JPS5931799A - Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｂ型肝炎ウィルスの遺伝子を組込んだ＃１換
えプラスミド、それにより形質転換を行なった酵母およ
びそれを用いたＢ型肝炎ウィルス表面抗原の製法に関す
る。さらに詳しくは、大腸菌および酵母の両方で増殖し
うる、いわゆるシャトルベクターを用い、そのベクター
に担われた抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域
（以下、酸性ホスファターゼプロモーターまだは酸性ホ
スファターゼ遺伝子という）の下流に、Ｂ型肝炎ウィル
ス（以下、ＨＢＶと略す）の表面抗原（以下、ＨＢｓ抗
原またはＨＢ　ｓ　Ａ　ｇという。単にＳ抗原と略すこ
ともある）の遺伝子を組込んだ組換えプラスミドを得、
これを酵母に与えて形質転換を起こさせて形質転換酵母
とし、この酵母を酸性ホスファターゼプロモーターが抑
制されない条件下に培養させて産生される免疫学的に活
性なＨＢｓ抗原（Ｉ（Ｂ　ｓＡｇ　）を得る方法である
。

Ｂ型ウィルス肝炎は、ＨＢＶ陽性者の血液の輸血その他
の原因によって感染する疾患であって、完全な治療薬が
なく、一度罹患するとその完全治癒が困難であり、その
予防には、ＨＢｓＡｇからなるワクチンが最も有効であ
ると考えられている。

しかしながら、ＨＢ　Ｖはヒトやチンパンジーにのみ感
染し、培養細胞への感染の試みは成功していない。この
よりなＨＢＶの特殊性によシ、そのようなＨＢｓＡｇは
主として人血清に求めざるを得ない。ソノため、ＨＢｓ
Ａｇワクチンの量産に問題がある。

最近、Ｉ−（ＢｓＡｇをヒト血清によらず、組換えＤＮ
Ａを用いて大腸菌に作らせることが提案されているが（
例えば特開昭５５−１０４８８７号）、大腸菌による場
合には、生じだＳ抗原が大腸菌内で壊れ易いとかそのＳ
抗原によって大腸菌の増殖が困難であるなどの欠点を有
するためＨＢｓＡｇの産生量が低く、所望のＨＢｓＡｇ
の大量生産には、かたらずしも適当でない。

また、ごく最近において、酵母によるＨＢｓ抗原粒子の
産生に成功したことが報告されている〔Ｎａｔｕｒｅ、
２９８巻、３４７〜３５０頁（２２Ｊｕｌｙ１９８２）
を参照〕。この文献によれば、インターフェロンの酵母
による産生に使用されているアルコールデヒドロゲナー
ゼ（ＡＤＨｌ　）のプロモーターを利用し、大腸菌−酵
母シャトルベタターの該ＡＤＨ１プロモーターの下流に
ＨＢｓ蛋白をコードする遺伝子を接続する方法が採用さ
れているが、この方法では産生されるＨＢｓ蛋白の量が
低く、所望のＨＢｓ抗原の量産にはかならずしも充分で
ないものと認められる。

このような事情のもとに、本発明者らは酵母によるＨＢ
ｓＡｇの量産について検討を重ねた結果、酵母の遺伝子
と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制性酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子を担った特定のプラスミドベクターに、
該ホスファターゼプロモーターの制御下にＨＢｓ抗原遺
伝子を組込んだ新しい組換えＤＮＡを調製し、それによ
って酵母を形質転換させ、かかる形質転換酵母を用いて
ヒト由来のＨＢｓＡｇと同じ免疫学的活性を有する■３
ｓＡｇを量産させることに成功し、本発明を完成するに
至った。

すなわち、本発明は　ＨＢｓ抗原遺伝子を組込んだ新規
な組換えプラスミド、それによる形質転換酵母および該
酵母によるＨＢｓＡｇの生産方法を提供するものである
。

本発明の組換えプラスミドは、大腸菌および酵母の両方
の遺伝子を備え、それらのいずれでも増殖しうるシャト
ルベクターを用い、そのベクターに担われた酸性ホスフ
ァターゼプロモーターの下流において、酸性ホスファタ
ーゼ構造遺伝子の一部または全部もしくはさらにその上
流の一定部位までを除去したのちにＨＢｓ抗原遺云子を
組み込んで得られる。このようにして得られるＨＢｓ遺
伝子発現プラスミドを常法により酵母に作用させて形質
転換を起こさせることによシ所望の形質転換酵母が得ら
れる。この形質転換酵母を、好ましくは酸性ホスファタ
ーゼプロモーターが抑制されない条件下に培養すること
により所望のＨＢｓＡｇが量産される。

以下に本発明の組み換えプラスミド、形質転換酵母菌、
およびそれによるＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇの生産についてさ
らに詳細に説明する。

（１）ＨＢＶ遺伝子 本発明で用いられるシャトルベクターに組み込むだめの
ＨＢＶ遺伝子は、大腸菌によりクローニングされたＨＢ
ＶＤＮＡで、ことに日本および他の東南アジアなどで多
く見られるＨ　Ｂ　Ｖサブタイプａｄｒのものであシ、
制限酵素ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩ認識部位を各々１個
有する。とのＨＢＶＤＮＡは通常制限酵素Ｘｈｏ：［ま
たはＢ　ａ　ｍ　ＨＩで処理してＨＢＶ遺伝子を含んだ
フラグメントとして組込みに供される。このフラグメン
トは、例えば制限酵素Ｘｈｏｌで処理して得られるＸｈ
ｏ■認識部位を末端とするものは、第１図に示すような
構造を有し、ＨＢｓ遺伝子とＨＢｃ　遺伝子とを対応さ
せた構造である。

第１図に示すように、Ｘｈｏｌ：で切断された５′末端
より２８番目のヌクレオチドからＨＢｓ遺伝子が開始し
、アミノ酸２２６個に相当する遺伝子があり、さらにそ
の下流にＨＢｃ遺伝子が同じ向きに存在する。また、こ
のフラグメントをさらにＢａｍＨＩで処理すると、Ｉ（
ＢＶＤＮＡ（３，２Ｋｂ）はＨＢｓ遺伝子を含むフラグ
メント（約１，３Ｋｂ）とＨＢｃ遺伝子を含むフラグメ
ント（約１，９Ｋｂ）の２つに分かれる。このＨＢｓ遺
伝子の塩基配列は本発明者らによシ決定され、第２図に
示すような配列を有する（欧米型のサブタイプａｄｗな
どについてはすでに構造が知られている：　下記文献を
参照）。なお、これらＨＢｓ、ＨＢｃ両遺伝子とも介在
配列はもたない。第２図に示すものは、Ｓ抗原決定領域
のヌクレオチド配列（最上段）とそれによりコードされ
るアミノ酸配列（第２段）を示し、ヌクレオチド配列の
上に付けた数字はＳ抗原のＮ端からのアミノ酸の個数を
示す。なお、その下段Ａ、Ｉｉ、Ｃ欄はそれぞれａ　ｄ
　／ｙ　ｗタイプ（ＰｏｏＣｋらの解析：Ｎａｔｕｒｅ
、２Ｂ２．５７５〜５７９．１９７９）、ａｄｗタイプ
（Ｖａｌ　ｅｎｚｕｃｌ　ａ　らの解析：　Ｎａｔｕｒ
ｅ　。

主８０．８１５〜８１９．１９７９）およびａｙｗタイ
プ（Ｃｈａｒｎａｙらの解析：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７６　、２２２２〜２２２６
　、１９７９〕のデータである。

このＨＢＶＤＮＡはつぎのようにして調製される。

まずＨＢｓ抗原保有のヒト血液中に含まれるウィルス粒
子〔ディン（Ｄａｎｅ）粒子〕を常法にょシ分離する。

但し、このＨＢＶＤＮＡは３，２００ｂｐを有する環状
２本鎖構造をとっているが、ＤＮＡ全体の１５〜５０％
の領域は１本鎖であり遺伝子クローニング用に２本鎖と
するために、サトラーおよびロヒンソンノ方法（Ｆ、５
ａｔｔｌｅｒ　ｇｅ　Ｗ、Ｓ　。

Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、　　３２　。

２２６〜２３３（１９７９）、’Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　
Ｂｖｉｒａｌ　ＤＮＡ　　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｈａｖ
ｅ　ｃｏｈｅｓｉｖｅｅｎｄｓ　’　　を参照）によ、
ｊｌ）１本鎖部分をＨＢＶに含−まれるエントゲナスＤ
ＮＡポリメラーゼを利用して２本鎖に修復したのちＤＮ
Ａを抽出し、これを大腸菌によりクローニングして増幅
したのち、通常は適当な制限酵素で処理して所定のフラ
グメントとして、後述のプラスミド構築に供する。

なお、本発明において用いられるＩ−Ｔ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　
Ｎ　Ａは前述したとおり日本などで多く見られるＩ−Ｉ
　Ｂ　Ｖザブタイプａｄｒがとくに好ましいが、欧米に
おいて多く見られるＨ　Ｂ　Ｖサブタイプａｄｗなども
同様に用いられうる。

（２）シャトルベクタ一 本発明で用いられるシャトルベクターは、酵母の遺伝子
と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制性酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子を担ったプラスミドベクターである。

この酵母の遺云子としては、一般に、プラスミドが酵母
中で染色体と独立して増殖するのに必要なりＮＡ配列、
例えば酵母の自律増殖に必要なりＮＡ配列（ａｒｓｌ）
と２　μｍ　Ｄ　Ｎ　Ａの複製に必要なりＮＡ配列（２
μｏｒｉ）があり、所望によシ、さらに形質転換酵母の
選択マーカーとなる遺伝子が含まれる。この選択マーカ
ーとしては、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生遺伝
子、トリプトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子、
アデニン産生遺伝子などが含まれ、これらの１種または
２種以」二が用いられる。

大腸菌側の遺伝子としては大腸菌体内においてプラスミ
ドが増殖するために必要々ＤＮＡ配列、例えばＣｏ１Ｅ
Ｉ糸のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好捷
しくけさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺伝
子を含む。この選択マーカーの遺伝子としてはアンピシ
リン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイ
クリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子な
どが挙げられ、これらの遺伝子の１種まだは２種以上が
用いられる。このような大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａとしてアンピ
シリン耐性遺伝子とテトラサイクリン産生遺伝子を有す
るｐＢＲ３２２が一般に汎用されている。

本発明で用いるシャトルベクターは酵母の抑制性酸性ホ
スファターゼプロモーターを担っていることが特徴であ
り、この酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスフ
ァターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリペプチ
ド（ｐ６０）のプロモーターである。

このようなシャトルベクターの代表的な例は、本発明者
らにより調製された、酵母側の遺伝子としてａｒｓｌ、
２μｏｒｉ　およびロイシン耐性遺伝子（Ｌｅｕ２）を
有する酵母ＤＮＡと大腸菌プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２
とを組合せだシャトルベクターＰＡ丁７７であり、これ
はつぎのようにして構築される。

酵母５２８８　ＣＤＮＡパンクより得られた抑制性酸性
ホスファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリ
ペプチド（ｐ６０）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオ
チド対（８Ｋｂ）の制限酵素Ｅｃ。

ＲＩ断片（ＰＮＡＳ、　７７巻、６５４１〜６５４５頁
、１９８０およびＰＮＡＳ、７．９巻、２１５７〜２１
６１頁、１９８２を参照）を公知の大腸菌プラスミドｐ
ＢＢ、３２２　（５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、Ｇ、、　Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍ　、　４３巻、７７〜９０頁、１９７９を参照）の
ＥｃｏＲＩ部位に挿入して得られるプラスミドを出発材
料とする。々おとの８Ｋｌ）ＤＮＡ断片は制限酵素５ａ
ｌｌ：の認識部位を約２．８に＋）と約５ＪＫｂに分け
る位置に１個所有し、２．８Ｋｂ側がｐＢＲ３２２のア
ンピシリン耐性遺伝子側になるように挿入されている。

このプラスミドを制限酵素５ａｉｌ：で切断し、さらに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてＰＢＲ３２
２のＳａｌ、ｌ：部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断
片の５．２ｘｂ側を失なったプラスミドを得、これをＰ
Ａ、Ｔ２５と称する。このＰＡＴ２５はＰＢＲ３２２の
アンピシリン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲ１部位からＳａ
ｌ１部位までの約３．７Ｋｂの断片と酵母の酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子のＥｃ。

ＲＩ部位から５ａｌＩ部位までの約２．３に、ｂの断片
がそれぞれ対応する末端同士で結合したプラスミドであ
る。

つぎに、上記ＰＡＴ２５のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ部位に、酵
母の自律増殖に必要なりＮＡ配列（ａｒｓｌ）および酵
母のＴｒｐｌ遺伝子を含む１，４ＫｂのＥ　ｃ　ｏ　Ｒ
Ｉ断片（ｐＮＡＳ、７６巻、１０３５〜１０３９頁、１
９７９を参照）を挿入する。得られたプラスミドをｐ　
Ａ　Ｔ　２６ど称する。なおこのａｒｓｌ−Ｔｒｐｌを
含む断片は、そのＴ　ｒ　ｐ　］遺伝子内に制限酵素Ｔ
ｌ１ｎｄｌｆｆの認識部位を１個所有する。

」二記１）　Ａ　Ｔ　２６のＴｌｌｎｄｌｌＴ部位ニ酵
母ノロイシン産生遺伝子（Ｌｅｕ２）と２７１．ｍ　Ｄ
　Ｎ　Ａの複製に必要−４ＤＮＡ配列（２１Ｌｏｒｉ）
を含むＨｉｎｄ■断片（Ｔｏｈｅ　、Ａ、　、Ｃ；ｕｅ
ｒｒｙ　、　Ｐ、、Ｗｉ　ｃｈｅｎｅｒ　、Ｒ，Ｂ。；
Ｊ。

Ｂａｃｈｔｅｒｉｏｌ、１４１．４１３〜４　］　６　
、１９８０を参照）を挿入する。このようにして得られ
るプラスミドがシャトルベクターｐＡＴ７７である。

このＰＡＴ７７およびのちに説明するようにそれから誘
導されるＰＡ、Ｍ８２の構造は第３図に示すとおりであ
って、太線部分は大腸菌プラスミドＴ）ＢＲ３２２由来
の遺伝子、残部は酵母菌の遺伝子である。すなわち、こ
のｐＡＴ７７は、大腸菌の遺伝子としてＰＢＲ３２２の
アンピシリン耐性遺伝子（Ａ、ｐｒ）を含むＥｃｏＲＩ
部位から５ａｌＪ：部位までを有し、一方酵母の遺伝子
として、ｐＢＲ３２２と結合したＥｃｏＲＩ部位よりａ
ｒｓｌ、２μｏｒｉ、Ｌｅｕ２遺伝子の順に位置し、さ
らにそのつぎに酸性ホスファターゼ遺伝子の上流から５
ａｌＪ部位までを有する。そしてそのＥｃｏＲＩおよび
Ｓａ１丁部位でこれら大腸菌遺伝子と酵母遺伝子が結合
した構造となっている。このｐＡ、Ｔ７７は大腸菌内に
おいてはＰＢＲ３２２により増殖し、また酵母内におい
てはａＴｓｌおよび２μｏｒｉにより増殖可能となる。

さらにこのプラスミドによる形質転換体の選択マーカー
として大腸菌側にアンピシリン耐性遺伝子（Ａ、ｐｒ）
を、酵母菌側にはロイシン産生遺伝子（Ｌｅｕ２）を有
しており、シャトルベクターとしての条件を充分に満た
している。

なお、このシャトルベクターを用いるのは、後記組換え
プラスミドを大腸菌を用いて調製するだめであり、該組
換えプラスミドで酵母を形質転換する段階に至っては、
大腸菌の遺伝子は除去されても間頌はない。

とのシャトルベクターｐＡＴ７７の酸性ホスファターゼ
プロモーター付近の遺伝子地図は第４図に示すとおりで
あり、ここに示されるＢｓｔＥ■−８ａｌｌ：領域の塩
基配列は本発明者らにより決定されており、第５図に示
すよう々配列である。第４図および第５図示されるＡＴ
Ｇコドン（メチオニン）が酸性ホスファターゼの開始コ
ドンである。

つマリ、このベクターの抑制性酸性ホスファターゼ遺伝
子断片（約２．８Ｋｂ）には、構造遺伝子の約２、７　
Ｋｂ上流から構造遺伝子８２ヌクレオチド対（８２ｂｐ
）までが含まれる。

このようなシャトルベクターｐＡＴ７７を公知の制限酵
素５ａｌＩで処理して開裂させ、ついでこれをエキソヌ
クレアーゼＢＡＬ３１で処理することにより第４図およ
び第５図に示す酸性ホスファターゼ構造遺伝子一部また
は全部と、所望によシさらにその上流の種々の部分壕で
除去する。この除去は酸性ホスファターゼプロモーター
領域と思われるＴ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ、　（Ｈｏ
ｇｎｅｓ　ｓ　ｂｏｘ）すなわち＝１．００ｂｐＯ前ま
での適当な部位まで行なわれ、エキソヌクレアーゼ処理
条件により適宜調節されるが、通常＋１〜−１００　ｂ
ｐ　、好ましくは＋１〜−５０　ｂｐまでである。この
際、除去が上流まで行きすぎると酸性ホスファターゼプ
ロモータノ制御が困難となり、形質転換酵母菌の培養の
際、所望のＨＢｓＡｇの収量が低下する。一方、除去が
不充分で酸性ホスファターゼ構造遺伝子が一部残存する
と産生されるＨＢｓ抗原がホスファターゼペプチドと合
いの子となるため好ましくない。

上記のようにして酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部
または全部もしくはさらにその上流部分を除去したのち
、この部位に合成または天然のリンカ−１例えば５ａｉ
ｌニリンカーまたはＸｈｏｌニリンカーを組込み再び環
状プラスミドに戻すことにより、酸性ホスファターゼプ
ロモーターの制御下に外来性遺伝子を純粋な形で発現さ
せ得るシャトルベクターが得られる。このシャトルベク
ターは、通常の制限酵素５ａｉｌ：またはＸ１１ｏＩで
処理することにより容易にその組込み部位を開裂させる
ことができるだめ、所望の遺伝子を組込むのに好適であ
る。

（３）　　ＨＢｓ遺伝子発現プラスミドの構築本発明の
組換えプラスミド、すなわちＨＢｓ遺伝子を組込んだプ
ラスミドの調整は、まず前記シャトルベクターを使用し
たリンカ−に対応する制限酵素、例えばＳａｌ　Ｊまた
はＸｈｏ工にて処理して開裂させ、これに上記ＨＢＶＤ
ＮＡを作用させて連結させる。これを大腸菌にて増幅し
、各種制限酵素分析によって正しい配位に組込まれたも
ののみを選択し、目的とする組換えプラスミドを得る。

（４）酵母の形質転換 形質転換されるべき酵母としては、プラスミドで担われ
た形質転換酵母の選択マーカー遺伝子によって相補され
る変異を持った変異株、例えばロイシン要求性変異株で
あるサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２ａ　Ｉｅ
ｕ　２　ｈｉｓ４　Ｃａｎ１（Ｃｔｒ　　）を用いる。

上記組換えプラスミドを大腸菌にて増題させたのち、該
酵母変異株に常法により作用させ、例えばスフェロプラ
スト化したのちカルシウム処理した菌体とプラスミドＤ
ＮＡを混合して形質転換を起させる。このように処理さ
れた酵母をベクター上に担われている宿主酵母の変異を
相補する遺伝子、例えばロイシン産生遺伝子の発現を指
標として形質転換酵母を選択し、分離する。

なお、酵母としてはロイシン要求性変異株のほかに、ヒ
スチジン要求性変異株、トリプトファン要求性変異株、
ウラシル要求性変異株、アデニン要求性変異株などが挙
げられる。

（５）形質転換酵母の培養およびＨＢｓＡｇの生産上記
の方法で得られた形質転換酵母をリン酸を含む培地にて
通常の培養条件下に前培養し、対数増殖期にある菌体を
リン酸を含まない培地に移しかえて酸性ホスファターゼ
プロモーターが抑制されない条件下に培養する。培養後
、常法によシ集菌し、溶菌処理し、所望のＨＢｓＡｇを
多量に含む溶菌液を得る。

なお、用いる酵母の種類により、例えばＰｈ。

８０変異株を用いた場合には、酸性ホスファターゼプロ
モーターを抑制しない条件をとくに採用する必要はなく
、該形質転換酵母を直接培養して所望のｉ（ＢｓＡｇを
多量に産生させることができる。

上記方法で得られるＨＢｓＡｇは免疫学的にヒト血清か
ら得られるものと全く同一であり、ヒト血清によるもの
と同様にしてＨＢ　Ｖ用ワクチンとして有用である。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例 α）ＨＢＶＤＮＡの調製 （１）ウィルスＤＮＡの調製 ＨＢｓＡｇ陽性かつＨＢｅＡｇ陽性の供血者（血清型ａ
ｄｒ）からのヒト血漿１０人分のプール７００ｍ１を５
．Ｑ　Ｑ　Ｑ　ｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を
除去する。これを４°Ｃにて１８．００　Ｏｒｐｍで８
時間遠心分離し、得られた沈査を緩衝液（１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、Ｑ、ｌ　ＭＮａＣｌ、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ
ＨｐＨ７，５）　１０−に再溶解させ、３０％の蔗糖を
含有する遠沈管の頂部に重層させる。これを４°Ｃにて
３９．００　Ｏｒｐｍで４時間遠心分離し、得られだ沈
査を上記と同じ緩衝液に再溶解させる。

ついで、のちの操作を容易にするために、ＨＢＶのもつ
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７ｍＭ）　リス−
ＨＣｌ　（ｐｉ４　７．５　）、８Ｑ　ｒｎ　Ｍ　ＮＨ
，ｉ　ＣＩ　　、２５　ｍ　Ｍ　Ｍｇ　Ｃｌ　２．０．
５％（ｗ／ｖ％、以下同じ）タージトールＮＰ−４Ｑ、
０．１％２−メルカプトエタノール、３３０μＭのｄｃ
ＴＰ（デオキシシチジントリホスフェート）、ｄＧＴＰ
（デオキシグアノシントリホスフェ−）　）、ｄＡＴＰ
　（デオキシアデノシントリホスフェート）、０．５μ
Ｍα−〔”２Ｐ′３　ｄＴＴＰ　（デオキシチアミント
リホスフェート）の混合液５００ＰＡ中で３７°Ｃにて
３０分間行なう。これにさらにｄＴＴＰを最終濃度３３
０μＭになるように加え、３７°Ｃで３時間反応させ、
これに同容量のｌ　Ｑ　Ｑ　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ溶液を加
える。このＤＮＡポリメラーゼ反応により、ＤＮＡ中の
一本鎖部分が修複され、ＣＰ）ラベル化された材料を得
、これを蔗糖の３０％、２０％および１０％水溶液を段
階的に重層した遠心管の頂部に重層し、４°Ｃにて３９
．００　Ｏｒｐｍで４．５時間遠心分離する。

ついでＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するため
に、上記で得られだ沈査を１　ｑ／ｒｎｌプロナーゼＥ
および０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２００
Ｉｚ７ｉ中で３７°Ｃにて２時間処理したノチ、Ｄ　Ｎ
　Ａラフエノール２００μｌで２回抽出し、ついでエー
テルで振ってフェノール溶媒を除去するとＨＢ　Ｖ　Ｄ
　Ｎ　Ａ溶液を得る。このＤＮＡは２、５　Ｘ　１０６
ｃｐｍ／Ｐグの比放射活性を示し、制限酵素消化に充分
使用し得る。

（１１）Ｉ−ＴＢＶＤＮＡのりｏ−ｙ化前記の方法で調
製された環状二本鎖のＨＢ　Ｖ　ＤＮＡを、下記のよう
にしてまずλファージシャロン１６ＡＤＮＡをベクタと
してクローン化し、さらに公知のプラスミドｐＡｃＹｃ
１７７をベクターとして再クローン化を行なう。

へ）λフアージシャロン１６Ａ宿主−ベクター系による
クローン化： ＨＢＶＤＮＡ、２　Ｑ　ｎｆを１０ｍＭ）リス−ＨＣ１
（ｐＨ７，４）、７ｍＭＭｇｃ１２．１００ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１、７ｍＭ　２−メルカプトエタノールの混液２０μ
ｌ中にて制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌによシ３７℃
にて２時間処理したのち、フェノール２００μｌにて抽
出し、ついでエーテル抽出後、その水層に２倍容量の冷
エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。との混液を一
７０°Ｃで１時間保持したのち１０．００　Ｏｒｐｍに
て５分間遠心分離して沈殿するＤＮＡを回収する。０離
した沈査をｌＱｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）お
よび１ｍＭＥＤＴＡの混液５μｌに溶解させる。ついで
、このＨＢ　Ｖ　ＤＮＡと等モル量の前記と同様にして
制限酵素Ｘ１１０Ｉにより開裂されたλファージシャロ
ン１５Ａ、ＤＮＡ（ＸｈｏＩ認識部位を１個所有する）
とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（５０ｍＭトリ：１．−　ＨＣ
ｌ　（ｐＨ７，４）、１０　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ　２、ｌ
ＱｍＭジチオスレイトール、１００μグ／記牛血清アル
ブミン、Ｑ、５ｍＭＡＴＰおよび０．５μｌ酵素調製物
との混液）１０μｌを用いて４°Ｃで１８時間反応させ
、この反応混合液を前記と同様にしてフェノール抽出、
エーテル処理およびエタノール沈殿に付し、得られだ沈
査を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）および１
ｍＭＥＤＴＡ混液１０μｌ中に溶解させる。

上記のようにしてアニールさせたＤＮＡよシ、ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻、２９９〜３０９を参照）
によりλフアージを形成させ、さらに大腸菌ＤＰ５　Ｑ
　５ｕｐＦを指示菌としてＬ−寒天平板（２３（７）×
２３α）」二に〜１０４個のプラークを形成させる。

これらプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持している
ファージにより形成されたプラークを選び出すために、
前記で調製した　Ｐ−ラベルされだＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　
Ａをプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを
行なイ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　、　１９６巻、１８０頁、１
９７７を参照）、目的とするファージを複数分離する。

■）プラスミドｐＡｃＹｃ１７７をベクタートシた再ク
ローン化： 上記（へ）で得られた１（ＢＶＤＮ、Ａを保持するファ
ージについて［生化学実験横座、核酸の化学１１５４〜
６５頁に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ　５　Ｑ−
８ｕ　ｐ　Ｆを感染菌としてファージＩ）ＮＡを調製す
る。得られたＤＮＡを前記の制限酵素ＸｈｏＩの反応条
件下で２時間消化したのち、この反応液を０．７５％ア
ガロースゲル電気泳切にかけ、分離した３、２ＫｂのＨ
ＢＶＤＮＡをＤＥＡＥ紙（東洋沖紙製）に吸着させてベ
クターＤＮＡと分離し、ついで１ＭＮａＣ１溶液にて溶
出し、両端がＸｈｏｌ：末端となったＨＢＶＤＮＡを得
る。

つぎにプラスミドｐＡｃＹｃ１７７　（Ｃｈａｎｇ。

Ａ、Ｃ，ＹｌＣｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、　ｌ　３４　。

１１４１〜１１５６（１９７８）〕（このものはＸｈｏ
Ｉ切断部位を１個所有し、それはカナマイシン耐性遺伝
子の中に存在する）を同様にＸｈｏｌにて消化し、その
生成物をフェノール抽出、エーテル処理およびエタノー
ル沈殿により精製する。ついで、Ｘｈｏｌ：開裂された
ｐＡ’ｃＹｃ１７７とＸｈ。

■末端−ＨＢＶＤＮＡとを分子比１：５で混合し、前記
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼの反応条件下に１８時間アニール
させる。

大腸菌Ｘ１７７６の培養液を高木康敬編著「遺伝子操作
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０．
１　ｒｎｌに、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μ
ｌを加えてよく混合させ、０°Ｃで２５分間放置したの
ち、アンピシリン（２０１Ｌグアｍｚ　）、α−ビオチ
ン（１μ９／ｍり、ジアミノピメリン酸（］、　ＯＯ７
ｚグアｍｉ　）、チシン（２ｏ　／Ｌ　ｙ／ｍｉ　）を
含有するＬ−寒天プレート上に塗沫して３７°Ｃで一夜
培養する。出現したコロニーについて、カナマイシン（
２０μグアｍｚ　）を含む寒天プレートとアンピシリン
（２０ｌＬ９７ｍｌ　）を含む寒天プレートにそれぞれ
対応させて塗沫し、アンピシリンを含むプレートでのみ
増殖したコロニーを選択する。ｐＡＣＹＣ１７７はアン
ピシリン耐性遺伝子トカナマイシン耐性遺伝子を有する
が、カナマイシン耐性遺（入子中にあるＸｈｏ工部位に
ＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａが挿入されることによりカナマイ
シン耐性が消失される。

すなわち選択されたコロニーはｐＡｃＹｃ１７７＋　Ｈ
Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａの組換えＤＮＡを保持している。

得られたコロニー数個について、「代謝」第１７巻、第
４「リパーゼ」第８１〜８９頁（１９８０）に記載され
る方法に従いプラスミドを調製する。

得られたプラスミドをｐ　ＨＢ　Ｖと称す。このｐ　Ｈ
ＢＶを制限酵素ＸｈｏＩで処理すると３，２Ｋｂの全Ｔ
（Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントが得られ、またＸｈ
ｏＩとＢａｍＩ（Ｉで処理するとＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　Ｉ
ｔ云子を含む約１．３Ｋｂのフラグメン）・が得られる
（第１図を参照）。

（２）シャトルベクターｐＡ、Ｍ３１．８２．８３およ
び８４の調製 酸１］５２８８ｃＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性
ホスファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリ
ペプチド（Ｐ２Ｏ）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオ
チド対（８に＋））の制限酵素Ｅｃ。

ｋ１断片を大腸菌プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２のＥｃ。

ｋ■部位に挿入して得られるプラスミドを出発材料とし
、これを制限酵素Ｓａ１．ｆｉで切断し、さらにＴ　４
．　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ
３２２のＳａｌ　Ｉ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子
断片の５，２Ｋｂ側を失なったプラスミドｐ　Ａ　Ｔ２
５（これはｐ　Ｂ　Ｔ２．３２２のアンピシリン耐性遺
伝子を含むＥｃｏＲ：［部位から５ａｉｌ：部位捷での
約３．７Ｋｂの断片と酵母菌の酸性ホスファターゼ遺伝
子のＥｃｏＲ工部位から５ａｌＩ部位までの約２．８Ｋ
　ｌ）の断片がそれぞれ対応する末端同士で結合したプ
ラスミドである）を得る。

つぎに、このＰＡＴ２５のＥｃｏＲＩ部位に、プラスミ
ドＹＲＰ　７をＥｃｏＲＩ処理することによって得られ
るａｒｓｌおよびＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４ＫｂのＥ
ｃｏＲＩ断片を挿入してプラスミドＰＡＴ２６を得る（
このａｒｓｌ−Ｔｒｐｌを含む断片は、そのＴ　ｒ　ｐ
　］遺伝子内に制限酵素Ｉ（ｉｎｄｌｌ）の認識部位を
１個有する）。

上記ｐ　Ａ、　Ｔ　２６のＴ−Ｉ　ｉ　ｎ　ｄ　Ｈｆ部
位に、プラスミドｐ　Ｓ　Ｌ　Ｅ　ｌをＩ−（ｉｎｄｌ
ｌで処理して得られる酵母のＬ　ｅ　ＩＩ　２および２
μＯｒｉを含むＨｉ　ｎ　ｄ　Ｎ断片を挿入してシャト
ルベクターｐＡＴ７７を得る。

上記の方法で得られたＰＡ、Ｔ７７（，１μ７）をＳ　
ａ、　１丁で開裂したのち、２０ｍＭトリス−ＨＣＩ（
ｐＴ−Ｔ　８．２　）、ｉ　２　ｍ　Ｍ　ＣａＣ＋２　
、１２　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ２、Ｑ、２ＭＮａＣ１、ｌ　
ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ溶液５０ｐ、ｌ中で０、］Ｕの
エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を３０秒〜１分間作用さ
せる。ついでフェノール抽出、エタノール沈殿を行なっ
たのち、ＸｈＯ■リンカ−１ｐｍｏｌとＴ４ＤＮＡリガ
ーゼの反応条件下で１２時間結結合行なう。この反応溶
液で大腸菌Ｘ１７７６を形質転換し、得られたアンピシ
リン耐性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、
各ＤＮＡについてマキサム−ギルバートの方法（Ｍａｘ
ａｍ、Ａ。＆　ＧｉＩｂｅｒｔ、Ｗ、；Ｐｒｏ、Ｎ、Ａ
、Ｓ、、７４゜５６０〜５６４を参照）に従い、塩基配
列を調べ、ＢＡＬ３１処理によ如除去された酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子領峡を決定する。これら中からホスファ
ターゼ構造遺伝子領域が完全に除去されたプラスミドｐ
ＡＭ８１、ＰＡＭ８２、ｐＡＭ　８３およびｐＡＭ８４
を得る。

ホスファターゼ構造遺伝子の産物Ｐ６０の最初のアミノ
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを＋
１として、ｐＡＭ３１は＋２まで、ＰＡＭ８２は−３３
まで、ｐＡＭ８３は−５０まで、ｐ　Ａ　Ｍ　３４は−
５１まで、それぞれ除去されたものである。なお、この
ｐ　Ａ　Ｍ　８２をサツカロミセス・セレビシェＡ、　
ｉ（２２に組込んだものは徽工研菌寄第６６６８号とし
て寄託している。

（３）　ＴＩＢ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子発現プラスミドの調
製（１）Ｔ（Ｂｓ遺伝子全体が組込まれたプラスミドの
調製 プラスミドｐ　ＨＢ　ＶをＸｈｏ］’：で処理して得ら
れるＨ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａと、ＸｈｏＩで開裂された
シャトルベクターｐＡ、Ｍ８１、ＰＡＭ８２、ｐ　Ａ　
Ｍ　８３およびｐ　Ａ、　Ｍ　３４のそれぞれを分子比
５：１でＴ４Ｄ　Ｎ　Ａ、　ＩＪガーゼによりアニール
させたのち、この反応溶液で大腸菌Ｘ１７７６を形質転
換する。得られたアンピシリン耐性の形質転換体よりプ
ラスミドＤＮＡを調製し、これらについて制限酵素Ｘｈ
ｏＩ、ＸｂａＪ、ｌ−１ｉｎｄ■で分析することにより
、ベクターへのＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａの組込みおよびそ
の方向を確認する。

Ｊ巽び出されたプラスミドはベクターのホスファターゼ
プロモーターの下流にＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　ＡがＨＢＳ遺
伝子、ＨＢｃ遺伝子の順に並ぶ向きに挿入されたもので
あり、これらがＴ（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子発現プラスミ
ドであって、シャトルベクターｐＡＭ８１、ｐ　Ａ、　
Ｍ　８２、ｐＡ、ＭＢ２およびｐＡＭ８４にＨＢＶＤＮ
Ａを組込んだものをそれぞれｐ　Ａ　Ｔ−Ｔ　２０１ｐ
　Ａ　Ｈ２０３、ｐＡＨ２０５およびｐＡＩ−Ｉ２０７
と称する。

（ｉｉ）ＨＢｓＡｇ遺伝子フラグメントが組込まれたプ
ラスミドの調製 プラスミドｐ　ＨＢ　ＶをＢａｍＨ■で処理して切断し
、そのＨＢｓＡｇ遺伝子フラグメント３μ７に対し、２
００７ｚＭのαＡＴＰ、ａＣＴＰ、　　αＴＴ　Ｐおよ
びａ　Ｇ　Ｔ　Ｐを含む６７ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐ
［Ｉ８．６）、５．７　ｍ　Ｍ　ＭｇＣＩ　２．１０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、６．７　μＭ　ＥＤＴＡ
、　　１６．７　ｍ　ＭＡｍ　Ｓ　Ｏ４溶液１００　ｐ
、ｌ中で、−１”　４．　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ０．
２Ｕを３０分間作用させ、Ｂ　ａ　ｍＴ（Ｉ切断末端を
埋める。ついでフェノール抽出、エタノール沈殿を行な
ったのち、これとＸｈＯ■リンカ−とを１：１０の分子
比でＴ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行なう。フェ
ノール抽出、エタノール沈殿ののち、これをさらにＸｈ
ｏｌ：で処理すると両端がＸｈｏ工切断末端となった約
１．３ＫｂのＨＢｓＡ、ｇ遺伝子フラグメントが得られ
る。このフラグメントとＸｈｏｆｉで開裂されたシャト
ルベクターｐＡＭ８２とを分子比５：１にてＴ４ＤＮＡ
リガーゼによりアニールさせたのち、前記（Ｄと同様に
して大腸菌Ｘ１７７６を形質転換してプラスミドＤＮＡ
を調製する。得られたプラスミドは、ベクターＰＡＭ８
２のホスファターゼプロモーターの下流にＨＢｓＡｇ遺
伝子が正しい向きに挿入されたものであり、これをｐＡ
Ｓ　１０１と称する。

（４）形質転換酵母の調製 酵ｆＬａ：してサツカロミセス・セレビシェＡ　Ｈ２２
［ａ　　Ｉｅｕ２　ｈｉｓ４　　ｃａｎｌ　　（Ｃｉｒ
＋）］　（ＩＪ工研菌寄第６６６７号）を用い、これを
ＹＰＤ培地（２％ポリペプトン、１％イーストエキス、
２％グルコース）１００ｍｌに接種し、３０°Ｃで一晩
培養したのち、遠心して集菌する。滅菌水２０ｙｄにて
菌体を洗浄し、ついで１，２Ｍソルビトールおよび１０
０μｙ／−チモリアーゼ６０．ＯＯ’Ｏ（生化学工業槽
）の溶液５−に懸濁させ、３０°Ｃで約３０分間保ち、
スフェロプラスト化する。ついで、スフェロプラストを
１．２Ｍソルビトール溶液で３回洗浄したのち、２Ｍツ
ルピトー／１．ｚ、ｌＱｍＭＣａＣ１２および１０ｍＭ
）リス−ＨＣＩ（ｐｒ−１７，５）の溶液０．６１ｎｌ
に懸濁させ、その６０μｌずつを小試験管に分注する。

これに前記（３）で調製した組換えプラスミドＰＡＨ２
０３溶液３０μｌを加え、充分混合し、さらに０．Ｉ　
ＭＣａＣ１２（３１ｒ７り加えて最終濃度１０ｍＭｃａ
ｃ１２とし、室温に５〜１０分間放置する。ついでこれ
に、２０％ポリエチレングリコール４０００、ｌ　０ｍ
ＭＣａＣｌ２および１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７
，５）溶液１−ずつを加えて混合し、室温に約２０分間
放置する。この混合液０．２ｔｎｌずつを４５°Ｃに保
温された再生培地（２２％ソルビトール、２％グルコー
ス、０．７％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％
ＹＰＤ、２０μグ／−ヒスチジン、３％寒天）１０ｍｌ
に加え、軽く混合させ、予め準備された１゜２Ｍソルビ
トール含有最小培地（０，７％イーストニトロゲンベー
スアミノ酸、２％グルコース、２０μＰ／ｍ！ヒスチジ
ン、２％寒天）プレートに重層し、固化させたのち、３
０’Ｃで培養してロイシン非要求性酵母のコロニーを得
る。このコロニーを２０μＰ／ｍ！ヒスチジンを含むバ
ルクホルダーミニマルメデイウム（Ｔｏｈｅ、Ａ、ｅｔ
　ａｌ；Ｊ＋Ｂａｃｈｃｅｒｏｌ＋。

１１３．７２７〜７３８（１９７３）を参照〕にて培養
して形質転換酵母サツカロミセス・セレビシェｐＡＨ２
０３を得る。

上記の方法において、組換えプラスミドｐＡＨ２０３の
代りにｐＡｓｌｏｌ、ＰＡＨ２０１およびｐＡＨ２０５
を用い、それぞれ下記の形質転換酵母を得る。

サツカロミセス・セレビシェｐＡＳ　１０１、サツカロ
ミセス・セレビシェｐＡＨ２０１、サツカロミセス・セ
レビシェＰＡＨ２０５゜（５）形質転換酵母によるＨＢ
ｓＡｇの製法前記（４）で得られた形質転換酵母の各コ
ロニーをさらに２０Ｐグ／ｍｌヒスチジンを含むバルク
ホルダーミニマルメデイウムの寒天プレート上に塗布し
、３０°Ｃにて培養してコロニーを形成させる（ロイシ
ン非要求性となった形質転換体の再確認のだめ）。つい
でこのコロニーから菌体を分離し、２０μｇ／１１ヒス
チジンを含むバルクホルダーミニマルメデイウム１０ｒ
ｎｌに接種し、３０°Ｃにて培養を行なう。約２４時間
後、対数増殖期にある菌体を遠心して集菌し、これをリ
ン酸を含まない最小培地（バルクホルダーミニマルメデ
イウムに含まれるＫＨ２Ｐ　Ｏ４をＫＣＩで置換し、さ
らに２０１Ｌ’ｉ／ｍｌヒスチジンを加えたもの）１０
ｒｎｌに菌数約４×１０６Ｃｅ１１Ｓ／ｒｎｌになるよ
うに懸濁し、３０°Ｃにて約２４時間培養を続けたのち
、４，０００回転、１０分間の遠心によシ菌体を集める
。この菌体を１．２Ｍソ／ｌ／　ヒト−／ｌ／、５Ｑｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）、１４ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、１００μり／ｍｌザイモリエース６０，
０００の溶液３ｍｌに懸濁させ、３０°Ｃにて３０分間
ゆるやかに振盪してスフェロプラスト化し、遠心分離に
よりこれを集める。このスフェロプラストを０．１％ト
リトンＸ−１００，５ＱｍＭリン酸緩衝液（ＰＩ］７．
２　）　１　ｒｐＪに充分懸濁し、数回激しく攪拌し、
７０００回転にて１０分間遠心して得られる上清液を酵
母溶菌液としてとる。

この溶菌液２０μｌをＨＢｓ抗原ＲＩＡキット（アボッ
ト社製）によｐＨＢｓ抗原活性を測定した。

その結果を第１表に示す。

第１表 ＊）このベクターはＨＢ　ＶまだはＨＢｓ遺伝子を含ん
でいない陰性対照である。

（なお、ＲＩＡ測定キットの陰性コントロールは３１０
　Ｃｐｍ、陽性コントロールは７＋　５００　ｃｐｍで
あった） まだ、前記のようにして得られた酵母溶菌液（Ｓ、セレ
ビシェＡＨ２２／ＰＡＨ２０３由来）について、前記Ｈ
Ｂｓ抗原検出用キット（アボット社製）を用いた平行線
検定法（厚生省薬務局監修、生物学的製剤基準解説、４
３５頁、１９７３　）に従い、抗原量および抗原の反応
性を推定した。なお、対照抗原としては、ヒト由来の精
製ＨＢｓ抗原を用いた。その結果を第６図に示す。第６
図に示されるように、抗原量は２μｍ／−と比較的高濃
度であった。しかも、直線の平行性によυ本発明に基づ
いて産生されたＨＢｓ抗原はヒト由来の精製抗原の持つ
反応性とほぼ同じ性質を持つことが理解できる。

さらに、上記溶菌液を１０匹のモルモット（体重３００
〜３８０グ）に０．４　ｙｎｌずつ１週問おきに３回皮
下に接種すると、すべてのモルモットに抗ＨＢｓ抗体が
出現することが、抗ＨＢｓ抗体検出用キット（アボット
社製「オーサブ」）によシ認められた。

以上によυ、本発明で得られる宿主・ベクター系および
ＨＢｓ抗原の製法が、Ｂ型肝炎起因物質（ディン粒子）
に対する免疫原物質を効率よく与えるきわめて有用な手
段および方法であることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いられるＨＢＶ遺伝子を含むＨＢＶ
ＤＮＡフラグメントの構造、第２図はＨＢｓ遺伝子のア
ミノ酸配列、第３図はシャトルベクターｐＡＴ７７およ
びｐＡＭ８２の構造、第４図は該シャトルベクターの酸
性ホスファターゼプロモーター付近の遺伝子地図、第５
図はそのＢｓｔＥＡＴ−８ａｌ工領域の塩基配列を示す
。第６図は本発明で得られる酵母溶菌液についての平行
線検定法による抗原量および抗原の反応性を示すグラフ
である。 特許出願人　財団法人化学及血清療法研究所代理人弁理
士青　山　　葆ほか１名 １ 畦太 −６筺　　　　呂冒借 Ｅ−と 妬　湖　　　　　　　　し　３ 一目炭　　　　月Ｓ ２叢力囲す隨　目上 ζ開力　　　　日当製 ＜　〒　事 ”（１乗　　　　Ｅ詔Ｊ Ｒ＾　　　　１西〈 １廂　　　　１詣３ ト　と ≦用　　　　　　１凋 く　〒 ｇｂ　　　　　８．！！！ く　〒 祖音　　　　１匠 −Ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−督特開
昭５９−３１７９９　（１３） １回 １凄 ＜　ム ■　３ ■ ■ 手続補正書６．ア。 １事件の表示 昭和５７年特許願第　１４２４６０　　　号２発明の名
称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　熊本県熊本市清水町大窪６６８番地名称　財団法
人化学及血清療法研究所 ４代理人 ５補正命令の日付　　自発 ６補正の対象 全文明細書および図面（第１図〜第６図）７補正の内容 （１）明細書 別紙のとおり（タイプ浄書のみで内容に変更ありません
。） （２）図　面 別紙のとおり（浄書。ただし、第６図中の「　　　」を
削除いたしました。） ｔ−一噂 以　　　」二 手続補正書、自到 昭和５８年８月２６日 昭和５７年特許願第　１４２４．６０　　　　号２発明
の名称 組換えプラスミド、それによる形質転換酵母およびＢ型
肝炎ウィルス表面抗原の製法３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　東京都千代田区霞が関二丁目２番１号名称　科学
技術庁長官官房会計課長 ４代理人 ６補正の対象 ７補正の内容 （１）明細書（昭和５７年９月１７日付提出の手続補正
音に添付のもの）の下記箇所において左欄の記載を右欄
のごとく補正する。 （１）８頁４行 「組み換え」→「組換え」 ｃ＋：）ｓ頁８〜９行 「組み込む」→「組込む」 （＋＋＋）９頁下から２行 「ＰｏｏｃｋらＪ　→「Ｐａ５ｅｋら」（１ｖ）１９頁
１０行 「で担わ牡た」→「に担わ詐た」 （Ｖ）２２頁８〜９行 「デオキシチアミントリ ホスフェート」 →「デオキンチミジント リホスフエート」 （Ｖ＋）　２３頁末行 ［フェノ−／１／２００Ｊ→「フェノール２０」（２）
図面中、第３図を別紙のとおり補正する。 以上 受託香り変更届 昭和５８年１１月４日 ） 特許庁長官　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第］　４．２．４６０号２、発明の名
称 組換えプラスミド、それによる形質転換酵母およびＢ型
肝炎ウィルス表面抗原の製法３、手続をした者 事件との関係　　特許出願人 住所　東京都千代田区霞か関二丁目２番１号名称　科学
技術庁長官官房会削課長 ４、代理人 １を所　大阪府大阪市東区本町２−１０本町ビル内氏名
　弁理士（６２１４）　　青　山　　葆　はが１名５、
旧寄託機関の名称 工業技術院微生物工業技術研究所 ６、旧受託番号 微工研菌寄第６６６７号 ７、新寄託機関の名称

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母
   の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域を担った
   プラスミドベクターに、該ホスファターゼプロモーター
   の制御下にＢ型肝炎ウィルス遺伝子を組込んだことを特
   徴とする組換えプラスミド。 （２）該抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域が
   ホスファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリ
   ペプチド（Ｐ２Ｏ）の遺伝子であシ、その構造遺伝子の
   一部まだは全部もしくはさらにその上流の種々の部位ま
   でが除去されている前記第（１）項の組換えプラスミド
   。 （３）酵母の遺伝子がａｒｓｌおよび２ＰＯｒｉである
   前記第（１）項の組換えプラスミド。 （４）酵母の遺伝子としてａｒｓｌ、２μｏｒｉならび
   に形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子を有する前
   記第（１）項の組換えプラスミド。 （５）該選択マーカーとなる遺伝子がロイシン産生遺伝
   子、ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子
   、ウラシル産生遺伝子およびアデニン産生遺伝子から選
   ばれる１種捷たけ２種以上である前記第（４）項の組換
   えプラスミド。 （６）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
   ために必要なりＮＡ配列である前記第（１）項の組換え
   プラスミド。 （７）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
   ために必要なりＮＡ配列ならびに形質転換大腸菌の選択
   マーカーとなる遺伝子である前記第（１）項の組換えプ
   ラスミド。 （８）該選択マーカーとなる遺伝子が、アンピシリン耐
   性遺伝子、カナヤイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン
   耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子から
   選ばれる１種または２種以上である前記第（７）項の組
   換えプラスミド。 （９）該組込みＢ型肝炎ウィルス遺伝子がアミノ酸２２
   ６個に相当するＴ（ｕｓ遺伝子全体を含むフラグメント
   である前記第（１）項の組換えプラスミド。 ００）該ＨＢｓ遺伝子全体を含むフラグメントが、制限
   酵素Ｘｂｏ］：で開裂されたＴＩＢＶＤＮＡ全体である
   前記第（９）項の組換えプラスミド。 Ｑｌ溢ＨＢ　ｓ遺伝子全体を含むフラグメントが、制限
   酵素Ｘｈｏ工およびＢａｍＴ（Ｉの処理によって得られ
   るフラグメントである前記第（９）項の組換えプラスミ
   ド。 Ｑ２）酵母に、前記第（１）項の組換えプラスミドを作
   用させて形質転換させてなる形質転換酵母。 ｏ：３）該酵母がロイシン要求性変異株、ヒスチジン要
   求性変異株、トリプトファン要求性変異株、ウラシル要
   求性変異株およびアデニン要求性変異株から選ばれる１
   種である前記第（１２）項の形質転換酵母。 ０４）該酵母がロイシン要求性変異株のサツ力ロミセス
   ーセレビシＩＡＨ２２ａ　　１ｅｕ２　ｈｉｓ４Ｃａｎ
   １（Ｃｉｒ＋）である前記第（１２）項の形質転換酵母
   。 （］５）前記第（］２）項の形質転換酵母を培養するこ
   とを特徴とするＢ型肝炎ウィルス表面抗原の製法。 （１６）該形質転換酵母の培養を、酸性ホスファターゼ
   プロモーターが抑制されない条件下に行なう前記第（１
   ５）項の製法。