CZ291394B6

CZ291394B6 - Způsob přípravy frakce hyaluronové kyseliny s nízkým polydisperzním indexem

Info

Publication number: CZ291394B6
Application number: CZ19981889A
Authority: CZ
Inventors: Lanfranco Callegaro; Davide Renier
Original assignee: Fidia Farmaceutici S.P.A.
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 2003-02-12
Also published as: WO1997022629A1; ITPD950244A1; EP0868437A1; JP4094059B2; HUP9903666A3; EP0868437B1; DE69604087T2; DK0868437T3; CZ188998A3; GR3031973T3; ES2139402T3; ITPD950244A0; HU226949B1; AU703332B2; AU1374997A; US6232303B1; IT1282219B1; ATE184024T1; IL124909A; JP2000502141A

Abstract

Způsob přípravy frakce hyaluronové kyseliny nebo její soli se střední molekulovou hmotností v rozsahu 5000 až 300 000, spočívající v tom, že zahrnuje působení na výchozí hyaluronovou kyselinu nebo její sůl s molekulovou hmotností od 50 000 do 10 000 000 po dobu kratší než 240 minut současně ultrazvukem i chlornanem sodným v takových koncentracích, aby molární poměr chlornan sodný/opakující se jednotka hyaluronové kyseliny byl mezi 0,01 a 5.ŕ

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu přípravy frakce hyaluronové kyseliny s nízkou střední molekulovou hmotností v rozsahu 5000 až 300 000 a polydisperzním indexem pod 1,7, zahrnujícího současné působení chlornanu a ultrazvuku na výchozí hyaluronovou kyselinu s vysokou molekulovou hmotností.

Dosavadní stav techniky

Hyaluronová kyselina je přírodní lineární disacharid, biokompatibilní a biologicky odbouratelný, složený z opakující se disacharidové jednotky tvořené glukoronovou kyselinou a N-acetylátglukosaminem spojených glykosidovými vazbami β 1—3 a a 1-4.

Hyaluronová kyselina je obsažena v pojivových tkáních vyšších organismů, v kloubním mazu, v pupeční šňůře a v kohoutím hřebínku; lze ji též syntetizovat z určitých bakteriálních druhů jako jsou streptokoky (Kendall a další, Journ. Biol. Chem., sv. 118, s. 61, 1937).

Hyaluronová kyselina hraje důležitou roli v mnoha biologických procesech jako je hydratace tkání, organizace proteoglykanu, diferenciace buněk a angiogeneze. Mnoho biomedicínských aplikací souvisí s reologickými vlastnostmi roztoků hyaluronové kyseliny: jedním z důležitých oborů je oční chirurgie (Grav a další, Exp. Eye Res., sv. 31, s. 119, 1979). Další biomedicínská použití hyaluronové kyseliny ajejich derivátů (jako jsou estery hyaluronové kyseliny, jak popsal della Valle a Romeo, EP 216 453, 1987), spadají do oblasti regenerace tkání (léze, spáleniny).

Pokud jde o frakce s nízkou molekulovou hmotností, v současné době se úspěšně zkoumají různé aplikační oblasti v dermatologii (Scott, EP 295 092 Bl, 1987) a farmakologii. Zjistilo se, že různé biologické vlastnosti jsou citlivé vůči poklesům molekulové hmotnosti a funkci distribuční křivky charakterizované různými lokalizacemi a disperzními indexy (Mw, Mn, Mz), a polydisperzním indexem. Frakce hyaluronové kyseliny s nízkou molekulovou hmotností například působí jako možná angiogenní činidla tím, že ovlivňují schopnost polysacharidu zvýšit vaskularizaci nebo vstoupit do zánětlivých pochodů jako specifické inhibitory faktorů jako je TNF (Noble a další, J. Clin. Inv., sv. 91, s. 2163, r. 1993).

Existuje mnoho případů přípravy frakcí hyaluronové kyseliny fyzikálními metodami jako je například zahřívání, ultrazvuk, UV- a gama-záření, nebo enzymatické reakce za použití hyaluronidázy (Chabrecek a další, Jour. Appl. Póly. Sci., sv. 48, s. 233, r. 1991; Řeháková a další, Int. J. Biol. Macrom., sv. 16/3, s. 121, r. 1994); nebo též reakcemi chemické depolymerace kyselinou askorbovou (Cleveland a další, Bioch. Biophy. Acta, sv. 192, s. 385, r. 1969) nebo působením chlornanů (Schiller a další, Biol. Chem. Hopp-Seyler, sv. 375, s. 169, r. 1994). Všechny uvedené způsoby jsou však nějakým způsobem neuspokojivé z hlediska typu získaných produktů. I když totiž některé z nich nemění primární polymemí strukturu působením na glykozidové vazby, nejsou schopny vytvořit odbouráním produkty s nízkou molekulovou hmotností charakterizované nízkým polydisperzním indexem. Bylo totiž shledáno, že technologie používající ultrazvuku nebo tepla mají kinetiku depolymerace asymptotického typu. Pokračování v depolymeraci za těchže podmínek (energie ultrazvuku a tepla) vedou k úplnému odbourání (degradaci) produktu.

Na rozdíl od fyzikálních způsobů, depolymerace působením hyaluronidázy má určité výhody jako je účinnost reakce, zachování primární struktury polymerního řetězce a regulace kinetiky odbourání.

Respektování těchto parametrů však nemusí zaručit vysoké výtěžky nebo produkty charakterizované distribucí nízkých molekulových hmotností.

Rozsáhlé použití chemických činidel jako je chlornan a askorbová kyselina však zároveň vede i ke ztrátě molekulové hmotnosti a k podstatným změnám chemické struktury polymerního řetězce. Degradační produkty s požadovanou velikostí a strukturou molekuly lze získat jen pečlivým a regulovaným použitím uvedených činidel, takže možné užití chemického řešení v průmyslovém měřítku se jeví jako značně omezené.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká způsobu přípravy frakce hyaluronové kyseliny nebo její soli se střední molekulovou hmotností v rozsahu 5000 až 300 000, při níž se na hyaluronovou kyselinu nebo její sůl se střední molekulovou hmotností mezi 50 000 a 10 000 000 působí současně ultrazvukem a chlornanem sodným po dobu nižší než 240 minut a v takové koncentraci, že molámí poměr chlornan sodný/opakující se jednotka hyaluronové kyseliny (HA r.u.). je mezi 0,01 a 5.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje ve formě grafu výsledky depolymerace výchozí hyaluronové kyseliny se střední molekulovou hmotností 175 000 provedené během 8 hodin pouze chlornanem sodným při molámím poměru NaOCl/HA r.u. v rozsahu 1,0 až 10,0, přičemž se tyto molámí poměry vynášejí na ose úseček, střední molekulové hmotnosti na levé ose pořadnic a polydisperzní indexy na pravé ose pořadnic.

Obrázek 2 ukazuje graf degradační kinetiky depolymerace provedené pouze chlornanem sodným při molámím poměru NaOCl/HA r.u. = 5,0, přičemž se doba (hodiny) vynáší na ose úseček, střední molekulové hmotnosti na levé ose pořadnic a polydisperzní index na pravé ose pořadnic.

Obrázek 3 představuje graf degradační kinetiky depolymerace frakce D3-b hyaluronové kyseliny, přičemž se doba (h.) vynáší na ose úseček, střední molekulová hmotnost na levé ose pořadnic a polydisperzní indexy na pravé ose pořadnic.

Obrázek 4 ukazuje degradační graf kinetiky depolymerace frakce D2 hyaluronové kyseliny, přičemž se v tomto grafu doba (h.) vynáší na ose úseček, střední molekulové hmotnost na levé ose pořadnic a polydisperzní indexy na pravé ose pořadnic.

Obrázek 5 ilustruje degradační kinetiku depolymerace výchozí hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností 990 000 a polydisperzním indexem 1,40 při současném působení ultrazvuku a chlornanu sodného a molámím poměru NaClO/Ha r.u. 0,5, 1,0 a 2,5 ve srovnání s depolymerací téže hyaluronové kyseliny pouhým ultrazvukem, přičemž jsou střední molekulové hmotnosti vynášeny na ose pořadnic a doba (minuty) na ose úseček.

Obrázek 6 ukazuje degradační kinetiky depolymerace hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností 990 000 a polydisperzním indexem 1,40, na kterou se současně působí ultrazvukem a chlornanem sodným při molámím poměru NaClO/HA r.u. 0,5, 1,0 a 2,5 ve srovnání s depolymerací téže hyaluronové kyseliny pouze účinkem ultrazvuku, přičemž jsou polydisperzní indexy vyneseny na ose pořadnic a doba (minuty) na ose úseček.

-2CZ 291394 B6

Podrobný popis vynálezu

Postup podle tohoto vynálezu se může použít pro depolymeraci hyaluronové kyseliny nebo jejích solí s různými molekulovými hmotnostmi.

Může se například použít pro depolymeraci hyaluronové kyseliny extrahované z kohoutích hřebínků, jak je popsáno vEP 138 572 a v EP-A-535 200, se střední molekulovou hmotností v rozsahu 100 000 do 1 500 000:

V takovém případě mají frakce hyaluronové kyseliny výhodně molekulovou hmotnost od 5000 do 50 000, výhodněji v těchto rozsazích: 5000 až 10 000, 10 000 až 15 000, 15 000 až 25 000 a 25 000 až 50 000.

Způsob podle vynálezu může též být výhodně použit pro depolymeraci komerční hyaluronové kyseliny vyrobené fermentačním způsobem, jenž se vyznačuje spíše vyšší molekulovou hmotností, zpravidla v mezích 1 000 000 až 5 000 000, přičemž depolymeračním způsobem podle tohoto vynálezu se z těchto frakcí hyaluronové kyseliny může získat hyaluronová kyselina se střední molekulovou hmotností v rozsahu 50 000 do 300 000. Konečně se tento způsob podle vynálezu může výhodně aplikovat na frakce hyaluronové kyseliny s vysokou molekulovou hmotností získané syntézou in vitro popsanou ve WO 95/24497, přičemž tato hyaluronová kyselina má molekulovou hmotnost od 50 000 do 10 000 000.

Způsob podle vynálezu se všeobecně realizuje svodným roztokem NaCl obsahujícím výchozí hyaluronovou kyselinu nebo její soli při koncentracích výhodně 10 mg/ml a teplotách výhodně 4 °C. Při použití způsobu podle vynálezu se NaOCl zpravidla přidává k uvedenému roztoku ve formě vodného roztoku při koncentracích většinou od 1 % do 20 % hmotn.

Při aplikaci způsobu podle vynálezu se NaOCl přednostně přidává v takových koncentracích, že molámí poměr NaOCl/HA r.u. je mezi 0,5 a 2,5.

Způsob podle vynálezu se výhodně uskutečňuje během 120 a 240 minut.

Energie ultrazvuku je přednostně v rozmezí 50 a 200 Watt a frekvence v rozmezí 10 až 50 Hz.

Navíc se způsob podle vynálezu vyznačuje depolymerační kinetikou, již lze nejen řídit a sledovat na základě jednoduchých matematických funkcí, ale která především umožňuje, jak bylo výše uvedeno, získat frakce polysacharidů s nízkým polydisperzním indexem (hodnoty Pd = Mw/Mn < 1,7), jaký by jinak bylo možno získat jen zdlouhavým a nákladným způsobem čištění.

Molekulové hmotnosti a polydisperzní indexy byly stanoveny kombinací chromatografie typu DEC (dimensional exlusion chromatography) s různými měřicími technikami jako je refraktometrie - zjišťování indexu lomu (RI) a měření rozptylu laserových paprsků MALLS (multi-angle lase light scattering).

Přihlašovatel experimentálně neočekávaně zjistil, že pouze současné působení ultrazvuku a NaClO umožňuje dosáhnout uvedeného cíle, zatímco alternativní způsoby, v nichž se ultrazvuk a NaClO aplikují ve dvou oddělených stupních, neumožňuje úspěšně dosáhnout zároveň frakcí s nízkou molekulovou hmotností a nízkého polydisperzního indexu.

-3CZ 291394 B6

V praxi bylo použiti následujících tří alternativních způsobů:

1) způsob A: depolymerace uskutečněná přidáním roztoku chlornanu sodného, po němž následuje působení ultrazvuku na výsledný roztok.

2) způsob B: depolymerace působením ultrazvuku ve dvou oddělených po sobě následujících stupních při zvolené energii a s přídavkem roztoku chlornanu sodného.

3) způsob C: depolymerace účinkem současného kombinovaného působení roztoku chlornanu sodného a ultrazvuku.

V zájmu srovnání těchto tří způsobů jsme uvedené proměnné (koncentraci hyaluronové kyseliny, koncentraci chlornanu, energii ultrazvuku aj.) maximálně stabilizovali. Vycházejíce z roztoků hyaluronové kyseliny získaných extrakcí, s molekulovou hmotností v rozsahu 100 000 a 1 500 000 a koncentrací 20 mg/ml, jsme studovali degradační kinetiku polymeru působením 5% roztoku chlornanu při různých molámích poměrech NaC10/HA r.u. při 50 °C v časových periodách kolísajících mezi 1 a 48 hodinami. Cílem bylo získat frakce hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností mezi 5000 a 20 000 s polydisperzním indexem < 1,7.

Obrázek 1 ukazuje frakce hyaluronové kyseliny a polydisperzní index, jenž se získají, když se nechá výchozí nyaluronová kyselina HA-1 se střední molekulovou hmotností 175 000 reagovat 8 hodin s roztoky chlornanu sodného při různých molámích poměrech NaClO/HA r.u. od 1,0 do 10 podle údajů v tabulce 1; na základě zvoleného molámího poměru 5,0 a údajů v tabulce 2 byla konstruována křivka degradační kinetiky (obrázek 2).

Ze získaných údajů vyplývá, že je obtížné získat frakce hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností pod 20 000 a s polydisperzním indexem, jehož číselná hodnota (Mw/Mn) nepřekračuje 1,7. Zvyšováním množství depolymeračního činidla a/nebo prodlužováním reakční doby nelze získat frakce hyaluronové kyseliny s požadovanými molámími charakteristikami, protože dochází k úplné degradaci polymeru.

Pro dokončení zkoumání způsobu A jsme použiti frakcí označovaných kódy D2 a D3-b, izolovaných z reakční směsi vysrážením organickou směsí složenou z methanolu a acetonu. Po solubilizaci v 0,15 M roztoku NaCl se na ně 15 minut až 8 hodin působí ultrazvukem při energii 150 až 200 W a frekvenci 20 kHz. Tabulka 3 uvádí molekulové hmotnosti zjištěné chromatografií GPC.

Tabulka 1

Produkt	Kód	Molekulová hmotnost	Polydisperzní index
Přír. hyaluronová kys. (HA)	HA-1	175 000	1,24
HA degradovaná s molár. poměrem NaClO/HA u.u.:l/l	Dl	119 000	1,29
HA degradovaná s molár. poměrem NaClO/HA r.u.: 2/1	D2	64 000	1,32
HA degradovaná s molár. poměrem NaClO/HA r.u.: 5/1	D3	21 000	1,81
HA degradovaná s molár. poměrem NaClO/HA r.u.: 10/1	D4	6000	2,2

-4CZ 291394 B6

Tabulka 2

Produkt	Kód	Molekulová hmotnost (MW)	Polydisperzní index (PD)
Doba: 1 hodina	D3-a	73 000	1,35
Doba: 2 hodiny	D3-b	56 000	1,41
Doba: 8 hodin	D3-c	21 000	1,81
Doba: 24 hodin	D3-d	11 500	1,98
Doba: 48 hodin	D3-e	5000	3,00

Tabulka 3

Frakce	D2	D3-b
Doba (min)	Molekulová hmotnost	Polydisp. index	Molekulová hmotnost	Polydisp. index
0	64 000	1,32	56 000	1,41
15	62 000	1,32	51 500	1,43
30	57 000	1,33	47 500	1,43
60	52 500	1,35	44 000	1,45
120	48 000	1,35	41 500	1,47
240	46 500	1,36	39 000	1,51
480	42 000	1,36	37 500	1,53

Získané údaje a příslušné grafy (obrázek 3 a 4) ukazují, že je nemožné připravit frakce hyaluronové kyseliny s požadovanou molekulovou hmotností použitím způsobu A. I když se prodlouží doba ultrazvukového působení nebo se upraví podmínky chemické depolymerace, stále ještě není možné získat finální produkt charakterizovaný polydisperzním indexem <1,7 a molekulovou hmotností mezi 5000 a 20 000.

Způsob B rovněž zahrnuje dvojí působení, jednak ultrazvuku, jednak reakce s chlornanem ve dvou oddělených stupních, a stejně jako způsob A vychází z přírodní hyaluronové kyseliny podle popisu, ale nevede ke vzniku frakcí s požadovanou střední molekulovou hmotností nebo polydisperzním indexem. Přesněji, bylo zjištěno, že i když působení ultrazvuku vytvoří hyaluronovou kyselinu s molekulovou hmotností kolem 35 000 a polydisperzním indexem 1,5 (po čtyřhodinové expozici za teploty 4 °C), následující chemická reakce s chlornanem sodným zničí strukturální charakteristiky produktu, a to i za velmi mírných podmínek.

Způsob C, jehož inovativní výsledky jsou popsány v tomto patentu, kombinuje a reguluje působení ultrazvuku a chlornanu. Kombinované působení předpokládá současné použití obou faktorů v časové periodě mezi 0 a 480 minutami. Fyzikálně-chemická degradace probíhá v 0,15 M roztoku NaCl při teplotě 4 °C za použití ultrazvuku energie 150 W a s frekvencí 20 kHz generovaného ponorným snímačem povlečeným titanem. Dále se přidá 5% roztok NaOCl v koncentraci přihlížející k molekulové hmotnosti hyaluronové kyseliny kolem 1 000 000, tak aby molámí poměr (moly NaOCl/moly hyaluronové kyseliny) byl mezi 0,5 a 2,5.

V době vyplývající z reakční kinetiky se odebere alikvotní množství roztoku a vysráží se v 5 objemech směsi methanol/aceton. Potom je produkt usušen a analyzován chromatografií GPC za použití dvou dříve popsaných způsobů měření; pro separaci se užijí dva za sebou řazené válce modelu TSK (G2000 a G3000). Výsledné údaje tohoto rozboru jsou uvedeny v tabulce 4 (molekulová hmotnost) a 5 (polydisperzita). Pro názornost se současně uvádějí hodnoty molekulových hmotností získaných v prvním stupni metody B (působení samotného ultrazvuku.)

-5CZ 291394 B6

Ze srovnání údajů z těchto dvou řad rozborů vyplývá, že lze získat nejméně tři frakce s požadovaným charakterem molekuly. Tyt tři odlišné produkty se kódovými názvy označují D4 (doba: 240 minut, NaOCl 0,5), D5 (doba: 120 minut, NaOCl 1,0) a D6 (doba: 120 minut, ONaOCl 2,5). Mají molekulové hmotnosti 13 400, 11 500 a 7800 a polydisperzní indexy mezi 1,55 a 1,7.

Tabulka 4

doba(min)	ultrazvuk (MW)	ultrazvuk + 0,5* (MW)	ultrazvuk +1* (MW)	ultrazvuk+2,5* (MW)
0	990 000	990 000	990 000	990 000
15	645 000	396 000	341 000	286 000
30	453 000	198 000	125 000	92 400
60	266 000	67 000	61 400	35 000
120	172 300	23 000	11 500	7 800
240	89 400	13 400	<5000	<5000
480	54 900	<5000	<5000	<5000

* molámí poměr NaOCl/Ha r.u.

Tabulka 5

doba (min)	ultrazvuk (PD)	ultrazvuk + 0,5* (PD)	ultrazvuk +1* (PD)	ultrazvuk +2,5* (PD)
0	1,40	1,40	1,40	1,40
15	1,45	1,32	1,42	1,50
30	1,51	1,34	1,45	1,53
60	1,56	1,38	1,60	1,55
120	1,60	1,44	1,63	1,7 .
240	1,60	1,55	>1,7	>1,7
480	1,65	>1,7	>1,7	>1,7

*molámí poměr NaOCl/HA r.u.

Molekulové hmotnosti pod 5000 je těžké určit přesně, protože jsou pod hranicemi citlivosti analytických přístrojů, takže je obtížné definovat frakce s těmito hodnotami.

Stojí za zmínku, že metoda degradace C kombinující dva současně použité přístupy vytváří frakce hyaluronové kyseliny, které jsou uvnitř přijatelných limitů polydisperzity a molekulových hmotností. Tyto výsledky potvrzují specifičnost depolymeračních reakcí a, soudě podle křivek v obrázcích 5 a 6, dobrou regulaci kinetiky, vyplývající ze tří testů s použitím těchto reakčních parametrů: ultrazvuk s energií 150 W, doba 120 minut a molámí koncentrace NaOCl 1M/1M hyaluronové kyseliny, přičemž se vychází z téže hyaluronové kyseliny, jíž bylo použito v předchozím pokusu, a odpovídající údaje uvedené v tabulce 6 ilustrují, že proces degradace je reprodukovatelný za použití těchto experimentálních podmínek.

-6CZ 291394 B6

Tabulka 6

Produkt	Molekulová hmotnost	Polydisperzní index	Výtěžek reakce
D5-a	11 100	1,60	55%
D5-b	10 700	1.55	61 %
D5-c	12 000	1,60	65%

V dalším uvádíme následující příklady jako ilustrativní a nikoliv omezující platnost způsobu podle tohoto patentu.

Příklad provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností mezi 5000 a 10 000.

2.4 g sodné soli hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností 990 000 z hyaluronové kyseliny získané extrakcí se solubilizuje ve 240 ml 0,15 M roztoku NaCl. Přidá se 7,9 ml 14% roztoku NaOCl. Při teplotě +4 °C se na výsledný roztok působí 120 minut ultrazvukem energie 150 W a frekvence 20 kHz.

Po skončení této reakce, což je zřejmé z poklesu viskozity, se pH pomocí 0,lN HC1 sníží na 6,5 a pak se provede vysrážení pevného produktu v 1000 ml směsi methanol-aceton 2:1. Produkt se separuje filtrací a suší ve vakuu 48 hodin při 45 °C.

Takto získaný výtěžek ve formě sodné soli (kód HA-D9-Na) je 1,65 g. Analýzou HPLC-GPC (kombinace vysokovýkonnostní kapalinové a plynové chromatografie) se zjišťuje, že takto získaná frakce hyaluronové kyseliny má střední molekulovou hmotnost (MW) 5 850, číselný průměr molekulové hmotnosti 3 640 a polydisperzní index 1,61.

Při srovnání s přírodní hyaluronové kyseliny se spektroskopií FT-IR nezjistily ve spektru žádné abnormality. Stanovení procentuálního obsahu hyaluronové kyseliny za použití karbazolu pro určení D-glukoronové kyseliny prokazuje čistotu 95 %.

Příklad 2

Příprava hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností mezi 10 000 a 15 000

2.5 g sodné soli hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností 740 000 z hyaluronové kyseliny 40 získané extrakcí se solubilizuje ve 250 ml 0,15M roztoku NaCl. Přidá se 3,3 ml 14% roztoku

NaOCl. Při teplotě +4 °C se na výsledný roztok působí 120 minut ultrazvukem energie 150 W a frekvence 20 kHz.

Po skončení této reakce, což je zřejmé z poklesu viskozity, se pH pomocí 0,lN HC1 sníží na 6,5 45 a pak se provede vysrážení pevného produktu v 1000 ml směsi methanol-aceton v poměru 2:1.

Produkt se separuje filtrací a suší ve vakuu 48 hodin při 45 °C.

Takto získaný výtěžek ve formě sodné soli (kód HA-D9-Na) je 1,50 g. Analýzou HPLC-GPC se zjišťuje, že takto získaná frakce hyaluronové kyseliny má střední molekulovou hmotnost (MW) 50 11 650, číselný průměr molekulové hmotnosti (MN) 7 330 a polydisperzní index 1,59.

Při srovnání s přírodní hyaluronovou kyselinou se spektroskopií FT-IR nezjistily ve spektru žádné abnormality. Stanovení procentuálního obsahu hyaluronové kyseliny za použití karbazolu pro určení D-glukuronové kyseliny prokazuje čistotu 98 %.

Příklad 3

Příprava hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností mezi 15 000 a 25 000

1,00 g sodné soli hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností 1 000 000 z hyaluronové kyseliny získané extrakcí se solubilizuje ve 100 ml 0,15M roztoku NaCl. Přidá se 0,6 ml 14% roztoku NaOC. Při teplotě +4 °C se na výsledný roztok působí 120 minut ultrazvukem energie 150 W a frekvence 20 kHz.

Po skončení této reakce, což je zřejmé z poklesu viskozity, se pH pomocí 0,lN HC1 sníží na 6,5 a pak se provede vysrážení pevného produktu v 500 ml směsi methanol-aceton v poměru 2:1. Produkt se separuje filtrací a suší ve vakuu 48 hodin při 45 °C.

Takto získaný výtěžek ve formě sodné soli (kód HA-D8-Na) je 0,65 g. Analýzou HPLC-GPC se zjišťuje, že takto získaná frakce hyaluronové kyseliny má střední molekulovou hmotnost (MW) 22 500, číselný průměr molekulové hmotnosti (MN) 15 550 a polydisperzní inex 1,45.

Ve srovnání s přírodní hyaluronovou kyselinou se spektroskopií FT-IR nezjistily ve spektru žádné abnormality. Stanovení procentuálního obsahu hyaluronové kyseliny za použití karbazolu pro určení D-glukuronové kyseliny prokazuje čistotu 97 %. Frakce hyaluronové kyseliny získané způsobem podle tohoto vynálezu lze široce použít při přípravě farmaceutických kompozic s charakteristikami vhodnými pro buněčné interakce v rámci mechanismů regenerace tkání, při angiogenezi a tvorbě kostí.

Kromě toho lze použít tyto frakce hyaluronové kyseliny v průmyslové výrobě samozesíťující hyaluronové kyseliny způsobem podle Evropské patentové EP 341 745 B1 použitelné v přípravě farmaceutických kompozic pro oční lékařství a oborové mechanismy zahrnující sloučeniny s účinky anestetickými, protizánětlivými, vazokonstrikčními, antibiotickými, antibakteriálními a antivirovými.

Deriváty hyaluronové kyseliny lze rovněž použít při výrobě hygienických a chirurgických výrobků, dále v potravinářském průmyslu a ve výrobě kosmetických přípravků.

Uvedené frakce lze též esterifíkovat a připravit esterifikovanou kyselinu hyaluronovou způsobem popsaným v Evropském patentu EP 216 453 Bl, použitelnou v očním lékařství, dermatologii, otorinolaryngologii, zubním lékařství, angiologii, gynekologii a v neurologii pro přípravu zdravotnických a chirurgických produktů.

Vedle syntézy samozesíťující a esterifíkované hyaluronové kyseliny lze použít frakce hyaluronové kyseliny získané způsobem podle tohoto vynálezu pro přípravu sulfátované hyaluronové kyseliny způsobem popsaným v patentové přihlášce WO 95/25751 pro aplikaci v očním lékařství, dermatologii, otorinolaryngologii, zubním lékařství, angiologii, gynekologii, urologii, hemodialýze, kardiologii, mimotělním oběhu, pro povlékání biomedicínských výrobků, jako vehikulum pro regulované uvolňování léčiv, při léčbě zánětů a pro urychlení hojení ran při zraněních a spáleninách.

Z tohoto popisu vynálezu je zřejmé, že uvedené způsoby je možno modifikovat tak, aby se z přírodních polymerů z živočišných, biotechnologických a biosyntetických zdrojů získaly frakce hyaluronové kyseliny s molekulovou hmotností až 300 000.

-8CZ 291394 B6

Podobné modifikace však nemají být považovány za odchylky od ducha a účelu vynálezu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob přípravy frakce hyaluronové kyseliny nebo její soli se střední molekulovou hmotností v rozsahu 5000 až 300 000, vyznačující se tím, že se působí na výchozí hyaluronovou kyselinu nebo její sůl s molekulovou hmotností od 50 000 do 10 000 000 po dobu kratší než 240 minut současně ultrazvukem i chlornanem sodným v takových koncentracích, aby molámí poměr chlornan sodný/opakující se jednotka hyaluronové kyseliny byl mezi 0,01 a 5.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se hyaluronová kyselina extrahuje z kohoutích hřebínků a má molekulovou hmotnost 100 000 až 1 500 000.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že výsledná frakce hyaluronové kyseliny má molekulovou hmotnost 5000 až 50 000.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že výsledná frakce hyaluronové kyseliny má molekulovou hmotnost 5000 až 10 000.

5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že výsledná hyaluronová kyselina má střední molekulovou hmotnost 10 000 až 15 000.

6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že výsledná hyaluronová kyselina má střední molekulovou hmotnost 15 000 až 25 000.

7. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že výsledná hyaluronová kyselina má střední molekulovou hmotnost 25 000 až 50 000.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že výchozí hyaluronová kyselina pochází z fermentačního způsobu a má střední molekulovou hmotnost v rozmezí 1 000 000 až 5 000 000.

9. Způsob podle nároku 8, vy zn ač u j í cí se tím, že výsledná frakce hyaluronové kyseliny má střední molekulovou hmotnost v rozmezí 50 000 až 300 000.

10. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že výchozí hyaluronová kyselina pochází ze syntézy in vitro a má střední molekulovou hmotnost v rozmezí 50 000 až 10 000 000.

11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se provádí s použitím vodného roztoku NaCl obsahujícího výchozí hyaluronovou kyselinu nebo její sůl při koncentracích 10 mg/ml a teplotách 4 °C.

12. Způsob podle nároku 11., vyznačující se tím, že se NaOCI přidá kuvedenému roztoku ve formě vodného roztoku s koncentrací v rozmezí 1 až 20 % hmotnostních.

13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se NaOCI přidává v takové koncentraci, že molámí poměr NaOCI/ opakující se jednotka hyaluronové kyseliny je mezi 0,5 a 2,5.

14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že se provádí v časovém rozmezí 120 až 240 minut.

-9CZ 291394 B6

15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že ultrazvuk se generuje energií mezi 50 a 200 W.