DE2426988C2

DE2426988C2 - Verfahren zur Trägerbindung biologisch aktiver Proteine

Info

Publication number: DE2426988C2
Application number: DE2426988A
Authority: DE
Inventors: Dieter Dr.Phil.Nat. 8132 Tutzing Jaworek; Josef 8134 Pöcking Maier; Michael Dr.phil. 8132 Tutzing Nelböck-Hochstetter
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1974-06-04
Filing date: 1974-06-04
Publication date: 1985-02-14
Also published as: DE2426988A1; ATA339175A; CH621146A5; IT1038261B; US4038140A; JPS5112891A; FR2273816B1; FR2273816A1; GB1450519A; AT336530B; NL7506507A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bindung biologisch aktiver Proteine an einen unlöslichen Träger

durch Umsetzung wenigstens eines derartigen Proteins in wäßriger Phase mit einem aktivierten Trägermaterial.

Biologisch aktive Proteine gehören zn den aussichtsreichsten Substanzen für die Erschließung neuer und verbesserter Technologien. So gehören beispielsweise die Enzyme zu den wirksamsten und spezifischsten Katalysatoren, die eine große Anzahl technisch äußerst interessanter Umsetzungen zu katalysieren vermögen. Einem Einsatz der biologisch aktiven Proteine in technischen Verfahren steht jedoch ihr hoher Preis und ihre geringe Stabilität hindernd im Wege. Diese Nachteile lassen sich jedoch im Prinzip durch die Bindung an unlösliche Träger ganz oder teilweise beseitigen. Insbesondere ermöglicht die Trägerfixierung eine vielfache Wiederverwendung und macht daher in vielen Fällen den Einsatz der biologisch aktiven Proteine in der Technik überhaupt erst möglich. Hinzu kommt, daß in vielen Fällen auch die Stabilität der aktiven Proteine durch eine Trägerbindung erhöht werden kann.

Bekannte Trägermaterialien, die sich zur Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen gut bewährt haben, sind solche auf Polyacrylamid- und Polydextranbasis. Wegen ihrer hydrophilen Eigenschaften, den

so geringen Wechselbeziehungen zwischen Träger und Protein sowie der Möglichkeit zur Beeinflussung des Porendurchmessers des Trägers durch entsprechende Vernetzung erfüllen sie die meisten Vorausetzungen, die an einen Proteinträger gestellt werden.

Durch Variation der Matrix derartiger Träger lassen sich für spezielle Aufgaben optimale Eigenschaften erzielen. In vielen Fällen gelingt dies durch den Übergang auf Copolymerisate auf Basis von Acrylamid. So ist eine vernetzte Polyacrylamidmatrix, die als Comonomer Maleinsäure oder Derivate davon enthält, bekannt. Sie läßt sich durch Vernetzer, wie N.N'-Methylen-bis-acrylamid, gut vernetzen, da derartige Vernetzer mit Acrylamid gut copolymerisieren und die Dicarbonsäure über das cyclische Anhydridderivat durch einfaches Erhitzen leicht aktivierbar ist. Bei derartigen Copolymerisaten ist der Einfluß der nach covalenter Bindung der aktiven Proteine noch geladenen Gruppen gering, so daß auch die pH-Optima und die kinetischen Parameter der

bo Enzyme fast unverändert bleiben. Derartige Träger haben auch den Vorteil, daß Substrat und Reaktionsprodukt sowie nicht covalent gebundenes biologisch aktives Protein kaum adsorbiert werden. Ein Nachteil derartiger Träger mit einer Anhydridgruppe /ur Fixierung des Proteins besieht jedoch darin, daß mit empfindlichen aus Untereinheiten bestehenden Proteinen, insbesondere mit vielen Enzymen in manchen Fällen keine befriedigenden Aklivitäisuusbcutcn. zu geringe spezifische Aktivitäten (U/g) und auch ungenügende Stabilität des trägerge-

b', bundenen Proteins erhalten werden.

Eine andere bekannte Methode ist der mechanische Einschluß von Proteinen in vcrnei/.lcs Polyacrylamid. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist das langsame Ausbluten des Proteins aus der Gelmatrix, so daß sich dieses Verfahren nicht in breitem Umfange durchsetzen konnte. Das Ausbluten des einschlußfixierten Proteins ist

Acrylamid-Maleinsäure-Copolymer	Anhydrid	10
Polyacrylamid	mechanisch eingeschlossen	80
Polyacrylamid	Protein-Copolymerisat	500

abhängig von der Vernetzung des Trägers, der Porenstruktur, der mechanischen Belastung und der lonenstärke der verwendeten Puffer. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht jedoch darin, daß auch empfindliche, aus Untereinheiten bestehende Enzyme, wie z. B. Lactatdehydrogenase, Katalase. Hexokinase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase mit guten Aktivitätsausbeuten gebunden werden können. Auch bleiben bei einem derartigen Einschluß eines Proteins in ein vernetztes Polyacrylamidgel die kinetischen Eigenschaften des Enzyms, zumindest gegenüber niedermolekularen Substraten, weitgehend unbeeinflußt.

Eine Verbesserung der bekannten Methoden zur Trägerfixierung biologisch aktiver Proteine gelang mit der Einführung eines Zweistufenverfahrens, bei dem in erster Stufe das Protein mit einer Brückenbildnerverbindung. welche mindestens eine zur Herstellung einer Bindung mit einem Träger geeignete funktionell Gruppe und mindestens eine in wäßriger Lösung Protein-acylierende oder -alkylierende Gruppe enthält, umgesetzt und anschließend das gebildete Produkt entweder mit einem bereits vorgebildeten Träger verbunden oder als »Comonomer« in einer Polymerisationsreaktion unter Bildung des eigentlichen Trägers fixiert wurde. Dieses Verfahren der »Proteincopolymerisation« hat gegenüber dem mechanischen Einschluß von Proteinen in Träger den Vorteil, daß infolge der covalenten Bindung jedes Ausbluten vermieden wird, besonders hohe Aktivitätsbzw. Proteinausbeuten erzielt werden und die covalente Bindung in statistischer Verteilung sowohl höherer als auch kleinerer Molekulargewichte erfolgt.

Die nachstehende Tabelle zeigt am Beispiel der Enzyme Glucoseoxydase (GOD) und D-Hydroxynitril-Lyase (D-Hy-Ly), wie unterschiedliche Trägermaterialien, die alle auf Basis eines Acrylamidpolymerisats beruhen, zu ganz unterschiedlichen Aktivitätsausbeuten führen. Das Enzym-Trägerverhältnis betrug jeweils 0,033 :1 g.

Trägermaterial Art der Fixierung spez. Aktivität (U/g)

GOD D-Hy-Ly

1,3

13

Eine weitere große Gruppe von Trägern für die Bindung von biologisch aktiven Proteinen sind Polysaccharide. Sie wurden bisher im wesentlichen nach zwei Methoden eingesetzt:

1, Fixierung über aktivierte Polysaccharide und

2. Einschluß in Zellulosederivate unter gleichzeitiger Formgebung (Mikroverkapselung, Naßspinnverfahren).

Um eine covalente Bindung herstellen zu können, mußte das Polysaccharid aktiviert werden. Beispielsweise wurde Carboxymethyl-Zelluloseazid verwendet, bei dem das Protein über eine Peptidverknüpfung mit einer aktivierten Carboxylgruppe gebunden wurde. Bei Einschluß in Zellulosederivate, z. B. Zellulosetriacetat, liegen die Proteine in Vakuolen gelöst vor.

Ein Nachteil der Bindung von aktiven Proteinen an aktivierte Polysaccharide wie Zellulose, vernetztes Dextran, Agarose usw. besteht darin, daß nach vollgezogcner Proteinverknüpfung ein Teil der Gruppen hydrolysiert und somit geladen vorliegt. Diese Träger sind z. T. so stark geladen, daß die zu immobilisierenden Enzyme zum großen Teil adsorptiv festgehalten werden und das gebundene Protein in Abhängigkeit von dem polyvalenten Charakter des Trägers eine Verschiebung des pH-Optimums erfährt. Ein weiterer Nachteil ist die starke Adsorption von Substrat und Reaktionsprodukt an derartigen geladenen Trägern.

Dieser Nachteil läßt sich zwar durch die Einschlußfixierung in regenerierte Zellulosederivate beseitigen. dieses Verfahren erlaubt jedoch wegen der starken Diffusionsbehinderung nur den Einsatz relativ kleiner Substratmoleküle, und die Aktivität geht zu rasch verloren.

Aus der DE-AS 22 60 184 ist ein Verfahren zur Herstellung einer an die Oberfläche eines Trägers kovalent gebundenen biologisch aktiven, makromolekularen Verbindung bekannt, bei der zur Polymerisation befähigte Monomere, die eine biologisch aktive Verbindung tragen, mit einem Molekularsiebmaterial umgesetzt werden, dessen Poren so groß sind, daß d;is Monomere eindringen kann, nicht jedoch das angekuppelte Protein. Bei der Polymerisation entsteht dann innerhalb des Molekularsiebmaterials ein vernetztes Polymer. Das biologisch aktive Prolein, das nicht in das Mnlekularsiebmaterial eindringen kann, iv an dessen Oberfläche fixiert.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Bindung biologisch aktiver Produkte an einen unlöslichen Träger zu schaffen, welches die oben erwähnten Nachteile nicht au! weist und insbesondere auch besonders empfindliche und aus Untereinheiten bestehende Proteine mit hohen Ausbeuten zu fixieren gestattet, eine .;ute Stabilität der gebundenen Proteine liefert, hinsichtlich der mechanischen Eigenschaften anpassungsfähig ist und den Anforderungen des technischen Einsatzes entspricht.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bindung biologisch aktiver Proteine an einen unlöslichen Träger durch Umsetzen wenigstens eines derartigen Proteins in wäßriger Phase mit einem to aktivierten Träger auf Basis eines Polysaccharids, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Träger ein ohne Zusatz eines Molekularsiebmaterials hergestelltes Polysaccharidpfropl'copolymcrisat mit einem hydrophilen Pfropfcomonomer verwendet wild.

Polysaecharidpfropfpolymerisate sind bekannt. Eine zusammenfassende Behandlung ihrer Eigenschaften und ihres Chemismus findet sich in »Advances in Makromolekular Chemistry«, Vol. 2, Academic Press, London und New York, 1970. Polysaccharidpfropfpolymerisate erwiesen sich als besonders geeignete Trägermatcrialien für die Bindung der biologisch aktiven Proteine. Vorzugsweise erfolgt ihre Verwendung als Träger derart, daß die Pfropfreaktion in Gegenwart des /u bindenden biologisch aktiven Proteins erfolgt, wobei je nach den gewählten

Reaktionsbedingungen sowohl eine covalente Bindung des Proteins als auch eine reine Einschließung erfolgen kann. Mit anderen Worten wird die Pfropfcopolymerisation des hydrophilen Monomeren auf dem Basispolysaccharid in Gegenwart des zu bindenden biologisch aktiven Proteins unter gleichzeitiger Bindung desselben durchgeführt

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden Proteine, aktiviertes Polysaccharid und aufzupfropfendes hydrophiles Monomer bzw. Monomere und gegebenenfalls Vernetzer in wäßriger Phase zusammengebracht, und dann wird die Pfropfcopolymerisation durchgeführt Man erhält so einschlußfixierte biologisch aktive Proteine mit gegenüber bisher bekannten Methoden zur EinschluB-fixierung verbesserter Aktivitätsausbeute, verbesserter Stabilität und verbesserter Zugänglichkeit für Substrate.

ίο Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausiührungsform des erfindungsgemäßen "Verfahrens wird das Proi-iin zusammen mit einer Brückenbildnerverbindung, die wenigstens eine copolymerisierbare Gruppe und wenigstens eine Protein in wäßrige Lösung acylierende oder alkylierende Gruppe enthält, umgesetzt und das Umsetzungsprodukt mit dem aktivierten Polysaccharid und dem aufzupfropfenden hydrophilen Monomer bzw. Monomeren u«d gegebenenfalls Vernetzer in wäßriger Phase zusammengebracht und dann die Pfropfcopoly-

merisation durchgeführt Diese Verfahrensvariante führt zu covalent gebundenen Proteinen mit besonders hohen Aktivitätsausbeuten.

Beispiele für im Rahmen der Erfindung verwendbare biologisch aktive Proteine sind Enzyme, Enzymverbände, Protein- und Peptidhormone, Antigene, Antikörper, u. ä.

Polysaccharide, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden können, sind beispiels-

weise Stärke, Zellulose und Zellulosederivate, wie Zelluloseacetat, Zellulosebutyrat, Allylzellulose, Carboxymethylzellulose, Deoxythiozelfulose, Äthylätherzellulose, Methylätherzellulose, Hydroxyalkylätherzellulose, regenerierte Zellulose, Allylstärke, Carboxymethylstärke, Dialdehydstärke, entsprechende Dextranderivate, Polyglucoside und dgl. Eine Zusammenstellung von zur Pfropfpolymerisation geeigneten Polysacchariden und geeigneten Pfropfpolymerisationsmethoden findet sich in der oben bereits zitierten Literaturstelle »Advances in Makromolekular Chemistry«.

Die für die Pfropfpolymerisation erforderliche Aktivierung des Polysaccharids kann durch Einführung einer Doppelbindung, beispielsweise durch Reaktion mit einer bifunktionellen Verbindung, die eine copolymerisationsfähige olefinische Doppelbindung und eine mit Hydroxylgruppen reaktive Gruppe enthält, beispielsweise eine Epoxydgruppe, Episulfidgruppe, Cycloimingruppe oder Laciamgruppe, oder durch ionisierende Bestrahlung unter Bildung langlebiger Radikale erfolgen oder durch Radikalbildung an den OH-Gruppen der Stärke mit einem 1 Elektronenacceptor wie Ce^lv erfolgen. Wesentlich ist hierbei,daß die Aktivierung eine Pfropfcopolymerisation mit dem aufzupfropfenden hydrophilen Monomer und Monomerengemisch in wäßriger Phase ermöglicht. Vorzugsweise erfolgt dabei die Aktivierung durch Reaktion mit einer bifunktionellen Verbindung in der Weise, daß das Polysaccharid hierdurch wasserlöslich gemacht wird. Im Rahmen der Erfindung können jedoch auch wasserunlösliche aktivierte Polysaccharide als Grundkörper für das trägergebundene aktive Protein eingesetzt werden.

Besonders bevorzugte difunktionellc Verbindungen für die Aktivierung des Polysaccharids sind aktivierte Allylderivate wie Allylhalogenide, z. B. Allylbromid, und aktivierte Acryl- bzw. Methacrylsäurederivate, wie die Säurechloride, Anhydride, Azide u. dgl. sowie aktivierte Dicarbonsäurederivatc wie Chlormaleinsäure. Auch andere bekannte Alkylierungs- bzw. Aeylierungsmonomere können verwendet werden.

Beispiele für zur Pfropfung geeignete Comonomere sind Acrylamid, Acrylnitril, Vinylacylate wie Vinylacetat, -propionat, -phosphat, Acrylate, Methacrylate, Allylzitrat, Polyalkylenglykolacrylate und -methacrylate, N'-Vinyllactame wie N-Vinylpyrrolidon, N-substituierte Acrylamide und Methacrylamide. Vorzugsweise besitzen die Monomeren wenigstens eine Carboxyl-, Aminocarbonyl-, Sulfo- oder Sulfamoylgruppe, ganz besonders bevorzugt wird Acrylamid.

Als aufzupfropfendes Monomeres kann ein einziges hydrophiles copolymerisierbares Monomer oder eine Mischung mehrerer verwendet werden. Auch können difunktionelle Vernetzer zugesetzt werden, welche wenigstens zwei zur Copolymerisation befähigte olefinische Doppelbindungen aufweisen müssen und vorzugsweise ebenfalls hydrophil sind. Geeignete Vernetzer sind beispielsweise Diacrylate, Dimethacrylate, Diacrylamide wie Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, die entsprechenden Methacrylverbindungen u. ä.

Wie bereits erwähnt, kann das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt werden, daß zuerst das Pfropfcopolymerisation auf Basis eines Polysaccharids hergestellt und anschließend das biologisch aktive Protein hieran fixiert wird. Beispielsweise kann zur Pfropfung eine Mischung von Acrylamid oder Methacrylamid und Maleinsäure oder Äthylenmaleinsäure eingesetzt werden.

Durch Erhitzen des erhaltenen Propfpolymerisate bilden sich die Dicarbonsäureanhydride, die dann in wäßriger Lösung mit dem biologisch aktiven Protein zu kuppeln vermögen. Derartige Fixierungsmethoden sind beispielsweise beschrieben in der deutschen Auslegeschrift 19 35 711.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die bevorzugt wird, erfolgt die Pfropfcopolymerisation in Gegenwart des zu bindenden Proteins. Wie oben bereits erwähnt, kann dies unter covalenter Bindung oder unter Einschlußfixierung erfolgen.

Im Falle der Einschlußfixierung unter mechanischer Bindung des Proteins braucht lediglich eine Lösung des Proteins mit dem hydrophilen Monomer und dem aktivierten Polysaccharid hergestellt und dann die Copolymerisationsreaktion durchgeführt werden, beispielsweise durch Zugabe üblicher Radikal-bildender Starter und Beschleuniger. Durch Zusatz von Veinctzern läßt sich dabei die Porenweile des Produktes, welches sich als

b5 dreidimensionales Sieb darstellt, nach Wunsch regeln und beispielsweise der Größe des zu fixierenden Proteins b/w. der Größe seines Substrates oder seines Reaktionsprodukles anpassen. Besonders bevorzugte aktivierte Polysaccharide für diese Anwendungsweise sind die Allyläihcr, Acrylsäure-, Methacrylsäure- und Maleinsäureester von Stärke oder Dcxtranen. Es lassen sich jedoch auch andere Polysaccharide in gleicher Weise verwenden

sowie andere aktivierte Derivate, insbesondere ionisierte Polysaccharide einsetzen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Pfropfcopolymerisation nicht in Gegenwart des unmodifizicrten biologisch aktiven Proteins wie bei der vorstehend beschriebenen Ausführungsform, sondern in Gegenwart eines Proteinreaktionsproduktes mit einer Brüekenbildnerverbindung. Ein derartiger »Brückcnbildner«, auch als »Kupplungsverbindung« bezeichnet, wcisi wenigstens eine copolymcrisationsfähige olefinische Doppelbindung oder eine andere, zur Ausbildung einer covalcn· ten Bindung mit der aufgepfropften Seitenkette in wäßriger Lösung geeignete Funktion und eine in wäßriger Lösung Proteine acylierende oder alkylierendc Gruppe auf. Bevorzugte acylierende oder alkylicrende Gruppen im Sinne der Erfindung sind Epoxydgruppen, Äthylenimingruppcn, durch Unsättigung aktivierte Halogenidgruppen, Säurehalogenidgruppen, Azidgruppen, Säurchalogenidgruppcn, Aldehydgruppen, Oxazolongruppen sowie von Carboxylgruppen abgeleitete Derivate, in denen die OH-Gruppe durch eine der auf Seite 3 bis 5 der deutschen Offenlegungsschrift 22 60 185 aufgeführten Gruppen ersetzt ist.

Bevorzugte Kupplungsverbindungen sind beispielsweise Maleinsäureanhydrid und dessen Homologe, in denen die Wasserstoffatome der olefinischen Doppelbindung durch Acylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ersetzt sind, Allylhalogenide, insbesondere Allylbromid und dessen Homologe, Äcryisäurechlorid und dessen Homologe, in denen die Wasserstoffatome durch ein oder mehrere Niedrigalkylgruppen ersetzt sind, die entsprechenden Methacrylsäureverbindungen, Maleinsäure- oder Fumarsäurechlorid und deren Homologe entsprechend der obigen Definition, wie Maleinsäureanhydrid, Maleinsäureazid, Äthyleniminverbindungen wie 1-Allyloxy-3-(aziridin)-propanol-(2), Epoxyde wie 2,3-Epoxypropoxyacrylat oder -methacrylat, Vinylsulfonsäurechlorid und ähnliche.

Die erfindungsgemäß verwendeten Polysaccharidpfropfpolymerisate lassen sich zur Enzymfixierung auch nachträglich aktivieren, beispielsweise mittels Bromcyan. Auch bei dieser Ausführungsform des Verfahrens werden gegenüber den bisher bekannten ähnlichen Methoden weit überlegene Ausbeuten bzw. Aktivitäten erzielt. Beispielsweise wurde bei der Bindung des Enzyms Acylase an einem in bekannter Weise mit Bromcyan aktivierten Träger auf Polydextranbasis (Sephadex G-25) je nach der Korngröße des Trägers bei einem Verhältnis Enzym zu Träger von 1 :10 bezogen auf das Gewicht spezifische Aktivitäten zwischen 0,6 und 2.2 U/g erzielt. Wurde dort statt dessen Stärkeallyläther-Acrylamidcopolymer, welches in gleicher Weise durch Bromcyan aktiviert wurde, eingesetzt, so betrug die spezifische Aktivität 120 U/g.

Weit überlegene Eigenschaften werden auch erzielt, wenn ein aktives Protein mit einem Brückenbildnercopolyrner an das Pfropfpolymerisat auf Polysaccharidbasis gebunden wird im Vergleich zu einer Bindungsmethode, bei der vergleichbar vorgegangen wird, jedoch anstelle der Polysaccharidkomponente im Träger ein anderer Vernetzer für das Polymerisat des hydrophilen Monomeren eingesetzt wird. Allein durch diesen Austausch des »Vernetzers« aktiviertes Polysaccharid gegen üblichen difunktionellen Vernetzer ergeben sich wesentlich erhöhte Aktivitätsausbeuten und erhöhte spezifische Aktivitäten sowie verbesserte mechanische Eigenschaften.

Die nachstehende Tabelle zeigt für drei verschiedene Enzyme als biologisch aktive Proteine die erzielten Aktivitätsausbeuten und spezifischen Aktivitäten bei der Bindung an einen erfindungsgemäßen Träger und einen damit vergleichbaren auf andere Weise vernetzten Träger nach dem Zweistufenverfahren unter Einsatz eines Brückenbildners:

Enzym	Verhältnis der Comonomcre	Verhältnis	Verhältnis	Aklivi-	spez.
	im Träger	Polymer :	Enzym : Brücken	tätsaus-	Akti
		Enzym¹)	bildner³)	beute	vität
		g/g	mg/μΙ	%	U/g

D-Hydroxynitril-Lyase Acrylamid: Stärkeallyläther

aus Mandelkleie 1 : 0,33

D-Hydroxynitrii-Lyase Acrylamid : N,N'-bis²)
aus Mandelkleie

1 :0,057

Acrylamid : Stärkeallyläther

1 :0,2

Acrylamid: N,N'-bis²)

1 :0,l

Acrylamid: Stärkeallyläther

1 :2

Acrylamid: N,N'-bis²)

1 -.02

') Bezogen auf das zur Immobilisierung eingesetzte Protein. ²) N,N'-bis = N.N'-Methylen-bis-Acrylamid. '\ Als Brückenbildner wurde Äcryisäurechlorid verwendet.

Trypsi

Trypsin

Hexokinase, Hefe
Hexokinase, Hefe

1:0,23 1:0,25 1:0,125 1:0,16

75:1

75:1

1:0,05
1:0,05
1:0,25

1:1
1:1

20
10
33
14

2,5

41 27 30 12 125 46

Die verbesserten mechanischen Eigenschaften, die erfindungsgemäß erzielt werden, zeigen sich beispielsweise ;.'

in höheren Durchflußgeschwindigkeiten bei Verwendung der trägergebundenen aktiven Proteine in Säulenre- ν

aktoren. In der folgenden Tabelle werden verglichen erfindungsgemäß an Stärkeallyläther/Acrylamidcopolymcr $

gebundene Acylase mit in gleicher Weise an vernetztes Polyacrylamid gebundene Acylase. *<

;■;

Träger spez. Akt. KorngröUe Cjclbcll DurchfluBgc- ν

U/g mm 0 cm Höhe cm sehwindigkeit¹) ft'

ml/min ..·,

ίο Vernetztes Polyacrylamid 130 0,2—0,4 1 10 4 '

Stärkeallyläther/Acrylamid 138 0,2-0,4 1 10 12 _;:;

I,

') 0,5 Md.l-N-Acetylalanin.

Im erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich durch geeignete Wahl der beiden Komponenten des Trägers, also ifi

des aktivierten Polysaccharids einerseits und des Piropfcomonomers bzw. der Pfropfeomonomerrnischung nicht jg

nur das Bindungsverhalten gegenüber dem aktiven Proteins nach Wunsch »niaßschneidern«, sondern auch die ||

physikalischen Eigenschaften lassen sich in ähnlicher Weise regeln. Im allgemeinen sollte das zur Kupplung S$

verwendete Polysaccharidpfropfcopolymerisat mindestens 20 Gcw.-% aufgepfropfte hydrophile Comonomere- |i

Einheiten enthalten, um eine für die normale Handhabung ausreichend stabile Trägersubstanz zu erzielen. In >??

gewissen Sonderfällen können jedoch auch mehr als 80% Polysaccharidanteil im Pfropfcopolymerisat zulässig j|

sein, wenn besonders leicht deformierbure und weiche Produkte gewünscht werden. Vorzugsweise enthält das jg

Pfropfcopolymerisat 10 bis 70 Gew.-% Polysaccharidanteil. ||

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. , ||

I

Herstellung des aktivierten Polysaccharids i|

Beispiel 1 j|

Stärke-Allyläther ||

Ausgangsmaterial: f*

:0 g Stärke, löslich g

50 ml Aceton jf

150 ml NaOH, 5%ig p

30 ml Allylbromid §

Methode U

Die Stärke wird in 50 ml Aceton aufgeschlämmt und in die Natronlauge gigeben. Das Gemisch wird ausrei- φ

chend mit Stickstoff durchlüftet und auf 40° C geheizt £

Dann wird innerhalb von 15 min das Allylbromid zugetropft, der Ansät/ wird bis zur neutralen Reaktion g

(50 min) bei 55°C gehalten. §|

Zur Fällung der gebildeten Allylstärkc wird die Lösung auf 10°C abgekühlt und mit 1 1 Aceton versetzt. fi

Das so ausgefällte zähe Produkt wird zur Wasserentfernung unter intensivem Rühren mit einer weiteren |3

Menge von 2 χ 250 ml Aceton behandeil und anschließend getrocknet. j$

Ausbeute:42 g(trocken). $

Beispiel 2 W

|j

Stärke-Acrylestcr gs

Ausgangsmaterial: ψ

10 g Zulkowsky-Stärke, N aOH, 2 η
4 ml Acrylsäurechlorid

5 ml Aceton

Methode

Die Zulkowsky-Stärke wird in 50 ml H₂O gelöst und mit der NaOH auf pH 9 eingestellt Die Lösung wird auf
4°C gekühlt und langsam innerhalb von 10 min mit einer Lösung von Acrylsäurechlorid in 5 ml Aceton versetzt

Temperatur sowie pH werden während der Reaktion konstant gehalten. Der gebildete Stärkeacrylester wird
mit Aceton gefällt gewaschen und getrocknet

Ausbeute: 12 g.
Pfropfcopolymerisation und gleichzeitige Proteinbindung.

Beispiel 3
Mechanischer Einschluß

Ausgangsmaterial: ϊ

3 g Acrylamid
2 g Stärke-Allylälher
bOOmg Acylase, spez. Akt. 20 U/g

2 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat (Starter)

2 ml 5%iges3-Dimethylamino-propionitril (Starter) io

Methode

Acrylamid, Stärke-Allyläther und Acylase werden in 40 ml Phosphatpuffer, pH 7,5, gelöst.

Die Lösung wurde mit den Startern versetzt und mit Stickstoff durchlüftet. Nach 5 min setzt die Gelierung ein.
Das Gel wurde durch ein Sieb mit der Maschenweite von 0,4 mm gepreßt und in einer Säule mit 5 1 0.3 M 15 Kochsalzlösung eluiert.

Spez. Aktivität: 26/g.

Ausbeute: 5 g.

B e i s ρ i e I 4 :o

Protein-Copolymerisationicovalente Proteinbildung mit Brückenbildner)

Ausgangsmaterial:

6 g Acrylamid 25

2 g Stärke-Allyläther

1890 mg D-Hydroxynitril-Lyase, spez. Akt. 1 U/mg

0,1 ml Acrylsäurechlorid (Brückenbildner)

2 ml 5°/oiges Ammoniumperoxydisulfat (Starter)

2 ml 5⁰/oiges3-Dimethylaminopropionitril (Starter) 30

50 ml Phosphatpuffer pH 7,5; 0,2 M

Methode

Acrylamid und Stärke-Allyläther werden in 15 ml Phosphatpuffer gelöst (Lösung 1).

Die Hydroxynitril-Lyase wird in 35 ml Phosphatpuffer gelöst, auf 4^UC abgekühlt und mil einer ebenfalls 35 gekühlten Lösung des Acrylsäurechlorids in 5 ml Äther versetzt. Das Gemisch wird 30 min intensiv gerührt und
anschließend zu Lösung 1 gegeben. Es wird mit Stickstoff durchlüftet, bis der größte Teil des Äthers entfernt ist.

Dann werden die Starterlösungen zugesetzt. Nach ca. 5 min beginnt der Ansatz zu erstarren.

Nachdem das Polymerisat mindestens 3 Stunden gestanden hat. wird es durch ein Sieb mit der Maschenweite
0.4 mm gepreßt und in einer Säule mit 5 I gepufferter Kochsalzlösung 0,5 M eluiert. 40

Ausbeute: 8,4 g.

Spez. Aktivität:41 U/g(Lyophilisat) = ca. 345 LJ = 18% Aktivilätsausbeute.

Vergleichsbeispiel 5

45 Protein-Copolymerisation

Ausgangsmaterial:

7.5 g Acrylamid

0,4 g Ν,Ν'-Methylen-bis-aerylamid 50

',890 mg HydrcxynitrU-Lyase. spez. Akt. 1 U/mg

0,1 ml Acryliäurechlorid

2 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat (Starter)

2 ml 5%iges3-Dimethylamino-propionitril (Starter)

45 ml Phosphatpuffer pH 7,5; 0,2 M. 55

Methode

Acrylamid und Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid wurden in 10 ml Phosphatpuffer gelöst

Die Hydroxynitril-Lyase wird in 35 ml Phosphatpuffer gelöst, auf 4°C abgekühlt und mit einer ebenfalls 60 gekühlten Lösung des Acrylsäurechlorids in 5 ml Äther versetzt Das Gemisch wird 30 min intensiv gerührt und
anschließend zu Lösung I gegeben.

Es wird mit Stickstoff durchlüftet bis der größte Teil des Äthers entfernt ist Dann werden die Starterlösungen
zugesetzt Nach ca. 5 min beginnt der Ansatz zu erstarren.

Nachdem das Polymerisat mindestens 3 Stunden gestanden hat wird es durch ein Sieb mit der Maschenweite b5 0,4 mm gepreßt und in einer Säule mit 5 I gepufferter NaCl-Lösung, 0,5 M, cluiert

Ausbeute: 83 g-

Spez. Aktivität: 27 U/g(Lyophilisat) = 230 U = 12%.

Beispiel 6
Protein-Copolymerisation

5 Ausgangsmaterial:

8 g Acrylamid

1,6 g Stärke-Allyläther

1200 mg Trypsin (Schweinepancrciis)

0,3 ml Acrylsäurechlorid
ίο 1,5 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat (Starler)

1,5 ml 5%iges3-Dimethylaminopropionitril (Starter)

40ml Phosphatpuffer pH 8,7; 0,4 M

Methode

Acrylamid und Stärke-Allyläther werden in 60 ml H2O gelöst (Lösung I).

Das Trypsin wird im Phosphatpuffer geiöst, auf4⁼C abgekühlt und mit einer ebenfalls gekühlten Lösung des Acrylsäurechlorids in 40 ml Äther versetzt. Das Gemisch wird 30 min intensiv gerührt und anschließend zu Lösung 1 gegeben.

20 Es wird mit Stickstoff durchlüftet, wobei der größte Teil des Äthers entfernt wird. Dann werden die Starterlösungen zugesetzt. Nach 15 min beginnt der Ansatz zu erstarren.

Nachdem das Polymerisat mindestens 3 Stunden gestanden hat, wird es durch ein Sieb mit der Maschenweite 0,4 mm gepreßt und mit 5 !gepufferter 0,5 M NaCI-Lösungeluieri.

Ausbeute: 8,2 g.
25 Spez. Aktivität: 30 U/g(Lyophilisat)246 U = 41% Ausbeute.

Vergleichsbeispiel 7

Protein-Copolymerisation 30

Ausgangsmaterial:

500 mg Trypsin, spez. Akt. 0,5 U/mg
3 g Acrylamid

0,3 g N,N'-Methylen-bis-Acrylamid
35 0,1 ml Acrylsäurechlorid

0,5 ml 5°/oiges 3-Dimethylamino-propionitril (Starter)
0.5 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat (Starter)

Methode

Das Trypsin wird in 10 ml 1 M Triäihanolaminpuffer, pH 8,5, gelöst, auf 10⁰C gekühlt und mit Stickstoff behandelt. Unter Rühren wird das Acrylsäurechlorid, gelöst in 5 ml Äther, zugegeben und eine halbe Stunde weitergerührt.

Anschließend werden Acrylamid und Ν,Ν'-Methylen-bis-Acrylamid, gelöst in 10 ml Wasser, sowie Starter Λ5 zum Reaklionsansatz gegeben. Die Lösung erstarrt zu einem Gelbrei, der nach Stehenlassen über Nacht durch ein Metallsieb mit 0,4 mm Maschenweitc gedrückt wird.

Das Granulat wird in eine Säule überführt und mit 3 I 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,5. eluiert und anschließend lyophilisiert.

Ausbeute: 3 g.
50 Spez. Aktivität: 12 U/g.

Aktivitätsausbeute: 14%.

	Ausgangsmaterial:	Stärke-Allyläther
	2g	Acrylamid
Beispiel 8	ig	Hexokinase
Protein-Copolymerisation	40 mg	Glucose
10 mg	Acrylsäurechlorid
0,04 ml	5%iges 3- Dimethylaminopropionitril
0,5 ml	5%igcs Ammoniumperoxydisulfat
0.5 ml

Methode

Wie in Beispiel 4 beschrieben. Ausbeute: 2,5 g(Lyophilisat). Spez. Aktivität: 80 U/g. Aktivitätsausbeutc: 3,6%.

Verglcichsbeispiel 9
Protein-Copolymerisation to

Ausgangsmaterial:	Acrylamid
3g	Ν,Ν'-Methylen-bis-Acrylamid
0.15 g	Hexokinase, spez. Akt. 140 U/mg
40 mg	Glucose
10 mg	Acrylsäurechlorid
0,04 ml	5%iges3-Dimethylaminopropionitril
0,5 ml	5%iges Ammoniumperoxydisulfat
0,5 ml

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Methode

Die Hexokinase wird abzentrifugieri, mit der Glucose und 10 ml 0,3 M Triäthanolamin-Puffer, pH 8,0, aufgenommen, auf 10° C gekühlt und mit Stickstoff begast.

Das Acrylsäurechlorid wird in 5 ml kaltem Äther gelöst und unter Rührer, langsam zugetropft. Nach einer Inkubationszeit von ca. 30 min werden Acrylamid und Ν,Ν'-Methylen-bis-Acrylamid, gelöst in JOmI 0,3 M Triäthanolamin-Puffer, pH 8,0, zugegeben und die Polymerisation durch Zugabe der Katalysatoren gestartet. Nach Auspolyrnerisieren über Nacht wird das Gel durch ein Metallsieb mit 0.4 mm Maschenweite gedrückt, in eine Säule überführt und mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,5, eluiert und anschließend lyophilisiert.

Ausbeute: 2,5 g (Lyophilisat).

Spez. Aktivität: 45 U/g.

Aktivitätsausbeute: 2%.

Beispiel 10

35

Protein-Copolymerisation

Ausgangsmaterial:

600 mg Acylase 1, Schweinenieren, spez. Akt. 18 U/mg

3,5 g Acylamid

1,5 g Stärke- Allyläther

44 ml TRIS-Puffer, pH 6,7,0,3 M

0,02 g CoCl₂

0,8 ml Allyloxy-(3-Aziridin-propanol-2)

3,5 ml 5%iges Ammoniumperoxydisulfat

3,5 ml 5⁰/oiges3-Dimcthylaminopropionitril

Methode

In 24 ml TRIS-Puffer werden Acrylamid, Stärke-Allyläther und CoCl₂ gelöst (Lösung I). so

Die Acylase wird in 20 ml TRIS-Puffer gelöst und auf 4°C abgekühlt. Dazu wird innerhalb 10 min das Allyloxy-(3-Aziridinpropanol-2) zugetropft. Nach 30 min Rührzeit wird die Lösung I zu dieser Lösung gegeben. Nach Zugabe der Starterlösungen wird mit Stickstoff durchlüftet. Der Polymerisationsvorgang setzt nach ca. 5 min ein. Das Gel wird nach mehrstündigem Stehen durch ein Sieb (0,4 rnm Maschenweite) gepreßt und mit 3 I 0.3 M NaCI-Lösung (gepuffert pH 7) ir> einer Säule eluiert.

Spez.Aktivität:138U/g.

Korngröße: 0,2—0,4 mm.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bindung biologisch aktiver Proteine an einen unlöslichen Träger durch Umsetzung wenigstens eines derartigen Proteins in wäßriger Phase mit einem aktivierten Träger auf Basis eines Polysac-

charids, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger ein ohne Zusatz eines Molekularsiebmaterials hergestellten Polysaccharid-Pfropfcopolymerisat mit einem hydrophilen Pfropfcomonomer verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pfropf copolymerisation des hydrophilen Monomeren auf dem Polysaccharid in Gegenwart des Proteins unter gleichzeitiger Bindung desselben durchgeführt wird.

ίο 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Protein, aktiviertes Polysaccharid und aufzupfropfendes hydrophiles Monomer bzw. Monomergemisch und Vernetzer in wäßriger Phase zusammengebracht und dann die Pfropfcopolymerisation durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Protein und eine Brückenbildnerverbindung mit einer Protein in wäßriger Lösung acylierenden oder alkylierenden Gruppe und einer copolymerisierbaren Gruppe umgesetzt und das Umsetzungsprodukt mit dem aktivierten Polysaccharid und dem aufzupfropfenden hydrophilen Monomer bzw. dem Monomerengemisch und gegebenenfalls Vernetzer in wäßriger Phase zusammengebracht und dann die Pfropfcopolymerisation durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polysaccharid-Pfropfcopolymerisat verwendet wird, das unter Verwendung einer Comonomerenmischung erhalten wurde, welche einen kleineren Anteil eines zur direkten Bindung mit einem Prolein befähigten Monomeren, wie eines Dicarbonsäureanhydrids, enthielt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polysaccharid-Pfropfcopolymerisat verwendet wird, welches nachträglich aktiviert wurde unter Einführung einer zur Proteinbindung befähigten Gruppe.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als aktiviertes Polysaccharid ein Polysaccharid-Allylether, Polysaccharid-Acrylsäure- oder — Methacrylsäureester oder —

Maleinsäurehalbester verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Polysaccharid

Stärke oder ein Zellulosederivat verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polysaccharid-Pfropfcopolymerisat verwendet wird, dessen hydrophiles gepfropftes Comonomer ganz oder überwiegend aus Acrylamid besteht.