PT1688500E - Sobre-expressão de genes de fitase em sistemas de leveduras - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Sobre-expressão de genes de fitase em sistemas de leveduras"

ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR À INVENÇÃO

As fitases, um conjunto particular de monoéster fosfatases, são necessárias para iniciar a libertação de fosfato ("P") a partir do fitato (hexafosfato de mioinositol), forma principal de armazenagem de P nos cereais alimentares ou utilizados em alimentação animal (Reddy, N.R. et al., "Phytates in Legumes and Cereais", Advances in Food Research, 28: 1 (1982)) . Uma vez que os animais com um único estômago, tais como os suinos e as aves, bem como os seres humanos, apresentam pequena actividade de fitase nos seus tractos gastrointestinais, quase todo o P de fitato ingerido é não digerível. Isto origina a necessidade de suplementos com P inorgânico, um nutriente caro e não renovável, nas dietas para estes animais. Uma característica adicional ainda mais indesejável, é que o P do fitato não utilizado integra por excreção o estrume destes animais transformando-se numa componente P da poluição ambiente (Cromwell, G.L. et al., "P - A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant-- Its Central Role in Animal Nutrition",

Biotechnology In the Feed Industry; Actas do Ί- Simpósio

Anual da Alltech, pág. 133 (1991) ) . Além disto, o fitato quela-se a elementos vestigiais essenciais tais como o zinco originando deficiências de nutrientes relacionadas com atrasos do crescimento e mentais em crianças que ingiram sobretudo alimentos de origem vegetal sem remoção do fitato.

Clonaram-se duas fitases, phyA e phyB, do Aspergillus niger NRRL3135, e sequenciaram-se (Ehrlich, K.C. et al., "Identification and Cloning of a Second Phytase Gene (phys) from Aspergillus niger (ficuum)", Biochem. Biophys. Res. Commun., 195: 53-57 (1993); Piddington, C.S. et al., "The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori", Gene, 133: 56-62 (1993)). Recentemente isolaram-se novos genes de fitase de Aspergillus terreus e de Myceliophthora thermophila (Mitchell et al., "The Phytase Subfamily of Histidine Acid Phosphatases: Isolation of Genes for Two Novel Phytases From the Fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila" Microbiology 143: 245-252, (1997)), de Aspergillus fumigatus (Pasamontes et al. , "Gene Cloning, Purification, and Characterization of a Heat-Stable Phytase from the Fungus Aspergillus fumigatus", Appl. Environ. Microbiol., 63: 1696-1700 (1997)), de Emericella nidulans e de Talaromyces thermophilus (Pasamontes et al., "Cloning of the Phytase from Emericella nidulans and the Thermophilic Fungus Talaromyces thermophilus", Biochim. Biophys. Acta., 1353: 217-223 (1997)), e do milho (Maugenest et al., "Cloning and Characterization of a cDNA Encoding a Maize Seedling Phytase", Biochem. J. 322: 511-517, 1997)). Têm sido isolados e/ou purificados diversos tipos de enzimas fitase a partir de Enterobacter sp. 4 (Yoon et al., "Isolation and Identification of Phytase-Producing Bacterium, Enterobacter sp. 4, and Enzymatic Properties of Phytase Enzyme", Enzyme and Microbial Technology 18: 449-454 (1996)), de Klebsiella terrlgena (Greiner et al., "Purification and Characterization of a Phytase from Klebsiella terrigena", Arch. Biochem. Biophys. 341: 201-206 (1997)), e de Bacillus sp. DS11 (Kim et al., "Purification and Properties of a Thermostable Phytase from Bacillus sp. DS11", Enzyme and Microbial Technology 22: 2-7 (1998)). Têm sido estudadas as propriedades destes enzimas. Além disto, foi publicada a estrutura cristalina da phy A de Aspergillus ficuum (Kostrewa et al., "Crystal Structure of Phytase from Aspergillus ficuum at 2.5 A Resolution", Nature Structure Biology 4: 185-190 (1997)).

Hartingsveldt et al. introduziram o gene phyA em A. niger e obtiveram um aumento de dez vezes da actividade de fitase em comparação com o de tipo selvagem. ("Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127: 87-94 (1993)) . Foi demonstrado que uma actividade suplementar de fitase microbiana com esta fonte nas dietas para suinos e aves era eficaz na melhoria da utilização do P de fitato e do zinco (Simons et al., "Improvement of Phosphorus Availability By Microbial Phytase in Broilers and Pigs", Br. J. Nutr., 64: 525 (1990); Lei, X.G. et al., "Supplementing Corn-Soybean

Meal Diets With Microbial Phytase Linearly Improves Phytate P Utilization by Weaning Pigs", J. Anim. Sci., 71: 3359 (1993); Lei, X.G. et al., "Supplementing Corn-Soybean Meal Diets With Microbial Phytase Maximizes Phytate P Utilization by Weaning Pigs", J. Anim. Sci., 71: 3368 (1993); Cromwell, G.L. et al., "P - A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant -- Its Central Role in Animal Nutrition", Biotechnology In the Feed Industry; Actas do Ί- Simpósio Anual da Alltech, pág. 133 (1991)). Mas o custo da quantidade exigua comercialmente disponível de fitase e a instabilidade da actividade do enzima ao calor durante a produção de pastilhas de alimento composto impedem a sua utilização prática na indústria de produção de animais (Jongbloed, A.W. et al., "Effect of

Pelleting Mixed Feeds on Phytase Activity and Apparent Absorbability of Phosphorus and Calcium in Pigs", Animal Feed Science and Technology, 28: 233-242 (1990)). Além disto, a fitase produzida a partir de A. niger não é presumivelmente a fonte mais segura para o fabrico de alimentos para seres humanos. O WO 99/08.539 descreve um enzima fitato purificado derivado de Escherichia coli.

Greiner et al. , Archives of Biochemistry and Biophysics, 303, N2 1, 1993, páginas 107-113 descrevem a purificação e a caracterização de duas fitases de Escherichia coli.

Touati et al., Biochimie, vol. 69, 1987, páginas 215-221 descrevem a estrutura do promotor e a da região do terminal amino do gene estrutural da fosfatase ácida a pH 2,5 (APPA) de E. coli.

Pode utilizar-se levedura para produzir enzimas eficazmente enguanto se cultiva sobre meios simples e baratos. Com uma seguência de sinalização apropriada, o enzima pode ser segregado para o meio, para uma recolha cómoda. Alguns sistemas de expressão de levedura têm a vantagem adicional de serem bem aceites na indústria alimentar e de serem produtores seguros e eficazes de produtos alimentares.

Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica, capaz de metabolizar metanol a titulo da sua única fonte de carbono. Este sistema é bem conhecido pela sua capacidade de expressar teores elevados de proteínas heterólogas. Uma vez gue se trata de uma eucariota, a Pichia tem muitas das vantagens dos sistemas de expressão mais elevados eucarióticos, tais como os do processamento proteico, da dobragem proteica, e da sua modificação pós-transcricional.

Nestas condições, existe uma necessidade de se desenvolver um sistema eficiente e simples para produzir economicamente fitase para aplicação nas indústrias alimentar e de alimentos para animais.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

As concretizações da invenção são: 1. Utilização de uma AppA bacteriana como fitase, em que a AppA mantenha pelo menos 60 % da sua actividade depois de se aquecer a AppA durante 15 minutos a 60 °C, em que a AppA seja expressa numa célula hospedeira de levedura. 2. Utilização de uma AppA bacteriana para catalisar a transformação de fitato em inositol e fosfato, em que a referida AppA mantenha pelo menos 60 % da sua actividade depois de se aquecer a AppA durante 15 minutos a 60°C, em que a AppA seja expressa numa célula hospedeira de levedura. 3. A utilização das concretizações 1 ou 2, em que a célula hospedeira de levedura seja seleccionada de entre o conjunto constituído pelas espécies Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Torulaspora e

Schizosaccharomyces. 4. A utilização da concretização 3, na qual a célula hospedeira de levedura seja de Saccharomyces cerevisiae. 5. A utilização da concretização 1 ou da 2, na qual a levedura hospedeira seja de uma estirpe de leveduras metilotróficas. 6. A utilização da concretização 5, na qual a levedura hospedeira referida seja Pichia pastoris. 7. A utilização de qualquer uma das concretizações 1 a 6, na qual a fitase bacteriana AppA referida seja misturada ou levada a um contacto com a composição para alimento dos animais. 8. A utilização de qualquer uma das concretizações 1 a 7, na qual a AppA bacteriana seja um polipéptido Appa de E. coli. 9. A utilização de uma estirpe de levedura incluindo um gene codificando para AppA bacteriana, funcionalmente ligado a um promotor que dirige a expressão do gene da AppA na estirpe de levedura, para produzir uma fitase, em que a fitase referida mantenha pelo menos 60 % da sua actividade depois de se aquecer a fitase durante 15 minutos a 60°C. 10. A utilização da concretização 9, na qual o polipéptido bacteriano AppA seja um polipéptido AppA de E. coli. 11. A utilização de qualquer uma das concretizações 9 a 10, em que a referida estirpe de levedura seja seleccionada de entre o conjunto constituído pelas espécies Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Torulaspora e Schizosaccharomyces. 12. A utilização da concretização 11, em que a estirpe de levedura referida seja uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae. 13. A utilização da concretização 11, em que a estirpe de levedura referida seja uma estire de Pichia pastoris. 14. A utilização de um vector incluindo um gene codificando para AppA, funcionalmente ligado a um promotor que dirige a expressão do gene de AppA numa estirpe de levedura, para produzir uma fitase em que a referida fitase mantenha pelo menos 60 % da sua actividade depois de se aquecer a fitase durante 15 minutos a 60°C.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra uma análise por SDS-PAGE de proteína solúvel preparada a partir do E. coli transformado com o gene de fitase, induzido com IPTG. Cultivaram-se as células durante 4 horas antes da colheita. Pista 1: Marcador; Pistas 2 e 3: Transformantes de pEP 1 (a proteína expressa tinha cerca de 55 kDa); Pista 4: Transformante obtido apenas com o vector de expressão pET25b(+). A Figura 2 mostra a análise por transferência Western da proteína de fitase expressa em E. coli. Obteve-se o anticorpo contra fitase nativa purificada de A. niger. Cada pista continha 50 pg de proteína total intracelular. Pistas 1 e 2: Recombinantes depois e antes da indução. Pistas 3 e 4: controlo (apenas o vector de expressão) antes e depois da indução. A Figura 3 é uma imagem por varrimento da análise por transferência Northern do mARN de PhyA em E. coli. Utilizou-se uma sonda de 1,4 kb para PhyA. Cada pista continha 20 pg de ARN total. Pistas 1 e 2: ARN isolado das células de controlo (apenas vector de expressão) antes e depois da indução. Pistas 3 e 4: ARN isolado dos recombinantes contendo PhyA antes e depois da indução. A Figura 4 mostra o decurso ao longo do tempo da expressão induzida da fitase (pEPl) em E. coli BL21 (DE3) . Induziram-se as células quando a D06oo atingiu 0,5. A proteína solúvel, preparada em cada altura ao longo do tempo, foi quantificada por análise por SDS-PAGE. A Figura 5 mostra uma análise por SDS-PAGE da proteína fitase extracelular expressa por S. lividans transformada para fitase depois de cultivada durante 72 horas. Centrifugaram-se as células durante 15 minutos a 8.000 x g, e submeteu-se o sobrenadante a uma electroforese sobre gel. Pista 1: Marcador; Pista 2: Controlo com apenas o vector de expressão; Pista 3: Fitase expressa positiva da colónia cuja dimensão era de cerca de 57 kDa. A Figura 6 mostra a análise por transferência Western da fitase expressa por S. lividans, utilizando um anticorpo contra fitase criado contra fitase nativa purificada de A. niger. Cada pista foi carregada com 20 pg de proteína do meio (sobrenadante). Pista 1: Sobrenadante do da cultura de células de controlo transformadas com vector; Pista 2: Sobrenadante da cultura inoculada com a colónia positiva. A Figura 7 representa uma análise por SDS-PAGE da fitase extracelular expressa por S. cerevisiae. Cada pista foi carregada com 50 pg de proteína do meio (sobrenadante). Pistas 1 a 3: Sobrenadante da cultura inoculada com a colónia positiva colhida respectivamente às 5, 10, e 25 horas após a indução; Pistas 4 a 6: Sobrenadante da cultura de células de controlo transformada com o vector, colhido respectivamente às 5, 10, e 25 horas após a indução; Pista 7: Marcador (kDa). A fitase expressa era de cerca de 110 kDa (confirmados por transferência Western). A Figura 8 representa o decurso ao longo do tempo da actividade da fitase extracelular expressa por S. cerevisiae transformado com a construção pYPPl depois de uma indução com galactose. Analisou-se a actividade no sobrenadante do meio recolhido. A Figura 9 mostra a análise da transferência Western da fitase extracelular expressa por S. cerevisiae antes e depois da desglicosilação (Endo H), utilizando um anticorpo contra fitase criado contra fitase nativa purificada de A. niger. Pista 1: Padrões para SDS-PAGE (kDa) previamente contrastados da Bio-Rad; Pistas 2 e 3: 10 e 20 pg, respectivamente, de proteína fitase desglicosilada; Pista 4: fitase glicosilada (20 pg de proteína). A Figura 10 é uma imagem por varrimento de uma análise de transferência Northern do ARN total isolado de células de S. cerevisiae transformadas. Pista 1: Controlo (apenas com o vector de expressão pYES2); Pistas 2 e 3: Tranformantes de pYPPl. A Figura 11 representa o decurso ao longo do tempo da actividade de fitase extracelular phyA produzida pelos transformantes de Pichia pastoris devidos a Muts (KM71) e Mut+ (X33) , após a indução. A Figura 12 representa uma análise por SDS-PAGE da fitase sobre-expressa em Pichia, com uma construção de pPICZaA-PhyA em KM71 (MUTS) . Pista 1: andaime proteico. Pista 2: 40 plL do sobrenadante de AK1 (uma colónia mostrava 21.700 mU/mL de fitase extracelular), obtido 108 horas depois da indução. Pista 3: 40 pL do sobrenadante de uma estirpe de controlo sobre-expressando albumina de soro humana (HAS, 6,7 kDa) a um teor de 1 g/L. Pista 4: 40 pL do sobrenadante do controlo KM71. A Figura 13 representa efeitos da desglicosilação por Endo H sobre a estabilidade térmica da fitase expressa em Pichia. Mediu-se a actividade da fitase depois de se aquecerem os enzimas durante 15 minutos a 37 ou a 80°C em tampão citrato 0,2 M, pH 5,5. A Figura 14 é uma imagem de um varrimento de uma análise por transferência Northern do mARN expresso por phyA das estirpes de Pichia pastoris transformadas (KM71 e X33) . Utilizou-se para a transferência uma sonda de 1,3 kb de phyA. Pistas 1 e 2: o transf ormante de KM71 antes e depois da indução; Pistas 3 e 4: o transformante de X33 depois e antes da indução. A Figura 15 mostra o pH óptimo da fitase extracelular expressa por Pichia (X33). Utilizaram-se tampões 0,2 M de glicina-HCl para pH 1,5, 2,5, 3,5; 0,2 M de citrato de sódio para pH 4,5, 5,5, 6,5, e 0,2 M de Tris-HCl para pH 7,5 e 8,5. A Figura 16 mostra a temperatura óptima da fitase extracelular expressa por Pichia (X33).

Conduziram-se os ensaios em tampão citrato 0,2 M, pH 5,5. A Figura 17 representa a libertação de fósforo livre a partir de soja, pela fitase expressa em Pichia (X33). Suspenderam-se cinco gramas de soja em 25 mL de citrato 0,2 M, pH 5,5, com diferentes quantidades do enzima. Conduziu-se a incubação durante 4 horas a 37 °C e determinou-se a quantidade de fósforo livre libertado no sobrenadante. A Figura 18 mostra o decurso ao longo do tempo da expressão da fitase extracelular de cinco transformantes de Pichia pastoris contendo o gene appA de E. coli. A Figura 19 representa graficamente a relação entre o pH do meio e a expressão da actividade da fitase por Pichia pastoris. A Figura 20 é uma análise por SDS-PAGE da fitase de E. coli sobre-expressa em Pichia pastoris. Pista 1: Andaime proteico; Pistas 2 a 4: Sobrenadantes recolhidos respectivamente das culturas das colónias positivas 23, 22, e 11, 118 horas após a indução. A Figura 21 representa graficamente o pH óptimo para a fitase sobre-expressa de E. coli na Pichia pastoris. A Figura 22 representa graficamente a temperatura óptima da fitase sobre-expressa de E. coli na Pichia pastoris. A Figura 23 representa a quantidade de fósforo livre libertada a partir de farinha de soja pela fitase sobre-expressa de E. coli na Pichia pastoris após quatro horas de tratamento.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A invenção presente proporciona a utilização de AppA bacteriana a titulo de fitase. Preferivelmente, expressa-se numa estirpe de levedura um gene heterólogo que codifica para uma proteína ou um polipéptido com actividade de fitase.

Os enzimas que catalisam a transformação de fitato em inositol e fósforo inorgânico são conhecidos em geral como fitases. Os micro-organismos que produzem fitases incluem bactérias tais como Bacillus subtilis (Paver et al. , J. Bacteriol. 151, 1102 (1982)) e Pseudomonas (Cosgrove, Austral. J. Biol. Sei. 23: 1207 (1970)); leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae (Nayini et al., Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24 (1984)); e fungos, tais como Aspergillus terreus (Yamada et al., Agric. Biol. Chem. 32:1275 (1986), que deste modo se incorpora neste documento por citação), bem como Aspergillus ficuum (van Gorcom et al. , Pedido de Patente Europeia 89/202.436).

As fitases também estão presentes endogenamente em muitas espécies de plantas; Loewus, em: Plant Biology vol. 9: "Inositol Metabolism in Plants" (editores D. J. Morre, W. F. Boss, F. A. Loewus) 13 (1990); e Gellatly, et al. , Plant Physiology (suplemento) 93: 562 (1990), mencionam o isolamento e a caracterização de um cone de cADN de fitase obtido de tubérculos de batata. Gibson, et al., J. Cell Biochem., 12C: L407 (1988) e Christen, et al., J. Cell Biochem., 12C: L402 (1988), mencionam a síntese de fitase endógena durante a germinação de sementes de soja.

Preferivelmente, a proteína ou o polipéptido com actividade de fitase é segregado pela célula para o meio de crescimento. Isto permite teores de expressão mais elevados e um mais fácil isolamento do produto. A proteína ou polipéptido com actividade de fitase está acoplado a uma sequência de sinal capaz de dirigir a proteína para fora da célula. Preferivelmente, a sequência de sinalização é clivada da proteína.

Numa concretização preferida, o gene heterólogo, que codifica para uma proteína ou um polipéptido com actividade de fitase, é inserido enquadrado num elemento de incremento transcricional.

Isolam-se os genes heterólogos preferidos codificando para proteínas com actividade de fitase a partir de uma célula bacteriana. É ilustrado o gene phyA de Aspergillus niger. Um gene codificando para fitase, phyA, de Aspergillus niger NRRL3135 havia sido clonado e sequenciado (Piddington, C.S. et al., "The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori", Gene. 133: 56-62 (1993)). Hartingsveldt et al. introduziu o gene phyA em A. niger, e obteve um aumento de dez vezes a actividade de fitase em comparação com a do tipo selvagem (Hartingsveldt et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127: 87-94 (1993)) .

Urn gene heterólogo preferido é o gene appA de E. coli. Este gene, originalmente definido como fosfoanidrido fosfohidrolase periplásmica de E. coli, contém 1.298 nucleótidos (número de acessão no GeneBank: M58708). Verificou-se em primeiro lugar que o gene codificava para uma fosfatase ácida, proteína com um pH óptimo de 2,5 (EcAP) em E. coli. A fosfatase ácida é um monómero com uma massa molecular de 44.644 Dalton. A EcAP madura contém 410 aminoácidos (Dassa, J. et al., "The Complete Nucleotide Sequence of the Escherichia Coli Gene AppA Reveals Significant Homology Between Ph 2.5 Acid Phosphatase and Glucose-l-Phosphatase", J. Bacteriology, 172: 5497-5500 (1990)). Ostanin, et al. sobre-expressaram appA em E. coli BL21 utilizando urn vector pT7 e aumentaram a actividade de cerca de 400 vezes como fosfatase ácida (440 mU/mg proteína) (Ostanin, K. et al., "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia Coli Acid Phosphatase", J. Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992)). 0 produto do gene appA não era anteriormente conhecido como possuindo actividade de fitase.

Pode expressar-se o gene appA em qualquer sistema de expressão procariótico ou eucariótico. Pode utilizar-se uma série de sistemas hospedeiro-vector para expressar as sequências de codificação proteica. Incluem-se nos vectores preferidos um vector viral, plasmídeo, cosmídeo ou um oligonucleótido. Em primeiro lugar, o sistema vector tem que ser compatível com a célula hospedeira utilizada. Incluem-se nos sistemas hospedeiro-vector, sem que se limitem a estes, os seguintes: bactérias transformadas com ADN de bacteriófagos, com ADN plasmídico, ou com ADN cosmídico; micro-organismos tais como levedura contendo vectores de levedura; sistemas de células de mamíferos infectados com vírus (por exemplo, vírus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectadas com vírus (por exemplo, baculovírus); e células de plantas infectadas por bactérias. Os elementos de expressão destes vectores variam na sua força e nas suas especificidades. Consoante o sistema hospedeiro-vector utilizado, pode utilizar-se qualquer um de entre uma série de elementos de transcrição e tradução adequados.

Podem incluir-se nos hospedeiros preferidos para expressar appA células de fungos, incluindo espécies de leveduras ou de fungos filamentosos, consoante a invenção presente. Incluem-se nas células de levedura hospedeiras preferidas diversas estirpes de Saccharomyces cerevisiae. Podem também utilizar-se outras leveduras, tais como Kluyveromyces, Torulaspora, e Schizosaccharomyces. Numa concretização preferida, a estirpe de levedura utilizada para sobre-expressar a proteína é Saccharomyces cerevisiae. As células hospedeiras de fungos que se preferem incluem Aspergillus e Neurospora. Uma estirpe mais preferida de Aspergillus é Aspergillus niger.

Noutra concretização preferida da invenção presente, a estirpe de levedura é uma estirpe de levedura metilotrófica. As leveduras metilotróficas são os géneros de levedura que são capazes de utilizar metanol como fonte de carbono para a produção dos recursos energéticos necessários para manter a função celular e contendo um gene para a expressão de álcool oxidase. Incluem-se nas leveduras metilotróficas típicas membros dos géneros Pichia, Hansenula, Torulopsis, Candida, e Karwinskia. Estes géneros de levedura conseguem utilizar metanol como única fonte de carbono. Numa concretização mais preferida, a estirpe de levedura metilotrófica é Pichia pastoris. A invenção presente também proporciona uma proteína ou polipéptido com actividade de fitase. A PhyA é expressa em Pichia e a proteína resultante produzida tem uma actividade extracelular muito maior (~65 mU/mL). 0 rendimento em actividade de fitase foi de cerca de 30 vezes maior do que em Saccharomyces cerevisiae transformada com phyA, 21 vezes maior do que em Aspergillus niger de tipo selvagem, e 65.000 vezes maior do que na Pichia não transformada. O pH óptimo da fitase expressa era de 2,5 e de 5,5, e a temperatura óptima era de 60 °C. De um modo semelhante, expressa-se appA em Pichia e em Saccharomyces cerevisiae, com uma proteína resultante exibindo uma actividade extracelular muito mais elevada e com um pH óptimo de 2,5 a 3,5.

Uma concretização preferida da invenção é uma proteína ou um polipéptido que tenham actividade como fitase e uma actividade óptima a uma temperatura na gama de 57 a 65°C. Uma concretização mais preferida é uma proteína ou um polipéptido que tenham actividade de fitase, uma actividade óptima a uma temperatura na gama de 58 a 62°C. A AppA é uma proteína, ou um polipéptido, com uma actividade de fitase, em que a proteína mantenha pelo menos 60 % da sua actividade depois de ser aquecida durante 15 minutos a 60°C.

Pode obter-se proteína purificada por diversos métodos. A proteína ou o polipéptido da invenção presente é produzida preferivelmente sob uma forma purificada (preferivelmente a pelo menos 80 %, mais preferivelmente a 90 % de pureza) por técnicas convencionais. Tipicamente, a proteína ou o polipéptido da invenção presente são segregados para o meio de crescimento de células hospedeiras recombinantes. Em alternativa, a proteína ou o polipéptido da invenção presente são produzidos mas não são segregados para o meio de crescimento. Nesses casos, para se isolar a proteína, propaga-se a célula hospedeira portadora de um plasmídeo recombinante, lisa-se por sonicação, termicamente, ou por tratamento químico, e centrifuga-se o homogenado para se removerem os restos de células. Submete-se então o sobrenadante a uma precipitação sequencial com sulfato de amónio. A fracção contendo o polipéptido ou a proteína da invenção presente é submetida a uma filtração sobre gel, numa coluna em dextrana ou poliacrilamida e com dimensão adequada, para separar as proteínas. Caso seja necessário, pode purificar-se mais a fracção proteica por HPLC. A utilização presente também emprega uma estirpe de levedura com um gene heterólogo que codifica para uma proteína ou um polipéptido com actividade como fitase. 0 gene heterólogo deve estar funcionalmente ligado a um promotor capaz de expressar a fitase em levedura.

Ainda outro aspecto da invenção é a utilização de um vector para expressar fitase em levedura. 0 vector é portador de um gene de um organismo não levedura que codifica para uma proteína ou um polipéptido com actividade de fitase. 0 gene de fitase pode ser clonado em qualquer vector que se replica autonomamente ou que se integra no genoma da levedura. 0 número de cópias dos plasmídeos com replicação autónoma, por exemplo plasmídeos YEp, pode ser elevado, mas a sua estabilidade à mitose pode ser insuficiente (Bitter et al., "Expression and Secretion Vectors for Yeast", Meth. Enzymol. 153: 516-44 (1987)). Eles podem conter a sequência plasmídica 2 miu responsável pela replicação autónoma, e uma sequência de E. coli responsável pela replicação em E. coli. Os vectores contêm preferivelmente um marcador genético para a selecção de transformantes de levedura, e um gene de resistência a antibiótico para sua selecção em E. coli. Os vectores epissomais contendo as sequências ARS e CEN ocorrem a uma única cópia por célula, e eles são mais estáveis do que os vectores YEp. Utilizam-se vectores integrativos quando se integra um fragmento de ADN, em uma ou diversas cópias, no genoma da levedura. Neste caso, o ADN recombinante é estável e não é necessária nenhuma selecção (Struhl et al., "High-Frequency Transformation of Yeast: Autonomous Replication of Hybrid ADN Molecules", Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 76: 1035-39 (1979); Powels et al., Cloning Vectors, I-IV. et seq. Elsevier, (1985); Sakai et al. , "Enhanced Secretion of Human Nerve Growth Factor from Saccharomyces Cerevisiae Using an Advanced δ-Integration System", Biotechnology 9: 1382-85 (1991)). Alguns vectores têm uma origem de replicação, que funciona na célula hospedeira seleccionada. Incluem-se nas origens de replicação adequadas 2μ, ARS1, e 25μΜ. Os vectores têm locais de endonuclease de restrição adequados para a inserção das sequências do gene de fusão e do promotor, e marcadores de selecção. Podem modificar-se os vectores por remoção ou por adição de locais de restrição, ou por remoção de outros nucleótidos não pretendidos.

Pode colocar-se o gene de fitase sob o controlo de qualquer promotor (Stetler et al., "Secretion of Active, Full- and Half-Length Human Secretory Leukocyte Protease Inhibitor by Saccharomyces cerevisiae", Biotechnology 7: 55-60, (1989)). Pode escolher-se um promotor constitutivo ou regulado de levedura. Incluem-se nas sequências adequadas para promotores de vectores em leveduras, entre outras, promotores para a metalotioneina, 3-fosfoglicerato quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) ou outros enzimas glicoliticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); e Holland et al., Biochem. 17: 4900, (1978)), tais como enolase, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase, e glucoquinase. Outros vectores e promotores adequados para utilização na expressão são além disto descritos no EP A-73.657 de Hitzeman, que deste modo se incorpora neste documento por citação. Outra alternativa é o promotor ADH2 repressivel por glucose descrito por Russell et al., J. Biol. Chem. 258: 2674 (1982) e por Beier et al., Nature 300: 724 (1982) .

Pode seleccionar-se um promotor de levedura constitutivo ou regulado. Os promotores fortes de, por exemplo, gene de fosfoglicerato quinase (PGK), de outros genes codificando para enzimas glicolíticos, bem como o gene do factor alfa, que são constitutivos. Quando se utiliza um promotor constitutivo, o produto é sintetizado durante o crescimento celular. 0 promotor ADH2 é regulado com etanol e glucose, os promotores GAL-1-10 e GAL7 com galactose e glucose, o promotor PH05 com fosfato, e o promotor de metalotionina com cobre. Os promotores de choque térmico, aos quais pertence o promotor HSP150, são regulados pela temperatura. Também se podem utilizar promotores híbridos. Utiliza-se um promotor regulado quando a expressão em contínuo do produto pretendido for nociva para as células hospedeiras. Em vez de promotores de levedura, pode utilizar-se um promotor procariótico forte tal como ο T7, mas neste caso a estirpe de levedura tem que ser transformada com um gene codificando para a polimerase respectiva. Para terminação da transcrição, pode utilizar-se o terminador HSP150, ou qualquer terminador funcional. Neste caso, os promotores e os terminadores são denominados elementos de controlo. A invenção presente não se restringe a nenhum vector específico, nem a um promotor, nem a um terminador. 0 vector também pode ser portador de um marcador seleccionável. Os marcadores seleccionáveis são amiúde genes de resistência a antibióticos ou genes capazes de proporcionar complementos a estirpes de levedura com deficiências metabólicas caracterizadas, tais como mutantes deficientes em triptofano ou em histidina. Os marcadores seleccionáveis preferidos incluem URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4, ou genes de resistência a antibiótico. 0 vector também pode ter uma origem de replicação capaz de replicação numa célula bacteriana. A manipulação de vectores é mais eficiente em estirpes bacterianas. As origens de replicação bacterianas preferidas são ColEl, Ori, ou oriT.

Pode utilizar-se uma sequência lider quer dos genes da levedura ou da fitase ou de outras fontes para suportar a secreção do enzima de fitase expresso para o meio. A invenção presente não se restringe a nenhum tipo especifico de sequência lider nem de péptido de sinalização.

Incluem-se nas sequências lider adequadas a sequência lider do factor alfa de levedura, que se pode empregar para dirigir a secreção da fitase. Amiúde insere-se a sequência lider do factor alfa entre a sequência do promotor e a sequência do gene estrutural (Kurjan et al. , Cell 30: 933, (1982); Bitter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 5330, (1984); Patente U.S. N2 4.546.082; e pedido publicado de patente Europeia N2 324.274) . Outra sequência lider aplicável é a sequência MF alfa 1 (de factor alfa) de S. cerevisiae, sintetizada sob a forma de uma pré-proteina com 165 aminoácidos incluindo o sinal ou de um pré-péptido com 19 aminoácidos seguido por um "líder" ou pró-péptido com 64 aminoácidos incluindo três locais de glicosilação ligados por N seguidos por (LysArg(Asp/Glu, Ala)2-3 factor alfa)4 (Kurjan, et al., Cell 30: 933-43 (1982)). Tem-se empregue largamente a parte de sinal e líder da pré-proteína MF alfa 1 para se obter a síntese e a secreção de proteínas heterólogas em S. cerivisiae. A utilização de péptidos sinal/líder homólogos aos de levedura é conhecida da Patente U.S. N2 4.546.082, dos Pedidos de Patente Europeia Nos 116.201; 123.294; 123.544; 163.529; e 123.289 e do Pedido de Patente DK N2 3.614/83. No Pedido de Patente Europeia N2 123.289, que deste modo se incorpora neste documento por citação, é descrita a utilização do precursor do factor alfa de S. cerevisiae, enquanto no WO 84/01.153, indica-se a utilização do péptido de sinal de invertase de Saccharomyces cerevisiae, e no Pedido de Patente Alemã DK 3.614/83, que deste modo se incorpora neste documento por citação, indica-se a utilização do péptido de sinal PH05 de Saccharomyces cerevisiae para a secreção de proteínas com outra origem.

Também se pode utilizar o sinal de factor alfa-líder de Saccharomyces cerevisiae (MF alfa 1 ou MF alfa 2) no processo de secreção de proteínas heterólogas expressas em leveduras (Patente U.S. N2 4.546.082, Pedidos de Patente Europeia Nos 16.201; 123.294; 123.544; e 163.529) . Fundindo uma sequência de ADN codificando para a sequência do sinal MF alfa 1/líder de S. cerevisiae no terminal 5' do gene para a secreção proteica pretendida, demonstrou-se o processamento da proteína pretendida. A utilização do sinal peptídico da amílase salivar de murganho (ou de um seu mutante) para proporcionar a secreção de proteínas heterólogas expressas em levedura foi descrita nas Publicações de Pedidos de PCT Nos WO 89/02.463 e WO 90/10.075. A Patente U.S. N2 5.726.038 descreve a utilização do péptido de sinal da protease aspártica 3 de levedura, que é capaz de proporcionar uma secreção melhorada de proteínas expressas em levedura. Outras sequências líder adequadas para facilitar a secreção de polipéptidos recombinantes a partir de leveduras hospedeiras são conhecidas dos especialistas da técnica. Uma sequência líder pode ser modificada na vizinhança do seu terminal 3' para conter um ou mais locais de restrição. Isto facilitará a fusão da sequência líder ao gene estrutural.

Os especialistas da técnica conhecem protocolos de transformação de leveduras. Um desses protocolos foi descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 1929 (1978). O protocolo de Hinnen et al. selecciona transf ormantes de Trp num meio selectivo, em que o meio selectivo é constituído por 0,67 % de base azotada de levedura, 0,5 % de aminoácidos cas, 2 % de glucose, 10 pg/mL de adenina e 20 pg/mL de uracilo.

Pode manter-se o gene num vector de expressão estável, num cromossoma artificial, ou por integração no cromossoma da célula de levedura hospedeira. Pode conseguir-se a integração no cromossoma clonando o gene de fitase num vector que recombinará com um cromossoma de levedura. Os vectores adequados podem incluir sequências de nucleótidos que são homólogas das sequências de nucleótidos do cromossoma de levedura. Em alternativa, o gene da fitase pode localizar-se entre locais de recombinação, tais como elementos transponíveis, que podem mobilizar o gene para dentro do cromossoma. A especificação presente também ilustra um método de produzir fitase proporcionando um gene isolado appA, que codifica para uma proteína ou um polipéptido com actividade de fitase, e expressando o gene numa célula hospedeira. Na utilização da invenção, o gene appA é preferivelmente isolado a partir de Escherichia coli. Incluem-se nas células hospedeiras preferidas as de leveduras ou de fungos filamentosos. 0 fungo filamentoso preferido é Aspergillus niger e as leveduras preferidas são Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora, e Schizosaccharomyces, em especial a estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae.

Também se proporciona a utilização de AppA bacteriano para transformar fitato em inositol e fósforo inorgânico. Isola-se um gene appA de um organismo, utilizando metodologias bem conhecidas na técnica. Expressa-se então uma proteína ou um polipéptido com actividade de fitase deste gene numa célula hospedeira. Mistura-se a proteína ou o polipéptido resultantes ou leva- se ao contacto com fitato. Esta técnica é especialmente útil para tratar fitato em alimentos ou em alimentos para animais. 0 gene appA preferido é isolado de Escherichia coli .

Enquanto o enzima fitase produzido num sistema de levedura liberta fitato-P a partir de milho e de soja tão eficazmente como a fitase comercial corrente, ele parece ser mais estável termicamente. Este sistema de sobre-expressão de fitase em levedura pode ser utilizado para proporcionar fitase termicamente estável para utilização nas indústrias alimentar e de rações.

EXEMPLOS

Marcam-se os Exemplos de referência com *Exemplo 1 - Materiais e Métodos para Sobre-expressar PhyA em E. Coli, S. Lividans, e num sistema de Saccharomyces.

Gene de fitase, estirpes hospedeiras, e plasmideos de expressão. 0 gene da fitase, phyA, foi amavelmente cedido pelo Dr. E. J. Mullaney do USDA. 0 gene (número de acessão no GenBank M94550) estava contido no plasmideo pMD4.21 na estirpe HB101 de E. coli. Um fragmento de 2,7 kb Sphl do ADN de A. niger continha a região de codificação da fitase desglicosilada e as suas sequências de flanco a 5' e a 3' . 0 Dr. X. L. Li da University of Georgia amavelmente cedeu um plasmideo contendo a sequência do péptido de sinal, Spxy, do gene activo de xilanase de Aureobasidum pullulans (número de acessão no GenBank U10298) . Utilizou-se a estirpe DH5a de E. coli como hospedeiro inicial para todos os plasmideos recombinantes. Para expressar phyA em E. coli, utilizaram-se o vector de expressão pET25b(+) (Novagen, Madison, WI) e o hospedeiro de expressão BL21 (DE3)pLysS. Para se expressar phyA em S. lividans TK 24, utilizou-se o plasmideo pSESl (Jung, E.D. et al.r "DNA Sequences and Expression in Streptomyces Lividans glucanase Gene and an Endoglucanase Gene from Thermomonospora Fusca", Appl. Environ. Microbiol., 59: 3032-43 (1993)), para construir o plasmideo de transporte (cedido pelo Dr. D. B. Wilson da Cornell University que o havia obtido do Dr. D. A. Hopwood, John Innes Institute, Norwich, Inglaterra). Para expressar phyA em levedura, utilizou-se o vector de expressão pYES2 e para hospedeiro a estirpe INVScl de S. cerevisiae (Invitrogen, San Diego, CA) .

Construções e transformações de plasmideos em cassete. Todos os plasmideos construídos e os correspondentes hospedeiros estão listados na Tabela 1. Amplificou-se um fragmento do gene phyA com 1,4 kb por PCR a partir do pMD4.21 utilizando dois iniciadores: a montante 5' - CGG AAT TCG TCA CCT CCG GAC T - 3' (SEQ ID No. 1) e a jusante 5' - CCC AAG CTT CTA AGC AAA ACA CTC - 3' (SEQ ID

No. 2) . 0 fragmento resultante continha a codificação para a sequência da fitase desglicosilada de A. niger, PhyA, e os locais de restrição EcoRI e HindIII respectivamente a montante a jusante. Depois de uma purificação com o estojo Geneclean II (BiolOl, Inc., La Jolla, CA), inseriu-se o fragmento em pET25b(+), e transformou-se a construção resultante pEPl (6893 pb) em BL21 (DE3)pLysS após uma confirmação inicial em células DH5a. A expressão estava sob o controlo do promotor T7 seguida pela sequência líder (pel B) codificando para 21 aminoácidos, e phyA. 0 hospedeiro transformado apenas com o vector pET25(+) foi utilizado como controlo.

Tabela 1. Vectores de expressão, construções, e estirpes hospedeiras utilizadas neste trabalho

A construção do plasmídeo para expressão de phyA em S. lividans começou com a síntese de um fragmento contendo o promotor pLTl e o péptido sinal Spe2 (Lao, G. et al. , "DNA Sequences of Three Beta-1,4-endoglucanase Genes From Thermomonospora Fusca", J. Bacteriol., 173: 3397-407 (1991)) por PCR. Utilizou-se um iniciador a montante, 5' -CAG CTA TGA CCA TGA TTA CGC C - 3' (SEQ ID No. 3), e urn iniciador a jusante, 5' - CCT AGA ACG GGA ATT CAT TGG CCG CC - 3' (SEQ ID No. 4), contendo respectivamente os locais de restrição PstI e EcoRI. Aplificou-se o fragmento de pBW2 (Jung, E.D. et al., "DNA Sequences and Expression in Streptomyces Lividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene From Thermomonospora Fusca", Appl, Environ. Microbiol., 59: 3032-43 (1993)) e depois digeriu-se com PstI e EcoRI, enquanto se digeriram a construção pEPl e o plasmídeo pBluescript SK+ (Strategene, La Jolla, CA) respect ivamente com EcoRI e Hindlll, e com PstI e Hindi11. Purificaram-se subsequentemente os três fragmentos digeridos utilizando o estojo Geneclean II, e ligaram-se a uma única construção recombinante que continha os locais de restrição pretendidos de PstI e Kpnl (do pBluescript SK*), promotor pLTl e péptido lider Spe2 da endoglucanase E2 (551 pb, Lao, G. et al., "DNA Sequences of Three Beta-1,4-endoglucanase Genes From Thermomonospora Fusca", J. Bacteriol., 173: 3397-407 (1991)), e o gene phyA (1365 pb). Depois de se digerir a construção com PstI e Kpnl, inseriu-se o fragmento resultante no vector de expressão pSESl, e transformou-se o plasmideo de transporte formado (pSPPl, 9131 pb) nos protoplastos do hospedeiro S. lividans consoante Hopwood et al. (Hopwood, D.A., et al., Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, Inglaterra (1985)). Da mesma forma, preparou-se um controlo transformando S. lividans com o vector de expressão pSES2.

Construiram-se três plasmideos de transporte com três sequências de sinalização peptidicas para expressar phyA no sistema de levedura (Veja-se a Tabela 2). O primeiro plasmideo provinha de um fragmento digerido HindIII de pSPpl, incluindo o promotor pLTl, a sequência lider Spe2, e a sequência da região de codificação de phyA. Ligou-se o fragmento ao local HindIII de pYES2 tratado com fosfatase alcalina intestinal de vitelo e denominou-se o plasmideo pYEPl (7783 pb) depois de se confirmar a sua orientação correcta. O segundo plasmideo continha Spxy, uma sequência peptidica sinal do gene de xilanase de A. pullulans (Li, X.L. et al., "Cloning, Sequencing, and

Regulation of a Xylanase Gene From the Fungus Aureobasidium Pullulans) Y-2311-1", Appl. Environ. Microbiol., 60: 3160- 166 (1994); Li, X.L. et al., "Expression of Aureobasidium

Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From, Saccharomyces Cerevisiae", Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996)), e o gene de phyA. Juntou-se a Spxy o gene phyA por extensão de sobreposição (Horton, R.M., "In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA: SOEing Together

Tailor-Made Genes", PCR Protocols: Current Methods and

Applications, 251-61 (1993)) com dois passos sucessivos de PCR. Um destinava-se a amplificar a sequência Spxy de pCE4 (Li, X.L. et al. , "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From Saccharomyces Cerevisiae", Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996)) utilizando o iniciador a montante (5' - CCC AAG CTT GAT CAC ATC CAT TCA - 3') (SEQ ID No. 5) com um local de restrição HindIII (iniciador 1) e o iniciador de sobreposição a jusante (5' - CGG GGA CTG CTA GCG CAC GTT CGA T - 3',

iniciador 2) (SEQ ID No. 6) . O outro PCR destinou-se a amplificar a região de codificação de phyA de pEPl utilizando um iniciador de sobreposição a montante (5' ATC GAA CGT GCG CTA GCA GCA GTC CCC G - 3', iniciador 3) (SEQ ID No. 7) e um iniciador a jusante (5' - GCT CTA GAC TAA GCA AAA CAC TCC - 3', iniciador 4) (SEQ ID No. 8) com um local de restrição Xbal. Levou-se a cabo o segundo passo de PCR para juntar os dois fragmentos gerados nos dois PCR acima, utilizando os dois fragmentos purificados como moldes e os iniciadores 1 e 4. O fragmento resultante continha os locais de restrição HindIII e Xbal e foi clonado em pSES2. Denominou-se este plasmídeo pYXPl (7219 pb). 0 terceiro plasmideo continha a sequência peptidica de sinal (Sphy) de phyA e a região de codificação de phyA, excluindo o intrão entre elas (Hartingsveldt, W. van., et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127: 87-94 (1993)) . Utilizaram-se dois iniciadores, incluindo urn com 70 pb do iniciador a montante contido no péptido de sinal com uma adição de um local de restrição Kpnl, e um iniciador a jusante que era o mesmo que se utilizou para a construção pYXPl (iniciador 4), para amplificar o fragmento pretendido de pEP 1. Digeriu-se o produto de PCR com Kpnl e Xbal e clonou-se em pSES2, resultando um plasmideo denominado pYPPl (7176 pb) . Transformaram-se todas as três construções acima em S. cerevisiae pelo método de Ito et al., "Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations", J. Bacteriol., 153: 163-68 (1983).

Tabela 2. Péptidos de sinal utilizados para a expressão de phyA em S. cerevisiae

Meio de crescimento e indução da expressão do gene. No sistema em E. coli, cresceram-se os transformantes em 50 mL de meio LB contendo 50 pg/mL de ampicilina a 30°C. Depois do valor de D06oo do meio haver atingido 0,5 a 0,6, induziu-se a expressão do gene de fitase por adição de IPTG (β-D-tiogalactopiranósido de isopropilo) no meio, até a uma concentração final de 1 mM. Três horas depois da indução, recolheram-se as células por centrifugação a 8.000 x g durante 15 minutos, lavaram-se com 1 x PBS, e lisaram-se com lisozima. Prepararam-se fracções solúveis e insolúveis das células, e suspendeu-se uma amostra contendo 500 pg no total de proteína (Lowry, O.H. et al., "Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent", J. Biol. Chem., 193: 265-75 (1951)) no mesmo volume de tampão 2 x SDS, analisando-se por SDS-PAGE (LaemmLi, U.K., "Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4", Nature (Londres), 227: 680-85 (1970)).

Cultivou-se S. lividans recombinante em caldo TSB com 5 pg/mL de thiostrepton a 30°C (Jung, E.D. et al., "DNA Sequences and Expression in Streptomyces Lividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene from Thermomonospora Fusca", Appl. Environ. Microbiol., 59: 3032-43 (1993) ) . Ao fim de 72 horas de incubação, recolheram-se as células e o meio e prepararam-se para SDS-PAGE (Wilson, D.B., "Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases", Crit. Rev. Biotechnol., 12: 45-63 (1992)).

Cultivaram-se inicialmente os transformantes de S. cerevisiae em meio Sabouraud-rafinose (a 4 %) (100 mL) sem uracilo durante 48 horas, adicionou-se então ao meio galactose estéril (2 %) para induzir a expressão da fitase. Recolheram-se amostras do meio e células em diversas alturas, e prepararam-se amostras extracelulares e intracelulares tal como descrito por Li e Ljungdahl, "Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of the Xylanase from, Saccharomyces cerevisiae", Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996). Quando necessário, concentrava-se o sobrenadante das fracções da cultura de células expressa com Stirred Cells da Amicon (Beverly, MA) utilizando membranas YM10 (corte de MM a 10.000) . Testaram-se os outros meios da mesma forma.

Ensaio da actividade enzimática da proteina e da sua actividade. Quantificaram-se as quantidades de proteína fitase expressa em várias condições, através da densitometria relativa de bandas específicas em SDS-PAGE, utilizando o Sistema de Imagiologia Digital IS-1000 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) . Determinou-se a actividade de fitase nas amostras de meio e de células tal como anteriormente descrito (Piddington, C.S. et ai., "The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori", Gene, 133: 56-62 (1993)) e determinou-se o fosfato inorgânico libertado pelo método de Chen, P.S. et al., "Microdetermination of P", Anal. Chem., 28: 1756-58 (1956) . Definiu-se uma unidade de fitase (PU) como a quantidade de enzima que liberta uma pmol de fosfato inorgânico do fitato de sódio por minuto a 37°C.

Análise por Transferência Western (imunotransferência). Recolheu-se a fracção solúvel da massa celular de E. coli transformado com fitase e o meio sobrenadante de transformantes de S. lividans e de S. cerevisiae tal como para SDS-PAGE. Depois da electroforese, transferiram-se as proteínas para sobre membranas de nirocelulose Protran® (Schleicher & Schuell, Keene, NH, EUA) em Tris-HCl 20 mM (pH 8,3), com 20 % de metanol, e 0,1 % de SDS, utilizando uma célula Mini Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories). A transferência ocorreu de um dia para o outro a 50 V constantes e a temperatura inicial do tampão era de 4°C. Submeteram-se então as membranas a uma análise por transferência Western. Utilizou-se a título de primeiro anticorpo um IgG policlonal de coelho (amavelmente cedido pelo Dr. A. H. J. Ullah do USDA. Diluição a 1: 5.000) contra fitase purificada nativa de A. niger. Terminou-se a transferência utilizando o Estojo de Ensaio Immuno-Blot (Bio-Rad Laboratories) contendo um segundo anticorpo conjugado com peroxidase de rábano.

Isolamento e análise do ARN total. Isolou-se o ARN total com o reagente TRIzol™ (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) a partir dos transformantes de E. coli e de S. cerevisiae, respectivamente 3 e 15 horas após a indução. Separaram-se então amostras de ARN (10 pg por pista) por electroforese de gel com formaldeído agarose (a 1,5 %, em peso por volume), e transferiram-se para membranas Hyblot (National Labnet, Woodbridge, NJ) (Davis et ai., Basic Methods in Molecular Biology, 2a Edição, Appleton e Lange, Norwalle, Ct. (1994)) . Preparou-se um fragmento de 1,4 kb de EcoRI-HindlII no plasmídeo pEP 1 e marcou-se aleatoriamente com 32P utilizando um estojo de marcação de ADN e em seguida uma purificação em coluna G-50 (Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ) , e depois hibridizou-se com as membranas de ARN da transferência numa estufa de hibridização (Hybaid, Middlesex, Reino Unido). Expuseram-se as membranas hibridizadas a peneiros numa Placa de Imagiologia Fuji e analisaram-se no Analisador de Bio-Imagiologia (Kohshin Graphic Systems, Fuji, Japão). *Exemplo 2 - Expressão de PhyA em E. coli.

Quatro horas após a indução, observou-se uma banda específica (~55 kDa) no SDS-PAGE (a 12,5 %) da fracção solúvel de células, comparada com o único controlo de vector de expressão transformado (Veja-se A nas Figuras 1 e 2) . Esta banda representava 3,8 % da proteína solúvel total desta fracção. Correspondentemente, uma análise Northern denotava uma sobre-expressão do mARN de phyA nestes transformantes do gene de fitase e não se observava nenhum sinal nos poços de controlo (Veja-se a Figura 3).

Para se optimizar a expressão da proteína fitase, estudou-se o seu decurso ao longo do tempo e os efeitos de diversos factores sobre a expressão. Nestes factores incluía-se a temperatura de incubação (30 e 37°C), o pH do meio (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, e 9,0), a anaerobiose (adicionando óleo mineral estéril por cima das células em crescimento), o teor em fosfato inorgânico no meio (Dassa, E. et al., "The Acid Phosphatases with Optimum pH of 2.5 of Escherichia coli", J. Bio. Chem., 257: 6669-76 (1982)), e o teor em fitato de sódio (0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, e 0,5 mM) . Os resultados indicavam que a expressão da proteína fitase se acumulava linearmente ao longo do tempo durante as primeiras seis horas após a indução (Veja-se a Figura 4) . Em seguida, a expressão permanecia relativamente constante embora as células bacterianas continuassem a crescer. Só o pH do meio e a concentração em fitato de sódio afectavam significativamente a expressão da proteína fitase. Obteve-se um máximo de proteína a pH 6,0 com fitato de sódio 0,3 mM, tendo a proteína fitase aumentado de 3,8 para 9,6 % da proteína solúvel total. Não se detectou actividade de fitase extracelularmente nem intracelularmente. Isto pode não ser completamente inesperado, porque a fitase nativa de A. niger é uma glicoproteína com uma dimensão de 70-80 kDa (Hartingsveldt et al., "Cloning, Characterization and

Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127: 87-94 (1993)). A proteína expressa no sistema de E. coli deste trabalho tem uma dimensão de cerca de 55 kDa. Presumivelmente, a falta de glicosilação da proteína e de outras modificações necessárias após a tradução durante a secreção impediria a actividade da fitase. *Exemplo 3 - Expressão de PhyA em S. lividans. Já foram expressos genes heterólogos em S. lividans, sendo os produtos resultantes segregados para o meio com actividade enzimática (Ghangas, G.S. et ai., "Cloning of the Thermomonospora Fusca Endoglucanase E2 Gene in Streptomyces Lividans: Affinity Purification and Functional Domains of the Cloned Gene Product", Appl. Environ. Microbiol., 54: 2521-26 (1988); Wilson, D.B., "Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases", Crit. Rev. Biotechnol., 12: 45-63 (1992); Jung, E.D. et al., "DNA Sequences and Expression in Streptomyces Lividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene from Thermomonospora Fusca", Environ. Microbiol., 59: 3032-43 (1993)). De um modo semelhante, o gene phyA foi expresso em S. lividans e a proteína foi introduzida no meio, tal como se ilustra numa banda específica nas amostras de meio analisadas por SDS-PAGE (Veja-se A nas Figuras 5 e 6). Isto sugere que o péptido de sinal do gene da endoglucanase E2 de T. fusca era capaz de levar a proteína fitase para fora da célula. Esta proteína tinha 57 kDa e representava 16,2 % da proteína total no meio. Mudando o pH do meio para 6,0 e adicionando fitato de sódio 0,3 mM ao meio melhorava o rendimento naquela proteína para 20,3 % da proteína total. Dado que a proteína fitase era segregada para o meio com urn teor tão elevado, ela deveria ser fácil de purificar e utilizar eficazmente para diversos objectivos, tais como produzir-se anticorpo contra fitase. Mais uma vez, não se observou aumento da actividade de fitase nem no meio nem nas células Usadas. Embora a dimensão da proteína tivesse aumentado ligeiramente (2-3 %) em comparação com a expressa em E. coli, presumivelmente devido à glicosilação da proteína fitase neste sistema de expressão, ainda não existia nenhuma actividade de fitase. *Exemplo 4 - Expressão de PhyA em S. cerevisiae.

Utilizaram-se três péptidos de sinal diferentes para comparar a eficiência em levar a proteína expressa para fora das células (Veja-se a Tabela 2). A actividade de fitase tinha aumentado substancialmente no meio de Sabouraud-rafinose de cultivo dos transformantes de pYEPl e pYPPl, mas não de pYXPl. A proteína fitase tornou-se visível num SDS-PAGE feito 20 horas depois da indução (A da Figura 7).

As expressões dos transformantes de pYEPl e de pYPPl foram determinadas em três tipos diferentes de meio: Sabouraud-rafinose (Li, X.L. et al., "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the

Xylanase From, Saccharomyces Cerevisiae", Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996)), Sabouraud-glicerol, e um meio YEPD para aplicação geral. Quanto aos transformantes de pYEPl, expressaram actividades de fitase semelhantes em meio Sabouraud-raf inose e em meio Sabouraud, mas não se detectou nenhuma actividade no meio YEPD. Em contraste, a actividade de fitase no meio de cultura com transformantes de pYPPl variava muito com os três tipos de meio. A actividade aumentava para 375 mU/mL utilizando meio Sabouraud-glicerol. A actividade aumentava mais para 1.675 mU/mL quando se alterava o meio para YEPD (Veja-se a Tabela 3) . Se por um lado o meio YEPD era muito mais barato que o meio Sabouraud-rafinose, o rendimento em fitase aumentava mais do que dez vezes. Portanto, o péptido de sinal putativo do gene da fitase de fungo conseguia a expressão mais eficiente da actividade extracelular de fitase. Quase toda a proteína produzida era segregada para o meio YEPD, atento que se detectava muito pouca actividade nas células de levedura. O decurso ao longo do tempo da expressão da fitase está representado em a Figura 8.

Tabela 3. Actividade de fitase expressa de transformante com pYPPl em diferentes meios

Uma série de micro-organismos incluindo bacilos, leveduras, e fungos filamentosos têm actividade de fitase, enquanto a estirpe A. niger NRRL3135 produz a maior actividade (340 mU/mL, Shieh, T.R. et al., "Survey of Microorganisms for the Production of Extracellular

Phytase", Appl. Environ. Microbiol., 16: 1348-51 (1968)). A

Schwanniomyces castellii CBS 2863 apresenta a maior actividade de fitase de entre 21 estirpes de levedura (140 mU/mL, Lambrechts, C. et al., "Utilization of Phytate by Some Yeasts", Biotechnology Letters, 14: 61-6 (1992)).

Claramente, a estirpe de levedura recombinante transformada com pYPPl neste trabalho produz uma actividade de fitase muito maior (1.675 mU/mL) do que A. niger (4 vezes) e do que S. castellii CBS 2863 (11 vezes) . Pode obter-se uma produção máxima de fitase no sistema optimizando as condições de incubação e modificando as cassetes de plasmideo (Demolder, J.W. et al., "Efficient Synthesis of Secreted Murine Interleukin-2 by Saccharomyces Cerevisiae:

Influence of 3'-Untranslated Regions and Codon Usage", Gene, 111: 207-13 (1992)). 0 teor elevado da expressão da actividade de fitase em S. cerevisiae foi com a maior probabilidade devido a uma glicosilação suficiente da proteína fitase e a outras modificações após a tradução, pela levedura. Depois de se concentrar o meio sobrenadante e de se submeter a uma análise por SDS-PAGE, existia uma banda com cerca de 110 kDa (Veja-se A nas Figuras 7 e 9) , com dimensão maior do que a da proteína nativa de A. niger (Hart ingsveldt, W. van. et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127: 87-94 (1993)). Uma análise Northern confirmou a sobre-expressão específica do mARN de phyA (Veja-se a Figura 10) . Estes resultados indicam que o sistema de levedura era eficiente para sobre-expressar activamente o enzima fitase extracelular. O sistema em levedura tem diversas vantagens sobre as bactérias ou outros sistemas tais como A. niger (Hartingsveldt, W. van et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127: 87-94 (1993)).

Ele leva a cabo modificações após a tradução, incluindo uma dobragem adequada, glicosilação, formação de ligações dissulfureto, e proteólise, durante a translocação de proteínas através do retículo endoplásmico e a membrana celular. A secreção de proteínas é facilitada por péptidos curtos e hidrofóbicos de sinalização nas regiões dos terminais N dos precursores de proteína (Li, X.L. et al., "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From, Saccharomyces Cerevisiae", Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996)). As proteínas segregadas por células de levedura estão protegidas contra a agregação e contra a degradação por proteases. De um modo com a maior importância, as proteínas enzimáticas produzidas por S. cerevisiae são facilmente purificadas, porque ele segrega apenas umas poucas proteínas. Considerando a segurança bem conhecida dos produtos de leveduras tanto para seres humanos como para animais, este sistema possui um grande potencial para as indústrias de alimentos humanos e de alimentos para animais. *Exemplo 5 - Propriedades da Fitase PhyA Sobre-expressa em Saccharomyces cerevisiae. A fitase sobre-expressa dos transformantes do plasmídeo pYPPl foi concentrada e utilizada para estudar as suas propriedades (Veja-se a Tabela 4) . O enzima exibia duas gamas de pH óptimo: 2 a 2.5 e 5,0 a 5,5. No entanto, a actividade enzimática a pH 2 a 2,5 era apenas 60 % da actividade a pH 5 a 5,5. Não se detectava nenhuma actividade nem a pH 1 nem a pH 8. O pH óptimo era virtualmente o mesmo do que para a fitase de A. niger (Simons et ai., "Improvement of Phosphorus Availability by Microbial Phytase in Broilers and Pigs", Br. J. Nutr., 64: 525 (1990)), e portanto seria certamente de esperar uma função activa de hidrólise do fitato-P nos tractos gastrointestinais. A temperatura óptima para o enzima era de 60°C, enquanto para o que existe correntemente no mercado, produzido pela Gist-Brocades, ela é de 55°C (BASF, 1996) . Mais do que 80 % da actividade era exibida a entre 50 e 55°C, mas detectava-se pouca actividade a 75 ou a 80°C. Aquecendo o enzima durante 15 minutos a 37 e a 80°C, a actividade remanescente da fitase expressa na levedura da invenção presente era respectivamente de 100 e de 63 %, e para a fitase da BASF Gist-Brocades era respectivamente de 100 e 52 %. As diferenças entre as duas fontes de enzimas a qualquer temperatura eram significativas (Veja-se a Tabela 5). Portanto, a fitase da levedura parece ser termicamente mais estável do que o produto de fitase correntemente no mercado.

Tabela 4. Caracteristicas da fitase sobre-expressa em levedura1

Tabela 5. Comparação da estabilidade térmica da fitase sobre-expressa em levedura com a da fitase Gist-Brocades produzida por A. niger1'2

Embora não seja claro como esta melhoria da estabilidade térmica se relaciona com diversas modificações após a tradução (dobragem, clivagem, glicosilação, etc.), (Li, X.L. et al. , "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From Saccharomyces Cerevisiae", Appl. Environ. Microbiol., 62: 209-13 (1996), que deste modo se incorpora neste documento por citação), é com certeza vantajoso dispor de um enzima fitase termicamente mais estável de que possa esperar-se maior resistência ao calor durante a granulação do alimento composto para animais, que é um problema com a fitase da Gist-Brocades utilizado hoje em dia.

* Exemplo 6 - Hidrólise In Vitro de Fitato-P existente em Farelos de Milho, Soja e Trigo pela Fitase Expressa em Levedura. A fitase expressa em levedura libertava fitato-P de bagaço de milho e de soja tão eficazmente como a fitase da Gist-Brocades, com base na actividade por unidade (Veja-se a Tabela 6) . Tal como era de esperar, a hidrólise do fitato-P era função do tempo e da dosagem da actividade. A fitase expressa em levedura também era eficaz em libertar fitato-P de farelo de trigo, indicando o seu grande potencial na fermentação de pão. Uma vez que o farelo de trigo utilizado neste trabalho continha uma actividade intrínseca de fitase muito maior do que na farinha de trigo habitualmente utilizada, seria de esperar um efeito muito maior da fitase expressa em levedura na melhoria da hidrólise de fitato-P da farinha bem como na libertação de elementos vestigiais, quando utilizada numa padaria ou pastelaria (Hall, M.N. et al.r "The Early Days of Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993), que sete modo se incorpora neste documento, por citação).

Tabela 6. Fósforo livre libertado a partir de milho, farinha de soja (SBM), e farelo de trigo, pela fitase sobre-expressa em levedura e pela fitase do fungo A. niger in vitro1

Compararam-se as sobre-expressões de fitase de Aspergillus niger (phyA) e Escherichia coli, Streptomyces lividans, e em Saccharomyces cerevisiae, para se desenvolver um sistema simples e eficaz de produzir economicamente a fitase. Expressou-se uma proteína intracelular solúvel com 55 kDa, representando 9,6 % da proteína solúvel total, em E. coli utilizando o sistema pET25b(+). Expressou-se uma proteína extracelular com 57 kDa, representando 20,3 % da proteína total no meio, em S. lividans utilizando um plasmídeo de transporte contendo o promotor pLTl e o péptido líder Spell da endoglucanase E2. Não se observou nenhum aumento de actividade de fitase em nenhum dos sistemas de expressão, presumivelmente devido à falta de glicosilação e de outras modificações após a tradução. Em contraste, produziu-se uma forte actividade extracelular de fitase em S. cerevisiae transformado com o gene phyA. Compararam-se três péptidos sinal diferentes e três tipos de meio diferentes para se identificar o melhor vector de expressão e as melhores condições. A maior actividade extracelular de fitase foi obtida utilizando o péptido Sphy do gene phyA e o meio YEPD. A fitase sobre-expressa em levedura tinha cerca de 110 kDa, e dois valores óptimos de pH: 2,0 a 2,5 e 5,5 a 6,0, e a temperatura óptima era de 60°C.

Exemplo 7 - Métodos e Materiais para a Expressão de phyA em Pichia

Hospedeiro e vector. Adquiriu-se um estojo de Expressão EasySelect™ para Pichia à Invitrogen (San Diego, CA) . O estojo proporciona hospedeiros e vectores para expressar o gene quer intracelularmente, quer extracelularmente, em estirpes quer de Mut+, quer Muts (utilização de Metanol normal ou lenta). Utilizaram-se X33 como estirpe Mut+ e KM71 como estirpe Muts. Utilizaram-se dois vectores, pPICZ B (de 3,3 kb) e pPICZaA (de 3,6 kb) , ambos os quais utilizando AOX1 como promotor.

Construção dos Vectores de Expressão. Para se comparar o efeito de diferentes péptidos de sinalização sobre a expressão de PhyA num sistema Pichia, prepararam-se duas construções. Em primeiro lugar, ligou-se um fragmento EcoRI-Kpnl de 1,4 kb, contendo a sequência PhyA codificando para a proteína da fitase madura, a pPICZaA. Neste plasmídeo (pPICZa-phyA) , PhyA era liderado por um factor alfa, um péptido de sinalização com forte utilização geral, proveniente de Saccharomyces cerevisiae. Em segundo lugar, ligou-se um fragmento Kpnl-Xbal de 1,4 kb de pYPPl ao vector (a região de codificação de phyA era liderada pelo seu próprio péptido de sinalização que era muito eficaz na segregação da fitase expressa em Saccharomyces cerevisiae) .

Transformação e expressão. Linearizaram-se as construções confirmadas com Pmel e transformaram-se em GS115 e em KM71, com o EasyComp™ proporcionado no estojo. Utilizou-se Neocin™ para se selecionarem as colónias positivas. Depois de se inocular uma única colónia em 10 mL de meio MGY cultivando-se até uma D06oo de 2-6 a 30°C, recolheram-se as células por centrifugação e voltaram a suspender-se em 10 mL de meio MMY (contendo 0,5 % de metanol) . Obtiveram-se amostras ao fim de cada 12 ou 24 h depois da indução. Separaram-se as células do sobrenadante e lisaram-se com pérolas de vidro em tampão de lise. Ensaiou-se tal como se descreveu anteriormente a actividade de fitase no sobrenadante e nas células. Conduziram-se SDS-PAGE e transferência Western para se determinar a dimensão e a quantidade relativa da proteína expressa. * Exemplo 8 - Actividade de Fitase PhyA em Pichia

Transformou-se a construção de expressão utilizando factor alfa como péptido de sinalização para phyA, a duas estirpes de Pichia. A KM71 é uma estirpe com utilização lenta de metanol, enquanto a X33 é uma Pichia de tipo selvagem que utiliza metanol de um modo eficiente. 0 despiste e a incubação foram conduzidos em frascos de 10 mL para agitação a 29-30°C. Para os transformantes em KM71, 19 das 20 colónias selecionadas apresentavam actividade extracelular de fitase maior do que 6 unidades/mL de sobrenadante de cultura após uma indução durante 24 horas. A colónia N2 13 denotava a maior actividade que era de 26 unidades/mL depois de incubada durante 108 horas. Para os transformantes em X33, todas as colónias (20/20) denotavam mais do que 10 unidades/mL depois de serem induzidas durante 24 horas. Uma das colónias (N2 101) produzia uma actividade de fitase de 65 unidades/mL de sobrenadante. Um estudo do decurso temporal da expressão de fitase em KM71 e em X33 foi resumido em a Figura 11. Apesar da diferença entre estas duas estirpes quanto à utilização do metanol e, portanto, quanto à sua capacidade de expressar a fitase, verificou-se que o factor alfa era correctamente processado pelas células de levedura. Além disto, quase toda a proteína expressa era segregada para o meio uma vez que não mais do que 5 % da actividade total expressa foi detectada intracelularmente.

Estudaram-se os efeitos do fósforo inorgânico e do pH dos meios sobre a expressão de fitase nesses meios (BMGY e BMMY) utilizando um recombinante de phyA de X33 (N2 101) . O meio contendo fosfato 50 mM produzia a mais alta actividade de fitase, 66 unidades/mL às 168 horas após a indução. Incluindo fosfato 50 mM nos meios, também se estudou o efeito dos diferentes valores de pH deste tampão (3, 4, 5, 6, 7, e 8). Para um pH de 6, este transformante de X33 produzia 75 unidades de fitase/mL de sobrenadante. Com base na concentração proteica e na análise por SDS-PAGE, estimou-se que o rendimento da expressão da proteína fitase era de 3 a 4 mg/mL. *Exemplo 9 - Propriedades da Fitase PhyA Expressa em Pichia

Dimensão molecular e desglicosilação da fitase expressa. Depois de submeter o sobrenadante do meio inoculado com o transf ormante de phyA a uma SDS-PAGE, observou-se uma banda forte a cerca de 95 kDa (a Figura 12). Esta era quase a única proteína visualizada no sobrenadante. A fitase expressa reagia eficientemente com o anticorpo policlonal de coelho criado contra fitase nativa purificada de A. niger. Isto indicava que a reactividade imunológica da fitase expressa era essencialmente a mesma que a da fitase nativa de A. niger. O tamanho diminuiu para 50 kDa por desglicosilação utilizando Endo Η. O anticorpo contra phyA também reagia com a fitase desglicolisada. Além disto, a desglicosilação, conduzida em condições nativas, diminuiu a actividade de fitase em cerca de 15 %, indicando que a glicosilação era importante para a actividade das fitases. Adicionalmente, a glicosilação afectava a estabilidade térmica dos enzimas (a Figura 13).

Análise Northern. Tal como se ilustra em a Figura 14, fez-se reagir uma sonda com 1,3 kb para o ADN de phyA hibridizada com o mARN dos transformantes induzidos de ambos KM71 (N2 13) e X33 (N2 101). Também se observou uma resposta dos transformantes antes da indução. Provavelmente a expressão de phyA neste sistema não era estritamente controlada ao nivel da transcrição. pH e temperatura óptimos e hidrólise a fitato-fósforo. À semelhanla da fitase de A. niger, a fitase expressa apresentava dois valores óptimos de pH, 2,5 e 5,5 (a Figura 15). A temperatura óptima da fitase expressa foi de 60°C (a Figura 16). Quando a fitase expressa foi incubada com amostras de soja a 100, 200, 400, 800 mU/g de amostra a 37°C, o fósforo era libertado de um modo linear com a dose de fitase (a Figura 17).

Exemplo 10 - Métodos e Materiais para a Sobre-expressão do Gene appA de E. coli em Saccharomyces cerevisiae

Gene e Proteína. Este gene, originalmente definido como fosfoanidrido fosfohidrolase periplásmica de E. coli (appA), contém 1.298 nucleótidos (número de acessão no GeneBank: M58708). Verificou-se em primeiro lugar que o gene codificava para uma proteína fosfatase ácida com um pH óptimo de 2,5 (EcAP) em E. coli. A fosfatase ácida é um monómero com uma massa molecular de 44.644 Dalton. A EcAP madura contém 410 aminoácidos (Dassa, J. et al. , "The Complete Nucleotide Sequence of the Escherichia coli Gene appA Reveals Significant Homology Between pH 2.5 Acid Phosphatase and Glucose-l-Phosphatase", J. Bacteriology, 172: 5497-5500 (1990), que deste modo se incorpora neste documento por citação). Ostanin, K. et al. ("Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase", J. Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992), que deste modo se incorpora neste documento por citação), sobre-expressarram appA em E. coli BL21 utilizando um vector pT7 e aumentaram a sua actividdae de fosfatase ácida em cerca de 400 vezes (440 mU/mg proteína).

Adquiriram-se o gene e uma estirpe hospedeira de E. coli CU 1869 (N2 47092) junto da ATCC. O gene, uma inserção com 1,3 kb, foi transformado à estirpe de E. coli BL21 (N2 87441) utilizando um vector de expressão pAPPAl (Ostanin, K. et al. , "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase", J. Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992), que deste modo se incorpora neste documento por citação).

Hospedeiro e Vector. O vector para sobre-expressar o gene appA em Saccharomyces cerevisiae foi pYES2 e o hospedeiro foi INVScI (Invitrogen, San Diego, CA).

Construção do Vector de Expressão. Inicialmente, isolou-se um fragmento Xbal de 1,3 kb de pAPPAl. Este fragmento continha o gene appA com o seu próprio péptido de sinalização. Depois de se ter ligado ao local Xbal de pYES2, a construção (PYES2-appA) foi transformada em Saccharomyces cerevisiae. Mas não aumentou a actividade de fitase nem na parte intracelular nem na extracelular, em comparação com os controlos. Cotransformaram-se pAPPAl e pYPPl (PhyA e o seu péptido de sinalização em pYES2) na estirpe de levedura. Mais uma vez, não se detectou qualquer aumento da actividade de fitase devido a pAPPAl, quer nos meios, quer nas células de levedura.

Sintetizaram-se dois iniciadores para construir o péptido sinal do gene PhyA com a região de codificação do gene appA. Um tinha um comprimento de 80 pb e continha o péptido de sinalização de PhyA e um local Kpnl no terminal 5': GGG GTA CCA TGG GCG TCT CTG CTG TTC TAC TTC CTT TGT ATC TCC TGT CTG GAG TCA CCT CCG GAC AGA GTG AGC CGG AG (SEQ ID No. 9) . O outro iniciador tinha um comprimento de 24 pb, com um local EcoRI no seu terminal 3': GGG AAT TCA TTA CAA ACT GCA GGC (SEQ ID No. 10). Levou-se a cabo PCR durante 25 ciclos, com uma desnaturação durante 1 minuto a 95°C, recozimento durante 1 minuto a 58°C, e extensão de cadeia durante 1 minuto a 72°C. Amplificou-se um fragmento com 1.3 kb, digeriu-se, e ligou-se a pYES2. Depois de se confirmar a inserção por mapeamento de restrição, transformou-se a construção (pYES2-SphyA-appA) em INVScI pelo método do acetato de litio.

Expressão. Inocularam-se os transformantes seleccionados no meio YEPD. Induziu-se a expressão adicionando galactose à cultura depois da DCtoo ter atingido 2, tal como se descreveu acima. Recolheram-se as células 15 ou 20 h após a indução.

Ensaio da Actividade. Ensaiou-se a actividade de fosfatase ácido a 37°C em tampão 25 mM de glicina-HCl (pH 2,5), utilizando fosfato de p-nitrofenilo como substrato (reserva a 250 mM) . Adicionou-se 1,7 mL de tampão de reacção a amostras com 0,1 mL. Depois de uma incubação durante 5 minutos aquecendo num banho de água a 37 °C, adicionaram-se 0,2 mL de substrato previamente aquecido e misturou-se. Transferiu-se a mistura reaccional para uma cuvete previamente aquecida e incubou-se durante 2 minutos num compartimento espectrofotométrico a 37°C. Leu-se continuamente o p-nitrofenol libertado durante 5 minutos a 405 nm, para se calcular a actividade do enzima.

Estudo in vitro. Suspendeu-se farinha de soja (5,0 g) em 20 mL de tampão citrato 20 mM, pH 5,5, misturou-se com 200 mU de fitase, incubou-se a 37°C durante 4 h com agitação contínua. Depois de se arrefecer sobre gelo durante 10 minutos, transferiu-se a suspensão para um tubo de centrífuga e centrifugou-se durante 15 minutos a 15.000 x g. Utilizou-se o sobrenadante para se determinar o fósforo livre.

Exemplo 11 - Quantificação da Actividade de Fitase de Sobre-expressão de Gene appA de E. coli em Saccharomyces cerevisiae A actividade intracelular de fosfatase ácida no E. coli (com sobre-expressão de appA, pAPPAl) era de 440 mU/mg proteína. Pela primeira vez, encontrou-se uma actividade intracelular de fitase maior do que 4.900 mU/mg de proteína na estirpe transformada. Mas existia apenas uma actividade mínima de fitase no controlo (BL21). Portanto, este gene de fosfatase ácida também codificava para uma fitase. A sequência do gene appA foi alinhada com a de PhyA e verificou-se que estes dois genes partilhavam 23 % de identidade.

Transformando INVScI com a construção pYES2-Sphy-appA (liderada pelo péptido sinal de PhyA) produziu uma actividade extracelular de fitase no sobrenadante que era 2,000 vezes maior do que as de tipo selvagem ou do transf ormante contendo o gene appA mais o seu próprio péptido sinal (Veja-se a Tabela 7).

Tabela 7. Actividade extracelular de fitase em transformantes do gene appA com diferentes péptidos sinal

Apresentam-se os efeitos do meio (YEPD), de fósforo inorgânico, de fitato, do pH, e da temperatura sobre a expressão da actividade de fitase pelo pYES2-Sphy-A-appA na Tabela 8. A maior actividade de fitase foi de 2.286 mU/mL (633 mU/mg proteína) em condições óptimas.

Tabela 8. Efeitos das diferentes condições do meio YEPD sobre a expressão da actividade de fitase de pYES2-SphyA- appA em levedura.

A estabilidade térmica da actividade de fitase sobre-expressa produzida no transformante de levedura era maior do que a da fitase intracelular produzida pelo E. coli transformado com pAPPAl (Veja-se a Tabela 9) .

Aquecendo a fitase extracelular durante 15 minutos a 80°C originava uma perda de 30 % da sua actividade de fitase, enquanto nas mesmas condições quase toda a actividade de fitase no E. coli se perdia.

Tabela 9. Efeito de aquecer diferentes fontes de fitase a 80°C durante 15 minutos, sobre as suas actividades

As comparações do efeito de libertação de fósforo a partir de farinha de soja por parte de fitases (200 mU) de E. coli, da sobre-expressa por AppA em levedura, e da BASF, são apresentadas na Tabela 10. Os resultados indicam que todas as três fontes de fitase libertavam fitato-fósforo eficazmente a partir de farinha de soja.

Tabela 10. Fósforo livre libertado a partir de farinha de soja por diferentes tipos de fitase

Quando se expressava o gene de appA (fosfatase ácida) de E. coli em Saccharomyces cerevisiae produz-se uma actividade extracelular de fitase no meio que é mais do que 2.000 vezes maior do que a do controlo. A fitase sobre-expressa liberta eficazmente fitato-fósforo a partir de farinha de soja, e parece ser termicamente mais estável do que a fitase comercial disponível hoje em dia e do que a fitase intracelular produzida em E. coli pelo mesmo gene (appA) .

Exemplo 12 - Métodos e Materiais para Sobre-expressar o Gene appA de E. coli Codificando para uma Fosfatase Ácida/Fitase em Pichia pastoris

Gene e Proteína. Obtiveram-se o gene appA e a estirpe hospedeira E. coli CU1867 (N2 47092) junto da ATCC. O gene, uma inserção com 1,3 kb, foi transformado na estirpe de E. coli BL21 (N2 87441) utilizando um vector de expressão pAPPAl (Ostanin, K. et al., "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase", J. Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992), que deste modo se inclui neste documento por citação).

Hospedeiro e Vector. Obteve-se um estojo

EasySelect™ de Expressão de Pichia junto da Invitrogen (San Diego, CA) . O estojo proporciona hospedeiros e vectores para expressar o gene de modo intracelular ou extracelular numa estirpe de tipo selvagem (X-33). Utilizaram-se dois vectores, um pPICZ B (3,3 kb) e um pPICZaA (3,6 kb), ambos utilizando A0X1 como promotor.

Construção do Vector de Expressão. Utilizaram-se dois iniciadores para amplificar o gene appA de pAPPAl e produziram-se dois locais de restrição EcoRI e Kpnl respectivamente nos terminais 5' e 3'.

Iniciador a montante: GGA ATT CCA GAG TGA GCC GGA (SEQ ID No. 11)

Iniciador a jusante: GGG GTA CCT TAC AAA CTG CAC G (SEQ ID No. 12)

Matriz: ADN de pAPPAl isolado de ATCC 87441

Conduziu-se PCR durante 30 ciclos, com 1 minuto de desnaturação a 94°C, 1 minuto de recozimento a 55°C, e 1 minuto de extensão de cadeia a 72°C. Amplificou-se um fragmento com 1.245 pares de bases, digeriu-se com EcoRI e Kpnl, e ligou-se (a 16°C de um dia para o outro) a pPICZ B (3,3 kb) e a pPICZaA (3,6 kb). Confirmou-se a ligação por mapeamento de restrição depois de transformar as construções dentro de DH5a.

Transformação da construção para dentro de Pichia (X33). Para cada transformação, prepararam-se 100 pg de ADN plasmidico e linearizou-se por digestão com Pmel. Depois da linearização, purificou-se o ADN e voltou a suspender-se em 10 pL de água desionizada estéril. Utilizou-se de facto metade do ADN para cada transformação. Utilizaram-se tanto uma electroporação como o estojo químico EasyComp (Invitrogen) para transformar o ADN em X33. No caso da electroporação, recorreu-se a um Electro Cell Manipulator (ECM 600, Gentromics, BTX Instrument Division, San Diego, CA 92121) e a cuvetes de 2 mm. A resistência era de 186 Ohm, a voltagem de carga foi de 1,5 quilovolt, e a duração real da carga foi de cerca de 7 milissegundos. Incubaram-se as células com electroporos em placas de agar YPD contendo 100 mg de Zeocin/mL a 30°C durante 2-4 dias para crescimento de colónias. No caso da transformação química, cultivaram-se as células em placas de agar YPDS contendo 100 mg de Zeocin/mL. Em comparação com a electroporação, o método químico apresentava uma menor eficiência de transformação.

Expressão. Inocularam-se colónias singelas em 10 mL de meio MGY (tubo de 30 mL) e cultivaram-se (16-18 h) até uma D06oo de 5-6 a 28-30°C numa incubadora agitada (200 rpm) . Recolheram-se as células por centrifugação (2.000 rpm) e voltaram a suspender-se em 10 mL de meio BMMY (contendo 0,5 % de metanol) para induzir a expressão. Recolheram-se as amostras (200 pL) a cada 12 ou 24 h após a indução. Adicionou-se metanol (a 100 %) a 100 pL a cada 24 horas para se manter uma concentração de 0,5 - 1 % nos meios.

Ensaios. Separaram-se as células dos meios (sobrenadantes) e lisaram-se com pérolas de vidro em tampão de lise. Ensaiaram-se as actividades de fitase extracelular no sobrenadante e de actividade de fitase intracelular nas células lisadas tal como se descreveu anteriormente (tampão citrato 0,2 M, pH 5,5 a 37°C utilizando fitato de sódio 10 mM). Determinou-se a actividade de fosfatase ácida a 37°C num tampão 25 mM de glicina-HCl (pH 2,5), utilizando fosfato de p-nitrofenilo como substrato (solução de reserva a 250 mM) . Adicionou-se 1,7 mL de tampão de reacção a amostras de 0,1 mL. Leu-se o p-nitrofenol libertado em continuo ao longo de 5 minutos a 405 nm para calcular a actividade enzimática. Conduziu-se SDS-PAGE (a 12 %) para se determinar o tamanho e a quantidade relativa da proteína expressa. Determinaram-se os óptimos de pH e de temperatura para a fitase expressa tal como se descreveu nos resultados.

Estudo in vitro. Suspendeu-se farinha de soja (5,0 g) em 20 mL de tampão citrato 20 mM, pH 5,5, misturou-se com diferentes teores de fitase, e incubou-se a 37°C durante 4 h com agitação contínua. Depois de se arrefecer sobre gelo durante 10 minutos, transferiu-se a suspensão para um tubo de centrífuga e centrifugou-se durante 15 minutos a 15.000 x g. Utilizou-se o sobrenadante para se determinar o fósforo livre.

Exemplo 13 - Rastreio de Actividade de Fitase em Colónias para Pichia pastoris Sobre-expressando o Gene appA de E coli A Pichia X33 de tipo selvagem produz uma actividade intracelular mínima de fitase (<0,03 U/mg de proteína) bem como extracelular (<0,05 U/mL). As células X33 transformadas coo gene appA inserido em pPICZB (sem o factor α e presumivelmente produzindo fitase intracelular) não denotam nenhum aumento da actividade da fitase (extracelular, 0,2 U/mL nem intracelular, 0,05 U/mg de proteína).

Transformando células X33 com a construção pPIZaA-appA (liderada pelo péptido sinal do factor α) resultou na produção de actividade de fitase extracelular nos meios. Inicialmente, rastrearam-se 72 colónias. Só duas colónias apresentavam actividade <1 U/mL 40 horas após a indução. A quase totalidade das colónias tinha uma actividade de entre 10 e 20 U/mL 40 horas após a indução. Todas as 70 colónias apresentava uma actividade de fitase >80 U/mL 118 horas após a indução. A actividade de fitase ais elevada que se detectou até à data foi de 215 U/mL, 192 horas após a indução (Veja-se a Tabela 11).

As actividades de fitase e de fosfatase ácida no transformante expressando uma actividade de fitase de 215 U/mL foram comparadas com as de X33 de tipo selvagem (192 horas após a indução) (Veja-se a Tabela 12) . Quase toda a proteína fitase expressa fora segregada pelas células, indicando que o factor a era um péptido sinal muito eficaz para a secreção de fitase.

Tabela 12. Actividades de fitase e de fosfatase ácida no transformante pPIZaA-appA e em X33 de tipo selvagem 192 horas após a indução.

Os transf ormantes de E. coli com o mesmo gene appA de fosfatase ácida apresentavam actividade de fitase intracelular de 5 U/mg de proteína (Ostanin et ai., "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase", J. Biol. Chem., 267: 22830-36 (1992), que deste modo se incorpora neste documento por citação) . Transformando o gene PhyA em A. niger produzia uma actividade extracelular de 7,6 U/mL (Hartingsveldt et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of

Aspergillus Niger", Gene 127: 87-94 (1993), que deste modo se incorpora neste documento por citação). Comparado com estes resultados, o sistema de expressão de fitase em

Pichia é um sistema de expressão muito eficiente.

Exemplo 14 - Decurso ao Longo de Tempo da

Expressão de Fitase

Existia um aumento linear da actividade de fitase extracelular no meio em quase todas as colónias selecionadas até 192 horas após a indução. A Figura 18 resume as alterações de actividade de cinco colónias selecionadas entre 24 e 163 horas após a indução.

Exemplo 15 - Efeitos do pH do Meio sobre a

Expressão da Fitase (Colónia ns 23, Actividade 136 U/mL às 186 h)

Utilizando meios 0,1 M em tampão fosfato, estudaram-se os efeitos de diversos valores de pH sobre a produção da fitase extracelular nos transformantes em relação a um meio de controlo sem tampão (pH 7,0). O meio tamponizado a pH 6 produziu a actividade de fitase mais elevada (Veja-se a Figura 19).

Exemplo 16 - Dimensão da Fitase Extracelular

Expressa

Utilizando uma análise por SDS-PAGE (gel a 12 %) , observou-se uma banda clara no meio sobrenadante da cultura inoculada de três colónias diferentes (Veja-se a Figura 20) . A dimensão era de cerca de 55 kDa, provavelmente parcialmente glicosilada. Uma vez que a proteína expressa representava quase a única banda visível do sobrenadante, seria conveniente recolher o enzima produzido sem ser necessária uma purificação entediante.

Exemplo 17 - pH e Temperatura Óptimos para a

Fitase Extracelular Expressa (Colónia ns 23) O valor óptimo de pH para a fitase expressa era de 2,5 a 3,5 (Veja-se a Figura 21) . Isto é significativamente diferente do valor para a fitase phyA quer de A. niger (BASF), quer nos nossos outros sistemas de expressão. É ideal para a função da fitase ao pH do estômago. A temperatura óptima para o enzima expresso era de 60°C (Veja-se a Figura 22).

Exemplo 18 - Efeito da Fitase Expressa sobre a Hidrólise de Fitato-Fósforo da Farinha de Soja

Esta fitase sobre-expressa de E. coli (Colónia n3 23) hidrolisava eficazmente fitato-fósforo de farinha de soja (Veja-se a Figura 23) . A libertação de fósforo livre na mistura era linear de 0 a 800 mU de fitase/g de alimento para animais.

Exemplo 19 - Efeitos da Fitase AppA de E. coli Expressa por Pichia pastoris sobre a Biodisponibilidade de Fósforo de Fitato para Porcos em Desmame

Para se determinarem os valores nutricionais da fitase de E. coli expressa por Pichia em dietas para suinos, comparou-se a eficácia desta nova fitase com a do fósforo inorgânico e com a fitase microbiana comercialmente disponível (Natuphos™, BASF Corp., Mt. Olive, NJ) . Seleccionaram-se quarenta e oito porcos desmamados provenientes de porcas com partos múltiplos na Cornell Swine Research Farm. Desmamaram-se os porcos aos 21 dias de idade e alimentaram-se com uma alimentação de desmame até ao dia 28. Colocaram-se então a dois por jaula atribuindo-se aleatoriamente seis jaulas por tratamento. Deixaram-se adaptar os porcos durante duas semanas à dieta de base constituída por milho e farinha de soja (Tabela 13).

Em seguida, cada jaula recebeu uma de quatro dietas do tratamento. 0 grupo de controlo positivo (+C) recebeu a dieta de base com um suplemento de fosfato dicálcico. 0 grupo de controlo negativo (-C) recebeu apenas a dieta de base. 0 grupo a fitase de levedura (YP) recebeu a dieta de base com um suplemento da fitase de E. coli expressa a 1.200 U/kg de alimento. O grupo a fitase microbiana (MP) recebeu a dieta de base com um suplemento de fitase BASF a 1.200 U/kg de alimento. Os porcos tinham acesso livre a alimento e a água. Registou-se semanalmente o aumento de peso individual dos porcos. Registou-se o consumo diário de alimento para cada jaula. Obtiveram-se semanalmente amostras de sangue de cada um dos porcos individuais para se determinarem as concentrações em fósforo inorgânico no plasma. Apresentam-se os resultados da massa corporal (BW), aumento médio diário (ADG), consumo médio de alimento (ADFI), e razão alimento/aumento (F:G), e fósforo inorgânico no plasma (PP) na Tabela 14.

Além disto, existia uma deficiência severa de fósforo no grupo de controlo negativo ao fim da experiência de quatro semanas. Mas não havia nenhum sinal de deficiência em fósforo nos outros três grupos. Claramente, a fitase de E. coli expressa por Pichia era pelo menos, e senão fosse mais, tão eficaz como a fitase microbiana comercial na melhoria da biodisponibilidade de fitato-fósforo a partir do alimento de milho-farinha de soja para porcos desmamados. Ela pode ser utilizada para substituir os suplementos de fósforo inorgânico para porcos desmamados.

Exemplo 20 - Efeitos da Fitase Appa de E. coli expressa por Pichia pastoris sobre a Biodisponibilidade do Ferro (Fe) e de Fitato Fósforo, em Porcos em Desmame

Para se determinar o efeito da fitase de E. coli sobre-expressa por Pichia em relação ao Fe ligado a fitato da dieta em porcos desmamados, seleccionaram-se 20 porcos anémicos (com 21 dias de idade e 7,3 g de hemoglobina (Hb)/dL de sangue). Alimentaram-se os porcos com um alimento de desmame deficiente em Fe durante 7 dias e alojaram-se em jaulas metálicas quando completaram 28 dias de idade. Alimentaram-se então os porcos com dietas experimentais quando completaram 35 dias de idade e durante 5 semanas. As dietas do tratamento eram como se segue: dieta de base deficiente em Fe (-C, com fósforo inorgânico adicionado), dieta com suplemento de Fe (+C), dieta deficiente em Fe e em fósforo com suplemento de fitase de E. coli expressa (YP), ou de fitase microbiana comercial (BASF, MP) a 1.200 U/kg de alimento. Determinaram-se semanalmente a massa corporal (BW), o volume de células empacotado (PCV), Hb, e o fósforo inorgânico no plasma (PP). Apresentam-se os resultados na Tabela 15.

Tabela 15. Resumo de PCV, Hb, BW, e PP de Porcos tais como Afectados pela Fitase na Dieta.1

Em conclusão, a fitase de E. coli sobre-expressa por Pichia era pelo menos tão eficaz como a fitase BASF na melhoria de fitato e fósforo bem como da utilização de Fe nas dietas de milho e farinha de soja para porcos desmamados.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Lei, Xingen

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: SOBRE-EXPRESSÃO DOS

GENES DE FITASE EM SISTEMAS DE LEVEDURA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Michael L. Goldman (B) RUA: Clinton Square, P. 0. Box 1051 (C) CIDADE: Rochester (D) ESTADO: Nova Iorque

(E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 14603 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disco Flexível

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC da IBM

(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patente Na publicação#l.0,

Versão#l.30 (vi) DADOS CORRENTES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE ENTRADA: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) ADVOGADO/AGENTE DE INFORMAÇÃO:

(A) NOME: Goldman, Michael L. (B) NÚMERO DE REGISTO: 30,727 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DA SÚMULA: 19603/1340 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (716) 263-1304 (B) TELEFAX: (716) 263-1600 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: CGGAATTCGT CACCTCCGGA CT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: CCCAAGCTTC TAAGCAAAAC ACTC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: CAGCTATGAC CATGATTACG CC 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: CCTAGAACGG GAATTCATTG GCCGCC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: CCCAAGCTTG ATCACATCCA TTCA 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:.6: CGGGGACTGC TAGCGCACGT TCGAT 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:7: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: ATCGAACGTG CGCTAGCAGC AGTCCCCG 28 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: GCTCTAGACT AAGCAAAACA CTCC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 80 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: GGGGTACCAT GGGCGTCTCT GCTGTTCTAC TTCCTTTGTA TCTCCTGTCT GGAGTCACCT 60 CCGGACAGAG TGAGCCGGAG 80 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: GGGAATTCAT TACAAACTGC AGGC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11: GGAATTCCAG AGTGAGCCGG A 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO :12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) N2 DE CADEIAS: singela (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12: GGGGTACCTT ACAAACTGCA CG 22

Lisboa, 14 de Janeiro de 2016.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de AppA bacteriano a titulo de uma fitase em que a referida AppA mantenha pelo menos 60 % da sua actividade depois de aquecer a AppA durante 15 minutos a 60 °C, em que a AppA está expressa numa célula hospedeira de levedura.
2. 2. Utilização de uma AppA bacteriana para catalisar a transformação de fitato em inositol e fosfato, em que a referida AppA mantenha pelo menos 60 % da sua actividade depois de se aquecer a AppA durante 15 minutos a 60°C, em que a AppA seja expressa numa célula hospedeira de levedura.
3. 3. A utilização das reivindicações 1 ou 2, em que a levedura hospedeira seja seleccionada de entre o conjunto constituído pelas espécies Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Torulaspora e Schizosaccharomyces.
4. 4. A utilização da reivindicação 3, em que a levedura hospedeira seja Saccharomyces cerevisiae.
5. 5. A utilização das reivindicações 1 ou 2, em que a referida levedura hospedeira seja uma espécie de levedura metilotrófica.
6. 6. A utilização da reivindicação 5, em que a referida levedura hospedeira seja Pichia pastoris.
7. I. A utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a referida fitase bacteriana AppA seja misturada ou levada a um contacto com uma composição de alimento para animais.
8. 8. A utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a AppA bacteriana seja um polipéptido Appa de E. coli.
9. 9. A utilização de uma estirpe de levedura que inclua um gene codificando para AppA bacteriana, funcionalmente ligado a um promotor que dirija a expressão do gene AppA na estirpe de levedura, para produzir uma fitase em que a referida fitase mantenha pelo menos 60 % da sua actividade após aquecimento da fitase durante 15 minutos a 60°C.
10. 10. A utilização da reivindicação 9, em que o polipéptido AppA bacteriano seja um polipéptido AppA de E. coli.
11. II. A utilização de qualquer uma das reivindicações 9 a 10, em que a referida estirpe de levedura seja selecionada de entre o conjunto constituído pelas espécies Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Torulaspora e Schizosaccharomyces.
12. 12. A utilização da reivindicação 11, em que a referida estirpe de levedura seja uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae.
13. 13. A utilização da reivindicação 11, em que a referida estirpe de levedura seja uma estirpe de Pichia pastoris.
14. 14. A utilização de um vector que inclua um gene codificando para AppA, funcionalmente ligado a um promotor que dirija a expressão do gene AppA numa estirpe de levedura, para a produção de uma fitase em que a fitase referida mantenha pelo menos 60 % da sua actividade depois de se aquecer a fitase durante 15 minutos a 60°C. Lisboa, 14 de Janeiro de 2016.