJebsiella terrigena.“ Arch. Biochem.Biophys. 341: 201-206 (1997)) a Bacullus sp, DS11 (Kim et ak „Purification and Properties of the Thermostable Phytase from Bacillus sp. DS1J“ Enzyme and Microbial Technology 22: 2-7 (1998)). Vlastnosti těchto enzymů byly studovány. Dále byla popsána krystalografická struktura phy A zAsperfillusficuum (Kostrewa et al. „Crystal Structure of Phytase from Aspergillus ficuum at 2.5 A Resolution.“ Nátuře Structure Biology 4: 185-190 (1997)).

-1 CZ 301680 B6

Hartingsveldt a spolupracovnici vnesli gen phy A do A. niger a dosáhli tak desetinásobného zvýšení phytasové aktivity oproti divokému kmeni („Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger/ Gene 127: 87-94 (1993)). Dodatečná mikrobiální fytasa z takovéhoto zdroje obsazená v potravě prasat a drůbeže se ukázala efektivní při zvyšování využití fytinového fosforu a zinku (Simons et al: „Impovement of Phosphorus Availability By Microbilab Phytase in Broilers and Pigs.“ Br. J. Nutr. 64: 525 (1990); Lei X.G, et al. „Supplementing Com-Soybean Meals Diets With Microbila Phytase Liearly Improves Phytate P Utilization by Weaning Pigs.“ J.Anim. Sci. 71: 3359 (1993); io Lei X. G. et al. „Supplementing Com-Soybean Meals Diets With Microbil a Phytase Maximízes Phytate P Utilization by Weaning Pigs.“ J.Anim. Sci. 71: 3368 (1993); Cromwell G.L. et al. „P-A Key essential Nutrient. Yet a Possible Major Pollutant and its Central Role in Animal Nutrition.“ Biotechnology In the Feed lndustry: Proceedings Alltech 7th Annual Symposium. P. 133 (1991)). Avšak náklady na dostupné komerční zdroje fytas a nestabilní aktivita enzymu během zahřívání při granulování krmivá předem brání praktickému využití v agroprůmyslu (Jongbloed A.W, et al. „Effect of Pelleting Mixed Feeds on Phytase Activity and Apparent Absorbabilíty of Phosphorus and Calcium in Pigs.“ Animal Feed Science and Technology 28: 233-242 (1990)). Kromě toho není zřejmě fytasa produkovaná A. niger tím nejbezpečnějším zdrojem pro výrobu potravin určených člověku.

Kvasinky mohou být použity k efektivní produkci enzymu, protože rostou na jednoduchém a levném médiu. S vhodnou signální sekvencí může být enzym sekretován do média a poté výhodně izolován. Některé kvasinkové expresní systémy mají další výhodu v tom, že jsou dobře přijímány v potravinovém průmyslu a jsou bezpečným a efektivním producentem potravinových výrobků.

Pichia pastoris je metylotrofní kvasinka schopná metabolizovat metanol jako výhradní zdroj uhlíku, Tento systém je dobře známý pro svou způsobilost exprese vysokých hladin heterologních proteinů. Protože je to eukaryotní systém, má Pichia mnoho výhod vyšších eukariotních expresních systémů jako jsou správné „zpracovaní“ proteinů (protein processing), sbalení a posttranskripční modifikace.

Je tedy zřejmé, že je zde potřeba vyvinout účinný a jednoduchý systém k ekonomické produkci fytasy pro aplikace v průmyslu potravin a krmiv.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob produkce fytasy v kvasinkách, při němž se z bakteriálních buněk izolovaný appA gen kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou exprimuje v kvasinkovém kmeni a izoluje se exprimovaný protein nebo polypeptid.

Předmětem vynálezu je dále také protein nebo polypeptid pripravitelný výše popsaným způsobem podle vynálezu, mající fytasovou aktivitu s optimem aktivity při teplotě v rozmezí od 57 do

65 °C a při pH v rozmezí od 2,5 do 3,5 nebo od 5 do 5,5. Pro fytasu je zvláště důležité pH optimum 2,5 až 3,5, poněvadž toto pH se vyskytuje v žaludku zvířat.

Dalším aspektem vynálezu je kvasinkový kmen obsahující appA gen izolovaný z bakteriálních buněk, přičemž tento appA gen kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou a je funkčně připojen k promotoru schopnému exprimovat fytasu v kvasince, kde uvedený protein nebo polypeptid má zvýšenou tepelnou stálost, je-li exprimován v kvasinkové hostitelské buňce ve srovnání s tímto proteinem nebo polypeptidem exprimo váným v nekvas i n kové hostitelské buňce.

Ještě dalším aspektem vynálezu je vektor obsahující appA gen izolovaný z bakteriálních buněk, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou; promotor funkčně připojený k tomuto

-2CZ 301680 B6 appA genu, přičemž tento promotor je schopen iniciovat transkripci v kvasince; a počátek replikace schopný udržet tento vektor v buňce; přičemž tento protein nebo polypeptid má zvýšenou tepelnou stálost, je-li exprimován v kvasinkové hostitelské buňce ve srovnání s tímto proteinem nebo polypeptidem exprimovaným v nekvasinkové hostitelské buňce.

Konečně je předmětem vynálezu také způsob konverze fytátu na inositol a anorganický fosfor, při němž se z bakteriálních buněk izolovaný appA gen kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou exprimuje v kvasinkové hostitelské buňce kmeni a exprimovaný protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou se kontaktuje s fytátem pro katalýzu konverze fytátu na inositol a anorganický fosfor.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Analýza rozpustného proteinu pomocí SDS-PAGE připraveného z E. coli transformované genem kódujícím fytasu a indukovaným IPTG. Buňky byly kultivovány 4 hodiny a poté sklizeny. Dráha 1: Markéry; dráha 2 a 3: transformanty pEPl (exprimovaný protein měl molekulovou hmotnost asi 55 kDa); dráha 4: transformant transformovaný pouze expresním vektorem pET25b (+).

Obrázek 2: Analýza exprímovaného proteinu (fytasy) v E. coli pomocí Western blotu. Protilátky byly připraveny proti purifíkované nativní fytase z A. niger. Každá jamka obsahovala 50 gg celkových vnitrobuněčných proteinů. Dráha 1 a 2: Rekombinantní buňky po a před indukcí. Dráha 3 a 4: kontrola (pouze expresní vektor) po a před indukcí.

Obrázek 3: Obraz analýzy mRNA PhyA z E.coli pomocí Nothem blotu. K analýze byla použita sonda PhyA o velikosti 1,4 kb. Každá jamka obsahovala 20 gg celkové RNA. Dráha 1 a 2; RNA izolovaná z kontrolních buněk (pouze s expresním vektorem) po a před indukcí.

Obrázek 4: Časová závislost indukované exprese fytasy (pEPl) v £.co//BL21(DE3). Buňky byly indukovány ve chvíli, kdy absorbance OD^ dosáhla 0,5. V každém časovém bodě byl připraven vzorek rozpustných proteinů a kvantifikován pomocí SDS-PAGE analýzy.

Obrázek 5: SDS-PAGE analýza exprimované extracelulámí fytasy ve fytasou transformované

S.lividans po 72 hodinovém růstu. Buňky byly odstřeďovány 15 minut pri 8000 x g. Supematant byl poté analyzován pomocí gelové elektroforézy. Dráha 1: Markéry; dráha 2: kontrola obsahující pouze expresní vektor; dráha 3: pozitivní kolonie exprimuj ící fytasu - molekulová hmotnost byla přibližně 57 kDa.

Obrázek 6: Analýza fytasy exprimované v 5. lividans pomocí Western blotu. Při Western blotu byly použity protilátky připravené proti purifíkované nativní fytase z A. niger. Každá jamka obsahovala 20 gg proteinů z kultivačního média (supematantu). Dráha 1: Supematant z kontrolní buněčné kultury transformované vektorem; dráha 2: Supematant z kultury inokulované positivními koloniemi.

Obrázek 7: Analýza extracelulámí fytasy exprimované S. cerevisiae pomocí SDS-PAGE. Každá z jamek obsahovala 50 gg proteinů z kultivačního média (supematantu). Dráha 1 až 3: Supernatant z kultury inokulované pozitivní kolonií a sklizené 5, 10 a 25 hodin po indukci. Dráha 4 až 6: Supematant z kontrolní kultury transformované vektorem a sklizené 5, 10 a 25 hodin po indukci. Dráha 7: Markéry (kDa). Molekulová hmotnost exprimované fytasy byla přibližně 110 kDa (potvrzeno pomocí Western blotu).

Obrázek 8: Časová závislost extracelulámí fytasové aktivity exprimované & cerevisiae transformované konstruktem pYPPl po indukci galaktosou. Aktivita byla analyzována v supematantu z nasbíraného média.

-3CZ 301680 B6

Obrázek 9: Analýza extracelulámí fytasy exprimované 5. cerevisiae pomocí Western blotu a po deglykosilaci (Endo H). Při analýze byly použity protilátky připravené proti nativní purifikované fytase z A.niger. Dráha 1: Barevné SDS-PAGE standardy (kDa) od firmy Bio-Rad. Dráha 2 a 3:

fytasa - degly kosi lovaný protein - 10 a 20 pg. Dráha 4: glykosilovaná fytasa (20 pg proteinu).

Obrázek 10: Nothem blot celkové RNA izolované z transformovaných buněk 5. cerevisiae. Dráha 1: Kontrola (pouze s expresním vektorem pYES2). Dráha 2 a 3: Transformanty pYPPl.

io Obrázek 11: Časová závislost extracelulámí phyA fytasové aktivity produkované transformanty Pichiapastoris Muť (KM71) a MUT+ (X33) po indukci.

Obrázek 12: Analýza fytasy overexprimované v Pichia pomocí SDS-PAGE. K transformaci byl použit konstrukt pPICZaA-PhyA ve vektoru KM71 (MUT^s).Dráha 1: proteinový žebříček.

Dráha 2: 40 pl supematantu AK1 (kolonie vykazovaly aktivitu extracelulámí fytasy 21 700 mU/ml). Kolonie byly sbírány 108 hodin po indukci. Dráha 3: 40 pl supematantu kontrolního kmene overexprimujícího lidský serumalbumin (HAS. 6.7 kDa) na hladině lg/1. Dráha 4: 40 pl supematantu kontroly KM71.

Obrázek 13: Vliv deglykosilace (s použitím Endo H) na termostabilitu exprimované fytasy v Pichia. Enzym byl zahříván 15 minut při 37 ⁰ nebo 80 °C, při pH 5,5 v 0,2 M citrátovém pufru.

Obrázek 14: Nothem analýza exprimované phyA mRNA tranformovaným kmenem Pichia pastoris (KM71 a X33). Pro bloting byla použita sonda phyA o velikosti 1,3 kb. Dráha 1 a 2:

transformant KM71 před a po indukci. Dráha 3 a 4: transformant X33 po a před indukcí.

Obrázek 15: pH optimum extracelulámí fytasy exprimované Pichia (X33). Pro pH 1,5, 2,5, 3,5, byl použit pufr 0,2 M glycin-HCl. Pro pH 4,5, 5,5,6,5 byl použit 0,2 M citrát sodný a pro pH 7,5 a 8,5 byl použit pufr 0,2 M Tris-HCI.

Obrázek 16: Teplotní optimum extracelulámí fytasy exprimované Pichia (X33). Stanovení bylo provedeno v 0,2 M citátovém pufru při pH 5,5.

Obrázek 17: Uvolnění volného fosforu ze sóji fytasou exprimovanou v Pichia (X33). Pět gramů sóji bylo rozptýleno v 25 ml 0,2 M citrátu, pH 5,5 s různým množstvím enzymu. Směs byla inkubována čtyři hodiny při 37 °C, Poté bylo stanoveno množství uvolněného volného fosfátu.

Obrázek 18: Časová závislost exprese aktivity extracelulámí fytasy pěti transformantů Pichia pastoris obsahujících gen appA.

Obrázek 19: Závislost exprese aktivity fytasy Pichia pastoris na pH média.

Obrázek 20: Analýza fytasy z E.coli overexprimované v Pichia pastoris pomocí SDS-PAGE elektroforézy. Dráha 1: Proteinový žebříček. Dráha 2 až 4: Supematant sebraný z kultur pozitiv45 nich kolonií 23, 22, 11 ve 118 hodině po indukci.

Obrázek 21: pH optimum fytasy z E. coli overexprimované v Pichia pastoris.

Obrázek 22: Teplotní optimum fytasy z E. coli overexprimované v Pichia pastoris.

Obrázek 23: Množství volného fosfátu uvolněného ze sójové moučky fytasou z E. coli overexprimovanou v Pichia pastoris po čtyřech hodinách působení.

-4CZ 301680 B6

Detailní popis vynálezu

Předkládaný vynález zajišťuje metodu produkce fytasy v kvasinkách. Podle této metody je heterologní gen kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou exprimován v kvasinkách.

Enzym, který katalyzuje konverzi fytinu na inositol a anorganický fosfát je obecně známý jako fytasa. Mezi mikroorganismy produkující fytasu patří bakterie jako např. Bacfflus subtilis (Paver et al., J. Bacteriol. 151, 1102 (1982), který je zde zahrnut odkazem) a Pseudomona Cosgrove, Austral. J.Biol. Sci. 23: 1207 (1970), který je zde zahrnut odkazem), dále kvasinky jako např. ío Sacharomyces cerevisiae (Nayini et al., Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17:

(1984), který je zde zahrnut odkazem) a houby jako např. Aspergillus terreus (Yamada et al.,

Agric Biol. Chem. 32: 1275 (1986), který je zde zahrnut odkazem) a Aspergillus ficuum (van Gorcom et al, European Patent Application 89/202.436, který je zde zahrnut odkazem).

Fytasy jsou také endogenně přítomny v mnoha rostlinných druzích. Loewus (Plant Biology vol.9:

Inositol Metabolism in Plants (eds. DJ. Morre, W.F.Boss, F.A. Loewus), 13 (1990)) a Gellatly se spolupracovníky (Plant Physiology (supplement) 93: 562 (1990), které jsou zde zahrnuty odkazem) popisují izolaci a charakterizaci klonu cDNA fytasy získaného z bramborových hlíz. Gibson a spolupracovníci (J. Cell Biochem., 12C: L407 (1988)) a Christen se spolupracovníky (J. Cell Biochem., 12C: L402 (1988), které jsou zde zahrnuty odkazem) popsali syntézu endogenní fytasy během klíčení semen sóji.

Je upřednostňováno, pokud je protein nebo polypeptid s ťytasovou aktivitou sekretován do kultivačního média. To poté umožňuje vyšší expresi a snadnější izolaci produktu. Protein nebo poly25 peptid s fytasovou aktivitou je spojen se signálním sekvenci zajišťující směrováním proteinu ven z buňky. Je dále upřednostňováno, pokud je signální sekvence vyštěpena z proteinu.

V upřednostňovaném provedení je heterologní gen, kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou svázán v jediném rámci s transkripčním zesilujícím elementem.

Upřednostňované heterologní geny kódující protein s fytasovou aktivitou jsou izolovány z bakteriálních buněk. Jedním z výhodnějších genů je gen PhyA z Aspergillus niger. Gen kódující fytasu -phyA z Aspergillus niger NRRL3135 byl klonován a sekvenován (Piddington, C. S. et al., The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy} and pH 2.5-optimum Acid

Phosphatase (aph) z Aspergillus niger var. Awamori, Gene, 133: 56-62 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Hartingsveldt se spolupracovníky vnesl gen phyA do A. niger. Výsledkem bylo desetinásobné zvýšení fytasové aktivity v porovnání s divokým kmenem (Hartingsveldt etal., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger, Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem).

Dalším vhodným heterologním genem je gen appA z E.coli. Gen, původně nazývaný jako gen kódující periplasmickou fosfoanhydridfosforylasu z E. coli (appA) obsahuje 1298 nukleotidů (GeneBank accsession number; M58708). Na počátku bylo zjištěno, že tento gen kóduje v E.coli kyselou fosfatasu s pH optimem 2,5 (EcAP). Kyselá fosfatasa je monomer s molekulovou hmot45 nosti 44644 daltonů. Zralý EcAP obsahuje 410 aminokyselin (Dassa, J. et al., The Coplete Nucleotide Sequence of the Escherichia Coli Gene AppA reveals Significant Homology Between Ph 2.5 Acid Phosphatase and Glucose-l-Phosphatase, J. Bacteriology. 172: 5497-5500 (1990), který je zde zahrnut odkazem). Ostanin se spolupracovníky overexprimoval appA v E. coli BL21 s použitím vektoru pT7 a aktivita kyselé fosfatasy se zvýšila přibližně 400 krát (440mU/mg protein) (Ostanin, K. et al., Overexpression, Site-Directed Mutagenesis and Mechanism of Escherichia Coli Acid Phosphatase, J, Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992), který je zde zahrnut odkazem). Nebylo známo, že produkt genu appA má fytasovou aktivitu.

Geny appA nebo phyA mohou být exprimovaný v jakémkoliv prokaryotickém nebo eukaryo55 tickém expresním systému. Může být použito mnoho různých hostitelských systémů a mnoho

-5CZ 301680 B6 různých vektorů k expresi sekvence či sekvenci kódujících tento protein. S výhodou bude vektor obsahovat virový vektor, plasmid, kosmíd nebo oligonikleotid. V první řadě musí být vektor kompatibilní s použitou hostující buňkou. Systém host vektor zahrnuje přinejmenším následující:

bakterie transformované bakteriofagovou DNA, plasmidovou DNA nebo kosmidovou DNA;

mikroorganismy jako např. kvasinky obsahující kvasinkové vektory; savci buněčné systémy infikované vity (např. vakcinovým virem, adenoviiy atd.); hmyzí buněčný systém infikovaný viry (např. bakulovirem) a rostlinné buňky infikované bakteriemi. Expresní elementy těchto vektorů se liší ve své síle a specifitě. V závislosti na použitém systému vektoru a hostitelského organizmu je možné použít jakýkoliv z mnoha translačních prvků.

Výhodným hostitelským organizmem k expresi appA nebo phyA jsou houby včetně kvasinek a filamentámích hub. Tyto mohou být využity jako hostitelské buňky v souvislosti s předkládaným vynálezem. Upřednostňované hostitelské buňky zahrnují rozličné kmeny Saccharomyces cerevisiae. Též mohou být použity další kvasinky jako např. Kluyveromyces, Torulaspora a

Schizosaccharomyces. Ve výhodném uspořádání jsou pro overexpresi proteinu použity buňky Saccharomyses cerevisiae. Mezi filamentámímí houbami jsou nejvhodnějšími hostitelskými buňkami buňky Aspergillus a Neurospora. Z kmenů Aspergillus je nejvhodnější kmenem Aspergillus ttiger.

V jiném výhodném uspořádání předkládaného vynálezu jsou kvasinkové kmeny methylotrofní. Methylotrofní kvasinky jsou tím druhem kvasinek, které jsou schopny používat methanol jako zdroj uhlíku k produkci potřebných zdrojů energie. Takovýto zdroj energie musí vystačit na udržení buněčných funkcí. Dále musí tyto kvasinky obsahovat gen pro expresi alkoholoxidasy. Typické methylotrofní kvasinky zahrnují členy druhů Pichia, Hansemtla, Torulopsis, Candida aKarwinskia. Tyto druhy kvasinek mohou používat methanol jako výhradní zdroj uhlíku. Nej výhodnějším methylotrofním kvasinkovým kmenem je Pichia pastoris.

Předkládaný vynález zahrnuje také protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou. PhyA je exprimován v Pichia a výsledný protein má mnohem vyšší extracelulámí aktivitu (okolo 65 mU/ml).

Výtěžek aktivity fytasy byl přibližně 30 krát vyšší než výtěžek aktivity z buněk Saccharomyces cerevisiae transformovaných genem phyA, jedenadvacetkrát vyšší než z divokého kmene Aspergillus niger a 65 000 krát vyšší než z netransformovaných buněk Pichia. pH optimum exprimované fytasy bylo 2,5 a 5,5 a teplotní optimum bylo 60 °C. Podobně gen appA exprimovaný v Pichia a Saccharomyces cerevisiae vedl k proteinu majícímu mnohem vyšší extracelulámí aktivitu a pH optimum (od 2,5 do 3,5), které je více požadováno.

V preferovaném uspořádání vynálezu je protein nebo polypeptid mající fytasovou aktivitu, přičemž teplotní optimum jev rozmezí 57 °C až 65 °C. Ještě výhodnější uspořádání zahrnuje protein nebo polypeptid mající fytasovou aktivitu, přičemž teplotní optimum je v rozmezí 58 °C až 62 °C.

V ještě dalším vhodném uspořádání je protein nebo polypeptid mající takovou fytasovou aktivitu, že po zahřívání proteinu po dobu 15 minut a teplotě 80 °C zůstává tato fytasová aktivita alespoň na úrovni 40 % původní aktivity. Ještě výhodnější uspořádání zahrnuje protein nebo polypeptid mající takovou fytasovou aktivitu, že po zahřívání proteinu po dobu 15 minut a teplotě 60 °C zůstává tato fytasová aktivita alespoň na úrovni 60 % původní aktivity.

Purifikovaný protein může být získán několika metodami. Protein nebo polypeptid předkládaného vynálezu je přednostně produkován v purifikované formě (přednostně o čistotě přinejmen50 ším 80%, lépe o čistotě přinejmenším 90%) konvenčními technikami. Běžně je protein nebo polypeptid předkládaného vynálezu sekretován do růstového média rekombinantních hostitelských buněk. Nebo je protein nebo polypeptid předkládaného vynálezu produkován, ale není sekretován do růstového média. V těchto případech je třeba k izolaci proteinu nejdříve namnožit hostitelské buňky nesoucí rekombinantní plasmid. Poté jsou tyto buňky lisovány sonikací, teplem nebo chemickým ošetřením a homogenát je zcentrifugován tak, aby byly odstraněny zbytky

-6CZ 301680 B6 buněk. Supematant je poté podroben sekvenčnímu srážení síranem amonným. K separaci proteinu je dále frakce obsahující protein nebo polypeptid předkládaného vynálezu podrobena gelové filtraci přes kolonu naplněnou vhodně velkým dextranem nebo polyakrylamidem. V případě potřeby je možné frakci s požadovaným proteinem dále purifíkovat pomoci HPLC.

Předkládaný vynález dále zahrnuje kvasinkové kmeny mající heterologní gen kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou. Heterologní gen by měl být funkčně spojený s promotorem schopným zajistit expresi fytasy v kvasinkách.

io Dalším aspektem vynálezu je vektor k expresi fytasy v kvasinkách. Takový vektor nese gen z jiného než hostitelského organizmu, kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou. Gen kódující fytasu může být klonován do jakéhokoliv vektoru, který se autonomně replikuje neboje integrován do genomu kvasinky. Počet kopii autonomně se replikujícího plasmidu např. plasmidu YEp může být vysoký, ale mitotická stabilita kvasinek může být nedostatečná (Bitter et is al., Expression and Secretion Vectors for Yeas, Meth. Enzymol. 153: 516 -44 (1987), který je zde zahrnut odkazem). Mohou obsahovat plasmidovou sekvenci 2-mu zodpovědnou za autonomní replikaci a sekvenci £. coli zodpovědnou za replikaci v E.coli. Je vhodné, aby v E. coli vektor obsahoval genetický markér pro selekci kvasinkových transformantů a gen kódující rezistenci na antibiotika vhodnou k selekci. Epizomové vektory obsahující sekvence ARS a CEN se vyskytuji pouze v jedné kopii na buňku a jsou stabilnější než vektory YEp. V případě, že jsou fragmenty DNA integrovány v jedné či více kopiích do genomu kvasinky se používají integrující se vektory. V tomto případě je rekombinantní DNA stabilní a není třeba selekce (Struhl et al., High-Frequency Transformation of Yeast: Autonomous Replication of Hybrid DNA Molecules, Proč. Nati. Acad. Sci USA 76: 1035 - 39 (1979); Powel et al., Cloning Vectors, I—IV et seq.,

Elsevier (1985); Sakai et al., Enhanced Secretin of Human Nerve Growth Factor from Saccharomyces Cerevisiae Using an Advanced 5-íntegration Systém, Biotechnology 9: 1382 - 85 (1991), které jsou zde zahrnuty odkazy). Některé vektory mají počátek replikace, který je funkční ve vybraných hostitelských buňkách. Přiměřený počátek replikace zahrnuje 2μ, ARS1 a 25 μΜ. Vektory nesou místa pro restrikční endonukleasy pro inzerci fúzních genů, promotoro30 vých sekvencí a selekčních markérů. Vektory mohou být modifikovány vyjmutím či přidáním restrikčních míst nebo vyjmutím jiných nechtěných nukleotidů.

Gen pro fytasu může být umístěn pod kontrolu jakéhokoliv promotoru (Stetler et al., Secretion of Active, Full- and Half-lenght Human Secretory Leukocyte Protease Inhibitor by Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology 7: 55 - 60 (1989), který je zde zahrnut odkazem). Lze si vybrat konstitutivní nebo regulovaný promotor. Vhodné promotory pro kvasinkové vektory jsou mezi jinými promotor pro metalothionein, 3-fosfoglyceratkinasu (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980, který je zde zahrnut odkazem) nebo další glykolytické enzymy (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland et al., Biochem 17: 4900 (1978), které jsou zde zahrnuty odkazem) jako např. enolasu, glyceraIdehyd-3-fosfatdehydrogenasu, hexokinasu, pyruvatdekarboxylasu, fosfofruktokinasu, glukosa-6-fosfatisomerasu, 3-fosfoglyceratmutasu, pyruvátkinasu, triosofosfatisomerasu, fosfoglukosaisomerasu a glukokinasu. Další vhodné vektory a promotory pro použití při expresi v kvasinkách jsou dále popsány v EP A-73,657 (Hitzeman), který je zde zahrnut odkazem. Jinou alternativou je použití promotoru ADH2 reprimovaného glukosou, který byl popsán Russellem a spolupracovníky (J. Biol. Chem. 258: 2674 (1982)) a dále Beierem a spolupracovníky (Nátuře, 300: 724 (1982), které jsou zde zahrnuty odkazem).

Je možné vybrat regulovaný nebo konstitutivní kvasinkový promotor. Silné promotory genů jako např. fosfoglyceratkinasy (PKG), dalších genů kódujících glykolytické enzymy a genu pro alfa-faktor jsou konstitutivní. V případě, že je použit konstitutivní promotor, je produkt syntetizován během buněčného růstu. Promotor ADH2 je regulovaný etanolem a glukózou, promotory GAL-1-10 a GAL7 jsou regulovány galaktosou a glukosou, promotor PHO5 fosfátem, promotor metalothioninu mědí. Promotory proteinů tepelného šoku, mezi které patří i promotor HSP150 jsou regulovány teplotou. Mohou být použity také hybridní promotory. Regulované promotory jsou používány tam, kde je kontinuální exprese požadovaného produktu zhoubná pro hostitelské

-7CZ 301680 B6 buňky. Místo kvasinkových promotorů je možné použít silné prokaryotické promotory jako je promotor T7. V tomto případě však musí být kvasinkový kmen transformován genem kódujícím odpovídající polymerasy. Pro ukončení transkripce jsou používány terminátory HSP150 nebo jakýkoliv funkční terminátor. Zde jsou promotory a terminátory nazývány kontrolními elementy (či prvky). Předkládaný vynález není omezen na jakýkoliv specifický vektor, promotor či terminátor.

Vektor též může obsahovat selekční markér. Selekční markéry jsou většinou geny kódující rezistenci na antibiotika nebo geny schopné komplentovat (doplnit) kvasinkové kmeny mající dobře io popsanou metabolickou poruchu, jako jsou např. tryptofan nebo histidin defícientní mutanty.

Mezi vhodné selekční markéry patří URA3, LEU2, HIS3, TRPÍ, HIS4, ARG4 nebo geny rezistence na antibiotika.

Vektor může mít také počátek replikace schopný replikace v bakteriální buňce. Manipulace 15 s vektory je efektivnější v bakteriálních kmenech. Vhodným bakteriálním počátkem replikace jsou ColEl, Ori nebo oriT.

Zaváděcí sekvence z kvasinky nebo z genu pro fytasu či jiného zdroje může být použita k podpoře sekrece exprimované fytasy do média. Předkládaný vynález není omezen na žádný specific20 ký typ zaváděcí sekvence nebo signálního peptidu.

Mezi vhodné kvasinkové zaváděcí sekvence patří zaváděcí sekvence alfa faktoru, která může být použita k přímé sekreci fytasy. Zaváděcí sekvence alfa faktoru je často umístěna mezi sekvenci promotoru a sekvenci strukturního genu (Kurjan et al., Cell 30: 933 (1982); Bitter et al., Proč

Nati. Acad. Sci USA 81: 5330 (1984); U.S. Patent No. 4 546 082; European published patent application No. 324.274, které jsou zde zahrnuty odkazem). Další vhodnou zaváděcí sekvencí je S. cerevisiae MF alpha 1. Alfa-faktor je syntetizován jako (pře) struktura 165 aminokyselin obsahujících signální 19 aminokyselinový prepeptid následující „zaváděcím“ („leader“) - peptidem o 64 aminokyselinách. Ten obsahuje tři N-glykosilační místa následovaná (LysArg30 (Asp/Glu, Ala)2-3 alpha-factor) 4 (Kurjan et al., Cell 30: 933 - 43 (1982), který je zde zahrnut odkazem). Signální (zaváděcí) část preproMF alpha 1 je široce využívána k dosažení syntézy a sekrece heterologních proteinů v 5. cerevisiae. Použití signálních (zaváděcích) peptidu homologních ke kvasinkám je známé z U.S.Patent 4 546 082, evropské patentové přihlášky (European Patent Application) 116 201; 123 294; 123 544; 163 529 a 123 289 a DK Patent Application No.

3614/83, který je zde zahrnut odkazem. V evropské patentové přihlášce (European Patent

Application No.) 123 289, která je zde zahrnuta odkazem, je popsáno použití prekurzoru α-faktoru ze S. cerevisiae. Použití signálního peptidu invertasy ze Saccharomyces cerevisiae je popsáno v WO 84/01153, který je zde zahrnut odkazem. Ukázka použití signálního peptidu PHO5 ze Saccharomyces cerevisiae k sekreci cizích proteinů je v německé patentové přihlášce (German Patent Application) DK 3614/83, kteráje zde zahrnuta odkazem.

Signální (zaváděcí) sekvence alfa-faktoru ze Saccharomyces cerevisiae (MF alpha 1 nebo MF alpha 2) může být též použita k sekrečnímu procesu exprimovaných heterologních proteinů v kvasinkách (americký patent (U.S. Patent 4 546 082, evropské patentové přihlášky (European

Patent Application No.) 16 201; 123 294; 123 544 a 163 529, které jsou zde zahrnuty odkazem). Použití fúzního proteinu sekvence DNA kódující signální (zaváděcí) sekvenci S. cerevisiae MF alpha 1 a 5 konce genu požadovaného sekretovaného proteinu bylo ukázáno. Dále bylo předvedeno další zpracování takto dosaženého proteinu. Použití myšího signálního peptidu ze slinné amylasy (nebo mutanty tohoto) k dosažení sekrece heterologních proteinů exprimovaných v kvasinkách bylo popsáno v publikovaných PCT aplikacích (Published PCT Application Nos.) WO 89/02463 a WO 90/10075, které jsou zde zahrnuty odkazem.

Americký patent (U.S. Patent No.) 5 726 038 popisuje použití signálního peptidu z kvasinkové aspartátkinasy 3, který je schopen zajistit zvýšenou sekreci proteinů exprimovaných v kvasin55 kách. Další zaváděcí sekvence vhodné k usnadnění sekrece rekombinantních polypeptidů z

-8CZ 3016SU B6 hostitelských kvasinek jsou známé znalým oboru. Zaváděcí sekvence může být modifikována blízko 3' konce zavedením jedné ěi více restrikčních míst. To usnadní fůzi zaváděcí sekvence se strukturním genem.

Protokoly pro transformaci kvasinek jsou známé znalým oboru. Jeden z nich je popsán Hinnenem a spolupracovníky (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978), který je zde zahrnut odkazem. V protokolu Hinnema a spolupracovníků jsou selektovány Trp transformanty v selekčním médiu, které obsahuje 0,67% základního kvasinkového dusíkového roztoku, 0,5% kyseliny kasaminové, 2% glukosu, lOpg/ml adeninů a 20pg/ml uracilu.

Gen může být udržován na stabilním expresním vektoru, umělém chromozomu nebo integraci do chromozomu hostitelské kvasinky. Integrace do chromozomu může být dosažena klonováním genu fytasy do vektoru, který rekombinuje do kvasinkového chromozomu. Vhodné vektory mohou obsahovat nukleotidové sekvence, které jsou homologní k nukleotidovým sekvencím v kvasinkovém chromozomu. Nebo může být gen kódující fytasu umístěn mezi rekombinantní místa, jako jsou transpozomy, které mohou vnést gen do chromozomu.

Předkládaný vynález dále zahrnuje metodu produkce fytasy zajištěním izolovaného genu appA, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou a expresi tohoto genu v hostitelské buňce. Gen appA je přednostně izolován z Escherichia coli. Vhodné hostitelské buňky zahrnují kvasinky a filamentámí houby. Vhodná filamentámí houba je Aspergillus niger a vhodné kvasinky jsou Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces, a zvláště pak kvasinkový kmen Saccharomyces cerevisiae.

Předkládaný vynález dále zahrnuje metodu konverze fytinu na inositol a anorganický fosfát. Gen appA je izolován z organismu s použitím technik známých znalým oboru. Protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou je poté exprimován v hostitelské buňce podle tohoto genu. Výsledný protein nebo polypeptid je poté dán dohromady s fytinem. Tato technika je zvláště užitečná k ošetření fytinu v potravinách nebo krmivech.

Vhodný gen appA je izolován z Escherichia coli.

Fytasa produkovaná v kvasinkovém systému uvolňuje fytinový fosfor z kukuřice a sóji stejně efektivně jako dnes komerčně dostupné fytasy. Oproti nim je však termostabilnější. Tento systém overexprese v kvasinkách produkující fytasu může být použit k produkci termostabilní fytasy, kterou lze použít v potravinářském průmyslu a průmyslu krmiv.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Materiál a metody pro overexpresi phyA v E.coli, S.lividans a v systému s použitím

Saccharomyces.

Gen kódující fytasu, hostitelské kmeny a expresní plasmidy. Gen kódující fytasu byl laskavě darován Dr. E.J: Mulaneyem z USDA. Gen (GenBank Accession number M94550) byl obsažen v plasmidu pMD4.21 v lóneni HB101 E.coli. Fragment SpAI o velikosti 2,7 kb z DNA A. niger obsahoval kódující oblast deglykosilované fytasy a její 5' a 3' „flakony“ sekvence. Plasmid obsahující signální peptidovou sekvenci - Spxy - genu pro xylanasu z Aureobasidum pullulans (GenBAnk Accession number U10298) byl laskavě darován Dr. X.L.Li z University of Georgia. Kmen DH5 E.coli byl použit jako počáteční hostitel pro všechny rekombinantní plasmidy, K účelům exprese phyA v E.coli byly použity expresní vektor pET25b (+) (Novagen, Madison,

WI) a expresní hostitel BL21(DE3) pLysS. Pro expresi phyA v S. lividans TK24 byl použit

-9CZ 301680 B6 plasmid pSESl (Jung. E.D. et al., DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonospora fusca, Appi. Envíron. Microbiol. 59: 3032 - 43 (1993), který je zde zahrnut odkazem) ke konstrukci přenosového (shuttle) plasmidů (od Dr. D.B.

WÍIsona z Comell University a on jej obdržel od Dr. D.A.Hopwooda z John Innes Institute,

Norwích, England). K expresi phyA v kvasinkách byl použit expresní vektor pYES2 a hostitelský kmen 5. cerevisiae INVScl (Invitrogen, San Diego, CA, USA).

Konstrukce plasmidových kazet a transformace. Všechny konstruované plasmidy a korespondující hostitelé jsou vyjmenovány v tabulce 1. 1,4 kb fragment PCR genu phyA byl amplifikován io z pMD4, 21 za použití dvou primerů: proti směru 5'-CGG AAT TCG TCA CCT CCG GAC T

- 3' (SEQ ID No.l) a po směru 5-CCC AAG CTT CTA AGC AAA ACA CTC - 3' (SEQ ID

No.2). Výsledný fragment obsahoval sekvenci kódující deglykosilovanou fytasu z A.niger, PhyA a restrikční místa EcoRl and HindlII po směru í proti směru. Po přečištění s pomocí kitu Geneclean II (Biol01, Inc., La Jolla, CA, USA) byl fragment vnesen do pET25b (+) a výsledný konstrukt pEPl (6893 bp) byl transformován do BL21(DE3) pLysS, po počátečním ověření, v buňkách DH5a. Exprese byla pod kontrolou promotoru T7 po kterém následovala zaváděcí sekvence (pel B) kódující 21 aminokyselin a phyA. Hostitelské buňky transformované pouze vektorem pET25 (+) byly použity jako kontrola.

Tabulka L

Expresní vektory, konstrukty ajejich hostitelské kmeny použité v této studii

Plasmid	Hostitel	Popis1	Literatura2
pET25b(+}	E. COlí DH5a a BL21 (DE3JpLysS	Expresní vektor	Novagen
pEPl	E. coli BL21 (DE3)pLysS	pET25boi(+) + gen phyA	Tato publikace
PSES2	E. coli DH5a a S.lividans TK24	Expresní vektor	Jung et al. 2r 1993
PSPP1	E, coli DH5cc a S. cerevisiae INVScl	pSES2+Spe2+phyA	Tato publikace
PYES2	E. coli a 5, cerevisiae INVScl	Expresní vektor	Invitrogen
PYEP1	E. coli DH5a á 5. cerevisiae INVScl	pYES2+Spe2+phyA	Tato publikace
PYXP1	E. coli ΰΗ5α a S. cerevisiae INVScl	pYES2+Spxy+pbyA	Tato publikace
PYPP1	E. coli DH5ot a S. cerevisiae INVScl	pYES 2+Spby+phyA	Tato publikace

1 Spe2 je signálním peptidem pro endonukleazu E2 z T. fusca (Wilson, D.B. Biochemistiy and

Genetics of Actinomycete Cellulases, Crit. Rev, Biotechnol, 12: 45-63 (1992), který je zde zahrnut odkazem; Spxy je signální peptid pro xylanasu z A. pullulans (Li and Ljungdahl, Cloning, Sequencing and Regulation of a Xylanase Gene from the Fungus Aureobasidium pullulans Y—2331—1, Appl. Envíron. Microbil., 60: 3160 - 66 (1994); Li and Ljungdahl,

Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae, Appl. Envíron. MícrobioL, 62: 209-13 (1996), které jsou zde zahrnuty odkazem; Sphy

-10CZ 301680 B6 je signální peptid pro phyA z A. niger (Hartingsveldt et al., „Cloning, Characterizatíon and

Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger/ Gene 127: 87-94 (1993), kteiý je zde zahrnut odkazem).

2 Jung. E.D. et al., DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonospora fusca, Appl. Environ. Microbiol. 59:3032 - 43 (1993), který je zde zahrnut odkazem.

Konstrukce plasmidu pro expresi phyA v S. lividans začala PCR syntézou fragmentu obsahujícího io pLT promotor a signální peptid Spe2 (Lao, G. et al., „DNA Sequences of Three Beta-l,4-endoglucanase genes From Thermomonospora fusca“ J. Bacteriol, 173: 3397 - 407 (1991), který je zde zahrnut odkazem).

Primery (primer proti směru: 5'-CAG CTA TGA CCA TGA TTA CGC C-3' (SEQ ÍD NO.3), primer po směru: 5'-€CT AGA ACG GGA ATT CAT TGG CCG CC-3' (SEQ ID NO.4)) obsahovaly restrikční místa Pstl a EcoRl. Fragment byl amplifikován z pBW2 (Jung. E.D. et al., DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonospora fusca, Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032 - 43 (1993), který je zde zahrnut odkazem) a poté štěpen pomocí Pstl a EcoRl. Konstrukt pEPl a plasmid pBluescript SK⁺ (Strategene, La Jolla, CA, USA) byl oproti tomu štěpen v jednom případě EcoRl a HindlII a v druhém případě Pstl a HindlII. Tři rozštěpené fragmenty byly poté purifikovány s použitím kitu Geneclean II a ligovány do jednoho rekombinantního konstruktu, který obsahoval požadovaná restrikční místa Pstl a Kpnl (z pBluescript SK⁺), promotor pLTl, zaváděcí sekvenci endonukleasy E2 Spe2 (551 bp, Lao, G. et al., „DNA Sequences of Three Beta-1,4-endo25 glucanase genes From Thermomonospora fusca“ J. Bacteriol, 173: 3397 - 407 (1991), který je zde zahrnut odkazem) a gen phyA (1365 bp). Po rozštěpení konstruktu pomocí Pstl a Kpnl byl výsledný fragment vnesen do expresního vektoru pSESl a vzniklý přenosový plasmid (pSPPl, 9131 bp) byl transformován do hostitelských protoplastu S. lividans podle Hopwooda a spolupracovníků (Hopwood, D.A., et al„ Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory

Manual, The John Innes Foundation, Norwich, England (1985), který je zde zahrnut odkazem). Stejně byla připravena kontrola transformací S. lividans expresním vektorem pSES2.

Byly připraveny tři různé přenosové plasmidy se třemi signálními peptidovými sekvencemi za účelem exprese phyA v kvasinkovém systému (viz tabulka 2). První plasmid vycházel z frag35 mentu pSPpl štěpeného HindlII a obsahoval promotor pLT, zaváděcí sekvenci Spe2 a sekvenci kódující oblasti phyA. Fragment byl ligován do místa HindlII pYAS2 ošetřeného telecí střevní alkalickou fosfatasou. Po ověření správné orientace byl výsledný plasmid nazván pYEPl (7783 bp). Druhý plasmid obsahoval zaváděcí peptidovou sekvenci Spxy pro gen kódující xylanasu v A. pullulans (Li, X.L. et al., „Cloning, Sequencing and Regulation of a Xylanase Gene from the

Fungus Aureobasidium pullulans Y-2331-1“, Appl. Environ. Microbil., 60: 3160- 66 (1994); Li, X.L. et al., „Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae“, Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996), které jsou zde zahrnuty odkazem) a gen phyA. Spxy byl spojen s phyA pomocí překrývajících se prodloužených konců (Horton, R.M., „In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA: SOEing Together

Tailor-Made Genes“, PCR Protocols: Current Methods and Applications, 251-61 (1993), který je zde zahrnut odkazem) ve dvou následných PCR reakcích. První byla aplifikace sekvence Spxyz pCE4 (Li, X. L. et al., „Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae“, Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996), které jsou zde zahrnuty odkazem) s použitím protisměrného primerů (5'-CGC GGA CTG CTA GCG so CAC GTT CGA T-3', primer 2) (SEQ ID No.6). Další PCR reakcí byla amplifikace kódující oblasti phyA z pEPl s použitím přesahujícího protisměrného primerů (5-ATC GAA CGT GCG CTA GCA GTC CCC G-3', primer 3) (SEQ ID No. 7) a primerů po směru ((5'-GCT CTA GAC TAA GCA AAA CAC TCC-3', primer 4) (SEQ ID No. 8) srestrikčním místem Xbal. Cílem druhého PCR kroku bylo spojení dvou fragmentů vytvořených ve výše uvedených dvou PCR reakcích. K tomu byly využity, jako templátů, dva purifíkované fragmenty a primery 1 a 4.

- ll CZ 301680 B6

Výsledný fragment obsahoval restrikční místa HindlII a Xbal a poté byl klonován do pSES2.

Takto vzniklý plasmid byl pojmenován pYXPl (7219 bp). Třetí plasmid obsahoval signální peptidovou sekvenci Sphy genu phyA a kódující oblast phyA s tím, že byl vyjmut intron mezi nimi (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding

Gene (phyA) of Aspergillus niger, Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Dva primery - 70bp protisměrný primer obsahoval signální peptid s restrikčním místem KpnI a primer po směru, který byl stejný s primerem použitým při konstrukci pYXP (primer4) - byly použity kamplifikaci požadovaného fragmentu zpEPl. Produkt PCR reakce byl štěpen KpnI a Xbal a klonován do pSES2. Výsledný plasmid byl nazván pYPPl (7176 bp). Všechny výše uvedené io konstrukty byly transformovány do 5. cerevisiae metodou podle Ita a spolupracovníků (Ito et al., „Transformation of Intact Yeast Cells Trated with Alkali Cations“ J. Bacteriol, 153: 163 - 68 (1983), který je zde zahrnut odkazem).

i s Tabulka 2

Signální peptidy použité k expresi phyA v S. cerevisiae

Konstrukt a jeho velikost (bp)	Peptid	Gen	Organismus	Aktivita fytasy1 (mPU/ml)
pYEPl 7783	Spe (93 bp)	Cellulasa E2	T. fusca	0,80
pYXPl 7219	Spxy (102 bp)	Xylanasa A	A. puilulans	Nedetekována
pYPPl 7176	Sphy (57 bp)	PhyA Fytasa	A. niger	146
pSESl2 7224			S. cerevisiae	Nedetekována

Aktivita íytasy byla detekována v supematantu buněčné kultury Sabouraud-rafinosového média 15 hodin po indukci (indukováno bylo přidáním galaktosy). Definice jednotky aktivity fytasy -viz následující text.

Expresní vektor pro 5. cerevisiae použitý jako kontrola.

Růstová média a indukce genové exprese, V systému E.coli byly transformanty pěstovány v 50 ml LBD média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 30 ^eC. Jakmile veličina OD_ÓOo média dosáhla hodnoty 0,5 až 0,6 byla indukována genová exprese íytasy přidáním IPTG (isopropyl b-D-thiogalaktopyranosid) do média tak, aby výsledná koncentrace byla 1 mM. Tři hodiny po indukci byly buňky odstředěny při 800 x g, 15 min. Poté byly promyty 1 x PBS a lyžovány lysozymem. Byly připraveny rozpustná a nerozpustná buněčná frakce a vzorky obsahující 500 pg celkových proteinů (Lowry, O.H. et al., „Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent“ J. Biol. Chem. 193: 265-75 (1951), který je zde zahrnut odkazem) byly resuspendovány ve stejném objemu 2xSDS pufru a analyzovány pomocí SDS-PAGE (Laemmli, U.K., „Cleavage of Structural Prozteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4“ Nátuře (London)

227:680-85 (1970), který je zde zahrnut odkazem),

Rekombinantní 5. lividans byly pěstovány v TSB polévce s thiostreptonem (5 pg/ml) při 30 °C (Jung. E.D. et al., DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonosporafusca, Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032-43 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Po 72 hodinách inkubace byly buňky a médium sklizeno a připraveno pro analýzu pomocí SDS-PAGE (Wilson, D.B. Biochemistry and Genetics of Actinomycete

Cellulases, Crit. Rev. Biotechnol. 12: 45-63 (1992), který je zde zahrnut odkazem).

-12CZ 301680 B6

Transformanty S. cerevisiae byly zpočátku pěstovány po dobu 48 hodin ve 4% Sabouraudrafinosovém médiu (100 ml) bez uracilu. Sterilní galaktosa (2%) byla poté přidána k indukcí exprese fytasy. Vzorky média a buněk byly odebírány v různou dobu a extracelulámí i intracelulámí vzorky byly připraveny podle popisu Li a Ljungdahla (Li and Ljungdahl, Expression of

Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae, Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996), který je zde zahrnut odkazem). V případě potřeby byl supematant z frakce expresní buněčné kultury zakoncentrován pomocí koncentrátoru a s použitím membrán YM10 (MW cutoff- 10 000) od firmy Amicon (Beverly, MA, USA). Ostatní média byla testována podobně.

io

Stanovení aktivity proteinu. Množství exprimované fytasy za rozdílných podmínek bylo kvantifikováno pomocí relativní densitometrie (s použitím přístroje IS—1000 Digital Imaging System, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA) specifických proužků na SDS-PAGE. Aktivita fytasy ve vzorcích média a buněk byla stanovena tak, jak již bylo popsáno (Piddíngton

C. S. et al., „The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5 - optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori Gene, 133: 56 - 62 (1993), který je zde zahrnut odkazem) a uvolněný anorganický fosfát byl stanoven podle metody Chena a spolupracovníků (Chen, P.S., et al., „Microdetermination of P“, Anal. Chem. 28: 1756 - 58 (1956), který je zde zahrnut odkazem). Jednotka fytasové aktivity byla definována jako množství enzymu, které uvolní jeden pmol anorganického fosfátu z fytinu sodného za minutu při 37 °C.

Analýza pomocí imunoblotu (Wester blotu). Rozpustná frakce z buněčné hmoty fytasou transformovaných buněk E.coli a supematant z média transformantů 5. lividans a S.cerevisiae byla připravena jako pro SDS-PAGE. Po elektroforéze byly proteiny přeneseny na nitrocelulosovou membránu (Protran nitrocellulose membrane, Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) v 20mM Tris-HCI (pH 8,3), 20% metanolu a 0,1% SDS s použitím Mini Trans-Blot cell, Bio-Rad Laboratories, USA). Přenos byl prováděn přes noc při konstantním napětí 50V a počáteční teplotě pufru 4 °C. Membrána byla poté analyzována pomocí Western blotu. Králičí polyklonální protilátky IgG (laskavě poskytnuty Dr. A.H:J. Ullahem z USDA, ředění 1:5000) proti purifikované nativní fytase z A. niger byly použity jako první protilátky. Blot byl zakončen s použitím kitu Immuno-Blot Assay Kit (Bio-Rad Laboratories), který obsahoval sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidasou.

Izolace a analýza celkové RNA. Celková RNA z transformantů E. coli a S. cerevisiae byla izolována TRIzol™ Reagentem (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA) za 3respektive 15 hodin po inkubaci. Vzorky RNA (10 pg na dráhu) byly poté separovány pomocí formaldehydové agarosové (1,5%, hm/obj) gelové elektroforézy a dále přeneseny na membránu Hyblot (National Labnet, Woodbridge, NJ, USA) (Davis et al, Basic Methods in Molecular Biology, 2nd Ed.,

Appleton and Lange, Norwalle, Ct. (1994), který je zde zahrnut odkazem). Byl připraven fragment o velikosti 1,4 kb EcoRÍ-HindllI v plasmidu pEPl a poté značen pomocí náhodného primerů ³²P s použitím kitu na značeni DNA. Následovala purifikace přes kolonu G-50 (Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ, USA) a poté hybridizace s blotovanou RNA na membráně v hybridizaění pícce (Hybaid, Middlesex, UK). Hybridizované membrány byly zviditelněny pomocí Fuji Imaging Plate a analyzovány Bio-Imaging analyzátorem (Kohshim Graphic Systems, Fuji, Japan).

Příklad 2 50

ExpresephyA v Ecoli.

Čtyři hodiny po indukci byl na SDS-PAGE (12,5%) zřetelný specifický proužek (okolo 55 kDa) rozpustné buněčné frakce při srovnání s kontrolním transformovaným expresním vektorem (obr. 1 a 2). Tento proužek reprezentoval 3,8 % celkových rozpustných proteinů dané frakce. Ve

- 13CZ 301680 B6 shodě s tím ukázala nothem analýza overexpresi mRNA phyA v transformantech s genem pro fytasu. V kontrolních buňkách nebyl pozorován žádný signál (obr. 3).

Ve snaze optimalizovat expresi fytasy byl studován vliv různých faktorů na expresi a také časová závislost exprese. Mezi tyto faktory patří: teplota inkubace (30 a 37 °C), pH média (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 a 9,0) anaerobicita (přidání sterilního minerálního oleje na povrh rostoucích buněk), hladina anorganického fosfátu v médiu (Dassa, E. et al., „The Acid Phosphatases with Optimum pH of 2.5 of Escherichia colF J. Biol. Chem. 257:6667 - 76 (1982), který je zde zahrnut odkazem) a koncentrace fytinu sodného (0,01, 0,2, 0,3, 0,4 a 0,5 mM). Výsledky ukázaly, že exprese fytasy io byla lineární v závislosti na čase po prvních šest hodin od indukce (obr. 4). Poté zůstávala exprese relativně nezměněna, ačkoliv bakteriální buňky dále rostly. Z ostatních faktorů pouze pH a koncentrace fytinu významně ovlivňovaly expresi fytasy. Maxima proteinu bylo dosaženo při pH 6,0 a koncentraci fytinu sodného 0,3 mM. Za těchto podmínek se zvýšil obsah fytasy z 3,8 na

9,6 % celkových rozpustných proteinů.

Fytasová aktivita nebyla detekována ani v extracelulámí ani v intracelulámí frakci. Toto zjištění nebylo úplně neočekávané, protože nativní ťytasa z A. niger je glykoprotein o velikosti 70 - 80 kDa (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger, Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem). V této studii měl protein exprimovaný v systému E. coli velikost přibližně 55 kDa. Zřejmě chybějící glykosilace proteinu a další nezbytné posttranslační modifikace během sekrece byly příčinou chybějící ťytasové aktivity.

Příklad 3

Exprese phyA v 5. lividans.

Heterologní geny byly exprimovaný v S. lividans a výsledné produkty s enzymatickou aktivitou byly sekretovány do média (Ghangas, G.S. et ak, „Cloning of the Thermomonospora Fusca Endoglucanase E2 Gene in Streptomyces Lividans·. Aťfinity Purification and Functional Domains of the Cloned Gene Produkt“, Appl. Environ, Microbiok 54: 2521-26 (1988); Wilson, D.B. Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases, Crit. Rev. Biotechnok 12; 45-63 (1992); Jung. E.D. et ak, DNA sequences and expression in Streptomyces lividans of endoglucanase gene from Thermomonospora fusca, Appk Environ. Microbiok 59: 3032 - 43 (1993), které jsou zde zahrnuty odkazem). Podobně byl gen phyA exprimován v 5. lividans a protein byl sekretován do média, jak je vidět na proužcích při analýze vzorků média metodou SDS-PAGE (obr. 5 a 6). Znamená to, že signální peptid z genu pro endonukleasu E2 z T. fusca byl schopen zajistit sekreci proteinu ven z buňky. Tento protein měl velikost 57 kDa a reprezentoval 16,2% celkových proteinů v médiu. Změna pH média na 6,0 a přidání 0,3 mM fytinu sodného do média zvýšila výtěžnost proteinu na 20,3 % celkových proteinů. Protože byl protein (fytasa) sekretován do média v tak vysokých hladinách, mělo by být snadné jej purifikovat a účinně použít k mnoha účelům, jako je například produkce protilátek proti ťytase. Zvýšená fytasová aktivita však opět nebyla nalezena ani v médiu ani v lyžovaných buňkách. Ačkoliv se velikost proteinu vůči proteinu exprimovánému v E. coli o trochu zvýšila (2 až 3 %), stále zde nebyla, zřejmě z důvodů glykosilace fytasy v tomto expresním systému, nalezena žádná fytasová aktivita.

Příklad 4

Exprese phyA v S. cerevisiae

Tři rozdílné signální peptidy byly použity ke srovnání účinnosti při zajišťování sekrece expresních proteinů ven z buněk (viz tabulka 2). Aktivita fytasy se značně zvýšila, jestliže byly trans55 formanty pYEPl a pYPPl pěstovány v Sabouraud.rafínosovém médiu, nezvýšila se však při

-14CZ 301680 B6 stejném pěstování u transformantu pYXPl. Proužek fytasy byl zřetelný na SDS-PAGE elektroforéze po 20 hodinách od indukce (obr. 7).

Exprese transformantu pYEPl a pYPPl byla stanovena ve třech různých typech média;

Sabouraud-rafinosovém (Li, X.L. et al., Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From, Saccharomyces Cerevisiae“, Appl. Environ. Microbiol. 62: 209-13 (1996), kteiý je zde zahrnut odkazem), Sabouraud-glycerolovém a modifikovaném obecném YEPD médiu. U transformantu pYEPl byla podobná fytasová aktivita exprimovaná v Sabouraud-rafinosovém médiu a Sabouraudově médiu. V médiu YEPD však nebyla detekována io žádná fytasová aktivita. Naproti tomu, u transformantu pYPPl se aktivita fytasy velmi lišila v závislosti na médiu. Aktivita se zvýšila až na hodnotu 375 mU/ml, jestliže bylo použito Sabouraud-glycerolové médium. V médiu YEPD se aktivita dále zvýšila až na 1675 mU/ml (viz. Tabulka 3). Ačkoliv je médium YEPD oproti Sabouraud-rafinosovému médiu o hodně levnější, výtěžek fytasy se v něm zvýšil více než desetkrát. V tomto uspořádání tedy předpokládaný signální peptid z houbového genu pro fytasu dosáhl nej účinnější exprese extracelulámí fytasové aktivity. Téměř všechen produkovaný protein byl sekretován do YEPD média, protože velmi málo aktivity bylo detekováno v kvasinkových buňkách. Časová závislost exprese fytasy v tomto systému je znázorněna na obr. 8.

Tabulka 3

Aktivita fytasy exprimovaná trans formantem s pYPPl v různých typech média

Počet hodin po indukci (mPU/mlJ¹

Médium	0	10	15
Sabouraud-rafinoSOvéu	22	136	146
Sabouraud-glycerolové	6	174	375
YEPD	18	1238	1675

1 Aktivita fytasy byla detekována v supematantu tří médií buněčných kultur po 0, 10 a 15 hodinách po indukci přidáním galaktosy. Definice jednotky fytasové aktivity viz text.

Různé druhy mikroorganismů včetně bakterií, kvasinek a filamentámích hub vykazují fytasovou aktivitu. Kmen A niger NRRL3135 však produkuje aktivitu nejvyšší - 340 mU/ml (Shieh, T.R. et al., „Survey of Microorganisms for the Production of Extracellular Phytase“, Appl. Environ. Microbiol. 16: 1348 - 51 (1968), který je zde zahrnut odkazem). Mezi jedenadvaceti kvasinkovými kmeny má nejvyšší fytasovou aktivitu Schwanniomyces castelli - 140 mU/ml (Lambrechts, C.et al., „Utilization of Phytate by Some Trast“, Biotechnology Letters 14: 61 - 6 (1992), který je zde zahrnut odkazem. Je zřejmé, že rekombinantní kvasinkový kmen transformovaný pYPPl popisovaný v této studii tvořil mnohem vyšší fytasovou aktivitu (1675 mU/ml) než má A. niger (4x) a 5. castellii CBS 2863 (1 lx). Maximální tvorba fytasy může být v daném systému dosažena optimalizací inkubačních podmínek a modifikací plasmidové kazety (Demolder, J.W. et al., „Efficient Synthesis of Secreted Murine Interleukon-2 by Saccharomyces Cerevisiae: Influence of 3 - Untranslated Regions and Codom Usage“. Gene: 111: 207 - 13 (1992), který je zde zahrnut odkazem).

Vysoká hladina exprese funkční fytasy v 5. cerevisiae byla způsobena zřejmě dostatečnou glykosilací fytasového proteinu a dalšími post-translačními modifikacemi ve kvasinkách. Po zakoncentrování supematantu média a analýze za pomocí SDS-PAGE byl zřetelný proužek o velikosti přibližně 110 kDa (viz obr. 7 a 9), což je více než velikost nativního proteinu z A. niger (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase

- 15CZ 301680 B6

Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger, Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Specifická overexprese phyA mRNA byla potvrzena nothem analýzou (obr. 10). Tento výsledek ukazuje, že kvasinkový systém je účinný při overexpresi aktivní extracelulámí fytasy.

Kvasinkový systém má několik výhod před bakteriemi nebo dalšími systémy jako např. A. niger (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger, Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Ten provádí během translokace proteinu přes endoplasmatické retikulum a buněčnou membránu post-translační modifikace včetně správného sbalení, glykosilace, tvorby disulfidických vazeb a proteolysy. Sekrece proteinu je ulehčena krátkým hydrofobním signálním peptidem na N-konci io prekurzoru proteinu. (Li, X.L. et al., „Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae“, Appl. Environ. Microbíol., 62: 209-13 (1996), který je zde zahrnut odkazem). Proteiny sekretované kvasinkami jsou chráněny proti agregaci a degradaci proteasami. Nej důležitější však je, že lze enzym tvořený S. cerevisiae snadno purifikovat, protože ta sekretuje normálně pouze několik proteinů, Vezmeme-li v úvahu dobře známou bezpečnost produkce kvasinek pro lidi i zvířata, zdá se, že tento systém má velký potenciál v potravinářském průmyslu a průmyslu krmiv.

Příklad 5

Vlastnosti PhyA fytasy overexprimované v Saccharomyces cerevisiae

Fytasa overexprimované transformanty s plasmidem pYPPl byla zakoncentrována a použita ke studiu jejich vlastností (viz. Tabulka 4). Enzym měl dvě pH optima: 2 až 2,5 a 5,0 až 5,5.

V oblasti 2 až 2,5 však byla aktivita enzymu pouze 60% oproti aktivitě enzymu v oblasti 5 až 5,5. Při pH 1 nebo 8 nebyla detekována žádná aktivita. pH optimum bylo prakticky stejné jako pH optimum fytasy z A. niger (Simons et al.: „Impovement of Phosphorus Availability By Microbilab Phytase in Broilers and Pigs.“ Br. J. Nutr,64: 525 (1990), který je zde zahrnut odkazem), což znamená, že aktivní funkce hydrolýzy fytinu v gastrointestinálním traktu lze zcela určitě předpokládat. Teplotní optimum enzymu bylo 60 °C, zatímco momentálně nejběžnější fytasa na trhu, vyráběná firmou Gist-Brocades, má teplotní optimum 55 °C (BASF, 1996). Při 50 až 55 °C stále zůstává více než 80% aktivity, při 75 až 80 °C však byla detekována již pouze malá aktivita. Při zahřátí exprimované kvasinkové fytasy, která je popsána v tomto vynálezu, na 15 minut a 37 ^ŮC respektive 80 °C je zbytková aktivita 100% respektive 63%. Fytasa BASF

Gist-Brocades za stejného uspořádání měla po zahřátí zbytkovou aktivitu 100% respektive 52%. Rozdíly mezi těmito dvěma enzymy při kterékoliv teplotě byly signifikantní (viz tabulka 5). Zdá se tedy, žeje kvasinková fytasa teplotně stabilnější než současná, komerčně dostupná, fytasa.

Tabulka 4

Charakteristika fytasy overexprimované v kvasinkách¹ pH optimum²

pH	1,0	2,0	2,5	3,0	4,0	5,0	5,5	6,0	8,0
Relativní aktivita (%)	Q,5e	59, 7C	64, Qc	48,1*	81,0b	100,0“	95, 0a	66,3°	0,8a
	±0,2	±3	±6	±4	±5	±1	±6	±1	±4
Teplotní optimum.3 °C	25	37	45	50	55	60	75	80
Relativní aktivita (%)	24, 2e	44,6*	63, 9C	83, 6b	89,8b	100,0*	0, 6*	0, 9f
	±0,8	±3	±9	±2	±4	±4	±0,1	±0,2

- 16CZ JU108U Bó

Data reprezentují průměr relativní aktivity ± standardní odchylka (n-4). Průměry s různými horními indexy jsou rozdílné (P<0,05). K analýze vlivů ošetření byl použit obecně lineární model statistické analýzy (1988) - Benferroniho /-test a celkově náhodné uspořádání pro porovnání průměrů při násobném ošetření. Hladina významnosti byla nastavena na P<0,05.

Aktivita byla stanovena při 37 °C (definice jednotky aktivity fytasy - viz text). Byly použity rozdílné pufty: 0,2mM glycin-HCl pro pH 1,0 až 3,5; 0,2 mM citrát sodný pro pH 4,0 až 6,5 a 0,2 mM Tris-HCl pro pufry nad 7.

io 3. Teplotní optimum bylo stanoveno při pH 5,5 (0,2 mM citrát sodný).

Tabulka 5

Porovnání termostability overexprimované fytasy v kvasinkách a výroku Gist-Brocades fytase z A. niger' ²

Relativní aktivita, %	37*C	30°C
Kvasinková fytasa	100“±1	63M
Fytasa z A. niger	1CG*±3	52y±2
P3<		0,3
. Data reprezentují průměr relativní aktivity ± standardní odchylka (n=3). Průměry s různými

horními indexy jsou rozdílné (P<0,05). K analýze vlivů ošetření byl použit obecně lineární model statistické analýzy (1988) - Benferroniho /-test a celkově náhodné uspořádání pro porovnání průměrů při násobném ošetření. Hladina významnosti byla nastavena na P<0,05.

2. Enzym byl zahříván po 15 minut pří různé teplotě před reakcí při 37 °C a pH 5,5.

3. Významnost (hodnota P) /-testu mezí aktivitou dvou fytas při každé z nastavených teplot

Ačkoliv je nejasné jak se takovéto zvýšení termostability vztahuje k různým post-translačním modifikacím (sbalení, štěpení, glykosilace) (Li, X.L. et al., „Expressíon of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretíon of Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae“, Appl. Environ.

Microbiol., 62: 209-13 (1996), který je zde zahrnutý odkazem), je jistě výhodou mít termostabilnější fytasu, která je snad odolnější vůči teplotě během granulování krmivá, což je problém se současnou Gist-Brocades fytasou.

Příklad 6

In vitro hydrolýza fytinu z kukuřice, sóji a mleté pšenice expresní kvasinkovou fytasou

Exprimovaná kvasinková fytasa uvolňovala fytinový fosfát z kukuřice a sójové moučky stejně efektivně jako fytasa Gist-Brocades jestliže se porovnání vztáhlo na jednotku aktivity (viz tabulka 6). Jak lze předpokládat, byla hydrolýza fytinu závislá na čase a množství aktivity. Exprimovaná kvasinková fytasa byla také účinná pri uvolňování fytinového fosfátu z pšeničné mouky což znamená její možné velké využití při kvašení chleba. Protože hrubě mletá pšenice použitá v této studii obsahovala o hodně vyšší množství své vlastní fytasové aktivity než obsahuje běžně používaná pšeničná mouka, je případný efekt expresní kvasinkové fytasy na zvýšení hydrolýzy fytinu, při použití v pekárnách, o hodně vyšší. Vliv by využití kvasinkové

-17CZ 301680 B6 fytasy mělo i na uvolňování stopových prvků (Halí, m.N. et al., „The Early Days of Yeast

Genetics“ Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993), který je zde zahrnutý odkazem).

Tabulka 6

Volný fosfát uvolněný z kukuřice, sójové moučky (SM) a hrubě mleté pšenice (HMP) overexprimovanou kvasinkovou fytasou a houbovou fytasou z A. niger in vitro¹

Kvasinková fytasa (PU/kg)	0	100	250	500	1000	250 (houbová fytasa)
		Volný fosfát	(mg/g)
Kukuřice: 1 hoď.	0,23**±0,03	0,64c±0,8	l,14b±0,18	1,46±0,04	1,54‘±0,04	l,16te±0,15
4 hoď.	Q,36e±Q,Q2	l,2€*±G,04	1,60*±0,03	l,66'±0,06	1,72*10,04	l,68*±0,04
SM: 1 hoď.	0,68d±0,01	1,18*10,02	1,62-+0,18	2,48b±0,32	3,13*±0,19	l,6BciO,2
4 hoď.	0,73d±	1,67°	2,69b	3,41*	3,71*	2,78”
HMP:	3,56*0,39		4,1110,64	4,672±0,Q5
1 hoď.
4 hoď.	5,63±5		6,02±0,4fl	6,38z±0,07

io 1 Každý vzorek (5g) byl míchán ve 20 ml pufru (0,2 mM citrát sodný) při teplotě 37 °C po dobu jedné nebo čtyř hodin. Supernatant byl připraven centrifugací při 800 g a 15 minut Po přefiltrování pres filtrační papír Whatman 541 bylo v takto vzniklém vzorku stanoveno uvolňování volného fosfátu podle metody Chena a spolupracovníků (Chen, P.S. et al., „Microdetermination of P.“ Anal. Chem., 28: 1756 - 58 (1956), který je zde zahrnutý odkazem). Data reprezentují průměr relativní aktivity ± standardní odchylka (n=4). Průměry s různými horními indexy jsou rozdílné (P<0,05). K analýze vlivů ošetření byl použit obecně lineární model statistické analýzy (1988) - Benferroniho f-test a celkově náhodné uspořádání pro porovnání průměrů při násobném ošetření. Hladina významnosti byla nastavena na P<0,05. U všech zkoumaných plodin existují významné rozdíly mezi první a čtvrtou hodinou při jakémkoliv množství enzymu (jak bylo dokázáno pomocí í-testu. Průměry v řádcích s rozdílným písmenem v horním indexu se lišt (P<0,05).

n=2

Byly porovnány overexprese fytasy Aspergillu niger (phyA) v Escherichia coli, Streptomyces lividans a Saccharomyces cerevisiae za účelem vývoje účinného a jednoduchého systému k ekonomické produkci fytasy. Vnitrobuněčný protein o velikosti 55 kDa a reprezentující 9,6 % celkových rozpustných proteinů byl exprimován v E.coli s použitím systému s pET25b (+). Extracelulámí protein o velikosti 57 kDa, reprezentující 20,3 % celkových proteinů v médiu byl exprimován v 5. lividans s použitím přenosového plasmidu obsahujícího promotor pLTl a zaváděcí sekvencí Spěli endonukleasy E2. Ani v jednom z výše uvedených expresních systémů nebyla detekována zvýšená aktivita fytasy, pravděpodobně proto, že protein nebyl glykosilová či jinak post-translačně modifikován. Naproti tomu byla produkována vysoká fytasová aktivita v 5. cerevisiae transformované genem phyA. Tři různé zaváděcí sekvence a tři různá média byla srovnávána s cílem nalézt nejlepší expresní vektor a nejlepší podmínky. Použití signálního peptidu Sphy z genu phyA v kombinaci s YEPD médiem dávalo nejvyšší extracelulámí fytasovou

-18CZ 3U1NMI B6 aktivitu. Fytasa overexprimovaná ve kvasinkách měla velikost přibližně 110 kDa a dvě pH optima: 2,0 až 2,5 a 5,5 až 6,0. Teplotní optimum bylo 60 °C.

Příklad 7

Materiál a metody pro expresi phyA v Pichia

Hostitel a vektor. Byl zakoupen EasySelect™ Pichia Expression kit od firmy Invitrogen (San io Diego, CA). Kit obsahuje hostitele a vektory potřebné k expresi genu buď intracelulámě nebo extracelulámě v kmenech Mut⁺ nebo Muť (Metanol je využíván normálně ěi málo (s-slow)),

X33 byl použit jako kmen Mut⁺ a kmen KM71 byl použit jako Muť. Byly použity dva vektory: pPICZB (3,3 kb) a pPICZaA (3,6 kb). Oba používaly promotor AOX1.

is Konstrukce expresního vektoru. Vliv různých signálních peptídů na expresi PhyA v systému Pichia byl sledován na dvou připravených konstruktech. První konstrukt byt připraven ligací fragmentu 1,5 kb velkého EcoRI-KpnI, obsahujícího sekvenci PhyA kódující funkční fytasu do pPICZaA. V tomto plasmidu (pICZa-p/rM) byl phyA zaváděn alfa-faktorem - velmi široce používaným signálním peptidem z Saccharomyces cerevisiae. Druhý konstrukt byl přípraven ligací 1,4 kb velkého fragmentu KpnI-Xbal pYPPl do vektoru (kódující oblast phyA byla zaváděna svým vlastním signálním peptidem. Který byl velmi účinný při sekreci exprimované fytasy v Saccharomyces cerevisiae).

Transformace a exprese. Ověřené konstrukty byly linearizovány Pmel a transformovány do

GSl 15 a KM71 pomocí EasyComp™ dodávaným v kitu. K selekci pozitivních kolonií byl použit Neocin™. Jednotlivé kolonie byly inokulovány do 10 ml MGY média a pěstovány při 30 °C do doby, kdy OD₆₀o bylo 2 až 6. Poté byly buňky zcentriťugovány a resuspendovány v 10 ml MMY média obsahujícího 0,5% metanolu. Vzorky byly sbírány 12 a 24 hodin po indukci. Buňky byly odděleny od supematantu a lisovány pomocí skleněných kuliček v homogenizačftím pufru.

Aktivita fytasy v supematantu a v buňkách byla stanovena tak, jak již bylo popsáno. Ke zjištění velikosti a relativního množství exprimovaného proteinu byly provedeny SDS-PAGE a Western blot.

Příklad 8

PhyA fytasová aktivita v Pichia

Expresní konstrukt s použitím alfa - faktoru jako signálního peptidu pro phyA byl transformován 40 do dvou kmenů Pichia. KM71 je pomalý kmen využívající metanol, kdežto X33 je divoký typ využívající metanol účinně. Skrýning a inkubace byly prováděny v 10 ml lahvičkách při 29 až °C. U transformace KM71 mělo po indukci a 24 hodinách 19 kolonií z dvaceti extracelulámí fytasu vyšší než 6 jednotek/ml supematantu. Kolonie číslo 13 vykazovala nejvyšší aktivitu (26 jednotek/ml) poté co byla inkubována 108 hodin, Všechny kolonie transformantu X33 (20 z 20) vykazovaly více než 10 jednotek/ml poté, co byly indukovány 24 hodin. Jedna z kolonií (číslo 101) produkovala ťytasovou aktivitu s hodnotou 65 jednotek/ml supematantu. Časové závislosti exprese fytasy v KM71 a X33 byly sumarizovány na obr. 11. Navzdory rozdílnosti těchto dvou kmenů ve využívání metanolu a proto též ve schopnosti exprese fytasy, bylo zjištěno, že alfafaktor je korektně užíván v kvasinkových buňkách. Vedle toho téměř všechen exprimovaný so protein byl sekretován do média, protože v buňce nebylo nalezeno více než 5 % celkové exprimované aktivity.

Byl studován vliv anorganického fosfátu a pH média na expresi fytasy v médiích BMGY aBMMY. K pokusům bylo použito phyA rekombinantního kmenu X33 (číslo 101). Médium obsahující 50mM fosfát produkovalo, 168 hodin po indukci, nejvyšší aktivitu fytasy -19CZ 301680 Bó jednotek/min. Byl studován vliv různého pH tohoto pufru (3,4,5,6,7 a 8) na expresi. Jestliže bylo pH 6, pak transformant X33 produkoval 75 jednotek/ml supematantu. Na základě koncentrace proteinů a SDS-PAGE analýzy byl odhadnut výtěžek exprese fytasy na cca 3 až 4 mg/ml.

Příklad 9

Vlastnosti PhyA fytasy exprimované v Pichia io Molekulová hmotnost a deglykosilace expresní fytasy. Silný proužek okolo molekulové hmotnosti 95 kDa byl dobře znatelný na SDS-PAGE supematantu připraveného z média, které bylo inokulováno trans formantem z genu phyA (obr. 12). Byl to téměř jediný zřetelný protein v supernatantu. Exprimovaná fytasa reagovala dobře s králičími protilátkami připravenými proti purifikované nativní fytase z A. niger. To značí, že imunoreaktivita exprimované fytasy byla v podstatě stejná jako imunoreaktivita nativní fytasy z A. niger. Po použití Endo H se snížila velikost fytasy deglykosilací na 50 kDa, Protilátky proti phyA reagovaly také s deglykosilovanou fytasou. Deglykosilace provedená za nativních podmínek navíc snížila aktivitu fytasy o 15%, z čehož vyplývá, že glykosilace byla důležitá pro aktivitu fytasy. Glykosilace dále ovlivnila termostabilitu enzymů (obr. 13).

Nothem analýza. Jak je vidět z obrázku 14, sonda phyA DNA o velikosti 1,3 kb hybridizovala s mRNA indukovaných transformantů jak z KM71 (č. 13) a X33 (č. 101). Signál daly také transformanty před indukcí. Pravděpodobně nebyla exprese phyA v tomto systému kontrolována striktně na hladině transkripce.

pH a teplotní optimum a hydrolýza fytinu. Stejně jako je tomu u fytasy z A. niger, má expresní fytasa dvě pH optima - 2,5 a 5,5 (obr. 15). Teplotní optimum exprimované fytasy bylo 60 °C (obr. 16). Jestliže byla expresní fytasa inkubována se sójovými vzorky při aktivitách 100, 200, 400, 800, mU/g a teplotě 37 °C, byla produkce fosfátu lineární v závislosti na množství fytasy (obr. 17).

Příklad 10

Materiál a metody pro overexpresi genu appA z E.coli v Sacharomyces cerevisiae.

Gen a protein. Tento gen, původně definovaný jako gen periplasmatické fosfoanhydridfosfohydrolasa z E. coli obsahuje 1298 nukleotidů (GeneBank accession number: M58708). Nejdříve bylo zjištěno, že gen kóduje kyselou fosfatasu s pH optimem 2,5 (EcAP) v E. coli. Kyselá fosfatasa je monomer s molekulovou hmotností 44644 daltonů. Zralé EcAP obsahuje 410 aminokyselin (Dassa, J. et al., „The Comptete Nucleotide Sequence of the Escherichia coli Gene appA reveals Significant Homology Between pH 2,5 Acid Phosphatase and Glucose-l-Phosphatase“, J. Bacteriology 172: 5497 - 5500 (1990), který je zde zahrnutý odkazem). Ostanin se spolupracovníky overexprimoval appA v E. coli BL21 vektorem pT7 a zvýšil tak její kyselou fosfatasovou aktivitu přibližně 400x (440 mU/mg proteinů) (Ostanin, K. et al., „Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase“, J. Bio. Chem., 267: 22830 - 36 (1992), který je zde zahrnutý odkazem).

Gen a hostitel - kmen CU1869 (No. 47092) E. coli byly zakoupeny od ATCC. Gen, insert 1,3 kb, byl transformován do kmene BL21 (no. 87441) E. coli s použitím expresního vektoru pAPPAl (Ostanin, K. et al., „Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase“, J. Bio. Chem., 267: 22830 - 36 (1992), který je zde zahrnutý odkazem).

Hostitel a vektor. Vektor pro overexpresi genu appA v Saccharomyces cerevisiae byl pYES2 a hostitel byl INVScI (Invitrogen, San Diego, CA. USA).

-20CZ 3U16SU Bb

Konstrukce expresního vektoru. Na začátku byí izolován fragment Xbal 1,3 kb velký z pAAPAl.

Tento fragment obsahoval gen appA se svým vlastním signálním peptidem. Poté, co byl tento fragment ligován do místa Xbal pYES2, byl takto vzniklý konstrukt (PYES2-appA) trans5 formován do Saccharomyces cerevisiae. Fytasová aktivita však nebyla zvýšena ani v extra- ani v intra - buněčných Částech v porovnání s kontrolou. pAPPAl a pYPPl (PhyA ajeho signální peptid v pYES2) byly kotransformovány do kvasinkového kmene. Ovšem, znovu nebyla pozorována vyšší aktivita kvůli pAPPAl v médiu nebo v kvasinkových buňkách.

Dva primery byly syntetizovány za účelem spojení signálního peptidu genu PhyA s kódující oblasti genu appA. Jeden, 80 bp dlouhý, obsahoval signální peptid PhyA a místo KpnI na 5' konci: GGG GTA CCA TGG GCG TCT CTG TTC TAC TTC CTT TGT ATC TCC TGT CTG GAG TCA CCT CCG GAC AGA GTG AGC CGG AG (SEQ ID No. 9). Druhý primer byl dlouhý 24 bp s EcoRl místem na 3' konci: GGG ATT TCA TTA CAA ACT GCA GGC (SEQ ID No. 10). PCR proběhlo ve 25 cyklech, v režimu - 1 min. denaturace při 95 °C - 1 min. annealing pri 58 °C a 1 min. prodloužení řetězce při 72 °C, Fragment 1,3 kb byl amplifikován, štěpen a ligován do pYES2. Poté, co byl insert potvrzen restrikčním mapováním, byl konstrukt (pYES2-SphyA-appA) transformován do INVScI lítium acetátovou metodou.

Exprese. Vyselektované transformanty byly inokulovány do YEPD média. Exprese byla indukována přidáním galaktosy do kultury poté, co OD₆oo dosáhla 2 tak, jak to bylo popsáno dříve. Buňky byly sklízeny 15 až 20 hodin po indukci.

Stanovení aktivity. Kyselá fosfotasová aktivita byla stanovena při 37 °C ve 25 mM glycin-HCl pufru (pH 2,5) s použitím p-nitrofenylfosfátu jako substrátu (zásobní roztok - 250mM). 1,7 ml reakčního pufru bylo přidáno do 0,1 ml vzorků. Po pětiminutové inkubaci ve vodní lázni při 37 °C bylo přidáno 0,2 ml vytemperovaného substrátu a zamícháno. Reakční roztok byl přenesen do vytemperované kyvety, která byla přímo v držáku spektrofotometru, a v ní byl inkubován při 37 °Č 2 minuty. Množství uvolněného p-nitrofenolu bylo sledováno průběžně po dobu 5 min., při vlnové délce 405 nm. Z výsledků se poté vypočetla enzymová aktivita.

In vitro studie. Sójová moučka (5,0 g) byla rozmíchána ve 20 ml 20mM citrátového pufru, pH 5,5 a dále smíchána s 200 mU fytasy a inkubována pri 37 °C po dobu 4 hodin za neustálého míchání. Po ochlazení ledem po dobu 10 min. byla suspenze přenesena do centrifugačních zkumavek a centriťugována po dobu 15 min. pri 15000 x g. V supematantu byly stanoveny volné fosfáty.

Přikladli

Kvantifikace aktivity fytasy z overexprimovaného genu E. coli appA v Saccharomyces cerevisiae.

Intracelulární aktivita kyselé fosfatasy v genem appA overexprimované E. coli (pAPPAl) byla 440 mU/mg proteinů. Nebývalé vysoká však byla nalezena fytasová aktivita v transformovaném kmeni (větší než 4900 mU/mg proteinů). V kontrole (BL21) bylo pouze minimální množství fytasové aktivity. To znamená, že tento gen pro kyselou fosfatasu také kódoval fytasu. Sekvence appA genu byla srovnána se sekvencí genu PhyA a bylo zjištěno, že tyto dva geny sdílí 23% identiti.

Transformace INVScI konstruktem pYES2-Sphy-appA (se zaváděcím signálním peptidem z PhyA) vedlo k produkci fytasové aktivity v supematantu, která byla 2000 krát větší než aktivita divokého typu nebo aktivita transformantu obsahujícího gen appA se svým vlastním signálním peptidem (viz tabulka 7.)

-21 CZ 301680 B6

Tabulka 7

Extracelulámí fytasová aktivita v transformantech s genem appA s různým signálními peptidy

Konstrukt	Signální peptid	Aktivita (mU/ml)	Aktivita (mU/mg proteinů)
PYES-	appA	Nedetekovatelná	Nedetokovatelná
pYES2-SphyA^appA	PhyA	1,158	445

Vliv koncentrace anorganického fosfátu, fytinu, pH a teploty média (YEPD) na expresi fytasové aktivity pYES2-Sphy-A-appA je ukázán v tabulce 8. Nejvyšší fytasová aktivita za optimálních podmínek byla 2,286 mU/ml (633 mU/mg proteinů).

io Tabulka 8

Vliv vlastnosti média YEPD na expresi fytasové aktivity pYES2-Sphy-A-appA v kvasinkách.

Vlastnosti média Aktivita (raU/ml)

Fosfor, mg/lOOml
0	1402
1	714
5	722
10	456
Fytínát sodný, g/lOOml
0	870
0,1	1019
1,0	1748
pH
5,0	892
7,0	996
8,0	2286
Teplota, °C
25	312
30	1037
37	996

Teplotní stabilita overexprimované extracelulámí fytínové aktivity produkované kvasinkovými transformanty byla vyšší než fytasy vnitrobuněčné produkované E. coli transformované pAPPAl (viz. Tabulka 9). Zahřátí extracelulámí fytasy na 80 °C a 15 minut vedlo k 30% ztrátě fytasové aktivity, kdežto téměř veškerá fytasová aktivita byla ztracena jestliže stejným podmínkám byla vystavena fytasa z E. coli.

-22CZ 3016VU B6

Tabulka 9

Vliv zahřívání (80 °C, 15 min.) na aktivitu fytas z různých zdrojů.

Fytasa	Relativní aktivita po zahřátí (%)
appA v E. coli	0,1
appA v S. cerevisiae	69
PhyA v S. cerevisiae	66
fytaaa BASF	50

Srovnání fytas (200 mU) z E. coli, overexprimované AppA v kvasinkách a BASF co do schopnosti uvolňovat fosfát ze sójové moučky je ukázáno v tabulce 10. Výsledky naznačují, že fytasy ze všech tří různých zdrojů uvolňují fytinové fosfáty ze sójové moučky účinné.

Tabulka 10

Volné fosfáty uvolněné ze sójové moučky fytasami ze tří různých zdrojů.

Fytasa	Fosfor (mg/g)
appA v E. coli	1,11
appA v S. cerevisiae	0,69
BASF	0,87

Jestliže byl gen E. coli appA (kyselá fosfatasa) exprimován v Saccharomyces cerevisiae produkoval extracelulámí fytasovou aktivitu v médiu jež byla více než 2000 krát vyšší než kontrola, Overexprimovaná fytasa účinně uvolňovala fytinové fosfáty ze sójové moučky a zdá se, že je termostabilnější než v současné době dostupná komerční fytasa nebo vnitrobuněčná fytasa produkovaná v E. coli stejným genem (appA).

Příklad 12

Metody a materiál pro overexpresi genu E. coli appA kódujícího kyselou fosfatasu / fytasu v Pichia pastoris.

Gen a protein. Gen appA a hostitel, kmen E. coli CU1867 (No. 47092) byly obdrženy z ATCC. Gen, insert 1,3 kb, byl transformován do kmene BL21 (no. 87441) E. coli s použitím expresního vektoru pAPPAl (Ostanin, K. et al., „Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and

Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase“, J, Bio. Chem., 267: 22830 - 36 (1992), který je zde zahrnutý odkazem).

Hostitel a vektor. Byl zakoupen EasySelect™ Pichia Expression kit od firmy Invitrogen (San

Diego, CA). Kit obsahuje hostitele a vektory potřebné k expresi genu buď intracelulámě nebo extraceluíámě v divokém kmeni (X33). Byly použity dva vektory: pPlCZB (3,3 kb) a pPICZaA (3,6 kb). Oba používaly promotor AOX1.

-23CZ 301680 B6

Konstrukce expresního vektoru. Dva primery byly použity k amplifikaci genu appA zpAPPAl a dvě restrikční místa EcoRI a KpnI byly zhotoveny na 5' a 3' koncích.

Primer proti směru: GGA ATT CCA GAG TGA GCC GGA (SEQ ID No. 11)

Primer po směru: GGG GTA CCT TAC AAA CTG CA G (SEQ ID No. 12)

Templát: pAPPAl DNA izolovaná z ATCC 87441 io PCR byla provedena ve 30 cyklech za následujícího uspořádání: 1 min. denaturace při 94 °C, 1 min. annealing při 55 °C a 1 min. prodlužování řetězce při 72 °C. Fragment o velikosti 1245 párů bází byl amplifikován, štěpen EcoRI a KpnI a ligován (16 °C přes noc) do pPICZB (3,3 kb) a do pPICZaA (3,6 kb). Ligace byla potvrzena restrikčním mapováním po transformaci konstruktu do DH5a.

Transformace konstruktu do Pichia (X33). Pro každou transformaci bylo připraveno 100 pg plasmidové DNA a poté linearizován štěpením s Pmel. Po linearizaci byla DNA purifikovaná a resuspendována v 10 pl sterilní deionizované vody. Ke každé transformaci byla poté použita polovina této DNA. K transformaci DNA do X33 byly použity elektroporace a kit EasyComp

Chemical kit (Invitrogen). V případě elektroporace byly použity 2 mm kyvety a Cell Manipulátor (ECM 600, Gentromics, BTX Instrument division, San Diego, CA 92121). Odpor byl 186 Ohm, nabíjecí napětí 1,5 kilovoltů a skutečná doba nabíjení byla přibližně 7 milisekund. Elektroporované buňky byly ínkubovány na YPD agarových plotnách obsahujících 100 mg Zeocinu/ml při 30 °C dva až čtyři dny dokud nevyrostly kolonie. V případě chemické transformace byly buňky pěstovány na YPDS agarových plotnách obsahujících 100 mg Zeocinu/ml. Chemická metoda měla v porovnání s elektroporací nižší transformační účinnost.

Exprese. Jednotlivé kolonie byly inokulovány do 10 ml média MGY (30ml zkumavky) a pěstovány při 28 až 30 °C v rotačním inkubátoru (200 otáček za minutu) (16 až 18 hodin) dokud hodnota

OD&00 nedosáhla 5 až 6. Buňky byly poté odstředěny (2000 ot./min) a resuspendovány v 10 ml média BMMY (obsahujícího 0,5% metanolu) k indukci exprese. Vzorky (200 μί) byly sbírány každých 12 nebo 24 hodin po indukci. Metanol (100%) byl přidán v množství 100 μί každých 24 hodin za účelem udržení jeho koncentrace v médiu na hladině 0,5 až 1 % v médiu.

Stanovení. Buňky byly odděleny z média (supematant) a lisovány s pomocí skleněných kuliček v homogenisačním pufru. Extracelulámí fytasová aktivita v supematantu a vnitrobuněčná fytasová aktivita v lyžovaných buňkách byla stanovena tak jak je popsáno dříve (0,2M citrátový pufr, pH 5,5, při teplotě 37 °C a s použitím lOmM fytátu sodného). Kyselá fosfotasová aktivita byla stanovena při 37°C ve 25 mM glycin-HCl pufru (pH 2,5) s použitím p-nitrofenylfosfátu jako substrátu (zásobní roztok - 250mM). 1,7 ml reakčního pufru bylo přidáno do 0,1 ml vzorků. Množství uvolněného /?-nitrofenolu bylo sledováno průběžně po dobu 5 min., při vlnové délce 405 nm. Z výsledků se poté vypočetla enzymová aktivita. Byla provedena SDS-PAGE (12%) s čilém stanovit velikost a relativní množství exprimovaného proteinu. pH optimum a teplotním optimum exprimované fytasy byly stanoveny tak, jak bylo popsáno ve výsledcích.

In vitro studie. Sójová moučka (5,0 g) byla rozmíchána ve 20 ml 20mM citrátového pufru, pH 5,5 a dále smíchána s 200 mU fytasy a inkubována při 37 °C po dobu 4 hodin za neustálého míchání. Po ochlazení ledem po dobu 10 min. byla suspenze přenesena do centrífugačních zkumavek a centrifugována po dobu 15 min. při 15000 x g. V supematantu byly stanoveny volné fosfáty.

-24CZ 301680 B6

Příklad 13

Sledování fytasové aktivity v koloniích Pichiapastoris overexprímujících gen E. coli appA.

Divoký typ Pichia X33 tvoří jak extracelulámě (< 0,03 U/mg proteinů) tak i intracelulámě (< 0,05 U/ml) minimální množství fytasové aktivity. Buňky X33 transformované appA genem vneseným do pPICZB (bez α-faktoru a tedy by tvořily vnitrobuněČnou fytasu) nevykázaly žádné zvýšení aktivity fytasy (extracelulámí aktivita 0,2 U/ml a intracelulámí aktivity 0,05 U/mg proteinů).

Transformace buněk X33 konstruktem pPIZaA-appA (se zaváděcí sekvencí α-faktoru) vedla k tvorbě extracelulámí fytasové aktivity v médiu. Na začátku bylo sledováno 72 kolonií. Pouze dvě kolonie měly po 40 hodinách od indukce aktivitu <1 U/ml. Většina kolonií měla za 40 hodin od indukce aktivitu v rozmezí 10 až 20 U/ml. Všech 70 kolonií mělo za 118 hodin od indukce fytasovou aktivitu >80 U/ml. Nejvyšší aktivita fytasy, dosud detekovaná, byla 215 U/ml ve 192 hodině po indukci (viz tabulka 11).

Tabulka 11

Oblast extracelulámí fytasové aktivity v koloniích X33 transformovaných pPIZaA-ďpp/l 40 a 118 hodin po indukci.

Počet kolonií	40 hodin po indukci	118 hodin po indukci
2	<1 U/ml
6	1-10 U/ml
36	11-20 U/ml
28	>20 U/ml
70		80 U/ml

Aktivity fytasy a kyselé fosfatasy v transformantu, ktetý exprimuje 215 U fytasové aktivity na ml 25 byly porovnány s aktivitami divokého typu X33 (192 hodin po indukci) (viz tabulka 12). Téměř všechna exprimovaná fytasa byla sekretována z buněk, což znamená, že α-faktor byl velmi účinným signálním peptidem při sekreci fytasy.

Tabulka 12

Aktivita fytasy a kyselé fosfatasy

Divoký typ X33	pPIZoA-appA transformant
	Extracelulární U/ml	Intracelulámí U/mg bílkoviny	Extracelulámí U/ml	intracelulámí U/mg bílkoviny
Fytasa	0,05	0,03	215	0,5
Kyselá fosfatasa	0,01	0,002	5,88	0,9

-25CZ 301680 B6

Transformanty E. coli genem pro kyselou fosfatasu appA z E. coli měly intracelulámí aktivitu fytasy 5 U/mg proteinů (Ostaňin, K. et al., Overexpression, Site-Directed Mutagenesis and

Mechanism of Escherichia Coli Acid Phosphatase, J. Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992), který je zde zahrnut odkazem).

Transformant s genem PhyA v A. niger tvořil extracelulámí aktivitu 7,6 U/ml (Hartingsveldt et al., Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger, Gene 27: 87-94 (1993), který je zde zahrnut odkazem). Ve srovnání s těmito výsledky je expresní systémem fytasy v Pichia velmi účinným expresním systémem.

Příklad 14

Časová závislost exprese fytasy

Aktivita extracelulámí fytasy v médiu se zvyšovala lineárně u téměř všech selektovaných kolonií až do 192 hodin po indukci. Obrázek 18 shrnuje změny aktivit pěti kolonií v čase 24 až 163 hodin po indukci.

Příklad 15

Vliv pH média na expresi fytasy (kolonie č. 23, aktivita 136 U/ml ve 186hodině)

Byl studován vliv rozdílných pH média na tvorbu extracelulámí fytasy u transformantů. K pokusům byly použity 0,1 M fosfáty pufrovaná média. Jako kontrola bylo použito médium bez pufru (pH 7,0). V médiu pufrovaném na pH 6,0 se tvořila nej vyšší fytasová aktivita (viz obr. 19).

Příklad 16

Velikost exprimované extracelulámí fytasy

Na SDS-PAGE (12% gel) byl jasně zřetelný proužek u vzorku supematantu média kultury ino35 kulované třemi rozdílnými koloniemi (viz. obr. 20). Velikost byla okolo 55 kDa, pravděpodobně byl protein částečné glykosilovaný. Protože expresní protein reprezentoval většinu viditelných proteinů v supematantu, bylo by praktické získávat enzym bez potřeby dlouhé purifikace.

Příklad 17 pH optimum a teplotní optimum expresní extracelulámí fytasy (kolonie č. 23) pH optimum expresní fytasy bylo 2,5 až 3,5 (viz obr. 21). To je významně odlišné od obou ťytas - fytasy phyA i fytasy z A. niger (BASF) nebo od našich dalších expresních systémů. Toto pH optimum je ideální pro její funkci v podmínkách pH žaludku.

Teplotní optimum exprimovaného enzymu bylo 60 °C (viz obr. 22).

Příklad 18

Vliv expresní fytasy na hydrolýzu fytinu a uvolnění fosfátu ze sójové moučky

-26CZ dUlWU Bb

Tato overexprimovaná £. coli fytasa (kolonie č. 23) účinně hydrolyzuje fytin a uvolňuje tak fosfát ze sójové moučky (viz obr. 23). Uvolňování volného fosfátu ve směsi bylo lineární od do 800 mU fytasy / g krmivá.

Příklad 19

Vlív expresní E. coli AppA fytasy exprimované Pichia pastoris na biologickou dostupnost fytinového fosfátu u prasat odstavených od kojení io

Ke zjištění nutriční hodnoty expresní E. coli fytasy exprimované Pichia při krmení prasat byla tato nová fytasa porovnávána s přidáváním anorganického fosfátu či s komerčně dostupným mikrobiálním systémem (Natuphos™, BASF Corp., Mt. Olivě, NJ, USA). Čtyřicet osm mladých, právě od kojení odstavených prasátek, bylo vybráno mezi prasnicemi, které porodily více mláďat na Comellově výzkumné prasečí farmě (Comell Swine Research Farm). Prasátka byla odstavena v 21 dnu a krmena komerčním krmivém do 28 dne. Poté byla přendána po dvou do ohrádek a náhodně bylo mezi nimi zvoleno ošetření. Prasátka si zvykala dva týdny na kukuřično-sójovou základní stravu (tabulka 13).

-27CZ 301680 B6

Tabulka 13

Složení experimentální stravy pro prasata

Složka	tC %stravy	-C %stravy	YP %strávy	MP sstravy
Kukuřice	60,5	61,57	61,07
Syrovátkový bílkovinný koncentrát	3	3	3	3
ΞΒΜ 44%	30	30	30	30
Kukuřičný olej	3	3	3	3
Limeta	0,8	0, 93	0,93	0,93
Fosforečnan vápenatý	1,2	0	0	0
Vitamíny a minerální látky	0,5	0,5	0,5	0,5
směs ECAP	0	0	0,5	0
směs MP	0	0	0	0,5
SŮ1	0,5	0,5	0,5	0,5
CSP 250	0,5	0,5	0,3	0,5
Celkem	100	100	10O	100
CP	20,6	20, 6	20,6	20,6
Ca	0,73	0,47	0,47	0,47
^celkový	0,6	0,39	0,39	0,39

Pozn.: Všechny směsi používají kukuřici jako nosič

Doplňkové vitaminy a minerální látky: 2540 MJ (mezinárodních jednotek-IU)

Vit. A, 660 MJ Vit. D, 15 MJ Vit. E, 2,2 mg Vit K, io

3,3 mg riboflavinu, 13,2 mg kyseliny pantotheové, 17,6 mg niacinu, 110,1 mg cholinu, 1,98 pg B-12,

37,4 mg Mn, 0,6 mg I, 10 mg Cu, 0,3 mg Se, 100 mg Zn a 100 mg Fe na kg stravy.

Poté každá ohrádka dostávala jednu ze čtyř strav. Skupina „positivní kontrola“ (+C) dostávala základní stravu doplňovanou fosforečnanem vápenatým. Skupina „negativní kontrola“ (-C) dostávala pouze základní stravu. Skupina „kvasinková fosfatasa“ (YP) dostávala základní stravu doplňovanou expresní £. coli fytasou v množství 1200 U/kg krmivá. Skupina „mikrobiální fytasa“ (MP) dostávala základní stravu doplňovanou fytasou BASF v množství 1200 U/kg krmi-28CZ 301680 B6 va. Prasátka měla volný přístup k potravě a vodě. Přírůstek váhy jednotlivých prasátek byl zaznamenáván týdně. Sežrané krmivo za den u každé ohrádky bylo také zaznamenáváno. Vzorky krevní plasmy každého z prasat byly odebírány týdně ke stanovení hladiny anorganického fosfátu v krvi, V tabulce 14 jsou výsledky tělesné váhy (body weight - BW), průměrného denního prí5 růstku (average daily gain - ADG), průměrného denního příjmu (average feed intake - ADFI), poměru krmivo/prírůstek (feed/gain - F:G) a anorganického fosfátu v plasmě (plasma inorganic phosphorus - PP).

io Tabulka 14

Celkové hodnoty PP, BW, ADG, ADFI a F:G prasat v závislosti na stravě a obsahu fytasy.

	+C	-C	YP	MP
Počáteční
stav
PP	12,99	13,02	13,07	13,54
BW	11,54	11, 63	12	11,5
1. týden
PP	10,83*	6, 48c	8,59®	8,35®
3W	14	13,83	14,29	13,92
ADG	0,351	0,316	0,327	0,345
ADFI	0,700	0,684	0,697	0,697
F:G	2,04	2,20	2,13	2,13
2. týden
PP	9,76*	5,64d	8,720	7,84c
BW	18,04	17,42	17,83	17,71
ADG	0,578	0,512	0,506	0,542
ADFI	0,833	0, 855	0,784	0,837
F:G	1,46®	1, 67*	1,56“	1,55“
3. týden
PP	11*	6,26c	8,64®	8,13®
BW	22,58	21,17	22	22,21
ADG	0,649*	0,536®	0,595“	0,643“
ADFI	1,166	1, 02	1,001	1,003
F:G	1,8	1,92	1x71	1,36
4. týden
PP	10,94*	6,31c	9,65®	9,2®
BW	27,54	25,29	27,79	27,38
ADG	0,708“	0,589®	0, 827*	0,738“
ADFI	0,1,395*	1,049®	1,309*	1,273“
F:G	1,98	1,87	1,59	1,73

Čísla ve stejném řádku, která nesdílí společné písmeno jsou významně odlišná. Analýza 15 rozdílů byla provedena pomocí Bonferroniho (Dunnovým) T- testem, kde alfa=0,05 a dť=20

Ke konci čtyřtýdenního experimentu byl pozorován velký nedostatek fosfátu u skupiny negativní kontrola. U všech ostatních tří skupin nebyly pozorovány náznaky nedostatku fosfátu. Je zřejmé, že ve zlepšení biologické dostupnosti fosfátu z fytinu kukuřično-sójové moučkové stravy pro

-29CZ 301680 B6 prasata byla expresní E.coli fytasa exprimovaná Pichia stejně, ne—li více, účinná jako komerční mikrobiální fytasa. Může tedy nahradit, u od kojení odstavených prasat, doplňování stravy anorganickým fosfátem.

Příklad 20

Vliv expresní E. coli AppA fytasy exprimované v Pichia pastoris na biologickou dostupnost železa (Fe) a fytinového fosfátu u prasat odstavených od kojení io

Ke zjištění vlivu expresní £. coli fytasy exprimované Pichia na biologickou dostupnost ve stravě obsaženého, na fytin vázaného Fe, pro, od kojení odstavená, prasata, bylo vybráno dvacet anemických prasat (stáří 21 dní, 7,3 g hemoglobinu (Hb)/dl krve). Prasata byla krmena sedm dní krmivém s nedostatkem Fe a poté byla ve věku 28 dní umístěna do metabolických klecí. Poté byla ve věku 35 dní krmena experimentální stravou po dobu pěti týdnů. Experimentální strava byla následující; základní strava s nedostatkem Fe (-C, s přidaným anorganickým fosfátem), strava s dodávaným Fe (+C), strava s nedostatkem Fe a fosfátu a s expresní E. coli fytasou (YP) nebo s komerční mikrobiální fytasou (BASF, MP, USA) v množství 1200 U/kg krmivá. Týdně byly stanovovány: tělesná váha (BW), objem sedimentovaných buněk (PCV), Hb a anorganický fosfát v plasmě (PP). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 15.

-30CZ 3V1MW Bb

Tabulka 15

Celkové hodnoty PCV, Hb, BW a PP prasat v závislosti na stravě a obsahu fytasy.

	+c	-c	ΓΡ	MP
Počáteční stav pcv	25	25	26	24
Hb	7,73	7,22	7,85	7,08
BW	8,14	8,27	8,17	7,45
PP	7,92	7,76	7,21	7,36
1. týden
PCV	25	26	29	27
Hb	7,62	8,3	8,77	7,88
BW	9,44	8,84	9,63	8,57
PP	8,41	8,45	8,48	8,22
2. týden
PCV	29	26	30	28
Hb	8,6	7,34	8,93	8,27
BW	12,32	10,13	11, 91	10,84
PP	10,28*	9,0546	8,8946	8,22*
3. týden
PCV	36*	296	34*	33*
Hb	11,55*	8,26	10,84*	9, 9646
BW	16,77“	136	15, 6246	14,6246
PP	12,14*	11,3746	10,25bc	9, 71c
4. týden PCV	39	34	38	36
Hb	12,99“	10,116	12,27*	11,3546
BW	21,36’	17,37b	19,44ab	18, 5646
PP	10,19*	9,3446	9, 4946	B, 8b
5. týden
PCV	40	38	40	39
Hb	13,52*	12,246	13,64*	13,13ab
BW	26,53	22,59	24,27	23,43
PP	9,27“	8,9546	8,7946	8,02

1 Hodnoty jsou průměry kde n=5. Průměry ve stejném řádku, které nesdílejí společné písmeno v horním indexu jsou významně rozdílné (P <0,10)

E. coli fytasa overexprimovaná v Pichia byla, ve zvyšování íytinového fosfátu a využití Fe z kukuřično-sójové moučkové stravy pro od kojení odstavená prasata, přinejmenším stejně io účinná jako fytasa BASF.

Ačkoliv jsou zde hlavní body vynálezu detailně popsány a vykresleny, je těm, kteří jsou znalí oboru zřejmé, že se mohou vyskytnout různé modifikace, doplňky, náhrady apod. bez toho, aby byl opuštěn duch vynálezu a jsou tak tyto stále pokládány za část vynálezu, jak je definovaný v patentových nárocích.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   I. Způsob produkce fytasy v kvasinkách, vyznačující se tí m , že se z bakteriálních buněk izolovaný appA gen kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou exprimuje v kvasinkovém kmeni a izoluje se exprimovaný protein nebo polypeptid.

   to
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že protein nebo polypeptid s vedoucím signálním peptidem je buňkou sekretován do růstového média nebo exprimován vnitrobuněčně.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že protein nebo polypeptid je sekreto15 ván do růstového média a jeho koncentrace je vyšší než 300 jednotek/mt
4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že appA gen je sestřižen do rámce s prvkem enhanceru transkripce.

   20 5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že appA gen je nesen stabilním vektorem.

   6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že appA gen je nesen umělým chromozomem.

   7. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m , že appA gen je integrován do chromozomu kvasinkového kmene.

   8. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že kvasinkový kmen je zvolen ze sou30 boru sestávajícího z Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.

   9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že kvasinkovým kmenem je kmen Saccharomyces cerevisiae.

   35 10. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že appA gen se izoluje z Escherichia coli.

   II. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že kvasinkovým kmenem je methylotrofní kvasinkový kmen.

   12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že methy lotrofhím kvasinkovým kmenem je kmen Pichia pastoris.

   13. Protein nebo polypeptid připravitelný způsobem podle nároku 1, mající fytasovou aktivitu

   45 s optimem aktivity při teplotě v rozmezí od 57 do 65 °C a při pH v rozmezí od 2,5 do 3,5 nebo od
5. 5 do 5,5.

   14. Protein nebo polypeptid podle nároku 13, kde teplotní rozmezí optimální aktivity je od 58 do 62 °C.

   15. Protein nebo polypeptid podle nároku 13, mající fytasovou aktivitu, který si podržuje alespoň 40 % své aktivity po zahřívání po dobu 15 minut na 90 °C.

   16. Protein nebo polypeptid podle nároku 15, který si podržuje alespoň 40 až 60 % své aktivity

   55 po zahřívání po dobu 15 minut na 90 °C.

   -32CZ 301680 B6

   17. Protein nebo polypeptid podle nároku 13 mající fytasovou aktivitu, který si podržuje alespoň 60 % své aktivity po zahřívání po dobu 15 minut na 60 °C.

   18. Kvasinkový kmen obsahující appA gen izolovaný z bakteriálních buněk, přičemž tento appA

   5 gen kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou a je funkčně připojen k promotoru schopnému exprimovat fytasu v kvasince, kde uvedený protein nebo polypeptid má zvýšenou tepelnou stálost, je-li exprimován v kvasinkové hostitelské buňce ve srovnání s tímto proteinem nebo polypeptidem exprimovaným v nekvasinkové hostitelské buňce, io 19. Kvasinkový kmen podle nároku 18, kde appA gen je izolován z Escherichia coli.

   20. Kvasinkový kmen podle nároku 18 zvolený ze souboru sestávajícího z Saccharomyces, Klvyveromy-ces, Torulaspora a Schizosaccharomyces.

   15 21. Kvasinkový kmen podle nároku 20, kterým je kmen Saccharomyces cerevisiae.

   22. Kvasinkový kmen podle nároku 19, kterým je methylotroftií kvasinkový kmen.

   23. Kvasinkový kmen podle nároku 22, kde methylotrofhím kvasinkovým kmenem je kmen

   20 Pichia pastoris.

   24. Vektor obsahující appA gen izolovaný z bakteriálních buněk, který kóduje protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou; promotor funkčně připojený k tomuto appA genu, přičemž tento promotor je schopen iniciovat transkripci v kvasince; a počátek replikace schopný udržet tento

   25 vektor v buňce; přičemž tento protein nebo polypeptid má zvýšenou tepelnou stálost, je-li exprimován v kvasinkové hostitelské buňce ve srovnání s tímto proteinem nebo polypeptidem exprimovaným v nekvasinkové hostitelské buňce.

   25. Vektor podle nároku 24, který dále obsahuje selektovatelný markér.

   26. Vektor podle nároku 25, v němž je selektovatelný markér zvolen ze souboru sestávajícího z URA3, LEU2, TRPÍ, HISS, HIS4, ARG4, a genu resistence vůči antibiotikům.

   27. Vektor podle nároku 24, který dále obsahuje počátek replikace schopný replikace v bakte35 riální buňce.

   28. Vektor podle nároku 27, v němž počátek replikace je zvolen ze souboru sestávajícího CoIEI, Ori, a oriT.

   40 29. Vektor podle nároku 24, kde appA gen je izolován z Escherichia coli.

   30. Způsob konverze fytátu na inositol a anorganický fosfor, vyznačující se tím, že se z bakteriálních buněk izolovaný appA gen kódující protein nebo polypeptid s fytasovou aktivitou exprimuje v kvasinkové hostitelské buňce a exprimovaný protein nebo polypeptid s fytasovou

   45 aktivitou se kontaktuje s fytátem pro katalýzu konverze fytátu na inositol a anorganický fosfor,

   31. Způsob podle nároku 30, v y z n a č u j í c í se tim, že fytát je obsažen v potravě nebo krmivu.

   50 32. Způsob podle nároku 30, v y z n a č u j í c í se t i m, že appA gen je izolován z Escherichia coli.