DE69333071T2

DE69333071T2 - Phytate-Hydrolyse und enzymatische Zusammensetzung für die Hydrolyse von Phytat

Info

Publication number: DE69333071T2
Application number: DE69333071T
Authority: DE
Inventors: Erik Eugene Maurice Vanderbeke; Marnix De Schrijver; Annie Maria Magdalena Vermeire
Original assignee: Aveve NV
Current assignee: Aveve NV
Priority date: 1993-04-05
Filing date: 1993-04-05
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2013-04-06
Also published as: ATE244302T1; JP3587876B2; CA2120265C; DE69333071D1; EP0619369B2; FI941545A0; ES2202305T3; DK0619369T3; NO941183L; US5443979A; PT619369E; EP0619369A1; EP0619369B1; JPH06319539A; NO941183D0; US5554399A; CA2120265A1; NO324857B1; FI941545A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Phytinhydrolyse durch Enzmye, insbesondere durch Phytasen, die fähig sind, die organische Phosphorverbindung Phytat in organischen Phosphor und Inosit zu hydrolysieren.
Hintergrund der Erfindung
Es ist eine hinreichend geklärte Tatsache, dass das Vorliegen von essentiellen Mineralstoffen eine wichtige Rolle bei der Tierfütterung spielt. Die Verfügbarkeit und Assimilation dieser Futterkomponenten spiegelt sich in der Leistungsfähigkeit des Tiers und der Ausscheidung im Dung wider. Infolge der Zunahme der intensiven Viehproduktion verursacht die Dungproduktion Umweltprobleme, teilweise wegen seiner Phosphate. Darüber hinaus bringt die Gesetzgebung bezüglich des problematischen Dungs, speziell des Phosphorgehalts des Dungs, Kosten mit sich, was es erforderlich macht, die Phosphorausscheidung in die Umgebung zu reduzieren.
Phosphor wird dem Futtermittel durch verschiedene pflanzliche Ausgangsmaterialien, tierische Nebenprodukte und anorganischen Phosphor zugeführt.
Phytinsäure oder Phytat ist der Hexa-Phosphorsäureester von Inosit (Myo-Inosithexakisphosphat), die/das in vielen Samen und Getreiden gefunden wird. Sie/es wirkt als primäre Speicherungsform sowohl für Phosphor als auch für Inosit und ist für mehr als 50 % des gesamten Phosphorgehalts verantwortlich (LOLAS et al., 1976; SOUVEUR, 1989). Ölsamen können bis zu 5,2% Phytin enthalten (REDDY et al., 1982).
Allerdings wird Phytinphosphor aus pflanzlichen Rohmaterialien von monogastrischen Tieren, zum Beispiel Geflügel, Schwein und Mensch, wegen ihres einfachen Magen-Darm-Trakts schlecht verdaut: ihnen fehlt intestinale Phytaseaktivität oder sie haben nur geringe intestinale Phytaseaktivität, um die Hydrolyse dieser Phytate in ihrem Darm zu katalysieren, und im Dickdarm freigesetzter Phytinphosphor wird in die Umgebung ausge schieden. Daher sind pflanzliche Rohmaterialien schlechte Phosphorquellen zur Tierfütterung und es muss zusätzlicher Phosphor durch Tiernebenprodukte oder anorganische Phosphate in die Nahrung aufgenommen werden.
Darüber hinaus wird Phytin infolge seiner chelatbildenden Eigenschaften als Antinährstofffaktor angesehen: Es bindet viele mehrwertige Kationen, zum Beispiel Ca²⁺, Fe³⁺, Mg²⁺ und Zn²⁺ durch Bildung unlöslicher Komplexe damit und reduziert daher die Bioverfügbarkeit und Absorption dieser essentiellen Nahrungsmineralstoffe. Darüber hinaus blockiert eine Komplexbildung von Proteinen mit Phytin (COSGROVE, 1966) eine enzymatische Proteinverdauung.
Die negativen Wirkungen von Phytin auf den Phosphor- und Mineralstoffe-Stoffwechsel, verbunden mit einer hohen Phosphorausscheidung in die Umgebung und die Existenz einer Gesetzgebung betreffend die Phosphorausscheidung, macht es notwendig, Phytinphosphor bioverfügbar zu machen.
Phytin kann enzymatisch durch Phytasen, die entweder in pflanzlichen Rohmaterialien vorliegen oder durch Mikroorganismen produziert werden, hydrolysiert werden.
Das Enzym Phytase (Myo-Inosithexaphosphat-phosphohydrolase E. C. 3.1.3.8.) hydrolysiert unter geeigneten Bedingungen Phytinsäure oder Phytat in anorganisches Phosphat, Inosit und Inosit-mono- bis pentaphosphate.
Phytase ist in Pflanzen und Mikroorganismen, speziell in Pilzen, weit verbreitet, wird aber im intestinalen Trakt von monogastrischen Tieren nur in unbedeutenden Mengen gefunden.
Pflanzenphytasen werden infolge ihrer geringen pH-Stabilität und eines engen pH-Aktivitätsbereichs (SUTARDI & CUCKLE, 1986; LOLAS & MARKAKIS, 1977) im Verdauungstrakt von monogastrischen Tieren schnell inaktiviert; ihre in vivo-Wirksamkeit ist demnach gering. Sie sind daher für die Tier-Mischfutterformulierung von geringerer Bedeutung.
Dagegen haben einige mikrobielle Phytasen eine breite pH-Stabilität und einen breiten pH-Aktivitätsbereich, wodurch Phytin im Magen-Darm-Trakt des Tiers wirksamer hydrolysiert werden kann. Aus diesem Grund wurden mikrobielle Phytaseproduktionsprozesse entwickelt, um Phytinphosphor in Tiernahrung durch Anwendung von Phytase, die die sauren Bedingungen im Magen tolerieren kann, aufzuwerten. Dennoch ist die Thermo stabilität von Phytase immer noch zu niedrig, um die hohen Temperaturen (70 bis 80°C) auszuhalten, die während des Mischfutterherstellungsverfahrens erreicht werden. In Anbetracht dessen kann es notwendig sein, eine Überdosis von 30% anzuwenden.
Es war bereits in vivo bewiesen worden, dass der Zusatz von fungaler Phytase die Assimilation von Phytinphosphor und Mineralstoffen verbessern kann, wodurch der Phosphorumwandlungskoeffizient erhöht wird und die Phosphormenge in Futter und Dung reduziert wird.
Die mikrobielle Phytaseaktivität ist gut dokumentiert. Neben bakteriellen (GREAVES et al., 1967; IRVING & COSGROVE, 1971; POWAR & JAGANNATHAN, 1982) und Hefephytasen (NAYINI & MARKAKIS, 1984) werden Phytasen hauptsächlich in Schimmel, insbesondere in Aspergillus-Stämmen gefunden (SHIEH & WARE, 1968; YAMAMOTO et al., 1972; YOUSSEF et al., 1987). Die meisten dieser Stämme und andere Mikroorganismen produzieren auch Säurephosphytasen. Obgleich einige Phosphatasen Phytasen genannt wurden, sind sie eher nicht spezifisch und ihre hydrolytische Aktivität gegenüber Phytin ist im Vergleich zu anderen organischen Phosphatasen gering.
In Abhängigkeit von den Fermentationsbedingungen produziert der Stamm Aspergillus fucuum NRRL 3135-Wildtyp ein Gemisch aus extrazellulären Phosphatasen und Phytasen. Die Synthese von Phytase und saurer Phosphatase kann durch die Phosphorkonzentration nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, reguliert werden (SHIEH et al., 1969; ULLAH und CUMMINS, 1987). In jüngerer Zeit veröffentlichte Patentanmeldungen beanspruchen die Verwendung von genetisch veränderten Aspergillus fuccum NRRL 3135- und Aspergillus niger-Stämmen, um ein hohes Produktionsniveau von Phytase zu erreichen ( EP 0 420 358 A1 ). Eine Klonierung von saurer Phosphase wurde in diesem Dokument ebenfalls erwähnt.
Die Reinigung roher A. ficuum NRRL 3135-Phytasekulturbrühe (ULLAH & GIBSON, 1987) liefert eine Phytase mit zwei unterschiedlichen pH-Optima: Höchste Aktivität wird bei pH 5,0 bis 5,5 gefunden, während der zweite Aktivitätspeak (60 % der Aktivität bei pH 5,0) bei pH 2,2 auftritt.
ULLAH & CUMMINS (1987) reinigten eine saure Phosphatase von Aspergillus ficuum NRRL 3135 (Orthophosphorsäuremonoester-phosphohydrolase E. C. 3.1.3.2.) mit einem pH-Optimum von 2,5. Die saure Phosphatase ist bei pH 4,5 65 % weniger aktiv und ist bei pH 6,0 tatsächlich inaktiv. Eine andere saure Phosphatase wurde von ULLAH & CUMMINS (1988) mit einem pH-Optimum von 6,0 gereinigt.
Beide saure Phosphatasen waren unfähig, sich auf Phytat als Substrat einzustellen, obgleich sie eine breite Substratselektivität bei verschiedenen organischen Phosphormonoestern aufweisen (ULLAH & CUMMINS, 1988); IRVING & COSGROVE (1974), was im Gegensatz zu der erwähnten spezifischen Aktivität (16 %) von A. ficuum-saure Phosphatase mit einem pH-Optimum von 2,2 für Phytat steht.
Jüngere Publikationen von ZYLA (1993) beschreiben die Wirkung von saurer Phosphatase in Gegenwaz von Phytase aus Aspergillus niger auf Futterrohmaterialien und Futter bei verschiedenen pH-Werten.
A. ficuum NRRL 3135-Phytase und saure Phosphatasen unterscheiden sich nicht nur in der Substratspezifität und den pH-Optima, sondern auch in den Temperaturoptima voneinander. Phytase entwickelt bei 58 °C höchste Aktivität und verliert bei 68 °C die gesamte Aktivität. Die saure Phosphatase mit einem pH-Optimum von 2,5 hat ein Temperaturoptimum von 63°C und behält bei 70°C noch 88% ihrer katalytischen Aktivität bei.
Das Temperaturoptimum der sauren Phosphatase mit einem pH-Optimum von 6,0 ist auch 63°C, allerdings verliert das Enzym 92% seiner Aktivität bei 70°C. Daraus kann der Schluss gezogen werden, dass die saure Phosphatase mit einem pH-Optimum von 2,5 in einem höheren Temperaturbereich aktiv ist als die Phytase und die saure Phosphatase mit einem pH-Optimum von 6,0.
Eine nicht-gereinigte, intrazelluläre saure Phosphatase aus einem Abfallmycelium von Aspergillus niger hat ein pH-Optimum von 1,8 bis 2,6 und ein Temperaturoptimum von 60°C. Die Restaktivität von saurer Phosphatase bei pH 4,5 war noch 85% ihres Maximums (ZYLA et al., 1989).
Aspergillus ficuum-Phytaseaktivität wird als Ergänzung zu Schweine- und Broilerfutter entsprechend der gewünschten Reduzierung an Phytin und fäkalem Phosphor kombiniert mit einer guten Leistung des Tiers, einschließlich Wachstum und Futterumwandlung, zugesetzt. Eine Phytaseaktivität von 500 bis 1000 Einheiten (pH 5)/kg Futter wird für Schweine- und Broilernahrung (SIMONS et al., 1990) genannt, wobei eine Aktivität von 500 Einheiten/kg 0,8 g Phosphor/kg in Schweinefutter und 1,0 g/kg in Hühnerfutter (BORGGREVE, 1991; VAHL, 1991) entspricht. Der empfohlene Zusatz von Phytase zu Schweinefutter ist auf 600 Einheiten/kg wegen eines abnehmenden Effektes zusätzlicher Einheiten begrenzt (Natuphos Manual, Gist-Brocades).
Die in vitro-Hydrolyse von Phytin in den pflanzlichen Rohmaterialien Weizenkleie und Sojabohnen mit nicht-gereinigter intrazellulärer saurer Phosphatase von Aspergillus niger ist nach 2 Stunden bei einer entsprechenden Dosierung von 12 000 und 30 000 Einheiten/kg, 40°C und pH 4,5 beendet, während eine Phytinhydrolyse in Broilerfutter nach 4-ständiger Reaktionszeit unter denselben Bedingungen beendet ist. Dies gibt die Unwirksamkeit der sauren Phosphatase zum Phytinabbau wieder (ZYLA et al., 1989).
ZYLA & KORELESKI (1993) geben an, dass die in vitro-Wirkung von saurer Phosphatase zusätzlich zu Phytase von Aspergillus niger auf Rapssamen und Sojabohnen durch den pH der Inkubation beeinflusst wird. Die Inkubationen wurden bei einem relativ hohen saure Phosphatase/Phytase-Verhältnis durchgeführt (3,5/l bis 62/l, ausgedrückt als Phytat-hydrolysierende Aktivität).
ZYLA (1993) gibt an, dass die Dephosphorylierungswirkung der sauren Phosphatase von Aspergillus niger auf Phytin sich von der Wirkung der Aspergillus niger-Phytase unterscheidet, was zu einer additiven Wirkung zwischen beiden Enzymen (und einer kürzeren Abbauzeit) führt. Es wird beschrieben, dass die Gesamtphosphorfreisetzung aus Phytat mit der weiter gereinigten Phytasepräparation langsamer ist (das heißt niedrigeres saures Phosphatase/Phytase-Verhältnis). Dennoch enthielt die am stärksten gereinigte Präparation ein hohes saure Phosphatase/Phytase-Verhältnis (3,5/l).
WO 94/03072, die das Prioritätsdatum vom 31. Juli 1992 beansprucht, aber am 17. Februar 1994 veröffentlicht wurde, das heißt nach dem Einreichungsdatum der vorliegenden Patentanmeldung, offenbart rekombinante Wirtszellen, die rekombinante Phytase und rekombinante pH 2,5-saure Phosphatase produzieren, wobei beide Enzyme von Aspergillus niger var. Awamori, Stamm ALK0243, stammen. Diese Enzyme werden bei pH 2,5 in einem Verhältnis saure Phosphatase-Enzymaktivität zu Phytase-Enzymaktivität von 3 : 1 bis 16 : 1 produziert. Es wird gezeigt, dass solche Gemische eine kooperative Enzymaktivität besitzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung einer synergetischen Wechselwirkung von fungalen sauren Phosphatasen und Phytasen, die in einem niedrigen, saure Phosphatase/Phytase-Verhältnis gemischt sind, während einer in vitro- und in vivo-Hydrolyse von Phytin in pflanzlichen Rohmaterialien und Futtermitteln.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Enzymzusammensetzung bereit, die Phytathydrolysierende Aktivität aufweist, umfassend eine Phytase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH im Bereich von 2,5 bis 5,0 hat, und eine saure Phosphatase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH von 2,5 hat, mit einem Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat von 0,8 : 1 bis unter 3 : 1, wobei diese eine synergetische Wirkung auf Phytat haben.
Bei einer erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung entspricht das saure Phosphatase/Phytase-Verhältnis vorzugsweise einem pH 2,5/5,0-Profil von 1/1 bis 2,5/1, noch bevorzugter von 1,5/1 bis 2/1.
Bei einer erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung ist die Phytase vorzugsweise eine Pilzphytase, bevorzugter eine Aspergillus-Phytase. Am geeignetsten ist die Pilzphytase aus der Gruppe bestehend aus Aspergillus ficuum-Phytase, Aspergillus niger-Phytase und Aspergillus terreus-Phytase, ausgewählt.
Bei einer erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung ist die saure Phosphatase vorzugsweise eine saure Pilzphosphatase, noch bevorzugter eine saure Aspergillus-Phosphatase. Am bevorzugtesten ist die saure Pilzphosphatase aus der Gruppe bestehend aus saurer Aspergillus ficuum-Phosphatase, saurer Aspergillus niger-Phosphatase und saurer Aspergillus terreus-Phosphatase, ausgewählt. Vorzugsweise ist die saure Phosphatase eine thermisch stabile saure Phosphatase, insbesondere ein Enzym, das thermisch stabiler ist als die Phytase.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine Enzymzusammensetzung, wie sie oben definiert ist, die ein verbessertes Verhältnis während der thermischen Behandlung hindurch zeigt, das heißt, nach einer thermischen Behandlung als Resultat eines erhöhten saure Phosphatase/Phytase-Verhältnisses eine verbesserte synergetische Wirksamkeit zeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Lebensmittel-, Futtermittel- oder Futterprodukt oder eine Komponente davon bereit, das/die eine Enzymzusammensetzung, wie sie oben definiert wurde, enthält, einschließlich eines thermisch behandelten Lebensmittel-, Futtermittel- oder Futterproduktes oder eine Komponente davon, das/die eine Enzymzusammensetzung, wie sie hier definiert wurde, enthält, bereit.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hydrolyse von Phytat bereit, das die Stufe eines Behandelns eines Rohmaterials, das Phytat enthält, mit einer Enzymzusammensetzung, wie sie hier definiert ist, umfasst, wobei die Behandlung unter hydrolysierenden Bedingungen bei einem pH von etwa 2 bis etwa 6, bei denen die Phytase und die saure Phosphatase der Enzymzusammensetzung hydrolysierende Aktivität haben, durchgeführt wird.
Vorzugsweise wird diese Behandlung bei einem pH von etwa 2,5 durchgeführt.
In diesem Verfahren ist das Phytat enthaltende Rohmaterial ein vegetabiles (pflanzliches) Rohmaterial, wie zum Beispiel insbesondere ein Sojabohnen- oder Weizen-Rohmaterial.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine genetisch modifizierte Pflanze oder einen Teil oder ein davon abgeleitetes Produkt bereit, wobei die Pflanze, der Teil der Pflanze oder das Produkt ein Gen, das für eine Pilzphytase codiert, die Phytathydrolysierende Aktivität bei einem pH im Bereich von 2,5 bis 5,0 hat, und ein Gen, das für eine saure Pilzphosphatase codiert, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH von 2,5 hat, enthält, wobei beide Gene funktionell an transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen gebunden sind, um eine Expression der Enzyme, die durch die Gene codiert werden, in einem Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) für Phytat von 0,8 : 1 bis unter 3 : 1, die eine synergetische Wirkung auf Phytat haben, zu erlauben.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verbesserung der Futtermittel- oder Futter-Verdauung bei der Viehproduktion und zur Verringerung der Phosphorausscheidung in Stalldung bereit, das Füttern des Viehs mit einem Futtermittel oder Futter umfasst, welches eine Enzymzusammensetzung, wie sie hier definiert ist, enthält.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen verbesserten enzymatischen Abbau von Pflanzenphytin durch ein geeignetes saure Phosphase/Phytase-Gemisch infolge einer synergetischen Wechselwirkung zwischen beiden Enzymen.
In der Natur fungiert Phytin als primäre Speicherform sowohl von Phosphor als auch von Inosit in vielen Pflanzensamen und Getreiden. Während des Keimens wird Phosphor durch Wirkung der Phytase, die in diesen Samen und Getreiden vorhanden ist, freigesetzt.
Wenn diese Pflanzenrohmaterialien in der Lebensmittel- und Futtermittelindustrie eingesetzt werden, ist Phytin eine potentielle Phosphorquelle für Mensch und Tier. Allerdings ist die Bioverfügbarkeit dieses Phytins für monogastrische Tiere begrenzt: Pflanzenphytasen werden im Magen-Darm-Trakt durch Magensäuren inaktiviert, wodurch ihre in vivo-Wirksamkeit niedrig ist. Daher können Verfahren entwickelt werden, um die Bioverfügbarkeit von Phytinphosphor und damit die Bioverfügbarkeit und Absorption von essentiellen Nahrungsmineralstoffen zu verbessern.

a. Enzymatische Vorbehandlung von Pflanzenrohmaterialien, um den Anteil an verdaulichem Phosphor zu erhöhen;
b: Enzymatische Vorbehandlung des Futters oder Lebensmittels;
c: in vivo-Phytasewirkung.

Während Pflanzenphytasen bei der Vorbehandlung von Pflanzenrohmaterialien, Futtermitteln und Lebensmitteln (neutraler pH) eine wichtige Rolle spielen können, sind sie für die in vivo-Wirkung von geringerer Bedeutung (Magen-pH (2)).
Die in vivo-Phytinhydrolyse kann besser durch mikrobielle, spezifische Pilzphytasen durchgeführt werden, die bei dem sauren Magen-pH eine hohe Aktivität entwickeln können und hohe pH-Stabilität aufweisen. Phytin-hydrolysierende Enzyme werden durch Pilze produziert, die zu der Gattung Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Botrytis,... gehören. Diese Pilze produzieren ein Gemisch aus sauren Phosphatasen (E.C.3.1.3.2) und Phytasen (E.C.3.1.3.8), die beide Phytin hydrolysieren, allerdings bei unterschiedlicher Spezifität für Phytat und Phosphatmonoester. Allerdings haben die meisten dieser Organismen einen niedrigen Enzymproduktionslevel. Da der Produktionslevel dieser Enzyme von größter Wichtigkeit ist, um das Verfahren wirtschaftlich zu machen, wurde Aspergillus ficuum NRRL 3135 als hochproduktiver Stamm ausgewählt. Alternative Pilze sind Aspergillus niger und Aspergillus terreus, mit einem niedrigeren Produktsionslevel.
Obgleich beide, saure Phosphasen und Phytasen, gelöstes gereinigtes Phytin hydrolysieren können, zeigen saure Phosphatasen sowohl in vitro als auch in vivo geringe Aktivität gegenüber Phytin in Pflanzenrohmaterial, Futter- oder Lebensmittel. Sie wurden daher bis vor kurzem als Phytin-hydrolysierende Enzyme vernachlässigt. Trotz der geringen Phytin-hydrolysierenden Aktivität von sauren Phosphatasen, wenn diese als einzige Enzymquelle verwendet werden, kann allerdings die Phytasewirkung auf Phytin durch Ergänzung mit saurer Phosphatase infolge einer synergetischen Wechselwirkung zwischen beiden Enzymen, die mit festgelegten Verhältnissen der saure Phosphatase/Phytase-Aktivität dosiert werden, verbessert werden. Die synergetische Wirkung tritt bei einer geeigneten Zusammensetzung und einem geringen Verhältnis beider Enzyme auf.
Neben der pH-Stabilität ist die Thermostabilität der Phytin-hydrolysierenden Enzyme für die Lebensmittel- und Futtermittel-Herstellungsverfahren ein wichtiger Faktor. Da das gängige Mischfutterproduktionsverfahren oft auf pelletisiertem Futter basiert, sollten Enzyme, die dem Futter vor dem Pelletisieren zugesetzt werden, die hohen Temperaturen aushalten, die in der Futtermühle erreicht werden (75 bis 80°C), um eine vorhersagbare Phytinhydrolyse sicherzustellen. A. ficuum-Phytase wird bei diesen Temperaturen teilweise denaturiert, wodurch eine Überdosis von 30% notwendig ist. Dagegen ist saure A. ficuum-Phosphatase stabiler, wodurch die Denaturierung geringer ist, und ein saure Phosphatase/Phytase-Gemisch ist gegenüber dem Futtermittelpelletisierverfahren stabiler als Phytase selbst.
Durch Verwendung eines Gemisches aus saurer Phosphatase und Phytase anstelle von Phytase als einzigem Enzym wird somit die Pflanzenphytinhydrolyse verbessert, und zwar nicht nur als Resultat einer höheren Thermostabilität dieses Enzymgemisches, sondern hauptsächlich als Resultat einer verbesserten synergetischen Wechselwirkung zwischen beiden Enzymen, wenn das Verhältnis pH 2,5/5,0-Phytat-hydrolysierender Aktivität durch unterschiedlichen thermischen Abbau beider Enzyme ansteigen wird.
Saure A. ficuum- oder A. niger-Pilzphosphatase (E.C.3.1.3.2) und A. ficuum-Phytase (E.C.3.1.3.8) sind beide fähig, Dodecanatriumphytat in Flüssigkeit zu hydrolysieren, allerdings ist ihre Hauptaktivität unterschiedlich: Phytase hat eine Hauptaktivität für Phytat (1) und eine Nebenaktivität für Monophosphatester (2); saure Phosphatase hat eine Hauptaktivität für Monophosphatester und eine Nebenaktivität für Phytat (Beispiel n. Das Verhältnis (1)/(2) von Aspergillus ficcum-Phytaseaktivität auf Phytat und Dinatrium-βglycerophosphat beträgt 6,6, während das saure A. ficuum-Phosphataseverhältnis (1)/(2) 0,13 beträgt, was die höhere Spezifität von Phytase für Phytat anzeigt. Für Aspergillus niger beträgt das Verhältnis (1)/(2) 0,17. Bei der weiteren Anwendung betrifft Phosphataseaktivität immer Phytathydrolyse. Die saure Phosphatase hat eine optimale Aktivität bei 2,3, während Phytase eine optimale Aktivität bei 5,0 hat und einen zweiten Aktivitätspeak bei 2,5 aufweist. Enzymgemische aus Phytase und Phosphatase werden außerdem durch das Verhältnis (a/p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) für Phytat charakterisiert. Für das a/p-Verhältnis reiner Phytase wird 0,6/l gefunden und für das a/p-Verhältnis für saure Phosphatase wird 1/0 gefunden.
A. ficuum NRRL 3135- und A. niger-Phytase- und saure Phosphataselösungen wurden nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erhalten.
Ein in vitro-Phytasetest wurde bei Standard-Schweinefutter bei niedrigem Feuchtigkeitsgehalt (70%), pH 2,5 und 40°C, 3 Stunden Inkubation, durchgeführt, um die aktive Komponente in Phytasepräparationen zu bestimmen (Figuren).
A. ficuum NRRL 3135-Phytasepräparationen mit einem unterschiedlichen a/p-Verhältnis wurden Schweinefutter zugesetzt, und zwar entweder basierend auf pH 2,5-Aktivität (Ua) oder basierend auf pH 5-Aktivität (Up) für Phytat.
Es bestand keine direkte Korrelation zwischen der Phytase-pH 2,5-Aktivität und der Phytinhydrolyse, obgleich der Abbau bei pH 2,5 stattfand und saure Phosphatase fähig war, gelöstes Natriumphytat in Flüssigkeit zu hydrolysieren (1). Andererseits könnte die Phytinhydrolyse mit der Phytase-pH 5,0-Aktivität in Korrelation stehen, speziell wenn Phytasepräparationen in Präparationen mit einem a/p-Verhältnis < 1,5/1 und Präparationen mit einem a/p-Verhältnis zwischen 1,5/1 und 3/1 getrennt wurden (2).
Daraus könnte der Schluss gezogen werden, dass die saure Phosphataseaktivität auf das Futterphytin nicht vorherrschend war. Allerdings wurde zwischen den verschiedenen Phytasepräparationen, die mit derselben pH 5,0-Aktivität dosiert worden waren, noch ein Unterschied festgestellt. Der Unterschied entsprach der unterschiedlichen saure Phosphataseaktivität in den Phytasepräparationen (Beispiel II): Als das a/p-Verhältnis von 0,6/1 auf 3/1 zunahm und folglich die Menge an saurer Phosphatase anstieg, war die Phytinhydrolyse in Schweinefutter begünstigt und die Wirksamkeit (Menge an Phytinphosphor, freigesetzt durch die Phytasepräparation (pH 5,0-Aktivität) – (g PP/500 Up)) des Phytasegemischs stieg an (3).
Die Bedeutung von saurer A. ficcum-Phosphatase 1/0 in einer Phytasepräparation mit a/p > 0,6/1 wurde durch in vitro-Hydrolyse von Schweinefutterphytin durch Phytasepräparationen 0,6/1 und 1/1 mit und ohne Ergänzung von sauer Phosphatase 1/0 bis zu einem a/p-Verhältnis = 2/1 bewiesen (Beispiel III). Darüber hinaus wurde ein synergetischer Effekt zwischen der Phytase und der sauren Phosphatase beobachtet. Bei Zusatz derselben Phytase-0,6/1-Aktivität (Up) zu dem Schweinefutter, ergänzt mit saurer Phosphatase zu einem a/p-Verhältnis von 2/1, wurde die Phytasewirksamkeit von 0,55 auf 1,25 g PP/500 Up mit einem synergetischen Effekt von 0,49 g PP/500 Up erhöht. Der synergetische Effekt zwischen A ficuum-Phytase und saurer Phosphatase auf das Schweinefutter war bei einem a/p-Verhältnis von 1,5–2/1 maximal und zeigte eine abnehmende Wirkung, wenn a/p auf 3/1 erhöht wurde. Oberhalb dieses Verhältnisses kann kein zusätzlicher synergetischer Effekt nachgewiesen werden (3).
Futter unterscheiden sich in der Futtermittelzusammensetzung von einander und könnten als solche die Phytasewirkung wie auch die synergetische Wechselwirkung zwischen Phytase- und saurer Phosphasepräparationen beeinflussen. Unterschiedliche Schweine- und Geflügelfutter, zum Beispiel Ferkel-, Sau-, Schweine- Broiler- und Legehennenfutter, wurden in vitro mit Phytasepräparationen mit a/p 1,6/1, 0,6/1 und einem Gemisch aus Phytase 0,6/1 und saurer Phosphatase 1/0 bis a/p 2/1 inkubiert.
Alle Phytase- und saure Phosphatasewirksamkeiten unterschieden sich für die verschiedenen Futter stark (z. B. Phytase 0,6/1: 0,25 -> 1,5 g PP/500 Up; saure Phosphatase: 0,025 -> 0,15 g PP/500 Ua}, was anzeigt, dass das Auftreten von Phytin in den verschiedenen Pflanzenrohmaterialien unterschiedlich ist und seine enzymatische Hydrolyse beeinflusst.
Der synergetische Effekt von saurer A. ficcum-Phosphatase, der in Standard-Schweinefutter nachgewiesen wurde, war auf die anderen Futter übertragbar, war aber für die verschiedenen Futter stark unterschiedlich (0,25 -> 0,94 g PP/500 Up).
Der Einfluss der Phytinherkunft auf die synergetische Wirkung zwischen Phytase und saurer Phosphatase, wie oben angenommen, wurde durch den in vitro-Phytinabbau verschiedener Pflanzenrohmaterialien, die häufig in Tiermischfutter gefunden werden: Erbsen, Weizenkleie, Sojabohnen und Reiskleie, untersucht (Beispiel V). A. ficuum-Phytase 0,6/1 wurde mit saurer A. ficuum-Phosphatase 1/0 zu einem a/p-Verhältnis = 2/1 ergänzt.
Die Wirksamkeiten von A. ficcum-Phytase (0,6/1 und 2/1) wie auch von saurer Phosphatase (1/0) waren stark variabel. Obgleich die saure Phosphatase bei Standard-Schweinefutter eine sehr geringe Wirksamkeit hatte (0,15 g PP/500 Ua), konnte etwas Pflanzenphytin wie Reiskleiephytin, leicht durch diese saure Phosphatase hydrolysiert werden (0,8 g PP/500 Ua). Anderes Pflanzenphytin wie Weizenkleie- und Sojabohnenmehlphytin wurde durch die saure A. ficuum-Phosphatase (0,2 g PP/500 Ua) hydrolysiert.
Der synergetische Effekt zwischen der A. ficuum-Phytase und saurer Phosphatase, der in Futter festgestellt wird, wurde nur in solchen Pflanzenrohmaterialien gefunden, in denen die saure Phosphatase selbst eine geringe Wirksamkeit hatte (0,2 g PP/500 Ua): Synergie in Sojabohnenmehl: 0,57 g PP/500 Up; Synergie in Weizenkleie: 0,47 g PP/500 Up.
Der synergetische Effekt zwischen der Phytase und der sauren Phosphatase war gering, wenn das Phytin bereits durch die saure Phosphatase selbst hydrolysiert wurde. Synergie in Reiskleie: 0,13 g PP/500 Up. Erbsenphytin wurde durch beide Enzyme kaum hydrolysiert und es konnte keine synergetische Wechselwirkung nachgewiesen werden.
Folglich kann die Wechselwirkung zwischen saurer A. ficuum-Phosphatase 1/0 und Phytase 0,6/1 in Futter als Resultat des normalen additiven Effekts, ergänzt durch unterschiedliche synergetische Effekte bei verschiedenen Pflanzenrohmaterialien, die das Futter bilden, erläutert werden.
Außer durch A. ficuum NRRL 3135 werden Phytase und saure Phosphatase auch durch Aspergillus niger-Stämme produziert. Wie A. ficuum produziert A. niger ein Gemisch aus extrazellulärer Phytase und saurer Phosphatase. Saure A. niger-Phosphatase 1/0 hat das gleiche pH-Aktivitätsprofil wie saure A. ficuum-Phosphatase mit einem pH-Optimum von 2,3. Die nachfolgenden Experimente bewiesen die synergetische Wirkung zwischen Phytasen und sauren Phosphatasen unterschiedlichen fungalen Ursprungs.
Die in vito-Phytinhydrolyse durch flüssige A. niger-Phytasepräparationen in Standard-Schweinefutter war identisch mit der Hydrolyse mit A. ficuum NRRL 3135- Phytasepräparationen (Beispiel VI). Die A. niger-Phytasewirksamkeit erhöhte sich von 0,75 auf 1,15 g PP/500 Up, wenn das a/p-Verhältnis der Phytasepräparation von 0,9/1 auf 1,6/1 anstieg.
Der Zusatz von saurer Phosphatase, entweder aus A. niger oder A. ficuum NRRL 3135 zu einer A. niger-Phytasepräparation a/p 1,15/1 zur Erhöhung des a/p-Verhältnisses auf 1,9/1 bzw. 1,6/1, bewies die synergetische Wechselwirkung dieser Enzyme (Beispiel VII).
Die Wirksamkeit von beiden sauren Phosphatasen war ähnlich. Wenn saure Phosphatase zu der A. niger-Phytase 1,15/1 zugesetzt wurde, war der restliche Phytinphosphor im Futter Null, wodurch die Enzymwirksamkeit und -synergie wegen der Erschöpfung des Phytatsubstrats nicht korrekt errechnet werden konnte.
Eine synergetische Wechselwirkung wurde auch zwischen saurer A. niger-Phosphatase und A. ficuum NRRL 3135-Phytase beobachtet: die Wirksamkeit wurde verdoppelt (0,85 -> 1,8 g PP/500 Up), wenn A. ficuum-Phytase 0,6/1 mit sauer A. niger-Phosphatase 1/0 zu a/p 1,9/1 ergänzt wurde, und zwar mit einer synergetischen Wirkung von 0,62 g PP/500 Up (Beispiel VIII).
Die saure A. ficuum NRRL 3135-Phosphatase 1/0 hat den Vorteil einer erhöhten Thermostabilität unter flüssigen Bedingungen und während der Futterpelletisierung, wodurch die synergetische Wirkung zwischen Phytase 0,6/1 und saurer Phosphatase 1/0 in pelletisiertem Futter gefördert werden kann.
Die Denaturierung einer flüssigen Phytase 0,6/1-Lösung betrug sowohl für die pH 2,5- als auch die pH 5-Aktivität nach 1 Minute bei 80 °C und pH 5 (0,5 M Acetatpuffer) 60 %, während eine saure Phosphatase 1/0-Lösung nur 10% ihrer Aktivität unter identischen Inkubationsbedingungen verlor.
Die Thermostabilität unter Futtermühlenbedingungen wurde simuliert. Phiolen wurden mit Standard-Schweinefutter, das mit flüssiger Phytase 0,6/1- oder saurer Phosphatase 1/0-Präparation ergänzt war, gefüllt. Die Feuchtigkeit des Gemisches betrugt 12,2 %. Die Phiolen wurden verschlossen und bei verschiedenen Temperaturen (60–90°C) durch Eintauchen in ein Wasserbad erwärmt (Beispiel IX).
Die Aktivität der sauren A. ficuum-Phosphatase 1/0 (pH 2,5) betrug nach 10-minütigem Erwärmen bei 70°C noch 100%, während A. ficuum-Phytase 0,6/1 bereits 40% ihrer Aktivität (pH 2,5) verloren hatte. Bei 80°C nahm die Aktivität der sauren Phosphatase auf 65% und die Phytaseaktivität auf 35% ab.
Die höhere Thermostabilität der sauren A. ficuum-Phosphatase 1/0, die bereits in Flüssigkeit und Futter nachgewiesen worden war, wurde weiterhin in einer Labormühle und in einer Industriemühle detektiert.
Schweinefutter, ergänzt mit A. ficuum-Phytase 0,6/1- oder saurer Phosphatase 1/0-Flüssigkeit (3000 Ua/kg Futter) wurde im Labormaßstab pelletisiert (Beispiel X). Die Temperatur der Pellets wurde durch Dampfzusatz in dem Futterkonditionierer kontrolliert.
Phytase 0,6/1 verlor im Durchschnitt 55% ihrer Aktivität bei einer Pelletisierungstemperatur im Bereich von 68,6–72,1°C, während saure Phosphatase 1/0 bei 71,6– 73,1°C (pH 2,5-Aktivität) im Durchschnitt nur 25% ihrer Aktivität verlor.
Es wurde ein industrielles Pelletisierungsexperiment mit getrockneten Phytasepräparationen durchgeführt. Phytase 0,6/1 und Phytasegemisch 1,25/1 wurden in Standard-Schweinefutter (900 Up/kg Futter) gemischt und durch eine Industriefuttermühle geführt (Beispiel XI). Die Wirksamkeit des Phytasegemisches 1,25/1 in der Nahrung betrug vor dem Pelletisieren 160% der Phytase 0,6/1-Wirksamkeit: 0,95 <-> 0,6 g PP/500 Up. Nach dem Pelletisieren bei etwa 75°C (Pellettemperatur) betrug die Wirksamkeit der Phytase 1,25/1 190% der Phyta e 0,6/1: 0,75 <-> 0,4 g PP/500 Up. Diese Zunahme kann der Kombination aus höherer Thermostabilität der sauren Phosphatase 1/0, die in der Phytase 1,25/1-Präparation vorliegt, und dem synergetischen Effekt zwischen beiden Enzymen zugeschrieben werden: der Aktivitätsverlust (33%) der Phytase 0,6/1-Komponente in der Phytase 1,25/1-Präparation wurde durch die Erhöhung des a/p-Verhältnisses auf 1,25/0,66 = 1,9/1 im pelletisierten Futter kompensiert.
Die synergetische Wirkung zwischen A. ficuum NRRL 3135-Phytase 0,6/1 und saurer Phosphatase 1/0, die während in in vitro-Phytinhydrolyse festgestellt wurde, und die höhere Thermostabilität der sauren Phosphatase könnten eine in vivo-Phytinhydrolyse in pelletisiertem Futter begünstigen.
In vivo-Verdauungsversuche mit Schweinen (Beispiel XII und XIII) wurden durchgeführt, um die Wirkung von saurer A. ficuum-Phosphatase 1/0, die A. ficuum-Phytase 0,6/1 zugesetzt war, zu bestimmen. Die Wirkung von Phytase oder saurer Phosphatase in vivo wurde durch den verdaubaren fäkalen Phosphor (dP) durch enzymatische Phytin hydrolyse gemessen. Fäkales dP in vivo wird wie folgt errechnet: Gesamtphosphoraufnahme – Gesamtphosphorausscheidung. Eine Erhöhung beim dP wird durch die Differenz zwischen in vivo-dP und dP, errechnet während der Futterformulierung, errechnet.
Im Schweineversuch I (Beispiel XII) stieg dP bei 0,78 g/kg Futter durch Zusatz von Phytase 0,6/1 mit 750 Up/kg Futter an; die Supplementierung der Phytase mit saurer Phosphatase 1/0 mit 1050 Ua/kg Futter zur Erhöhung des a/p-Verhältnisses auf 2/1 erhöhte dP auf 0,89 g/kg Futter mit einer synergetischen Wirksamkeit von 0,055 g dP/500 Up. Saure Phosphatase, die allein dem Futter zugesetzt wurde (1050 Ua/kg Futter) hatte überhaupt keinen Einfluss auf den dP-Level im Futter: dP blieb nach dem Testzeitraum unverändert.
Die Wirksamkeit der Phytase in diesem Versuch war wegen ihrer hohen Dosierung niedrig (0,52 g dP/500 Up).
Durch Zusatz von saurer Phosphatase zu Phytase wurde die Gesamtwirksamkeit um 13% von 0,52 auf 0,59 g dP/500 Up erhöht.
Die synergetische in vivo-Wirkung auf dP für sowohl Phytase wie auch Phytase/saure Phosphatase-Gemisch wurde auch in eine verringerte Phosphorausscheidung umgesetzt: Zusatz von Phytase (750 Up/kg Futter) reduzierte die Phosphorausscheidung um 37%, während das Phytase/saure Phosphatase-Gemisch die Phosporausscheidung um 41%, verglichen mit dem Kontrollfutter, reduzierte. Diese zusätzliche Verringerung der Ausscheidung (relativ 11%) kann sich im Hinblick auf die Phosphorausscheidungs-Gesetzgebung in geringeren Kosten widerspiegeln.
Im Schweineversuch II (Beispiel XIII) wurde Phytase 0,6/1 dem Schweinefutter in der empfohlenen Konzentration von 400 Up/kg zugesetzt. dP stieg um 0,58 g/kg Futter durch Phytasezusatz und um 0,62 g/kg Futter durch Ergänzung der Phytase mit saurer Phosphatase 1/0 (580 Ua/kg) auf ein a/p-Verhältnis = 2/1.
Eine Senkung des Phytaselevels erhöhte ihre Wirksamkeit auf 0,725 g dP/500 Up. Durch Zusatz von saurer Phosphatase stieg die gesamte Wirksamkeit um 24% (relativ) auf 0,9 g dP/500 Up mit einer synergetischen Wirkung von 0,125 g dP/500 Up.
Aus den beiden Versuchen I und II kann geschlossen werden, dass die synergetische in vivo-Wirkung zwischen A. ficuum-Phytase und saurer Phosphatase bei niedrigerer Phytase- und saurer Phosphatasekonzentration ausgeprägter ist (Beispiel XIV). Wenn die Do sierung des Phytase + saurer Phosphatase-Gemisches von 750 Up + 1050 Ua/kg auf 400 Up + 580 Ua/kg gesenkt wurde, stieg die Wirksamkeit von 0,59 auf 0,9 g dP/500 Up an.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Pflanzenphytin wurde in vitro in Standard-Schweinefutter mit 0,33% Phytinphosphor durch verschiedene Aspergillus ficuum-Phytasepräparationen mit einem a/p-Verhältnis, das zwischen 1/0 und 16/1 variierte, hydrolysiert. Die Hauptkomponenten des Schweinefutters waren Tapioca, Erbsen, Maisglutenfutter, Weizenglutenfutter und Sojabohnenextrakte.
Phytasepräparationen wurden in verschiedenen Konzentrationen dosiert:

1. 0–2,5 Ua (pH 2,5-Aktivität)/g Futter (1),
2. 0–2,8 Up (pH 5-Aktivität)/g Futter (2).

Der Gesamtphytinphosphor des Futters wurde nach ELLIS und MORRIS (1983 und 1986) gemessen. Eine in geeigneter Weise verdünnte Phytasepräparation wurde zu 2 g des Futters gegeben, die Feuchtigkeit des Gemisches wurde durch Zusatz von 0,2 M Sörensen-Puffer, pH 2,5, auf 70% eingestellt und das Gemisch wurde bei 40°C 3 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Futter mit 40 ml 2,4% HCl (3 h) extrahiert und der Rest Phytinphosphor im Extrakt wurde nach Ionenaustauschchromatographie und Phytinzerstörung gemessen.
Eine Phytaseeinheit für Phytat bei pH 5 wird hier als 1 Up abgekürzt, wohingegen eine saure Phosphatase- oder Phytase-Einheit für Phytat bei pH 2,5 als eine Ua abgekürzt wird.
1 gibt den prozentualen Rest-Phytinphosphorgehalt nach Phytasewirkung als Funktion der dosierten pH 2,5-Aktivität an: ein Zusatz derselben Phytase-pH 2,5-Aktivität zu Futter (z. B. 0,5–1 Ua/g), Rest Phytinphosphor (95–10%), zeigte keine Korrelation mit der Enzymdosis, was anzeigt, dass es keine Korrelation zwischen der Phytase-pH 2,5-Aktivität und der in vitro-Phytinhydrolyse in Schweinefutter gibt.
2 gibt den prozentualen Rest-Phytinphosphorgehalt nach Phytasewirkung als Funktion der dosierten pH 5-Aktivität an: eine Dosierung (bzw. ein Zusatz) derselben Phytase-pH 5-Aktivität zu dem Futter (z. B. 0,4–0,5 Up/g) zeigte eine Korrelation zwischen Rest-Phytinphosphor und Enzymdosis. Wenn Phytasepräparationen mit a/p zwischen 1,5/1 und 3/1 und a/p < 1,5/1 getrennt wurden, wurde außerdem die Differenz beim Rest-Phytinphosphor nach Phytaseeinwirkung bei derselben pH 5-Dosierung kleiner: Phytasepräparationen mit a/p < 1,5 hydrolysierten Phytinphosphor weniger wirksam als Phytasepräparationen mit a/p zwischen 1,5/1 und 3/1.
3 zeigt die in vitro-Phytinhydrolyse, errechnet als die Menge an Phytinphosphor, die durch Zugabe von 500 Einheiten Phytase (Up) zu 1 kg Futter bei 40 °C über 3 h (g PP/500 Up) freigesetzt wurde. Die Wirksamkeit der verschiedenen Phytasepräparationen wurde mit der Wirksamkeit, die als additive Wirkung zwischen den zwei Enzymen, die die Phytasepräparationen bilden, Phytase 0,6/1 und saure Phosphatase 1/0, wie in Beispiel III, errechnet wurde, verglichen. Die synergetische Wirkung zwischen beiden Enzymen wurde als die Differenzen zwischen dem Testresultat und der errechneten additiven Wirkung errechnet. Eine ansteigende synergetische Wirkung kann mit einem Maximum bei etwa a/p 2/1 nachgewiesen werden. Oberhalb dieses Verhältnisses kann keine zusätzliche synergetische Wirkung beobachtet werden.
Beispiel I
Phytase und saure Phosphatase-pH 2,5-Aktivität wurde durch Messung der Phosphorfreisetzung untersucht. 0,5 ml einer geeignet verdünnten Enzympräparation wurden zu 2 ml eines 1/1-Gemisches aus 0,2 M pH 2,5-Sörensen-Puffer und 12,5 mM Dodecanatriumphytat oder 25 mM Dinatrium-β-glyzerophosphatlösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 10 Minuten bei 40 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,5 ml einer 10%igen Trichloressigsäure beendet. Freigesetzter Phosphor wurde spektralphotometrisch gemessen, wobei entsprechend dem offiziellen EEC-Verfahren 5 ml eines Vanadat/Molybdat-Reagens zugesetzt wurden.
Die pH 5-Phytaseaktivität auf Dodecanatriumphytat wurde auf ähnliche Weise gemessen, indem der pH 2,5-Sörensen-Puffer durch 1 M pH 5-Acetatpuffer ersetzt wurde.
Eine Phytase- oder saure Phosphataseaktivitätseinheit war als die Enzymmenge definiert, die 1 μMol Phosphor/min bei 40°C unter pH 5 bzw. pH 2,5 freisetzt.
Das Verhältnis (1)/(2) zwischen der Enzymaktivität bei pH 2,5 für Phytat (1) und Dinatrium-β-Glycerophosphat (2) bestimmt die Spezifität beider Enzyme: Phytase 0,6/1 entwickelt die höchste Aktivität für Phytat, während die sauren Phosphatasen höchste Aktivität für Dinatrium-β-glycerophosphat entwickeln.
Tabelle 1
Beispiel II
Phytin wurde in vitro in einem Standard-Schweinefutter mit 0,33% Phytinphosphor durch verschiedene A. ficuum-Phytasepräparationen hydrolysiert. Die Hauptkomponenten des Schweinefutters waren Erbsen, Tapioka, Maisglutenfutter, Weizenglutenfutter und extrahierte Sojabohnen. Der Gesamtphytinphosphor des Futters wurde nach ELLIS und MORRIS (1983, 1986) gemessen. 1,4 Einheiten (Up) einer flüssigen Phytasepräparation wurden zu 2 g des Futters gegeben, die Feuchtigkeit des Gemischs wurde durch Zusatz von 0,2 M pH 2,5-Sörensen-Puffer auf 70% eingestellt, und das Gemisch wurde für 3 Stunden bei 40°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Futter mit 40 ml 2,4% HCl (3 h) extrahiert und der Phytinphosphor im Extrakt wurde nach Ionenaustauschchromatographie und Phytinabbau gemessen. Die Phytinhydrolyse wurde als Differenz im Phytingehalt des Futters vor und nach Behandlung mit Phytase errechnet. Die in vitro-Phytasewirksamkeit wurde als die Menge an Phytinphosphor (g PP) errechnet, die durch 500 Einheiten Phytase (Up) pro kg Futter bei 40°C über 3 h freigesetzt wird.
Wenn das a/p-Verhältnis der Phytasepräparationen mit niedrigem a/p-Verhältnis (0,6/1 -> 2/1) stieg, zeigte die Wirksamkeit der Präparationen einen linearen Anstieg: reine Phytase 0,6/1 zeigte eine Wirksamkeit von 0,55 g PP/500 Up, während die Wirksamkeit einer Phytasepräparation mit einem a/p-Verhältnis = 2/1 1,75 g PP/500 Up betrug. So führt der Zusatz von 500 Einheiten (Up) Phytaseaktivität zu 1 kg Schweinefutter zur Freisetzung einer Phytinphosphormenge, die in Abhängigkeit vom a/p-Verhältnis der Phytase zwischen 0,55 und 1,75 g schwankt. Bei höherem a/p-Verhältnis flacht die Wirksamkeitszunahme (Synergie) ab.
Tabelle 2
Beispiel III
Phytin wurde in vitro in Standard-Schweinefutter (Beispiel II) durch A. ficuum-Phytasepräparationen, ergänzt mit saurer A. ficuum-Phosphatase 1/0, hydrolysiert, um die Bedeutung von saurer Phosphatase in einem saure Phosphatase/Phytase-Gemisch zu beweisen. Phytase 0,6/1 wurde mit saurer Phosphatase zu a/p = 2/1 und 3/1 durch Zusatz von 2 bzw. 3,4 Ua saurer Phosphatase zu 1,4 Up Phytase ergänzt; Phytase 1/1 (1,4 Up) wurde mit 1,4 und 2,8 Ua saurer Phosphatase zu einem jeweiligen a/p-Verhältnis 2/1 und 3/1 ergänzt.
1,4 Up einer flüssigen Phytasepräparation (a/p, 0,6/1, 1/1, 2/1 und 3/1) wurden zu 2 g des Futters gegeben, die Feuchtigkeit des Gemisches wurde durch Zusatz von 0,2 M pH 2,5-Sörensen-Puffer auf 70% oder 80% eingestellt und das Gemisch wurde über 3 h bei 40°C inkubiert.
Die Wirksamkeit der sauren Phosphatase selbst wurde durch Zugabe von 2 Ua zu 2 g des Schweinefutters und Inkubieren des Gemischs, wie es oben erwähnt wurde, bestimmt.
Die Phytinhydrolyse wurde wie in Beispiel Π berechnet.
Ein Vermischen von Phytase- und saurer Phosphatasepräparationen zu einem a/p-Verhältnis 2/1 und 3/1 vor Zugabe zum Futter erhöhte die Wirksamkeit des Enzymgemisches sowohl durch additive als auch synergetische Wechselwirkung zwischen beiden Enzymen.
Zum Beispiel: Zusatz von 500 Up Phytase 0,6/1 zu Schweinefutter setzt 0,95 g Phytinphosphor frei, während der Zusatz von 500 Ua saurer Phosphatase 1/0 0,25 g Phytinphosphor freisetzt. Da 500 Up Phytase 0,6/1 300 Ua pH 2,5-Aktivität haben, sind 700 Ua saurer Phosphatase 1/0 notwendig, um eine saure Phosphatase/Phytase-Mischung mit einem a/p-Verhältnis = 2/1 zu erhalten. Wenn beide Enzyme eine einfache additive Wirkung haben, kann die Wirksamkeit wie folgt errechnet werden: (500 Up Phytase*0,95 g PP/500 Up) + (700 Ua saure Phosphatase*0,25 g PP/500 Ua) = 1,3 g PP(/500 Up Phytase).
Die im Assay festgestellte Wirksamkeit ist nicht 1,3 sondern 2,1 g PP/500 Up, was eine synergetische Wirkung von 0,8 g PP/500 Up beinhaltet.
Tabelle 3
Beispiel IV
Phytin wurde in vitro in verschiedenen Standardfuttern (Schweine-, Ferkel-, Sau-, Broiler- und Legehennenfutter) durch verschiedene A. ficuum-Phytasepräparationen hydrolysiert, um die synergetische Wechselwirkung zwischen Phytase und saurer Phosphatase bei Futter im Allgemeinen zu untersuchen.
Die Hauptkomponenten der Futter waren:
Ferkel: Gerste, Weizen, extrahierte Sojabohnen, Weizenkleie, Molkepulver und Fischmehl
Sau: Tapioka, Erbsen, extrahierte Sonnenblumenkerne, Reiskleie und Kokosnußexpeller
Schwein 1: Tapioka, Erbsen, extrahierte Sojabohnen und Weizenglutenfutter
Schwein 2: Tapioka, Erbsen, extrahierte Sojabohnen, Weizenglutenfutter und Maisglutenfutter
Broiler: Sorghum, extrahierte Sojabohnen, Erbsen und Fleischmehl
Legehühner: Mais, Sojabohnen, extrahierte Sonnenblumensamen und Kalkstein.
Phytase 0,6/1 wurde mit 0,7 Up/g dosiert und saure Phosphatase 1/0 wurde mit 1 Ua/g dosiert. Phytase 0,6/1 wurde mit saurer Phosphatase 1/0 zu a/p 2/1 ergänzt, indem 1 Ua saure Phosphatase zu 0,7 Up Phytase gegeben wurde. Die Inkubationsbedingungen waren ähnlich wie in Beispiel III (80% Feuchtigkeit). Die synergetische Wirkung wurde wie in Beispiel III errechnet.
Sowohl die Phytase- wie auch die saure Phosphatasewirksamkeit unterschieden sich für die verschiedenen Futter stark. Die synergetische Wirkung zwischen beiden Enzymen wurde in allen Futtern festgestellt, differierte aber für die verschiedenen Futter.
Phytase a/p 1,6/1 wurde mit 0,7 Up/g zu verschiedenen Futter gegeben. Die Wirksamkeit dieser Phytase bestätigte die Wirkung der sauren Phosphatase 1/0 in einem saure Phosphatase/Phytase-Gemisch.
Tabelle 4 g PP/500 U a/p
Beispiel V
Da die enzymatische Phytinhydrolyse sich zwischen verschiedenen Futtern stark unterschied (Beispiel IV), könnte erwartet werden, dass die Phytinhydrolyse von den Pflanzenrohmaterialien abhängt, die das Futter bilden.
Die Hydrolyse von Pflanzenphytin verschiedenen Ursprungs und die Wirksamkeit von A. ficuum-Phytase 0,6/1 und saurer Phosphatase 1/0, allein oder in Kombination zugesetzt, auf verschiedene Pflanzenrohmaterialien, wurde in vitro getestet.
Phytase 0,6/1 wurde mit 0,35–0,7 Up/g dosiert und saure Phosphatase 1/0 wurde mit 1 Ua/g Futtermittel dosiert. Phytase 0,6/1 wurde mit saurer Phosphatase 1/0 zu a/p 2/1 dosiert, indem 0,5 bzw. 1 Ua saure Phosphatase/g zugegeben wurden. Die Inkubationsbedingungen waren ähnlich wie in Beispiel 1 (80% Feuchtigkeit). Die Phytinhydrolyse wurde analysiert und die Phytasewirksamkeit wurde wie in Beispiel II berechnet; die synergetische Wirkung wurde wie in Beispiel III berechnet.
Die Phytasewirksamkeit bei Erbsen war sehr niedrig (0,15 g PP/500 Up), wobei keine synergetische Wechselwirkung mit der sauren Phosphatase auftrat.
Die höchste Synergie wurde in solchen Pflanzenrohmaterialien gefunden, in denen Phytin durch Phytase leicht hydrolysiert wird und durch die saure Phosphatase kaum hydrolysiert wird, z. B. in Sojabohnen und Weizenkleie.
Eine geringe Synergie wurde festgestellt, wenn die saure Phosphatase selbst das Pflanzenphytin wirksamer hydrolysierte, z. B. bei Reiskleie.
Tabelle 5 g PP/500 U a/p
Beispiel VI
Eine in vitro-Phytinhydrolyse in Standard-Schweinefutter (Beispiel II) durch Aspergillus niger-Phytasepräparationen mit unterschiedlichem a/p-Verhältnis. Phytase wurde mit 0,7 oder 1 Up/g Futter dosiert. Die Inkubationsbedingungen waren ähnlich denen von Beispiel II (70% Feuchtigkeit).
Die Phytinhydrolyse wurde analysiert und die Phytasewirksamkeit wurde wie in Beispiel II berechnet.
Wenn das a/p-Verhältnis der A. niger-Phytasepräparationen anstieg (bei niedrigem Verhältnis), nahm die Wirksamkeit der Präparationen zu: die Phytasewirksamkeit variierte zwischen 0,75 und 1,15 g PP/500 Up, und zwar in Abhängigkeit vom a/p-Verhältnis der Phytase.
Tabelle 6
Beispiel VII
In vitro-Phytinhydrolyse in Standard-Schweinefutter (Beispiel Π) durch Aspergillus niger-Phytasepräparation a/p 1,15/1, ergänzt mit saurer Phosphatase aus Aspergillus niger ((An) oder Aspergillus ficuum NRRL 3135 (Af), um das a/p-Verhältnis auf 1,9/1 bzw. 1,6/1 zu erhöhen.
A. niger-Phytase 1,15/1 wurde mit 0,7 Up/g Futter dosiert; 0,5 Ua A. niger oder 0,3 Ua saure A. ficuum-Phosphatase/g wurden zu der A. niger-Phytase gegeben, um das a/p-Verhältnis auf 1,9/1 (An) bzw. 1,6/1 (Af) zu erhöhen. Saure Phosphatasen wurden mit 0,5 Ua A. niger oder 0,3 Ua A. ficuum/g einzeln zu dem Futter gegeben.
Die Inkubationsbedingungen waren ähnlich denen von Beispiel Π (80% Feuchtigkeit). Die Phytinhydrolyse wurde analysiert und die Phytasewirksamkeit wurde wie in Beispiel II errechnet.
Die synergetische Wirkung zwischen A. niger-Phytase a/p 1,15/1 und sauren Phosphatasen 1/0, entweder aus A. niger oder A. ficuum, wurde wie in Beispiel III berechnet.
Tabelle 7 g PP/500 U
Beispiel VIII
In vitro-Phytinhydrolyse durch A. ficuum-Phytase (Af), ergänzt mit saurer A. niger-Phosphatase (An), in Standard-Schweinefutter. Phytase 0,6/1 wurde mit 0,7 Up/g dosiert; die Phytase wurde mit 0,85–0,9 Ua/g saure Phosphatase 1/0 ergänzt, um Phytasepräparationen mit einem a/p-Verhältnis von 1,8/1 bzw. 1,9/1 zu erhalten.
Saure Phosphatase 1/0 wurde mit 1 Ua/g dosiert.
Die Inkubationsbedingungen waren ähnlich denen von Beispiel II (80% Feuchtigkeit).
Die Phytinhydrolyse wurde analysiert und die Phytasewirksamkeit wurde wie in Beispiel Π errechnet. Die synergetische Wirkung zwischen A. ficuum-Phytase 0,6/1 und saurer A. niger-Phosphatase 1/0 wurde wie in Beispiel III berechnet.
Tabelle 8 g PP/500 U
Beispiel IX
Die in vitro-Thermostabilität von A. ficuum-Phytase 0,6/1 und saurer Phosphatase 1/0 wurde in Standard-Schweinefutter (Beispiel II) in geschlossenen Phiolen, eingetaucht in ein Wasserbad, getestet, wobei die Futtermahlbedingungen simuliert wurden.
20 g Schweinefutter, das 1750 Ua Phytase oder saure Phosphatase enthielt, wurde mit 480 g Schweinefutter vermischt, was zu einem Futter mit 3500 Ua/kg führte. Phiolen wurden mit 7 g des mit Enzym ergänzten Futters, das 10,5 Ua Phytase oder saure Phosphatase enthielt, gefüllt. Die Feuchtigkeit des Futters war 12,2%. Die Phiolen wurden verschlossen und in ein Wasserbad mit verschiedenen Temperaturen (70–90°C) während 10 Minuten eingetaucht. Restliche saure Phosphatase- und Phytaseaktivität bei pH 2,5 wurde nach Enzymextraktion gemessen: 3 g des Temperatur-behandelten Futters wurde mit 50 ml 0,1 M pH 2,5-Sörensen-Puffer 30 Minuten lang extrahiert und die Aktivität der Phytase oder sauren Phosphatase im Futterextrakt wurde bei pH 2,5 an Dodecanatriumphytat ge mäß Beispiel I bestimmt. Die Aktivität, gemessen im nicht-behandelten Futter, wurde als 100% angenommen und alle Aktivitäten wurden als prozentuale Restaktivität errechnet.
Tabelle 9
Beispiel X
Schweinefutter wurde nach Zugabe von flüssiger A. ficuum-Phytase 0,6/1 oder saurer Phosphatase 1/0 im Labormaßstab pelletisiert. Beide Enzyme wurden mit 165000 Ua/550 g Vormischung zugesetzt, die dann 55 kg Schweinefutter vor dem Pelletisieren zugesetzt wurde.
Die Hauptkomponenten des Schweinefutters waren: Erbsen, extrahierter Rapssamen, Maisglutenfutter und Tapioka.
Die Temperatur der Pellets, die die Düse der Mühle verließen, wurde durch Dampfzusatz zwischen 69 und 74 °C kontrolliert.
Die Phytase- und saure Phosphatase-pH 2,5-Aktivität des Mehls und der Pellets wurde nach Futterextraktion gemessen: 5 g des Futters wurde mit 50 ml 0,1 M pH 2,5 Sörensen-Puffer während 30 Minuten extrahiert und die Phytase- oder saure Phosphataseaktivität wurde bei pH 2,5 an Dodecanatriumphytat gemäß Beispiel I gemessen. Die Aktivität im Mehlfutter (3 Ua/g) wurde als 100% genommen.
Die Feuchtigkeit des Phytase- und saurer Phosphatasefutters in% nahm von 11,6 bzw. 11,9 im Mehlkonditionierer auf 10,6 bzw. 10,8 in den gekühlten Pellets ab.
Tabelle 10
Beispiel XI
A. ficuum-Phytase 0,6/1- und Phytase 1,25/1-Präparationen wurden Schweinefutter mit 900 Up/kg Futter zugesetzt, worauf sich eine Futterpelletisierung im industriellen Maßstab anschloss. Die Hauptkomponenten des Futters waren: Erbsen, Maisglutenfutter, extra hierte Sojabohnen und Tapioka. Die Phytinphosphorkonzentration war 0,37%, gemessen gemäß Beispiel II. Die Temperatur der Pellets, die die Düse der Mühle verließen, war vergleichbar (74,5°C). Das Phytaseüberleben wurde durch eine in vitro-Phytinhydrolyse im pelletisierten Futter gemessen: 2 g des Phytasefutters wurden wie in Beispiel II inkubiert (80% Feuchtigkeit). Die Phytinhydrolyse wurde analysiert und die Phytasewirksamkeit wurde wie in Beispiel II berechnet. Die Phytasewirksamkeit im Mehlfutter vor dem Pelletisieren wurde als 100% angenommen. Die Phytase 1,25/1-Wirksamkeit im pelletisierten Futter ist 190% (0,75) der Phytase 0,6/1-Wirksamkeit (0,4), wohingegen ihre Wirksamkeit im Mehlfutter nur 160% (0,95) der Phytase 0,6/1-Wirksanllceit (0,6) ist.
Tabelle 11
Beispiel XII
Phosphorverdauungsversuch I (12 Schweine, 3 Schweine/Futter)
Kontrollschweinefutter wurde mit 2 g/kg verdaubarem Phosphor (dP) (Futter I) und einem Gesamtphosphorgehalt von 5,8 g/kg formuliert. Futter I enthielt hauptsächlich Erbsen, Tapioka, Maisglutenfutter, Weizenglutenfutter und extrahierte Sojabohnen.
Phytase-enthaltende Schweinefutter wurden zu einem Gesamtphosphorgehalt von 4,4 g/kg und einem Gehalt an verdaubarem Phosphor von 1,17 g/kg formuliert, wobei diese Futter dieselben Hauptkomponenten wie Futter I enthielten. Sie wurden mit verschiedenen A. ficuum-Phytasepräparationen ergänzt: 750 Up Phytase (0,6/1)/kg (Futter II), 1050 Ua saure Phosphatase (1/0)/kg (Futter IV) und ein Gemisch aus 750 Up Phytase + 1050 Ua saure Phosphatase/kg (Futter III), um ein a/p-Verhältnis = 2/1 zu erhalten. Es wurden konzentrierte Enzymlösungen zu dem Mehlfutter gegeben. Zwölf (12) Schweine wurden in Einzelboxen gehalten und für 17 Tage (7 Tage einleitend und 10 Tage Test) (3 Schweine/Futter) bei einer täglichen Futteraufnahme von 1800 g und einer Gesamtaufnahme von 18 kg während des Testzeitraums gehalten. Fäces wurden während dieser 10 Tage pro Schwein gesammelt und die Gesamtphosphorausscheidung wurde in den gesammelten Fäces nach dem EEC-Verfahren bestimmt. Der scheinbare Phosphorverdauungskoeffizient (DC-P (%)) wurde durch die Differenz zwischen der Gesamtphosphoraufnahme und der Gesamtphosphorausscheidung errechnet.
Zum Beispiel Futter I:
DC-P(%) = 100 – 67,9(%) = 32,1
Verdaubarer Phosphor (g dP/kg) wird dann berechnet als:
Gesamtphosphorkonzentration im Futter*DC-P z. B. Futter I: g dP/kg = 5,8 g P/kg*0,321 = 1,86.
Tabelle 12
Beispiel XIII
Phosphorverdauungsversuche Π (24 Schweine, 8 Schweine/Futter) Kontrollschweinefutter wurde mit 2 g/kg verdaubarem Phosphor und 6,1 g/kg Gesamtphosphor (Futter I) formuliert. Futter I enthielt hauptsächlich Erbsen, Tapioka, Weizenglutenfutter und extrahierte Sojabohnen; Phosphor wurde teilweise durch Monocalciumphosphat zugeführt. Phytase-enthaltende Futter wuden mit 5,2 g/kg Phosphor und 1,4 g/kg verdaubarem Phosphor formuliert, wobei sie dieselben Hauptkomponenten wie Futter I unter Weglassung von Monocalciumphosphat enthielten.
Sie wurden entweder mit Phytase 0,6/1 mit einem empfohlenen Level von 400 Up/kg (Futter II) oder einem Gemisch aus 580 Ua saurer Phosphatase 1/0 + 400 Up Phytase 0,6/1/kg ergänzt, wobei ein a/p-Verhältnis = 2/1 (Futter III) erhalten wurde. Phytaselösungen wurden dem Futtermehl zugesetzt. Vierundzwanzig (24) Schweine wurden in Einzelboxen gehalten und wurden für 17 Tage (7 Tage vorbereitend und 10 Tage Test) (8 Schweine/Futter) mit einer täglichen Aufnahme von 1800 g und einer Gesamtaufnahme von 18 kg während des Testzeitraums gehalten. Fäces wurden pro Schwein während dieser 10 Tage gesammelt und die Gesamtphosphorausscheidung an den gesammelten Fäces nach dem EEC-Verfahren gemessen. Verdaubarer Phosphor (DC-P% und g dP/kg) wurde wie in Beispiel XII errechnet.
Tabelle 13
Beispiel XIV
In vivo-Phytasewirksamkeit (g dP/500 Up) von flüssiger A. ficuum-Phytase und saurer Phosphatase, dosiert in verschiedenen Konzentrationen in Schweinefutter (Mehl)
(Beispiel XII und XIII)
Die in vivo-Phytasewirksamkeit war als die Menge an Phosphor definiert, die während der Verdauung durch 500 Einheiten (Up) Phytase (0,6/1 oder 2/1), die dem Futter zugesetzt worden waren, freigesetzt wurde (g dP/500 Up).
Die Menge an Phosphor, die durch die Enzyme freigesetzt wird, wird als die Differenz zwischen dem formulierten verdaubaren Phosphor im Futter und dem verdaubaren Phosphor, errechnet aus dem Tierversuch wie in Beispiel XII, errechnet.
Zum Beispiel:

Verdaubarer Phosphor, formuliert im Futter: 1,17 g/kg

Verdaubarer Phosphor aus dem Tierversuch: 2,06 g/kg

Phytasegehalt des Futters: 750 Up Phytase + 1050 Ua saure Phosphatase/kg
Phytasewirksamkeit (g dP/500 Up): (2,06 – 1,17)*500/750 = 0,59.
Wenn die in vivo-Wirksamkeit der sauren Phosphatase 0 ist, wird die synergetische Wirksamkeit als die Differenz zwischen der Wirksamkeit des 2/1 saure Phosphatase/Phytase-Gemischs und der Phytase 0,6/1 errechnet.
Tabelle 14
Literaturstellen:
E. P. 0 321 004 B1 (1988). A process for steeping cereals with a new enzyme preparation.
E. P. 0 420 358 A1 (1990). Cloning and expression of microbial phytase.
BORGGREVE, G. (1991). Effectiviteit van microbieel fytase in varkensvoeders. Lezing CLO-studiedag, Utrecht.
COSGROVE, D. (1966). The chemistry and biochemistry of inositol polyphosphates. Rev. Pure Appl. Chem. 16, 209–224. EECKHOUT, W. & DE PAEPE, M. (1991). The quantitative effects of an industrial microbial phytase and wheat phytase on the apparent phosphorus absorbability of a mixed feed by piglets. Med. Fac. Landbouww. Rijksuniversiteit Gent 56 (4a), 1693– 1647.
ELLIS, R. & MORRIS, E. (1983). Improved ion-exchange phytate method. Cereal Chemistry 60, 121–124.
ELLIS, R. & MORRIS, E. (1986). Appropriate resin selection for rapid phytate analysis by ion-exchange chromatography. Cereal Chemistry 63, 58–59.
GREAVES, M., ANDERSON, G. & WESLEY, D. (1967). The hydrolysis of inositol phosphates by Aerobacter aerogenes. Biochim. Biophys. Acta 132, 412–418.
IRVING, G. & COSGROVE, D. (1971). Inositol phosphate phosphatases of microbiological origin. Some properties of a partially purified bacterial (Pseudomonas sp.) phytase. Aust. J. Biol. Sci. 2.4, 547–557.
IRVING, G. &. COSGROVE, D. (1974). Inositol phosphate phosphatases of microbiological origin. Some properties of the partially purified phosphatases of Aspergillus ficuum NRRL 3135. Aust. J. Biol. Sci. 27, 361–368.
LOLAS, G. & MARKAKIS, P. (1977). The phytase of navy beans (Phaseolus vulgaris). J. Food Sci. 42(4), 1094–1097, 1106. LOLAS, G., PALAMIDIS, N. & MARKAKIS, P. (1976). The phytic acid-total phosphorus relationship in barley, oats, soybeans, and wheat. Cereal Chemistry 53(6), 867–871.
NAYINI, N. & MARKAKIS, P. (1984). The yeast of phytase. Lebensm.-Wiss. u. -Technol. 17, 24–26.
NATUPHOS MANUAL, Gist-Brocades.
POWAR, V. & JAGANNATHAN, V. (1982). Purification and properties of phytase-specific phosphatase from Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 151(3), 1102–1108.
REDDY, N., SATHE, S. & SALUNKHE, D. (1982). Phytates in legumes and cereals. Adv. Food Res. 28, 1–92.
SAUVEUR, B. (1989). Phosphore phytique et phytases dans l'alimentation des volailles. INRA 2(5), 343–351.
SHIEH, T. & WARE, J. (1968). Survey of microorganisms for the production of extracellular phytase. Appl. Microbiol. 16(9), 1348–1351.
SHIER, T., WODZINSKI, R. & WARE, J. (1969). Regulation of the formation of acid phosphatases by inorganic phosphate in Aspergillus ficuum. J. Bacteriol. 100(3), 1161–1165.
SIMONS, P., VERSTEEGH, H., JONGBLOED, A. & KEMME, P. (1990). Improvement of phosphorus availability by microbial phytase in broilers and pigs. Brit. J. Nutr. 64, 525–540.
SUTARDI & BUCKLE, K. (1986). The characteristics of soybean phytase. J. Food Biochem. 10, 197–216.
ULLAH, A. & CUMMINS, B. (1987). Purification, N-terminal amino acid sequence and characterization of pH 2.5 optimum acid phosphatase (E. C. 3.1.3.2) from Aspergillus ficuum. Prep. Biochem. 17(9), 397–422.
ULLAH, A. & CUMMINS, B. (1988). Aspergillus ficuum extracellular pH 6.0 optimum acid phosphatase: purification, N-terminal amino acid sequence, and biochemical characterization. Prep. Biochem. 18(1), 37–65.
ULLAH, A. & GIBSON, D. (1987). Extracellular phytase (E. C. 3.1.3.8) from Aspergillus ficuum NRRL 3135: purification and characterization. Prep. Biochem. 17(1), 63–91.
VAHL, H. (1991). Effectiviteit van microbieel fytase in slachtkuikenvoeders. Lezing CLO-studiedag, Utrecht.
YAMAMOTO, S., MINODA, Y. & YAMADA, K. (1972). Chemical and physicochemical properties of phytase from Aspergillus terreus. Agr. Biol. Chem. 36(12), 2097–2103.
YOUSSEF, K., GHAREIB, M. & NOUR EL DEIN, M. (1987). Purification and general properties of extracellular phytase from Aspergillus flavipes. Zentralbl. Mikrobiol. 142, 397–402.
ZYLA, K. (1993). The role of acid phosphatase activity during enzymic dephosphorylation of phytates by Aspergillus niger phytase. World J. Microbiol. Biotechnol. 9, 117–119.
ZYLA, K. & KORELESKI, J. (1993). In vitro. and in vivo dephosphorylation of rapeseed meal by means of phytatedegrading enzymes derived from Aspergillus niger. J. Sci. Food Agric. 61, 1–6.
ZYLA, K., KORELESKI, J. & KUJAWSKI, M. (1989). Dephosphorylation of phytate compounds by means of acid phosphatase from Aspergillus niger. J. Sci. Food Agric. 49, 315–324.

Claims

Enzymzusammensetzung, die Phytat-hydrolysierende Aktivität hat, umfassend: – eine Phytase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH im Bereich von 2,5 bis 5,0 hat, und – eine saure Phosphatase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH von 2,5 hat, mit einem Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat von 0,8 : 1 bis unter 3 : 1, die eine synergetische Wirkung auf Phytat haben.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat 1 : 1 bis 2,5 : 1 ist.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat 1,5 : 1 bis 2 : 1 ist.
Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Phytase eine Pilzphytase ist.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Pilzphytase eine Aspergillus-Phytase ist.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Pilzphytase aus der Gruppe, bestehend aus Aspergillus ficuum-Phytase, Aspergillus niger-Phytase und Aspergillus terreus-Phytase, ausgewählt ist.
Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die saure Phosphatase eine saure Pilzphosphatase ist.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die saure Pilzphosphatase eine saure Aspergillus-Phosphatase ist.
Enzymzusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die saure Pilzphosphatase aus der Gruppe, bestehend aus saurer Aspergillus ficuum-Phosphatase, saurer Aspergillus niger-Phosphatase und saurer Aspergillus terreus-Phosphatase ausgewählt ist.
Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die saure Phosphatase eine thermisch stabile saure Phosphatase ist, die bei 70°C Aktivität beibehält.
Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , dass die saure Phosphatase thermisch stabiler ist als die Phytase.
Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, die durch thermische Behandlung ein verbessertes Verhältnis (a : p) von 1,5 : 1 bis 2 : 1 zeigt.
Nahrungsmittel-, Futtermittel- oder Futter-Produkt oder eine Komponente davon, das/die eine Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthält.
Thermisch behandeltes Lebensmittel-, Futtermittel- oder Futter-Produkt oder eine Komponente davon, das/die eine Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthält.
Verfahren zur Hydrolyse von Phytat, das die Stufe eines Behandelns eines Rohmaterials, das Phytat enthält, mit einer Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst, wobei die Behandlung unter hydrolysierenden Bedingungen bei einem pH von etwa 2,5 bis etwa 5,0, bei denen die Phytase und die saure Phosphatase der Enzymzusammensetzung hydrolysierende Aktivität haben, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , dass die Behandlung bei einem pH von etwa 2,5 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet , dass das Phytatenthaltende Rohmaterial ein vegetabiles (Pflanzen-)Rohmaterial ist.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzen-Rohmaterial Sojabohnen- oder Weizen-Rohmaterial ist.
Genetisch modifizierte Pflanze, wobei die Pflanze ein Gen, das für eine Pilzphytase codiert, die Phytathydrolysierende Aktivität bei einem pH im Bereich von 2,5 bis 5,0 hat, und ein Gen, das für eine saure Pilzphosphatase codiert, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH von 2,5 hat, enthält, beide Gene funktionell an transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen gebunden sind um eine Expression der Enzyme, die durch die Gene codiert werden, in einem Verhältnis (a : p) ihrer Akti vität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat von 0,8 : 1 bis unter 3 : 1, die eine synergetische Wirkung auf Phytat haben, zu erlauben.
Teil oder Produkt, der/das aus einer genetisch modifizieren Pflanze nach Anspruch 19 stammt, wobei der Teil oder das Produkt eine Phytase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH im Bereich von 2,5 bis 5,0 hat, und eine saure Phosphatase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH von 2,5 hat, in einem Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2, 5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat von 0,8 : 1 bis unter 3 : 1, die synergetische Wirkung auf Phytat haben, enthält.
Verfahren zur Verbesserung der Futtermittel- oder Futter-Verdauung bei der Viehproduktion und Verringerung der Phosphorausscheidung in Stalldung, das Füttern des Viehs mit einem Futtermittel oder Futter umfasst, welches eine Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 enthält.
Lebensmittel-, Futtermittel- oder Futter-Produkt oder eine Komponente davon, das/die eine Enzymzusammensetzung enthält, die Phytat-hydrolysierende Aktivität hat und eine Phytase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH im Bereich von 2,5 bis 5,0 hat, und eine saure Phosphatase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH von 2,5 hat, in einem Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat von 0,8 : 1 bis unter 3 : 1, die eine synergetische Wirkung auf Phytat haben, umfasst.
Thermisch behandeltes Lebensmittel-, Futtermittel- oder Futter-Produkt oder eine Komponente davon, das/die eine Enzymzusammensetzung enthält, die Phytathydrolysierende Aktivität hat und eine Phytase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH im Bereich von 2,5 bis 5,0 hat, und eine saure Phosphatase, die Phytathydrolysierende Aktivität bei einem pH von 2,5 hat, in einem Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat von 0,8 : 1 bis unter 3 : 1, die synergetische Wirkung auf Phytat haben, umfasst.
Verfahren zur Hydrolyse von Phytat, das die Stufe einer Behandlung eines Rohmaterials, das Phytat enthält, mit einer Enzymzusammensetzung, die Phytat-hydrolysierende Aktivität hat und eine Phytase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH im Bereich von 2,5 bis 5,0 hat, und eine saure Phosphatase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH von 2,5 hat, in einem Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat von 0,8 : 1 bis unter 3 : 1, die eine synergetische Wirkung auf Phytat haben, umfasst, wobei die Behandlung unter hydrolysierenden Bedingungen bei einem pH von etwa 2,5 bis etwa 5,0, bei dem die Phytase und saure Phosphatase der Enzymzusammensetzung hydrolysierende Aktivität haben, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung bei einem pH von etwa 2,5 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Phytat-enthaltende Rohmaterial ein vegetabiles (Pflanzen-)Rohmaterial ist.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , dass das Pflanzen-Rohmaterial ein Sojabohnen- oder Weizen-Rohmaterial ist.
Verfahren zur Verbesserung der Futtermittel- oder Futter-Verdauung bei der Viehproduktion und zur Reduzierung der Phosphorausscheidung im Stalldung, das Füttern des Viehs mit einem Futtermittel oder Futter umfasst, wel ches eine Enzymzusammensetzung, die Phytat-hydrolysierende Aktivität hat, und eine Phytase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH im Bereich von 2,5 bis 5,0 hat, und eine saure Phosphatase, die Phytat-hydrolysierende Aktivität bei einem pH von 2,5 hat, in einem Verhältnis (a : p) ihrer Aktivität bei pH 2,5 (a) und pH 5 (p) auf Phytat von 0,8 : 1 bis unter 3 : 1, die eine synergetische Wirkung auf Phytat haben, umfasst.