DE69604087T2

DE69604087T2 - Verfahren zur herstellung von einer hyaluronsäurefraktion mit niedrigem polydispersionindex

Info

Publication number: DE69604087T2
Application number: DE69604087T
Authority: DE
Inventors: Lanfranco Callegaro; Davide Renier
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers SRL
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 2000-02-24
Anticipated expiration: 2016-12-20
Also published as: WO1997022629A1; ITPD950244A1; EP0868437A1; JP4094059B2; HUP9903666A3; EP0868437B1; DK0868437T3; CZ188998A3; CZ291394B6; GR3031973T3; ES2139402T3; ITPD950244A0; HU226949B1; AU703332B2; AU1374997A; US6232303B1; IT1282219B1; ATE184024T1; IL124909A; JP2000502141A

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Hyaluronsäure-Fraktion mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 5000 und 300 000 und einem Polydispersionsindex unter 1,7 das die Behandlung der Ausgangs-Hyaluronsäure mit hohem Molekulargewicht gleichzeitig mit Natriumhypochlorit und Ultraschall umfaßt.

Technischer Hintergrund

Hyaluronsäure ist ein natürliches lineares Polysaccharid, das biologisch verträglich und biologisch abbaubar ist und besteht aus einer wiederkehrenden Disaccharid-Einheit, die von Glucuronsäure und N-Acetylat-Glucosamin gebildet wird, die durch β-1,3 und α-1,4-Giycosid-Bindungen miteinander verbunden sind.
Die Hyaluronsäure kommt in den Bindegeweben höherer Organismen, in der Synovial-Flüssigkeit, in der Nabelschnur und in Hahnenkämmen vor; sie kann auch aus bestimmten bakteriellen Formen, beispielsweise Streptococcen, synthetisiert werden (Kendall et al., "Journ. Biol. Chem.", Band 118, S. 61, 1937).
Die Hyaluronsäure spielt eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, beispielsweise bei der Gewebehydratation, bei der Proteoglycanorganisation, bei der Zeildifferenzierung und bei der Angiogenese. Es gibt viele biomedizinische Anwendungen, die mit den rheologischen Eigenschaften von Hyaluronsäure-Lösungen in Verbindung stehen: ein wichtiger Sektor ist die Augenchirurgie (Grav et al., "Exp. Eye Res., Band 31, S. 119, 1979). Andere biomedizinische Anwendungen, an denen die Hyaluronsäure und ihre Derivate (beispielsweise Hyaluronsäureester, wie sie von della Valle und Romeo in EP 0 216 453 (1987) beschrieben sind) beteiligt sind, betreffen Prozesse, die mit der Gewebe-Reparatur (Verletzungen, Verbrennungen) in Verbindung stehen.
Was die Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht angeht, so werden derzeit verschiedene Anwendungsgebiete mit Erfolg erforscht in der Dermatologie (Scott, EP 0 295 092 B1 (1987)) und in der Pharmakologie. Bestimmte biologische Eigenschaften haben sich als empfindlich für die Abnahme des Molekulargewichtes und für die Funktion der Verteilungskurve erwiesen, die durch verschiedene Lokalisierungs- und Dispersions-Indices (Mw, Mn, Mz) und den Polydispersionsindex charakterisiert sind. So wirken beispielsweise Hyaluronsäure-Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht als potentielle angiogenetische Substanzen, die auf die Fähigkeit des Polysaccharids, die Gefäßbildung zu verstärken, einwirken oder in Entzündungsprozesse eingreifen als spezifische Inhibitoren von Faktoren wie TNF (Noble et al., "J. Clin. Inv.", Band 91, S. 2163, 1993). Darüber hinaus können Hyaluronsäure-Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht bei Knochenbildungs-Phänomenen und als antivirale Mittel verwendet werden.
Es gibt viele Beispiele für die Herstellung von Hyaluronsäure-Fraktionen, die durch physikalische Verfahren, umfassend beispielsweise das Erhitzen, die Anwendung von Ultraschall, von UV- und γ-Strahlung, oder durch enzymati sche Reaktionen unter Verwendung von Hyaluronidase erhalten werden (Chabreck et al., "Jour. Appl. Poly. Sci.", Band 48, S. 233, 1991; Rehakova et al., "Int. J. Biol. Macrom.", Band 16/3, S. 121, 1994); oder sie können wiederum durch chemische Depolymerisations-Reaktionen mit Ascorbinsäure (Cleveland et al., "Bioch. Biophy. Acta", Band 192, S. 385, 1969) oder durch Behandlung mit Hypochloriten (Schiller et al., "Biol. Chem. Hopp-Seyler", Band 375, S. 169, 1994) erhalten werden. Alle genannten Verfahren sind jedoch in irgendeiner Weise mangelhaft in bezug auf den Typ der erhaltenen Produkte. Obgleich einige von ihnen die primäre polymere Struktur nicht modifizieren durch Eingreifen in die glycosidischen Bindungen, sind sie nämlich nicht in der Lage, abgebaute Produkte mit einem niedrigen Molekulargewicht, die durch einen niedrigen Polydispersionsindex charakterisiert sind, zu bilden. Es wurde nämlich gefunden, daß bei Verfahren, in denen Ultraschall oder Wärme angewendet wird, Depolymerisationskinetiken auftreten, die asymptotische Muster aufweisen. Weitere Behandlungen für den gleichen Zeitraum und unter den gleichen Bedingungen (Ultraschallenergie und Temperatur) führen zu einem vollständigen Abbau des Produkts.
Im Unterschied zu diesen physikalischen Verfahren weist die durch Einwirkung von Hyaluronidase induzierte Depolymerisation bestimmte Vorteile auf, beispielsweise eine Wirksamkeit der Reaktion mit daraus folgender Aufrechterhaltung der Primärstruktur der Polymerkette und Kontrolle der Abbaukinetik. Die Einhaltung dieser Parameter garantiert jedoch keine hohen chemischen Ausbeuten oder Produkte, die durch eine niedrige Molekulargewichts-Verteilung charakterisiert sind.
Letzlich führt die extensive Einwirkung von chemischen Agentien wie Natriumhypochlorit und Ascorbinsäure gleichzeitig zu einem Verlust an Molekulargewicht und zu einer signifikanten Veränderung der chemischen Struktur der Polymerkette. Abbau-Derivate mit dem gewünschten molekularen Profil können nur durch eine vorsichtige und kontrollierte Verwendung dieser Reagenti en erhalten werden, so daß die potentielle Anwendung des chemischen Verfahrens in einem industriellen Maßstab stark eingeschränkt ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Hyaluronsäure-Fraktion oder eines Salzes davon mit einem durchschnittliches Molekulargewicht in dem Bereich von 5000 bis 300 000, das umfaßt das Behandeln einer Hyaluronsäure oder eines Salz derselben mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 50 000 und 10 000 000 mit Ultraschall bei gleichzeitiger Gegenwart von Natriumhypochlorit in einer solchen Konzentration, daß das Molverhältnis Natriumhypochlorit/wiederkehrende Hyaluronsäure-Einheit (HA r.u.) zwischen 0,01 und 5 liegt für eine Reaktionszeit von weniger als 240 min.

Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 zeigt in Form eines Diagramms die Ergebnisse der Depolymerisation, die 8 h lang nur mit Natriumhypochlorit bei einer Ausgangs-Hyaluronsäure mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 175 000 durchgeführt wurde unter Anwendung von Molverhältnissen NaOCl/HA r.u. in dem Bereich von 1,0 bis 10,0, wobei die genannten Molverhältnisse auf der Abszissen-Achse angegeben sind, die durchschnittlichen Molekulargewichte auf der linken Ordinaten-Achse angegeben sind und die Polydispersions-Indices auf der rechten Ordinaten-Achse angegeben sind.
Die Fig. 2 stellt eine graphische Darstellung der Abbaukinetik der Depolymerisation dar, die nur mit Natriumhypochlorit bei einem Molverhältnis NaOCl/HA r.u. = 5,0 durchgeführt wurde, wobei die Zeit (h) auf der Abszissenachse, die durchschnittlichen Molekulargewichte auf der linken Ordinatenachse und der Polydispersionsindex auf der rechten Ordinatenachse angegeben sind.
Die Fig. 3 zeigt das Diagramm der Abbaukinetik der Depolymerisation, die mit einer Hyaluronsäure-Fraktion D3-b durchgeführt wurde, wobei die Zeit (h) auf der Abszissenachse, die durchschnittlichen Molekulargewichte auf der linken Ordinatenachse und die Polydispersionsindices auf der rechten Ordinatenachse angegeben sind.
Die Fig. 4 gibt das Diagramm der Abbaukinetik der Depolymerisation in Form eines Diagramms wieder, die mit der Hyaluronsäure-Fraktion D2 durchgeführt wurde, wobei die Zeit (h) auf der Abszissenachse, die durchschnittlichen Molekulargewichte auf der linken Ordinatenachse und die Polydispersionsindices auf der rechten Ordinatenachse angegeben sind.
Die Fig. 5 zeigt die Abbaukinetik der Depolymerisation, die mit einer Ausgangs-Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 990 000 und einem Polydispersionsindex von 1,40 durchgeführt wurde, die gleichzeitig mit Ultraschall und Natriumhypochlorit bei Anwendung des folgenden Molverhältnisses NaClO/HA r.u. = 0,5; 1,0; 2,5 durchgeführt wurde, verglichen mit der Depolymerisation, die mit der gleichen Hyaluronsäure durchgeführt wurde, die nur mit Ultraschall behandelt wurde, wobei die durchschnittlichen Molekulargewichte auf der Ordinatenachse angegeben sind, während die Zeit (min) auf der Abszissenachse angegeben ist.
Die Fig. 6 zeigt die Abbaukinetik der Depolymerisation, die mit einer Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 990 000 und einem Polydispersionsindex von 1,40 durchgeführt wurde, die gleichzeitig mit Ultraschall und Natriumhypochlorit behandelt wurde unter Anwendung des folgenden Molverhältnisses NaClO/HA r.u. = 0,5; 1,0; 2,5, verglichen mit der Depolymerisation, die mit der gleichen Hyaluronsäure durchgeführt wurde, die nur mit Ultraschall behandelt wurde, wobei die Polydispersionsindices auf der Ordinatenachse angegeben sind, während die Zeit (min) auf der Abszissenachse angegeben ist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Depolymerisation von Hyaluronsäure oder eines Salzes derselben mit unterschiedlichen Molekulargewichten angewendet werden.
Es kann beispielsweise angewendet werden zur Depolymerisation von Hyaluronsäure, die aus Hahnenkämmen extrahiert wurde, wie in EP 0 138 572 und in EP-A-0 535 200 beschrieben, die ein durchschnittliches Molekulargewicht in dem Bereich von 100 000 bis 1 500 000 aufweist.
In diesem Fall hat die Hyaluronsäure-Fraktion vorzugsweise ein Molekulargewicht von 5000 bis 50 000, besonders bevorzugt in den folgenden Bereichen: 5000 - 10 000; 10 000 - 15 000; 15 000 - 25 000 und 25 000 - 50 000.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise auch mit Vorteil angewendet werden zur Depolymerisation von handelsüblicher Hyaluronsäure, die aus Fermentationsverfahren stammt und eher durch ein hohes Molekulargewicht charakterisiert ist, das im allgemeinen in dem Bereich von 1 000 000 bis 5 000 000 liegt, und mit dem erfindungsgemäßen Depolymerisationsverfahren ist es möglich, aus diesen Hyaluronsäure-Fraktionen eine Hyaluronsäure mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht in dem Bereich von 50 000 bis 300 000 herzustellen.
Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch mit Vorteil mit Hyaluronsäure-Fraktionen mit einem hohen Molekulargewicht durchgeführt werden, die durch Anwendung der in vitro-Synthese erhalten werden, wie sie in der PCT-Patentanmeldung Nr. WO 95/24497 beschrieben ist, wobei die genannte Hyaluronsäure dadurch charakterisiert ist, daß sie ein Molekulargewicht in dem Bereich von 50 000 bis 10 000 000 hat.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen mit einer wäßrigen NaCl-Lösung, welche die Ausgangs-Hyaluronsäure oder ein Salz derselben in Konzentrationen vorzugsweise von 10 mg/ml enthält, bei Temperaturen vorzugsweise von 4ºC durchgeführt. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das NaOCl im allgemeinen in Form einer wäßrigen Lösung in Konzentrationen, die im allgemeinen in dem Bereich von 1 bis 20 Gew.-% liegen, zu der genannten Lösung zugegeben. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das NaClO vorzugsweise in einer solchen Konzentration zugegeben, daß das Molverhältnis NaClO/HA r.u. zwischen 0,5 und 2,5 liegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise für eine Dauer zwischen 120 und 240 min durchgeführt. Die angewendete Ultraschallenergie liegt vorzugsweise zwischen 50 und 200 Watt und hat eine Frequenz in dem Bereich von 10 bis 50 KHz.
Darüber hinaus ergibt das erfindungsgemäße Verfahren eine Depolymerisationskinetik, die durch einfache mathematische Funktionen gesteuert und verfolgt werden kann, vor allem aber erlaubt sie, wie weiter oben angegeben, die Herstellung von Polysaccharid-Fraktionen mit einem niedrigen Polydispersionsindex (Pd-Werten von Mw/Mn < 1,7), die ansonsten nur durch langwierige und teure Reinigungs-Verfahren erzielbar wären.
Die Molekulargewichte und Polydispersionsindex-Werte wurden bestimmt durch Größenausschluß-Chromatographie in Kombination mit verschiedenen Instrumenten zur Messung beispielsweise des Refraktionsindex (RI) und der Multiwinkel-Laserlicht-Streuung (MALLS).
Die Anmelderin hat nämlich überraschend gefunden, daß nur die gleichzeitige Behandlung mit NaClO und Ultraschall die Erreichung dieses Ziels erlaubt, während die alternativen Verfahren, bei denen die Ultraschalltechnik und das NaClO in getrennten Stufen angewendet werden, nicht die gleichzeitige Erzielung von Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht sowie eines niedrigen Polydispersionsindex erlaubten.
Es wurden nämlich die folgenden drei alternativen Verfahren durchgeführt: 1) Verfahren "A": die Depolymerisation wurde erzielt durch Zugabe einer Natriumhypochlorit-Lösung und anschließende Behandlung der resultierenden Lösung mit Ultraschall;
2) Verfahren "B": die Depolymerisation wurde erzielt durch Einwirkenlassen von Ultraschall in zwei getrennten aufeinanderfolgenden Stufen bei einer gegebenen Energieeinstellung und unter Zugabe einer Natriumhypochlorit-Lösung;
3) Verfahren "C": die Depolymerisation wurde erzielt durch kombiniertes, gleichzeitiges Einwirkenlassen einer Natriumhypochlorit-Lösung und von Ultraschall.
Um einen Vergleich zwischen den drei Verfahren zu erleichtern, wurde versucht, die Reaktionsvariablen (die Konzentration an Hyaluronsäure, die Konzentration an Hypochlorit, die Ultraschallenergie und dgl.) so stabil wie möglich zu machen. Ausgehend von Lösungen der Hyaluronsäure, die durch Extraktion erhalten wurde, mit einem Molekulargewicht (MW) in dem Bereich zwischen 100 000 und 1 500 000 und mit einer Konzentration von 20 mg/ml wurde die Abbaukinetik des Polymers untersucht durch Behandlung mit (5%igen) Hypochlorit-Lösungen bei unterschiedlichen Molverhältnissen NaClO/HA r.u. bei 50ºC für Zeitspannen, die zwischen 1 und 48 h vaiierten. Ziel war es, Hyaluronsäure-Fraktionen mit Molekulargewichten zwischen 5 000 und 20 000 Da und mit einem Polydispersionsindex von ≤ 1,7 herzustellen.
Die Fig. 1 repräsentiert die Hyaluronsäure-Fraktionen und den Polydispersionsindex, die erhalten wurden, wenn man die Ausgangs-Hyaluronsäure HA-1 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 175 000 8 h lang mit Natriumhypochlorit-Lösungen bei unterschiedlichen Molverhältnissen NaClO/HA r.u. zwischen 1,0 und 10, wie sie in der Tabelle 1 angegeben sind, reagieren ließ, und mit dem Molverhältnis-Wert 5,0 wurde eine Kurve aufgestellt, die in der Fig. 2 dargestellt ist, welche die Abbaukinetik mit den in der Tabelle 2 angegebenen Daten zeigt. Tabelle 1 Tabelle 2
Aus den oben erhaltenen Daten ergibt sich, daß es schwierig ist, Hyaluronsäure-Fraktionen herzustellen, die durch Molekulargewichte von weniger als 20 000 D und durch einen Polydispersionsindex mit einem numerischen Wert (Mw/Mn), der 1,7 nicht übersteigt, charakterisiert sind. Durch Verwendung großer Mengen an Depolymerisationsmittel und/oder durch Erhöhung der Reaktionszeit ist es nicht möglich, Hyaluronsäure-Fraktionen mit den gewünschten molekularen Profil-Eigenschaften (vollständiger Abbau des Polymers) zu erhalten.
Um die Studie des Verfahrens A zu vervollständigen, wurden die als D2 und D3-b bezeichneten Fraktionen verwendet, von der Reaktionsmischung abgetrennt durch Ausfällung mit einem organischen Gemisch, bestehend aus Methanol und Aceton. Nach der Solubilisierung in einer 0,15 M NaCl-Lösung wurden diese mit Ultraschall, dessen Energie auf einen Wert zwischen 150 und 200 W und eine Frequenz von 20 KHz eingestellt worden war, für einen Zeitraum zwischen 15 min und 8 h behandelt. In der Tabelle 3 sind das Molekulargewicht (MW) und die Polydispersionsindex-Werte, die bei der GPC- Chromatographie erhalten wurden, angegeben. Tabelle 3
Die Daten und die zugehörigen Diagramme (Fig. 3 und 4) zeigen, daß es unmöglich ist, HA-Fraktionen mit dem gewünschten Molekulargewicht (MW) herzustellen durch Anwendung des Verfahrens "A". Selbst durch Verlängerung der Ultraschall-Behandlungszeit oder durch Modifizierung der chemischen Depolymerisations-Bedingungen ist es nicht möglich, ein Endprodukt zu erhalten, das durch einen Polydispersionsindex von < 1,7 und durch ein Molekulargewicht zwischen 5000 und 20 000 charakterisiert ist.
Auch das Verfahren "B" umfaßt die doppelte Behandlung in zwei getrennten Stufen mit Ultraschall und die Umsetzung mit Hypochlorit, wobei man von natürlicher Hyaluronsäure ausgeht, wie sie in dem Verfahren "A" beschrieben ist, es entstehen jedoch keine Fraktionen mit dem gewünschten durchschnittlichen Molekulargewicht (MW) oder dem gewünschten Polydispersionsindex. Insbesondere wurde festgestellt, daß, obgleich die Anwendung von Ultraschall zur Bildung von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von etwa 35 000 und einem Polydispersionsindex von 1,5 (nach 4-stündiger Behandlung bei 4ºC) führte, die nachfolgende chemische Reaktion mit Natriumhypochlorit einen zerstörenden Effekt auf die Struktur-Eigenschaften des Produkts auch unter extrem milden Bedingungen hatte.
In dem Verfahren "C", dessen neuartige Ergebnisse in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind, werden die Einwirkungen von Ultraschall und Natriumhypochlorit kombiniert und kontrolliert (gesteuert). Die kombinierte Wirkung umfaßt die gleichzeitige Anwendung dieser beiden Faktoren über eine Zeitspanne zwischen 0 und 480 min. Der chemisch-physikalische Abbau tritt auf in einer (0,15 M) NaCl-Lösung bei einer Temperatur von 4ºC unter Anwendung von 150 W-Ultraschall mit einer Frequenz von 20 KHz, erzeugt mittels einer Titan-beschichteten Tauchsonde. Darüber hinaus wurde eine 5%ige NaOCl-Lösung in einer molaren Konzentration, bezogen auf die natürliche Hyaluronsäure (MW etwa 1 000 000), in dem Bereich zwischen 0,5 und 2,5 (mol NaOCl/mol Hyaluronsäure) zugegeben.
Zu den für die Reaktionskinetik festgelegten Zeiten wurde ein Aliquot der Lösung entnommen und in 5 Volumenteilen einer Methanol/Aceton-Mischung ausgefällt. Das Produkt wurde dann getrocknet und durch GPC-Chromatographie analysiert unter Verwendung der beiden weiter oben beschriebenen Meß-Einrichtungen: es wurden zwei Serien-Kolonnen des Modells TSK (G2000 und G3000) für die Trennung verwendet.
Die bei dieser Analyse erhaltenen Daten sind in der Tabelle 4 (Molekulargewichte) und in der Tabelle 5 (Polydispersionsindex) angegeben. Zur Erzielung eines klareren Bildes von den Ergebnissen wurden die in der ersten Stufe des Verfahrens B (Behandlung nur mit Ultraschall) erzielten MW-Werte ebenfalls angegeben. Tabelle 4
* = Molverhältnis NaClO/HA r.u. Tabelle 5
* = Molverhältnis NaClO/HA r.u.
Ein Vergleich zwischen den Daten, die bei den beiden Analysenreihen erhalten wurden, zeigt, daß es möglich ist, mindestens drei Fraktionen mit dem geforderten Molekularprofil zu erhalten. Diese drei unterschiedlichen Produkte werden mit den Code-Namen D4 (Zeit: 240 min. NaOCl 0,5), D5 (Zeit: 120 min. NaOCl 1,0) und D6 (Zeit: 120 min. NaOCl 2,5) bezeichnet. Sie weisen Molekulargewichte von 13 400, 11 500 bzw. 7 800 und Polydispersionsindexwerte zwischen 1,55 und 1,7 auf.
MW-Werte von weniger als 5 000 sind sehr schwierig genau zu ermitteln, da sie unterhalb der Instrumenten-Empfindlichkeitsgrenzen liegen, so daß Fraktionen mit solchen Werten schwierig zu definieren sind.
Es ist interessant darauf hinzuweisen, daß bei dem Verfahren "C" mit gleichzeitigem, kombiniertem Abbau Hyaluronsäure-Fraktionen gebildet werden, die innerhalb der akzeptablen Grenzen, bezogen auf die Polydispersität der Molekulargewichte, bleiben. Diese Ergebnisse bestätigen die Spezifität der Depolymerisations-Reaktion und, unter Berücksichtigung der Kurven in den Fig. 5 und 6, eine gute Kinetik-Kontrolle, bestätigt durch drei Tests, die unter Anwendung der folgenden Reaktions-Parameter durchgeführt wurden: Ultraschall- Energie 150 W, Reaktionsdauer 120 min und molare NaOCl-Konzentration 1 mol/mol Hyaluronsäure, ausgehend von der gleichen Hyaluronsäure, wie sie in dem vorhergehenden Versuch verwendet wurde, und die entsprechenden Daten, die in der Tabelle 6 angegeben sind, zeigen, daß das Abbau-Verfahren reproduzierbar ist, wenn die gleichen Versuchs-Bedingungen angewendet werden. Tabelle 6
In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung erläutert, das erfindungsgemäße Verfahren ist darauf jedoch nicht beschränkt.

Beispiel 1

Herstellung von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht zwischen 5000 und 10 000

2,40 g Hyaluronsäure-natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 990 000 Da aus Hyaluronsäure, die durch Extraktion erhalten wurde, werden in 240 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung solubilisiert. Es werden 7,9 ml einer 14%igen NaOCl-Lösung zugegeben. Während die Temperatur bei +4ºC gehalten wird, wird die resultierende Lösung 120 min lang mit Ultraschall bei einer Leistung von 150 W und einer Frequenz von 20 KHz behandelt.
Wenn einmal die Reaktion beendet ist, was aus dem Abfall der Viskosität zu ersehen ist, wird der pH-Wert mit 0,1 N HCl auf 6,5 gebracht und dann wird in 1000 ml eines Methanol/Aceton (2 : 1)-Gemisches ausgefällt. Das Produkt wird durch Filtrieren abgetrennt und 48 h lang bei 45ºC vakuumgetrocknet.
Man erhält so 1,65 g in der Natrium-Form (Code-Name. HA-D9-Na). Die HPLC-GPC-Analyse zeigt, daß die erhaltene Hyaluronsäure-Fraktion ein durchschnittliches Molekulargewicht (MW) von 5 850, ein zahlendurchschnittliches Molekulargewicht (MN) von 3 640 und einen Polydispersionsindex von 1,61 aufweist.
Die FT-IR-Spektroskopie im Vergleich mit der natürlichen Hyaluronsäure zeigte keine Abnormitäten des Spektrums. Schließlich zeigte die Analyse des Prozentsatzes an vorhandener Hyaluronsäure, die unter Anwendung des Verfahrens unter Verwendung von Carbazol zur Bestimmung von D-Glucuronsäure erhalten wurde, eine Reinheit von 95%.

Beispiel 2

Herstellung von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht zwischen 10 000 und 15 000

2,5 g Hyaluronsäure-natriumsalz mit einem MW von 740 000 Da, hergestellt aus Hyaluronsäure, die durch Extraktion erhalten wurde, werden in 250 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung solubilisiert. Es werden 3,3 ml einer 14%igen NaOCl-Lösung zugegeben. Während die Temperatur bei +4ºC gehalten wird, wird die resultierende Lösung 120 min lang mit Ultraschall mit einer Leistung von 150 W und einer Frequenz von 20 KHz behandelt.
Wenn die Reaktion einmal beendet ist, was durch den Abfall der Viskosität erkennbar ist, wird der pH-Wert mit 0,1 N HCl auf 6,5 gebracht und dann wird in 1000 ml eines Methanol/Aceton (2 : 1)-Gemisches ausgefällt. Das Produkt wird durch Filtrieren abgetrennt und 48 h lang bei 45ºC vakuumgetrocknet.
Man erhält so 1,50 g in der Natriumform (Code-Name HA-D9-Na). Die HPLC- GPC-Analyse zeigt, daß die erhaltene Hyaluronsäure-Fraktion ein durchschnittliches Molekulargewicht (MW) von 11 650, ein zahlendurchschnittliches Molekulargewicht (MN) von 7330 und einen Polydispersionsindex von 1,59 aufweist.
Die FT-IR-Spektroskopie im Vergleich zu natürlicher Hyaluronsäure zeigte keine Abnormitäten im Spektrum. Schließlich ergab die Analyse des Prozentsatzes der vorhandenen Hyaluronsäure, die nach dem Verfahren unter Ver wendung von Carbazol zur Bestimmung von D-Glucuronsäure durchgeführt wurde, eine Reinheit von 98%.

Beispiel 3

Herstellung von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht zwischen 15 000 und 25 000

1,00 g Hyaluronsäure-natriumsalz mit einem Molekulargewicht von etwa 1 000 000 Da, hergestellt aus Hyaluronsäure, die durch Extraktion erhalten wurde, wird in 100 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung solubilisiert. Es werden 0,6 ml einer 14%igen NaOCl-Lösung zugegeben. Während die Temperatur bei +4ºC gehalten wird, wird die resultierende Lösung 120 min lang mit Ultraschall bei einer Leistung von 150 W und einer Frequenz von 20 KHz behandelt.
Wenn die Reaktion einmal beendet ist, was am Abfall der Viskosität zu erkennen ist, wird der pH-Wert mit 0,1 N HCl auf 6,5 gebracht und dann wird in 500 ml eines Methanol/Aceton (2 : 1)-Gemisches ausgefällt. Das Produkt wird durch Filtrieren abgetrennt und 48 h lang bei 45ºC im Vakuum getrocknet.
Man erhält so 0,65 g in der Natrium-Form (Code-Name HA-D8-Na). Die HPLC- GPC-Analyse zeigt, daß die erhaltene Hyaluronsäure-Fraktion ein durchschnittliches Molekulargewicht (MW) von 22 500, ein zahlendurchschnittliches Molekulargewicht (MN) von 15 550 und einen Polydispersionsindex von 1,45 aufweist.
Die FT-IR-Spektroskopie im Vergleich mit natürlicher Hyaluronsäure ergab keine Abnormitäten im Spektrum. Schließlich ergab die Analyse des Prozentsatzes der vorhandenen Hyaluronsäure, die nach einem Verfahren unter Verwendung von Carbazol zur Bestimmung von D-Glucuronsäure durchgeführt wurde, eine Reinheit von 97%.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Hyaluronsäure- Fraktionen können in großem Umfang zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die Wirkungen auf die zelluläre Wechselwirkung bei Gewebe-Reparaturmechanismen, bei der Angiogenese und bei der Knochenbildung haben.
Darüber hinaus können diese Hyaluronsäure-Fraktionen in industriellen Verfahren zur Herstellung von selbstvernetzter Hyaluronsäure nach dem in dem Patent EP 0 341 745 B1 beschriebenen Verfahren verwendet werden, das zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die ophthalmische Verwendung oder für Mechanismen eingesetzt wird, die Verbindungen mit anästhetischer, antiinflammatorischer, gefäßverengender, antibiotischer, antibakterieller und antiviraler Wirkung ergeben.
Die Hyaluronsäure-Derivate können auch zur Herstellung von Artikeln bzw. Gegenständen für die Gesundheitspflege und chirurgischen Gegenständen und auf dem Gebiet der Industrie, der Nahrungs- bzw. Lebensmittel und Kosmetika verwendet werden.
Die genannten Fraktionen können auch Veresterungs-Verfahren unterworfen werden zur Herstellung von veresterter Hyaluronsäure nach dem in dem Patent EP 0 216 453 B1 beschriebenen Verfahren zur Verwendung in der Ophthalmologie, in der Dermatologie, in der Otorinolaryngology, in der Zahnheilkunde, in der Angiologie, in der Gynäkologie und auf dem Gebiet der Neurologie zur Herstellung von Artikeln bzw. Gegenständen für die Gesundheitspflege und von chirurgischen Gegenständen.
Neben der Synthese von selbstvernetzter und veresterter Hyaluronsäure ist es möglich, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Hyaluronsäure-Fraktion zur Herstellung von sulfatierter Hyaluronsäure nach dem in der PCT-Patentanmeldung WO 95/25751 beschriebenen Verfahren herzustellen für die Verwendung in der Ophthalmologie, in der Dermatologie, in der Otorino laryngology, in der Zahnheilkunde, in der Angiologie, in der Gynäkologie, in der Urologie, bei der Hämodialyse, in der Cardiologie, im extracorporalen Kreislauf, als biomedizinische Produkte und zum Beschichten derselben, als Vehiculum für die kontrollierte Freisetzung von Arzneimitteln, bei der Behandlung von Entzündungen und zur Beschleunigung von Wundheilungsprozessen in Wunden und Verbrennungen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Hyaluronsäure-Fraktion oder eines Salzes davon mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht in dem Bereich von 5000 bis 300000, das umfaßt das Behandeln einer Ausgangs-Hyaluronsäure oder eines Salzes derselben mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht in dem Bereich von 50000 bis 10000000 mit Ultraschall in gleichzeitiger Gegenwart von Natriumhypochlorit in einer solchen Konzentrationen, daß das Molverhältnis Natriumhypochlorit/wiederkehrende Hyaluronsäure-Einheit zwischen 0,01 und 5 liegt, für eine Reaktionszeit von weniger als 240 min.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Hyaluronsäure aus Hahnenkämmen extrahiert worden ist und ein Molekulargewicht in dem Bereich von 100000 bis 1500000 hat.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die resultierende Hyaluronsäure- Fraktion ein Molekulargewicht in dem Bereich von 5000 bis 50000 hat.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die resultierende Hyaluronsäure- Fraktion ein durchschnittliches Molekulargewicht in dem Bereich von 5000 bis 10000 hat.

5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die resultierende Hyaluronsäure ein durchschnittliches Molekulargewicht in dem Bereich von 10000 bis 15000 hat.

6. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die resultierende Hyaluronsäure ein durchschnittliches Molekulargewicht in dem Bereich von 15000 bis 25000 hat.

7. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die resultierende Hyaluronsäure ein durchschnittliches Molekulargewicht in dem Bereich von 25000 bis 50000 hat.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Ausgangs-Hyaluronsäure aus Fermentationsprozessen stammt und ein durchschnittliches Molekulargewicht in dem Bereich von 1000000 bis 5000000 hat.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die resultierende Hyaluronsäure- Fraktion ein durchschnittliches Molekulargewicht in dem Bereich von 50000 bis 300000 hat.

10. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Ausgangs-Hyaluronsäure aus der in vitro-Synthese stammt und ein durchschnittliches Molekulargewicht in dem Bereich von 50000 bis 10000000 hat.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das mit einer wäßrigen NaCl-Lösung, welche die Ausgangs-Hyaluronsäure oder ein Salz derselben in Konzentrationen von 10 mg/ml enthält, bei Temperaturen von 4ºC durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem NaClO der genannten Lösung in Form einer wäßrigen Lösung zugegeben wird, die Konzentrationen in dem Bereich von 1 bis 20 Gew.-% aufweist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem NaClO in einer solchen Konzentration zugegeben wird, daß das Molverhältnis NaClO/Hyaluronsäure in der wiederkehrenden Einheit zwischen 0,5 und 2,5 liegt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, das für eine Reaktionszeit zwischen 120 und 240 min durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem Ultraschall mit einer Energie zwischen 50 und 200 W verwendet wird.

16. Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht in dem Bereich von 5000 bis 300000 D und einem Polydispersionsindex von ≤ 1,7, wie sie bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 erhalten wird.

17. Hyaluronsäure nach Anspruch 16, die ein Molekulargewicht in dem Bereich von 5000 bis 50000 aufweist.

18. Hyaluronsäure nach Anspruch 17, die ein Molekulargewicht in dem Bereich von 5000 bis 10000 aufweist.

19. Hyaluronsäure nach Anspruch 17, die ein Molekulargewicht in dem Bereich von 10000 bis 15000 aufweist.

20. Hyaluronsäure nach Anspruch 17, die ein Molekulargewicht in dem Bereich von 15000 bis 25000 aufweist.

21. Hyaluronsäure nach Anspruch 17, die ein Molekulargewicht in dem Bereich von 25000 bis 50000 aufweist.

22. Autovernetztes Hyaluronsäure-Derivat, das aus der Hyaluronsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 21 hergestellt wurde.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff (aktiven Bestandteil) eine therapeutisch wirksame Menge mindestens eines autovernetzten Hyaluronsäure-Derivats nach Anspruch 22 enthält.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23 für die Verwendung in der Ophthalmologie.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23 bis 24, die außerdem eine therapeutisch wirksame Menge eines Wirkstoffes (aktiven Bestandteils) enthält, der ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus einem antiinflammatorischen, anästhetischen, gefäßverengenden, antibiotischen, antibakteriellen und antiviralen Agens.

26. Hyaluronsäureester, die aus der Hyaluronsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 21 hergestellt wurden.

27. Biomedizinisches Produkt, das mindestens einen Hyaluronsäureester nach Anspruch 26 enthält.

28. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 27 für die Verwendung in der Ophthalmologie.

29. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 27 für die Verwendung in der Dermatologie.

30. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 27 für die Verwendung in der Otorhinolaryngologie.

31. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 27 für die Verwendung in der Dentologie (Zahnheilkunde).

32. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 27 für die Verwendung in der Angiologie.

33. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 27 für die Verwendung in der Gynäkologie.

34. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 27 für die Verwendung in der Neurologie.

35. Chirurgischer Formkörper (Gegenstand), der das autovernetzte Hyaluronsäure-Derivat nach Anspruch 22 oder die Hyaluronsäureester nach Anspruch 26 enthält.

36. Gesundheitsvorsorgeprodukte, welche die autovernetzten Hyaluronsäure-Derivate nach Anspruch 22 oder die Hyaluronsäureester nach Anspruch 26 enthalten.

37. Sulfatiertes Hyaluronsäure-Derivat, das aus der Hyaluronsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 21 hergestellt worden ist.

38. Biomedizinisches Produkt, welches das sulfatierte Hyaluronsäure- Derivat nach Anspruch 37 enthält oder damit beschichtet ist.

39. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung in der Ophthalmologie.

40. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung in der Dermatologie.

41. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung in der Otorhinolaryngologie.

42. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung in der Dentologie (Zahnheilkunde).

43. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung in der Angiologie.

44. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung in der Gynäkologie.

45. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung in der Urologie.

46. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung bei der Hämodialyse.

47. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung in der Cardiologie.

48. Biomedizinisches Produkt nach Anspruch 38 für die Verwendung im extracorporalen Kreislauf.

49. Pharmazeutische Zusammensetzung mit kontrollierter Freigabe, welche die sulfatierte Hyaluronsäure nach Anspruch 38 als Vehiculum enthält.

50. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff (aktiven Bestandteil) die sulfatierte Hyaluronsäure nach Anspruch 38 in Kombination mit geeigneten Exzipienten und Verdünnungsmitteln enthält.

51. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50 zur Behandlung von Entzündungen.

52. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 50 und 51 zur Beschleunigung der Heilungsprozesse in Wunden und bei Verbrennungen.

53. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff (aktiven Bestandteil) die Hyaluronsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 21 enthält, für die Verwendung bei der Gewebsreparatur, in der Angiogenese und bei der Knochenbildung.