JP2000511059A - ガラス化による長期貯蔵保存 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的活性試料をガラス化することにより、すなわちそれらを貯蔵温度で真のガラス状態を得るような方法で脱水し、その後に冷却することにより、貯蔵保存する方法。この方法は、試料を真のガラス状態で貯蔵するためには脱水しようとする物質の脱水温度が推奨されている貯蔵温度より高くなければならないという認識に基づいている。ガラス化温度は水含有量の増加に伴って急速に低下するため（例えば、純水はＴｇ＝−１４５℃においてガラス化するが、８０％重量スクロース溶液はＴｇ＝−４０℃においてガラス化し、そして無水スクロースはＴｇ＝６０℃においてガラス化する）、試料を強力に脱水してＴｇを貯蔵温度（Ｔｓ）より上に高めることが必要である。発明者により決定されているように、脱水温度は推奨されている貯蔵温度より高く選択しなければならず、そして脱水後の冷却により、ガラス状態が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】 ガラス化による長期貯蔵保存 発明の分野 本発明は、最大の貯蔵安定性のために真のガラス状態を得るための改良された ガラス化技術を使用して、懸濁分子または分散分子、特に生物学的活性分子、並 びに細胞および組織の溶液および乳濁液を保存する方法に関する。 発明の背景 生物学的活性物質、細胞および多細胞組織の長期貯蔵は商業および研究目的の 両方においてますます必要となってきているが、そのような物質は既知のあらゆ る物質の中でも貯蔵するのが最も困難である。皮肉なことに、生物学的活性薬剤 および生活形を価値あるものにしているその性質が、それらを保存するのを困難 にさせる性質である。単離し、精製し、そして非常に短い期間であっても室温溶 液中に貯蔵するに十分なほど安定性があるのは、非常にわずかな物質だけであろ う。 商業的および実用的にも、脱水された生物学的活性物質の保存は、多くの利点 を有する。首尾良く、脱水された試薬、物質および細胞は、重量が減り、貯蔵の ための必要となるスペースも小さくなるが、それにもかかわらず貯蔵寿命は増加 する。乾燥物質の室温貯蔵は、低温貯蔵方式およびそれらに伴う費用と比べた場 合、費用効果がより大きい。ここで挙げられる生物学的活性物質には、生物学的 活性高分子（酵素、血清、ワクチン）、ウイルスおよび殺虫剤、ドラッグデリバ リーシステムおよびリポソーム、並びに***のような細胞懸濁液、赤血球および 他の血液細胞、幹細胞および多細胞組織、例えば皮膚、心臓弁などが包含される が、それらに限定されない。 生物試料の貯蔵保存の利点がますます認識されてきたため、研究者達は生物学 的分野に「ガラス化」技術を利用するために努力してきた。「ガラス化する」、 すなわちいかなる物質に対して「ガラス」状態を得る技術は、それ故今後の保存 技術の要となると認識されていたが、先行技術のガラス化技術には予期せぬ問題 が生じた。出願人はこの理論により拘束されることを意図するわけではないが、 本発明の基礎をなす新事実が説明するように、これまでは試料の損傷を恐れ、研 究者たちはいかなる物質のガラス状態をも、周囲温度で実際に得るために適切な 脱水温度を検討することを阻まれていたようである。その結果、ガラス化におけ るこれまでの試みは一般的には過度の水含有量を有するか、または真のガラス状 態と矛盾する性質を有する劣悪な生成物を生じた。これらの生成物は一般的には 室温またはそれより高い温度において限られた貯蔵安定性を示す。 ガラス化が乾燥だけにより得られるという考えには、大きな誤解が存在する。 物質が乾燥により真のガラス状態に到達するとされる文献は多いが、開示されて いる技術は実際にガラス状態を生成しない。乾燥は水分子の拡散により制限され る工程であるため、一定の静水圧におけるガラス状態は冷却だけにより得られる ことが真の陳述である（しかし本発明以前はこれは認識されていなかった）。こ れに関しては、この誤解が誤って具体化されている発行された特許に注意するこ とが重要である。WettlauferおよびLeopoldの米国特許第５，２９０，７６５号 は、生体物質を乾燥状態での分解反応から保護する方法を特許取得した。彼らは 生体懸濁液を乾燥およびその後の貯蔵中に、懸濁液を十分な量の１種もしくはそ れ以上のガラス化溶質と組み合わせることにより保護することを提唱しており、 そして３／１重量％のスクロース／ラフィノース混合物を推奨した。物質は乾燥 が十分になるまで乾燥させることを意図すると教示されているが、これは誤解を 生む間違った教示である。せいぜい、これらの物質はゴム状態に似た非常に粘着 性である液体状態になるが、ガラス状態は生じない。 Franks等は米国特許第５，０９８，８９３号で同様に、周囲温度においてガラ ス状態を得るのに必要なことは周囲温度における蒸発であること、並びに任意の 温度上昇が蒸発速度の増加のみに寄与するはずであることを教示している。この 理由のために、Franks等は、これらの例に記載されている試料がガラス状態を得 たと信じているが、実際には彼らは得ていない。 以上で説明した誤解は、いくつかの理由のために起きた。第１に、「ガラス」 、「ガラス状」および／または「ガラス化された」という語をあいまいな、そし てその結果として誤った方法で使用していたこともある。第２に、ポリマーまた は 生体ポリマーを含有する乾燥混合物のガラス転移温度を、信頼のおけるように測 定することは明らかに困難である。そのような混合物中での比熱における変化は 非常に小さく、そして広い温度範囲に渡って発生し、それがＴｇの信頼のおける 差動走査熱量測定（ＤＳＣ）を困難にする。測定が省略される場合には、ガラス 状態が得られなかった時でも得たと推定してしまうこともある。第３に、時々真 のガラス状態に一致するであろうものより多い水が、ガラス化されたであろう物 質中に残存するが、多くの場合、この水の測定は種々の理由のために誤った結果 を招く。これらの理由の全て、および恐らく他の事柄により、実際にガラス状態 が得られなかった場合でも、ガラス状態が得られたという希望的な考えを促進さ せる傾向がある。温度をガラス転移温度を以上に高めると、水の拡散係数は急速 に増加するため、先行技術の保存方法では試料がガラス転移温度以上で貯蔵され る場合には、安全な貯蔵時間が制限される。 従って、ペプチド、蛋白質、他の分子および高分子並びに細胞を含む生物学的 活性物質の真のガラス化に影響を与え、無制限の貯蔵時間を供する保存処方が望 まれる。 発明の概要 この要望を満たすために、本発明は、生物学的活性試料をガラス化することに より、すなわちそれらを真のガラス状態を得るような方法で脱水することにより 、それらを貯蔵保存する方法である。この方法は、試料を真のガラス状態で貯蔵 するためには、脱水しようとする物質の脱水温度は推奨されている貯蔵温度より 高くなければならないという認識に基づいている。水含有量の増加につれてガラ ス化温度は急速に下がるため（例えば、純水はＴｇ＝−１４５℃においてガラス 化するが、８０重量％スクロース溶液はＴｇ＝−４０℃においてガラス化し、そ して無水スクロースはＴｇ＝６０℃においてガラス化する）、試料は強力に脱水 してＴｇを貯蔵温度（Ｔｓ）より高めることが必要である。発明者により決定さ れているように、脱水温度は推奨されている貯蔵温度より高くしなければならず 、そして脱水後の冷却によりガラス状態が得られる。例えば、この指定をある場 合において実行するには、室温において乾燥し、その後の室温より低い貯蔵温度 へ の冷却することだけが必要であり、他の場合においてはこの方法はガラス化しよ うとする物質の室温以上の温度への注意深い加熱、並びにその後の脱水およびそ の後の冷却を必要とする。 発明の詳細な説明 ここに記載されている発明は、先行技術の欠点を克服し、そして貯蔵中に生物 学的活性を損なうことなく真のガラス状態での試料の保存および貯蔵を可能にす る。ガラス状態にガラス化できる生物試料には蛋白質、酵素、血清、ワクチン、 ウイルス、リポソーム、細胞、およびある場合にはある多細胞試料が包含される が、それらに限定されない。ガラス状態での保存は、実際には無制限であり、そ して安全な貯蔵時間を推定するための加速熟成を行う必要はない。真のガラス化 の手段は、脱水を推奨されている貯蔵温度（Ｔｓ）より高い温度で行ってガラス 転移温度（Ｔｇ、Ｔｇ＞Ｔｓ）を得、その後に試料を推奨されている貯蔵温度Ｔ ｓに冷却することである。一例として、ある場合におけるこの処方の実行には室 温での脱水およびその後の室温より低い貯蔵温度への冷却のみが必要であり、他 の場合にはこの方法はガラス化しようとする物質の室温より高い温度での注意深 い脱水、並びにその後の室温への冷却を必要とする。 本発明を使用し、中程度の低温（冷蔵）（−５０℃より高い）および／または 周囲もしくはそれより高い温度におけるガラス化により、生物試料の無制限の保 存を供することができる。そしてガラス化工程を逆転させ、保存された試料を初 期の生理活性に保つことができる。この方法を医薬および食品製品の安定化に適 用することもできる。 広義では、ガラス化は液体から無定型固体への変換をさす。液体−ガラス転移 はまだ完全には理解されていないかもしれないが、液体−ガラス転移はエントロ ピーにおける同時減少、熱容量および膨張係数における急激な減少、並びに粘度 における大幅な増加により特徴づけられる。液体−ガラス転移を明らかにするた めに、自由容量理論、浸透理論、モード結合理論などを含む数種の微視的モデル が推奨されている。しかしながら、本発明の信頼のおける実験方法を実施してＴ ｇを制定する限り、これらの理論は重要ではない。推奨される方法は当技術で既 知である温度刺激による減極電流法である。 品質を改良し、そして貯蔵温度における無制限の貯蔵寿命を延長するためには 、試料をＴｇが実際にＴｓより高くなるように脱水しなければならない。推奨さ れるＴｓ値によって、異なる脱水方法を適用できる。例えば、冷凍脱水試料（ま たは溶液）の最高ガラス化温度であるＴｇより低い温度における貯蔵が、冷凍に より可能になるかもしれない。本発明に従う適当な脱水が、周囲温度における貯 蔵を可能にする。しかしながら、ガラス状物質の脱水は実際に不可能であるため 、一定の静水圧においてＴｇ＞Ｔｓを得るための唯一の方法は、試料をガラス転 移温度より高い温度において脱水することである。これは試料が熱により変性す る危険性にもかかわらず行わなければならない。 高温における生物試料の脱水は、使用温度が適用可能な蛋白質変性温度より高 い場合には非常に危険であるかもしれない。試料を温度の上昇に伴う危険性から 保護するために、脱水工程は段階的に行うべきである。脱水の第１段階（空気ま たは真空）は試料がその活性を損なわずに脱水できるような低温で実施すべきで ある。第１段階が０度以下における脱水を必要とする場合には、凍結乾燥技術を 適用してもよい。第１の乾燥段階後に、より高い温度において乾燥することによ り脱水を続けることができる。各段階で脱水の程度および乾燥温度を同時に高め ることが可能であろう。例えば、酵素保存の場合には、室温における乾燥後に乾 燥温度を酵素活性を損なわずに、少なくとも５０℃に高めることができる。５０ ℃における乾燥後に得られる脱水の程度は、活性を損なわずに乾燥温度のさらな る上昇を可能にするであろう。保存しようとするいかなる試料についても、試料 自体が保存工程中に耐え得る最高温度、すなわち変性温度などを決定するであろ う。しかしながら、種々の保護剤および凍結保護剤、すなわち、糖、ポリオール およびポリマー凍結保護剤、が乾燥工程中に乾燥しようとする物質を保護するこ とに注目すべきである。 本発明によると、報告されている限りの、生物試料の凍結乾燥および乾燥を成 功させるような全ての方法は、本発明に従う追加のガラス化により最適化できる ことも注目すべきである。ガラス化された試料は、無制限の時間にわたり貯蔵す ることができる。実際にガラス化するに当たっての唯一の負の影響は、水または 再水和溶液中での溶解時間を増加させる可能性があり、それにより一部の場合に おいての一部の試料に対して、ある種の損傷を引き起こす場合もあり得る。再水 和水をガラス化された試料に適用する前に再水和水を最適に加熱することにより 、この望ましくない影響を改善できる。試料の損傷を最少にする範囲内に加熱が 調節される場合には、加熱は最適である。 本発明を上記の特定物質および方法に関して記載してきたが、本発明は添付さ れている請求の範囲に示されている限りにおいてのみ限定されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １.真のガラス化による生物試料の貯蔵保存方法であり、生物学的活性物質を推 奨されている貯蔵温度より高い温度において脱水し、その後に前記試料を前記貯 蔵温度に冷却することを含む方法。 ２.前記生物学的活性物質は、酵素、ペプチド、蛋白質、生体分子、生体高分子 、および細胞よりなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３.前記生物学的活性物質は、蛋白質、酵素、血清、ワクチン、ウイルス、リポ ソーム、細胞および多細胞試料よりなる群から選択される、請求の範囲第１項に 記載の方法。 ４.前記生物学的活性物質は、糖、ポリオールおよびポリマーよりなる群から選 択され、水溶性または水膨潤性である保護剤と組み合わされている、請求の範囲 第１項に記載の方法。 ５.前記生物学的活性物質を室温で乾燥し、その後に前記物質をその意図する貯 蔵温度に冷却する、請求の範囲第１項に記載の方法。 ６.前記生物学的活性物質を室温以上の温度において乾燥し、その後に前記物質 を貯蔵のために室温またはそれより低い温度に冷却する、請求の範囲第１項に記 載の方法。 ７.前記試料は、貯蔵期間後に再水和される、請求の範囲第１項に記載の方法。 ８.前記試料は、前記試料の前記貯蔵温度より高い温度を有する水で再水和され る、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９.前記試料を約２０℃を越える温度において貯蔵する、請求の範囲第８項に記 載 の方法。 １０.前記試料を約３０℃を越える温度において貯蔵する、請求の範囲第９項に 記載の方法。 １１.前記試料を約４０℃を越える温度において貯蔵する、請求の範囲第１０項 に記載の方法。