JP4094059B2 - 低い多分散指数を有するヒアルロン酸分画の調整方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は平均分子量が５，０００と３００，０００の間より成り且つ出発高分子量ヒアルロン酸を次亜塩素酸ナトリウムと超音波で同時に処理する１．７以下の多分散指数を有するヒアルロン酸分画の調製方法に関する。
従来の技術
ヒアルロン酸は配糖体結合β１−３及びα１−４によりリンクされたグルクロン及びＮ−アセチルグルコサミンにより形成された二糖単位の繰返しにより構成された天然の、線状多糖類で、生体親和性且つ生分解性である。
ヒアルロン酸は高級器官の結合組織の中、滑液の中、膝帯の中及び鶏頭の中に存在する；それは又連鎖球菌のようなある種の細菌形態から合成もされ得る（ケンドールほか，Ｊｏｕｒｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１１８，ｐ６１，１９３７）。
ヒアルロン酸は組織の水和、ムコ多糖の組織化、細胞分化及び脈管形成のような多くの生物学的過程で活発な役割を演じる。ヒアルロン酸溶液のレオロジー的性質に関連して多くの生体医学的応用がある：一つの重要な部門は眼の外科手術のそれである（グラブほか，Ｅｘｐ．ＥｙｅＲｅｓ．，ｖｏｌ．３１，ｐ１１９，１９７９）。ヒアルロン酸及びその誘導体（デラバレとロメオ，ＥＰ０２１６４５３，１９８７．で記述されたヒアルロン酸エステルのような）を含む他の生体医学的応用は組織回復（外傷、火傷）に関連した過程に関する。
低分子量分画に関して、種々の分野又は応用が皮膚科学（スコットＥＰ０２９５０９２，Ｂ１，１９８７）及び薬理学で成功裡に探求されている。ある種の生物学的性質が分子量の減少及び種々の局在化と分散指数（Ｍｗ，Ｍｎ，Ｍｚ）及び多分散指数により特徴付けられた分布曲線の機能に敏感なことを証明した。例えば、低分子量ヒアルロン酸は多糖類の血管新生を増加させる能力で作用する、又はＴＮＦのような特定の抑制因子として炎症性の進行を阻害する脈管形成可能な物質として作用する（ノブルほか，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．，ｖｏｌ．９１，ｐ２１６３，１９９３）。更に、ヒアルロン酸の低分子量分画は骨形成現象に又抗ウイルス剤として使用できる。
ヒアルロン酸分画の調製には例えば加熱、超音波、紫外線及びガンマー線照射を含む物理的方法、又はヒアルロン酸分解酵素を用いる酵素反応（チャブレックほか，Ｊｏｕｒ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．４８，ｐ２３３，１９９１；レハコバほか，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍ．，ｖｏｌ．１６／３，ｐ１２１，１９９４）による、更にまた、アスコルビン酸との化学的解重合反応（クリーブランドほか，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．１９２，ｐ３８５，１９６９）又は次亜塩素酸塩類との処理（シラーほか，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐ−Ｓｅｙｌｅｒ，ｖｏｌ．３７５，ｐ１６９，１９９４）により得られた多くの例がある。然し、すべての引用した方法は得られた生成物のタイプについて幾つかの方法に分けられる。事実、これらの幾つかは例え配糖体結合を阻害して一次重合構造を変更しないとしても、これらは低い多分散指数により特徴付けられる分解された低分子量生成物を生成することは出来ない。事実、超音波又は熱を用いた技術は漸近的傾向を呈する解重合反応速度論（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を作ることが見られた。更に同時に同じ条件（超音波出力と温度）での処理は生成物の完全な分解に導く。
これらの物理的方法と違って、ヒアルロン酸分解酵素の作用により誘導された解重合は結果としての重合鎖の一次構造の保持による反応の効力及び分解反応速度論の制御のような或種の利点を生じさせる。然しこれらのパラメーターの観察は低分子量分布により特徴付けられる高い化学的生産量又は生産物を保証しない。
最後に、次亜塩素酸ナトリウムやアスコルビン酸のような化学薬品の大量の作用は同時に分子量の損失及び重合鎖の化学構造の重大な変更に導く。望ましい分子の輪郭を持つ分解誘導体はこれらの試薬の注意深い且つ制御された使用によってのみ得ることができる、それ故工業的規模での化学工程の可能性のある使用は大きく制約される。
発明の要約
本発明は、５０，０００と１０，０００，０００の間の平均分子量を有しているヒアルロン酸又はその塩を、次亜塩素酸ナトリウムのモル／ヒアルロン酸繰返し単位（ＨＡ ｒ．ｕ．）のモルの比率が０．０１と５の間より成るような濃度の次亜塩素酸ナトリウムの存在下で同時に超音波で２４０分間以下の時間処理することより成る、５，０００から３００，０００までの範囲の平均分子量を有しているヒアルロン酸又はその塩の分画の調製方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１：１．０から１０．０までの範囲の、ＮａＣｌＯのモル／ＨＡｒ．ｕ．のモルの比率を使用して平均分子量１７５，０００を有している出発ヒアルロン酸を８時間次亜塩素酸ナトリウムだけで行った解重合の結果を図表の形で表現、前記モル比は横軸で、平均分子量は左縦軸に且つ多分散指数は右縦軸に書いた。
図２：ＮａＣｌＯのモル／ＨＡ ｒ．ｕ．のモルの比率＝５．０で次亜塩素酸ナトリウムだけで行った解重合の分解反応速度論（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）のグラフ、ここで時間は横軸に、平均分子量は左縦軸に且つ多分散指数は右縦軸に書いた。
図３：ヒアルロン酸分画Ｄ３−ｂに行われた解重合の分解反応速度論の図表、時間を横軸に、平均分子量は左縦軸に且つ多分散指数は右縦軸に書いた。
図４：ヒアルロン酸分画Ｄ２に行われた解重合の分解反応速度論の図表、時間（分）を横軸に、平均分子量は左縦軸に且つ多分散指数は右縦軸に書いた。
図５：ＮａＣｌＯのモル／ＨＡ ｒ．ｕ．のモルの比率が０．５，１．０，２．５である次亜塩素酸ナトリウムと超音波で同時に処理された分子量９９０，０００及び多分散指数＝１．４０を有する出発ヒアルロン酸及び比較のための超音波だけで処理した同じヒアルロン酸に行われた解重合の分解反応速度論の表現、平均分子量は縦軸で、一方時間（分）は横軸に書かれた。
図６：：ＮａＣｌＯのモル／ＨＡ ｒ．ｕ．のモルの比率が０．５，１．０，２．５である次亜塩素酸ナトリウムと超音波で同時に処理された分子量９９０，０００及び多分散指数＝１．４０を有するヒアルロン酸及び比較のための超音波だけで処理した同じヒアルロン酸に行われた解重合の分解反応速度論の表現、多分散指数は縦軸で、一方時間（分）は横軸に書かれた。
発明の詳細な説明
本発明に従う工程は異なった分子量を有しているヒアルロン酸又はそれの塩を解重合するのに使用され得る。
例えばそれはＥＰ０１３８５７２及びＥＰ−Ａ−０５３５２００に記載されている如く１００，０００から１，５００，０００までの範囲の平均分子量を持っている鶏頭から抽出されたヒアルロン酸を解重合するのに使用され得る。
この場合ヒアルロン酸分画はなるべくなら５，０００から５０，０００までの分子量を持つ、もっと出来れば以下の範囲内にあるのがよい：５，０００−１０，０００，１０，０００−１５，０００，１５，０００−２５，０００，及び２５，０００−５０，０００。
本発明に従う工程は例えば発酵技術由来の且つ寧ろ高い分子量、一般に１，０００，０００から５，０００，０００までの範囲、を持つことを特徴とする市販のヒアルロン酸の解重合にも都合よく使用できる、又本発明に従う解重合工程により前記ヒアルロン酸から５０，０００から３００，０００の範囲より成る平均分子量を持っているヒアルロン酸分画を得ることが可能である。
最後に本発明に従う工程はＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９５／２４４９７で公開された生体外合成法により得られる、５０，０００から１０，０００，０００までの分子量範囲を持つことを特徴とするヒアルロン酸の高分子量分画にも都合良く実行され得る。
本発明に従う工程は一般になるべくなら１０ｍｇ／ｍｌの濃度で且つなるべくなら４℃の温度で出発ヒアルロン酸又はその塩を含んでいるＮａＣｌ水溶液で実行される。
本発明に従う工程では、ＮａＣｌＯは一般に１から２０重量％の範囲の濃度で水溶液の形で前記溶液に添加される。
本発明に従う工程では、ＮａＣｌＯはなるべくならＮａＣｌＯのモル／ＨＡ ｒ．ｕ．のモルの比率が０．５と２．５の間より成るような濃度で添加される。
本発明に従う工程はなるべくなら１２０と２４０分の間より成る時間行われる。
超音波はなるべくなら５０と２００ワットの間の出力で且つ１０から５０ｋＨｚの周波数範囲を持つ。
更に本発明に従う工程は簡単な数学関数により制御と追跡が出来る解重合反応速度論を用意する、然しとりわけ前述の如く、それは低い多分散指数（Ｐｄ値＝Ｍｗ／Ｍｎ＜１．７）を有している多糖類分画を得ることを許す、さもなければそれは長時間で且つ高価な精製工程によってだけ入手可能となるであろう。
分子量と多分散指数値は、屈折率（ＲＩ）及び多角レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）などを計測する種々の計器と結合した次元分子篩（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーにより決定された。
本出願人はＮａＣｌＯと超音波の同時処理だけがこの目的に達することを実際思いもかけず発見した、これに反し超音波技術とＮａＣｌＯが二つの別々の段階で加えられるような選択的方法では低い分子量分画と低い多分散指数とを同時に得ることには成功しなかった。
事実次の三つの選択的方法が行われた：
１） 方法‘Ａ’：次亜塩素酸ナトリウム溶液の添加に続いてその溶液への超音波処理により得られた解重合。
２） 方法‘Ｂ’：与えられた出力を固定した超音波の作用、続いて次の段階で次亜塩素酸ナトリウム溶液の添加することによる解重合。
３） 方法‘Ｃ’：次亜塩素酸ナトリウム溶液と超音波を組み合わせた同時作用により得られた解重合。
三つの方法の比較を容易にするために、反応変数（ヒアルロン酸の濃度、次亜塩素酸塩の濃度、超音波の出力など）を出来るだけ不変に与えることを試みた。抽出により得られた１００，０００と１，５００，０００の間の範囲にあるＭｗを持つヒアルロン酸溶液で出発して、分解反応速度論で５０℃で違った、ＮａＣｌＯのモル／ＨＡ ｒ．ｕ．のモルの比率の次亜塩素酸塩の（５％）溶液で１と４８時間の間の変動する期間処理することによる重合体を研究した。ねらいは多分散指数≦１．７を持つ分子量５，０００乃至２０，０００Ｄａのヒアルロン酸分画を作り出すことにあった。
図１は平均分子量１７５，０００を持つヒアルロン酸ＨＡ−１から出発して表１に書かれた１．０と１０の間の異なった、ＮａＣｌＯのモル／ＨＡ ｒ．ｕ．のモルの比率で次亜塩素酸ナトリウム溶液と８時間反応して得られたヒアルロン酸分画と多分散指数を表している、又モル比値５．０をとり曲線は表２に書かれたデータと共に図２の分解反応速度論を構成し且つ表現した。

２０，０００Ｄ以下の分子量で且つ数値（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．７を越えない多分散指数により特徴付けられるヒアルロン酸分画を得ることが困難なことは得られたデータから明らかである。多量の解重合剤の使用及び／又は反応時間の増加によって、望みの分子分布特性を持つヒアルロン酸分画（重合体の完全な分解）を得ることは不可能である。
方法‘Ａ’の研究を完成させるために、メタノールとアセトンより成る有機混合液での沈澱により反応混合物から分離された記号Ｄ２及びＤ３−ｂの分画を使用した。ＮａＣｌの０．１５Ｍ溶液に溶解した後、これらは１５０と２００Ｗの間の出力で且つ２０ｋＨｚに設定した超音波で１５分間から８時間の間処理される。表３はゲル浸透クロマトグラフィーにより明らかになったＭｗと多分散指数値を示す。

データと関連グラフ（図３と４）は方法‘Ａ’を用いて望ましいＭｗを持つＨＡ分画を製造することが不可能なことを示す。超音波処理時間を増加させる、又は化学的多分散条件を変更することによってさえ、多分散指数＜１．７によって特徴付けられ且つ５，０００と２０，０００の間の分子量を持つ最終生成物を得ることは未だ不可能である。
方法‘Ｂ’も又、方法‘Ａ’で述べたのと同じく天然ヒアルロン酸から出発して、超音波及び次亜塩素酸塩との反応の二つの別々の工程による二重処理を含むが、望まれる平均Ｍｗ又は多分散指数を持つ分画は製造しない。正確に言うと、超音波の作用は約３５，０００の分子量と多分散指数１．５（４℃で４時間の処理後）を持つヒアルロン酸を作り出すけれども、その後の次亜塩素酸ナトリウムとの化学反応が極度に穏やかな条件下であってさえも製品の構造特性を荒廃させる効果を有することが指摘された。
方法‘Ｃ’、本発明で記述されるその革新的結果は超音波と次亜塩素酸ナトリウムの作用を組合わせ且つ制御する。その組合わせた作用は０と４８０分間の間の期間にわたってこれら二つの因子の同時使用を含む。化学物理的分解は、チタンをコートした投込み型プローブで作られる２０ｋＨｚの周波数を持つ１５０Ｗ超音波を使用しながら、ＮａＣｌの溶液（４℃の温度で０．１５Ｍ）中で起こる。更に、ＮａＣｌＯの５％溶液が０．５と２．５（ＮａＣｌＯのモル／ヒアルロン酸のモルの比率）の間の範囲で天然ヒアルロン酸（Ｍｗ約１，０００，０００）に関して一モル濃度に加えられる。反応速度論的に決まった時間毎に溶液の一定量を採取して５倍量のメタノール／アセトン混合液中に沈澱させる。生成物はそこで乾燥され、二つの前述の計測手段を用いてゲル浸透クロマトグラフィーにより分析される：その間ＴＳＫ型（Ｇ２０００及びＧ３０００）の二つの直列カラムが分離に使用される。
この分析のデータは表４（分子量）と表５（多分散度）に記載した。この結果をよりはっきりさせるため、方法‘Ｂ’の第一段階（超音波処理だけ）で得られたＭｗも含めた。

二組の分析データの比較は要求される分子輪郭を持つ少なくとも三つの分画を得ることが可能なことを示す。これら三つの別種の生成物は記号名Ｄ４（時間：２４０分；ＮａＣｌＯ ０．５）、Ｄ５（時間：１２０分；ＮａＣｌＯ １．０）及びＤ６（時間：１２０分；ＮａＣｌＯ２．５）で呼ばれるだろう。これらは夫々１３，４００、１１，５００及び７，８００の分子量を持ち、多分散指数値は１．５５と１．７の間にある。
５，０００以下のＭｗ値はそれらが計器の感度限界以下にあるので正確に確かめることは非常に難しい、それで斯かる値を持つ分画は規定が困難である。
同時に組合わせた分解方法‘Ｃ’が分子量の多分散度による許容限界内に残るヒアルロン酸分画を製造することを示すことは興味がある。これらの結果は解重合反応の特異性を確認する、そして図５と６の曲線による判断、以下の反応パラメーター：超音波出力１５０Ｗ、１２０分の期間及び１モルのＮａＣｌＯ／ヒアルロン酸のモルのモル濃度、を用いて実行された三つのテストにより確認された良好な反応速度論的制御、前述の実験に用いたのと同じヒアルロン酸から出発して又表６に記した対応するデータは同じ実験条件が使用される時には分解工程が再現可能であることを示す。

ここで実例として以下の諸例を記載するが、本発明に従う方法の目的を限定するものではない。
実施例１：５，０００と１０，０００の間の分子量を持つヒアルロン酸の調製
抽出によって得られたヒアルロン酸から９９０，０００Ｄａの分子量を持つヒアルロン酸ナトリウム２．４０ｇｒを、ＮａＣｌの０．１５Ｍ溶液２４０ｍｌ中に溶解させる。１４％ＮａＣｌＯ溶液７．９ｍｌを添加する。＋４℃に保温したまま、その結果としての溶液は１５０Ｗの強度で且つ２０ｋＨｚの周波数の超音波で１２０分間処理される。
一滴の粘性から反応の完了がわかると直ちに、０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨを６．５にして、メタノール−アセトン２：１の混合液１，０００ｍｌ中に沈澱させる。生成物は瀘過で分離されて４５℃で４８時間真空乾燥させられる。
斯くしてナトリウム塩の形で１．６５ｇｒが得られる（記号 ＨＡ−Ｄ９−Ｎａ）。高速液体クロマトグラフィー−ゲル浸透クロマトグラフィー分析は、得られたヒアルロン酸分画が重量平均分子量（Ｍｗ）５，８５０、数平均分子量（Ｍｎ）３，６４０及び多分散指数１．６１を持つことを明らかにした。
天然ヒアルロン酸と比較したフーリエ変換赤外分光法はスペクトルにどんな異常も明らかにしなかった。最後に、Ｄ−グルクロン酸の決定用のカルバゾールを用いる方法によって得られた、ヒアルロン酸の存在率の分析は純度９５％を示した。
実施例２：１０，０００と１５，０００の間の分子量を持つヒアルロン酸の調製
抽出によって得られたヒアルロン酸から７４０，０００ＤａのＭｗを持つヒアルロン酸ナトリウム２．５ｇｒを、ＮａＣｌの０．１５Ｍ溶液２５０ｍｌ中に溶解させる。１４％ＮａＣｌＯ溶液３．３ｍｌを添加する。＋４℃に保温したまま、その結果としての溶液は１５０Ｗの強度で且つ２０ｋＨｚの周波数の超音波で１２０分間処理される。
一滴の粘性から反応の完了がわかると直ちに、０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨを６．５にして、メタノール−アセトン２：１の混合液１，０００ｍｌ中に沈澱させる。生成物は濾過で分離されて４５℃で４８時間真空乾燥させられる。
斯くしてナトリウム塩の形で１．５０ｇｒが得られる（記号ＨＡ−Ｄ９−Ｎａ）。高速液体クロマトグラフィー−ゲル浸透クロマトグラフィー分析は、得られたヒアルロン酸分画が重量平均分子量（Ｍｗ）１１，６５０、数平均分子量（Ｍｎ）７，３３０及び多分散指数１．５９を持つことを明らかにした。
天然ヒアルロン酸と比較したフーリエ変換赤外分光法はスペクトルにどんな異常も明らかにしなかった。最後に、Ｄ−グルクロン酸の決定用のカルバゾールを用いる方法によって得られた、ヒアルロン酸の存在率の分析は純度９８％を示した。
実施例３：１５，０００と２５，０００の間の分子量を持つヒアルロン酸の調製
抽出によって得られたヒアルロン酸から約１，０００，０００Ｄａの分子量を持つヒアルロン酸ナトリウム１．００ｇｒを、ＮａＣｌの０．１５Ｍ溶液１００ｍｌ中に溶解させる。
１４％ＮａＣｌＯ溶液０．６ｍｌを添加する。＋４℃に保温したまま、その結果としての溶液は１５０Ｗの強度で且つ２０ｋＨｚの周波数の超音波で１２０分間処理される。
一滴の粘性から反応の完了がわかると直ちに、０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨを６．５にして、メタノール−アセトン２：１の混合液５００ｍｌ中に沈澱させる。生成物は濾過で分離されて４５℃で４８時間真空乾燥させられる。
斯くしてナトリウム塩の形で０．６５ｇｒが得られる（記号ＨＡ−Ｄ８−Ｎａ）。高速液体クロマトグラフィー−ゲル浸透クロマトグラフィー分析は、得られたヒアルロン酸分画が重量平均分子量（Ｍｗ）２２，５００、数平均分子量（Ｍｎ）１５，５５０及び多分散指数１．４５を持つことを明らかにした。
天然ヒアルロン酸と比較したフーリエ変換赤外分光法はスペクトルにどんな異常も明らかにしなかった。最後に、Ｄ−グルクロン酸の決定用のカルバゾールを用いる方法によって得られた、ヒアルロン酸の存在率の分析は純度９７％を示した。
本発明の方法により得られるヒアルロン酸分画は組織回復機構、脈管形成及び骨形成における細胞相互作用を持つ薬学的組成品の調製に広く使用できる。
更に、これらのヒアルロン酸分画は、欧州特許Ｎｏ．０３４１７４５Ｂ１に記載の方法に従って、麻酔性、抗炎症性、血管収縮神経性、抗生物質、抗菌性、抗ウイルス性作用を持つ化合物を含んでいる眼科的用法又は機構のための薬学的組成品の調製に使用されるべき自己架橋ヒアルロン酸の工業的製造工程に使用できる。
ヒアルロン酸誘導体も又保健及び外科的関節間分節の準備及び産業、食品及び化粧品の分野でも使用できる。
前記分画は又、欧州特許Ｎｏ．０２１６４５３Ｂ１に記載の方法に従って、眼科学、皮膚科学、耳鼻咽喉科学、歯科学、脈管学、婦人科学での及び保健と外科的関節間分節（ｓｕｒｇｉｃａｌ ａｒｔｉｃｌｅｓ）の準備に関する神経学の分野での使用のため、エステル化したヒアルロン酸のエステル化調製工程を受けることができる。
合成的に自己架橋した及びエステル化したヒアルロン酸に加えて、生体医学的生成物及び同じく外被用として、医薬品の解放を制御する賦形剤として、炎症の治療に及び挫傷や火傷の傷治癒過程の加速に、眼科学、皮膚科学、耳鼻咽喉科学、歯科学、脈管学、婦人科学、泌尿器科学、血液透析、心臓学、体外循環での使用のために、特許出願Ｎｏ．ＰＣＴＷＯ９５／２５７５１に記載の方法に従って硫酸塩にしたヒアルロン酸調製のため本発明に従う工程で得られたヒアルロン酸分画を使用することも可能である。
ここで述べた発明でこれらの方法が、動物、生体工学又は生合成源から得られた天然重合物から出発して３００，０００Ｄａまでの分子量を持つヒアルロン酸分画を得るように変更できることは明らかである。斯かる変更が本発明の精神と目的からの逸脱と見なすべきではない。

Claims (15)

1. ５，０００から３００，０００までの範囲の平均分子量を有するヒアルロン酸又はそれの塩の分画の調製において、５０，０００から１０，０００，０００までの範囲の平均分子量を有する出発ヒアルロン酸又はその塩を、次亜塩素酸ナトリウムのモル／ヒアルロン酸繰返し単位のモルの比率が０．０１と５の間より成るような濃度での次亜塩素酸ナトリウムの存在下で同時に超音波で２４０分以下の時間処理することより成る調製方法。
2. ヒアルロン酸が１００，０００と１，５００，０００の範囲の分子量を有する鶏頭から抽出される、請求項１に記載の方法。
3. 生成するヒアルロン酸分画が５，０００から５０，０００までの範囲の分子量を持つ、請求項２に記載の方法。
4. 生成するヒアルロン酸分画が５，０００〜１０，０００の範囲の平均分子量を持つ、請求項３に記載の方法。
5. 生成するヒアルロン酸が１０，０００〜１５，０００の範囲の平均分子量を持つ、請求項３に記載の方法。
6. 生成するヒアルロン酸が１５，０００〜２５，０００の範囲の平均分子量を持つ、請求項３に記載の方法。
7. ２５，０００〜５０，０００の範囲の平均分子量を持つ請求項３に記載の方法。
8. 出発ヒアルロン酸が発酵工程からの由来であり且つ１，０００，０００から５，０００，０００までの範囲の平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
9. 生成するヒアルロン酸分画が５０，０００から３００，０００までの範囲の平均分子量を持つ、請求項８に記載の方法。
10. 出発ヒアルロン酸が生体外合成からの由来であり且つ５０，０００から１０，０００，０００までの範囲の平均分子量を有する、請求項２に記載の方法。
11. 出発ヒアルロン酸又はそれの塩を含むＮａＣｌ水溶液が温度４℃且つ濃度１０ｍｇ／ｍｌで実行される、請求項１−１０の何れにも記載の方法。
12. １から２０重量％の範囲の濃度を有する水溶液の形でＮａＣｌ０が前記溶液に添加される、請求項１１に記載の方法。
13. ＮａＣｌＯのモル／ヒアルロン酸繰返し単位のモルの比率が０．５と２．５の間より成るような濃度でＮａＣｌＯが添加される、請求項１−１２の何れにも記載の方法。
14. １２０と２４０分の間より成る時間実行される、請求項１−１３の何れにも記載の方法。
15. 超音波が５０と２００Ｗの間より成る出力を有する、請求項１−１４の何れにも記載の方法。

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