HU218600B

HU218600B - Eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, deszulfatált heparin alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására

Info

Publication number: HU218600B
Application number: HU9703606A
Authority: HU
Inventors: Saburo Hara; Masayuki Ishihara; Keiichi Yoshida
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-07-03
Publication date: 2000-10-28
Also published as: US6545136B1; US6140481A; EP1371666A2; EP0769502A4; US20030149253A1; DE69535565D1; WO1996001278A1; EP0769502B1; EP0769502A1; DE69531945T2; EP1371666B1; US6809086B2; DE69535565T2; HUT76426A; EP1371666A3; JP3929486B2; DE69531945D1; HU9603606D0

Abstract

A találmány tárgyát képezi egy eljárás deszulfatált poliszacharidelőállítására, melyben szelektíven eltávolítják a szulfatáltpoliszacharid primer hidroxilcsoportjaihoz kötődő szulfátcsoportokat,valamint a találmány tárgyát képezi az eljárással nyerhetődeszulfatált heparin. Az ilyen, a szelektíven deszulfatált heparinegyedül vagy alap- fibroblastnövekedési faktorral kombinálva széleskörű felhasználást nyerhet mint gyógyszer, például seb-, égés-, vagybőrfekélykezelésben, az osteoporosis, csonttörés, emésztőszervi fekélygyógyításában, a szívinfarktus kilátásainak javításában, valamint afelfekvés (decubitus) megelőzésében. ŕ

Description

A találmány tárgyát képezi egy eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, melyben szelektíven deszulfatáljuk a szulfátéit poliszacharid primer hidroxilcsoportjaihoz kötődő szulfátcsoportokat, valamint a találmány tárgyát képezi az eljárással nyerhető deszulfatált heparin.

Biológiailag aktív szulfátéit poliszacharid előállítása céljából különböző módszereket vizsgáltunk meg a szulfátéit poliszacharid deszulfatálására. Ismert egy szulfátéit poliszacharidot deszulfatáló módszer, mely a deszulfatáláshoz savas katalizátort alkalmaz sósavas metanolban (Kantor T. G. és Schubert M., J. Am. Chem. Soc. 79,152,1957). Ez a módszer azonban nem teszi lehetővé egyes szulfátcsoportok specifikus deszulfatálását, ezenkívül metanolízis következik be a glikozidkötéseken, ami a cukorlánc elhasadásával, így a molekulatömeg csökkenésével jár, ami csökkenti az eredeti lánchosszúságú reakciótermék hozamát.

Egy további, jó hozamú deszulfatálási módszernél a szolvolízist olyan aprotikus oldószerben végzik, mint a dimetil-szulfoxid (DMSO), Ν,Ν-dimetil-formamid (DMF) vagy piridin stb. (Usov A. és munkatársai, Carbohydr. Rés. 18, 336, 1971) vagy kis mennyiségű vizet vagy metanolt tartalmazó DMSO (Nagasawa K. és munkatársai, Carbohydr. Rés. 58, 47, 1977, Nagasawa K. és munkatársai, J. Biochem. 86, 1323, 1979). Ismeretes, hogy a szolvolízis reakciómechanizmusa fordítottja a szulfatálási reakciónak, melyben a szulfatálást aprotikus oldószerben, kén-trioxid komplexszel, valamely amin jelenlétében végzik. Ez a reakció szabályzott reakciókörülmények között felhasználható az N-szulfát-csoportok szelektív deszulfatálására, ugyanakkor a primer vagy szekunder hidroxilcsoporthoz kötődő O-szulfát-csoportok így nem távolíthatók el. Továbbá, ha ezt a módszert alkalmazzák egy oligoszacharid vagy poliszacharid esetében, nehézséget jelent az oldószer, például DMSO stb. eltávolítása a reakció befejezése után, ezenkívül a deszulfatálás teljessé tételéhez szükséges a reakció-hőmérséklet növelése, ami ilyen reakciókörülmények között a glikozidkötés elhasadásához vezethet stb.

Ismeretes egy módszer, mely N,O-bisz(trimetil-szilil)-acetamidot (BTSA) alkalmaz szacharidok primer hidroxilcsoportjaihoz kötődő szulfátcsoportok specifikus deszulfatálására (Matsuo M. és munkatársai, Carbohydr. Rés. 241, 209-215, 1993). Ha ezt a módszert használják heparin esetében, akkor a glükózamin 6-os helyzetében levő szulfátcsoport viszonylag szelektíven eltávolítható. Mikor azonban a reakciótermék szerkezetét részletesen megvizsgálták enzimatikus emésztés segítségével, úgy találták, hogy a primer hidroxilcsoportokhoz kötődő szulfátcsoportokkal együtt egy kevés Nszulfátcsoport is eliminálódik. Tehát igény merült fel egy olyan módszerre, mely nagyobb szelektivitással tudja eltávolítani a primer hidroxilcsoportokhoz kötődő szulfátcsoportokat.

Biológiai aktivitással rendelkező humán szulfátéit poliszacharid gyógyszer előállítása szempontjából nagy jelentősége van olyan módszer kidolgozásának, mely szelektíven eliminálni tudja a primer hidroxilcsoportokhoz kötődő szulfátcsoportokat. így például az olyan szulfátéit poliszacharidok, mint a dextrán-szulfát, xilán-szulfát, kondroitin-szulfát, heparin stb. lipometabolizmust fokozó szerként vagy antitrombotikumként használatosak. Az is ismeretes azonban, hogy olyan poliszacharidban, melyben a szulfátcsoportokat mesterségesen vitték be, a bevitt szulfátcsoportok helyzete nem specifikus és nagy mennyiségű szulfátcsoport bevitele mellékhatást okoz, fokozódik a szövetek bevérződési hajlama. Ezenkívül, eredetüktől függően, a természetes anyagból származó szulfatált poliszacharidokban a szulfátcsoportok helyzete és mennyisége különböző, és így kissé különbözik a szulfatált poliszacharidok fiziológiai aktivitása is.

A deszulfatált heparinnak, mely specifikusan tud kötődni különböző fiziológiai aktivitású fehérjékhez, igen nagy a jelentősége. Például, a heparin szerkezetében, mely kölcsönhatásba lép az alap-fibroblastnövekedési faktorral (bFGF), hogy fokozza stabilizációját és aktivitását a sejtburjánzással szemben, bőségesen jelen vannak az N-szulfát-csoportok és az iduronsav 2. helyzetében levő szulfátcsoportok, de nincs szükség a 6-os helyzetű szulfátcsoportra (Ishihara M. és munkatársai, Glycobiology 4, 451-458, 1994). Másrészt az aktivitás fokozására savas fibroblastnövekedési faktorral (aFGF) vagy FGF-4-gyel (Kaposi-szarkóma FGF) szemben sok szulfátcsoportra van szükség a 6-os helyzetben is (Ishihara M., Glycobiology 4, 817-824, 1994). Ezért a 6-os helyzetben szelektíven deszulfatált heparinban, mely úgy nyerhető, hogy a heparinban levő glükózamin primer hidroxilcsoportjáról szelektíven eltávolítjuk a szulfátcsoportot (6-os helyzetű hidroxilcsoport), a heparin deszulfatálását megelőző állapothoz képest csökken az antikoaguláns aktivitás, megmarad ugyanakkor a bFGF aktivitást specifikusan fokozó hatás, és várható, hogy csökken több nemkívánatos fiziológiai aktivitás, mely abból származott, hogy a molekula kis koncentrációban in vivő kölcsönhatásba lépett nagyszámú egyéb fiziológiailag aktív molekulával.

A közzétett 80583/1994 számú ideiglenes japán szabadalmi leírásban fibroblastnövekedési faktort (FGF) és poliszacharidokat tartalmazó készítményként javasolnak például olyan gyógyszerkészítményt, mely FGF-et, egy vírusellenes aktivitású szulfatált poliszacharidot és excipienst tartalmaz, míg az 509517 számú európai szabadalmi leírás olyan készítményt ismertet, mely FGF-et, L-iduronsav-2-O-szulfátot, N-szulfo-D-glükózamint és legalább egy olyan 8-18 szacharidot tartalmazó oligoszacharidot tartalmaz, mely kötődni tud FGF-hez, és a közzétett 40399/1990 számú japán közrebocsátási irat egy FGF-muteinből és glikózamino-glikánból álló komplexet ismertet, illetve egy olyan készítményt, mely ezeket tartalmazza a gyógyszerformában. Ezek közül egyik sem deszulfatált poliszacharid - mint az 5 288 704 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett gyógyszerkészítményben használt poliszacharid sem -, és feladatuk, hogy együttes hatásuk fokozza a vírusellenes aktivitást. Az 509517 számú európai szabadalmi leírás is ismertet egy specifikus oligoszacharidot, ez azonban nem deszulfatált és a közzétett 40399/1990 számú japán közrebocsátási irat szin2

HU 218 600 Β tén olyan természetes glikózamino-glikánt ismertet, melyet nem vetettek alá deszulfatálókezelésnek.

A találmány célja a szulfátéit poliszacharidok biológiai aktivitásának specifikusabbá tétele és a mellékhatások - mint például a bevérzést okozó hatás - csökkentése oly módon, hogy a szulfátéit poliszacharidnak csak a primer hidroxilcsoporthoz kapcsolódó szulfátcsoportjait távolítjuk el. Ezért olyan deszulfatálási eljárást kerestünk, melynek nagy a pozicionális szelektivitása és nem következik be olyan mellékreakció, mint a glikozidkötés felhasadása vagy az N-szulfát-csoportok eliminálódása.

A találmány tárgya eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy a primer hidroxilcsoporthoz kötődő szulfátcsoport szelektív eltávolítása céljából egy szulfátéit primer hidroxilcsoporttal rendelkező és cukoralkotóként szereplő szacharidegységeket tartalmazó szulfátéit poliszacharidot egy (I) általános képletű szililezőszerrel reagáltatunk, ahol a képletben

R, jelentései azonosan vagy különbözően, hidrogénatom vagy halogénatom,

R₂ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, és R₃ jelentései azonosan vagy különbözően 1-6 szénatomos alkilcsoport, fenilcsoport vagy halogénatom.

Az eljárás előnyös megvalósítási módja szerint a szulfátéit poliszacharidot szerves oldószerben oldódó sóvá alakítjuk át, például szerves bázis sójává, amelynek során a reakciót szerves oldószerben végezzük.

Az eljárás előnyös megvalósítási módja az is, amikor a deszulfatálási reakció után eltávolítjuk a szililcsoportokat a szililezett hidroxilcsoportokról.

A találmány tárgyát képezi továbbá a szelektíven deszulfatált heparin, mely a következő tulajdonságokkal jellemezhető:

(1) egy telítetlen diszacharidkészítmény enzimatikus emésztéssel és nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (HPLC) mérve a 2. ábrán ábrázolt ADiHStri(U,6,N)S-tartalom 10-40 mol% és ugyanebben a ADiHS-di(U,N)S-tartalom 30-60 mol%, (2) az N-szulfát-csoportot tartalmazó diszacharidtartalom 75-95%, (3) az átlagos molekulatömeg 4000-30 000 dalton, (4) az antitrombinaktivitás 20 E/mg-150 E/mg, és (5) az alap-fibroblasmövekedési faktor sejtburjánzással szembeni aktivitását fokozó hatás megmarad úgy, hogy az a nem deszulfatált heparinénak legalább 80%-a vagy több.

Továbbá a találmány tárgyát képezi egy szelektíven deszulfatált heparin, melynek a fenti (1)-(5) tulajdonságokkal rendelkezik, és melyet úgy állítunk elő, hogy a fenti eljárással deszulfatáljuk a heparint.

Továbbá a találmány tárgyát képezi egy anyag, mely hatóanyagként a fenti deszulfatált heparint tartalmazza az alap-fibroblastnövekedési faktor aktivitásának fokozására, és egy készítmény, mely tartalmazza a fenti deszulfatált heparint és az alap-fibroblastnövekedési faktort, és melyben fokozott az alap-fibroblastnövekedési faktor aktivitása a sejtburjánzással szemben.

Az 1. ábra mutatja a metil-a-galakto-piranozid-6szulfát deszulfatálási fokát az MTSTFA mennyiségének függvényében.

A találmány további tárgyát képezi az olyan (I) általános képletű deszulfatált heparin, amelyben a primer hidroxilcsoportokhoz kötődő szulfátcsoportok el vannak távolítva, és amely a következő tulajdonságokkal jellemezhető:

(1) egy telítetlen diszacharidkészítmény enzimatikus emésztéssel és nagy felbontóképességű folyadékkromatográfíával végzett elemzése során nem mutatható ki olyan összetevő, mely a (II) általános képlettel jellemezhető - ahol a képletben

R¹ jelentése SO₃1U,

R² jelentése acetilcsoport és

R³ jelentése hidrogénatom, vagy

R¹ és R³ jelentése SO₃H~ és

R² jelentése acetilcsoport (2) az N-szulfát-csoportot tartalmazó diszacharidtartalom 75-95 mol%.

A glikózamin-glikán enzimatikus emésztése során képződő különböző ide vonatkozó telítetlen diszacharidizomerek rövidített elnevezését az 1. táblázatban adjuk meg.

A 2. ábra ábrázolja a glikózamino-glikán enzimatikus emésztése során képződő különböző telítetlen diszacharidizomerek szerkezetét és rövidített elnevezését. Az ábrán Ac acilcsoportot jelent.

A találmány szerinti eljárásban - a reakciókörülmények szabályozásával - a szulfátcsoportok, melyek a szulfátéit poliszacharid primer hidroxilcsoportjaihoz kötődnek (ha a cukor-alkotóelem pentóz vagy hexóz, akkor a hidroxilcsoport 5-ös, illetve 6-os helyzetű), pozicionális szelektivitással teljesen vagy részlegesen deszulfatálhatók.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott szulfátéit poliszacharid lehet - nem korlátozó jelleggel akármilyen poliszacharid (a találmányban „poliszacharid” elnevezést használunk mind az oligoszacharidokra, mind a komplex poliszacharidokra), mely cukoralkotóelemként primer hidroxilcsoportjain szulfatált szacharidot tartalmaz. Ilyen szulfatált poliszacharid lehet valamely természetes anyagból extrakcióval izolált vagy szintetizált poliszacharid. Ezek között említhető olyan szulfatált poliszacharid, melynek cukor-alkotóeleme N-szubsztituált glikózamin és különösen előnyös az a szulfatált poliszacharid, mely cukoralkotóként olyan N-szulfatált glikózamint tartalmaz, melynek Nszulfát-csoportjai könnyen eltávolíthatók a hagyományos deszulfatáló eljárásban.

A találmány szerinti eljárásban használható szulfatált poliszacharidok közül külön említendők azok, melyek cukor-alkotóelemként olyan N-szubsztituált glikózamint tartalmaznak, melyben a primer hidroxilcsoport szulfátéivá van. Ilyen N-szulfatált glikózaminok például azok a glikózamino-glikánok, melyek cukoralkotóelemként N-szulfatált vagy N-acetilezett glükózamint vagy galaktózamint tartalmaznak, például a heparin, heparán-szulfát, kondroitin-szulfát, dermatán-szulfát, keratán-szulfát stb., a funorán, melynek cukor-alko3

HU 218 600 Β tóeleme a D-galaktóz-6-szulfát, és a porfirán, melynek cukor-alkotóeleme az L-galaktóz-6-szulfát stb.

A találmány szerinti deszulfatálási reakciót általában szerves oldószerben végezzük, ahol a szulfátéit poliszacharid szerves oldószerben oldódó só formájában vesz részt a reakcióban. Szerves oldószerben oldódó só lehet a szulfátéit poliszacharid szerves bázissal képezett sója. Ilyen szerves bázis lehet aromás amin, például a piridin, dimetil-anilin, dietil-anilin stb., tercier amin, például a trimetil-amin, trietil-amin, tributil-amin, N,N-diizopropil-etil-amin, trioktil-amin, Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametil1,8-naftalin-diamin stb., N-alkil-heterociklusos amin, például az N-metil-pirimidin, N-etil-pirimidin, N-metilmorfolin, N-etil-morfolin stb. és egyebek. A szulfatált poliszacharid szerves bázissal képezett sója könnyen előállítható, ha a szabad szulfatált poliszacharidot reagáltatjuk a szerves bázissal.

A deszulfatálási reakcióban az (I) általános képlettel jellemezhető szililezőszert reagáltatjuk vízmentes szerves oldószerben a szulfatált poliszachariddal. A reakció során eliminálódik a szulfátcsoport a szulfatált hidroxilcsoportról és szilileződik a hidroxilcsoport.

A reakcióban használható szerves oldószerek közül előnyben részesítendők a fenti szerves bázisok, melyeket a szulfatált poliszacharid sóképzésénél használtunk (piridin stb.), de a szerves bázisok helyett használhatók aprotikus oldószerek is, például az acetonitril, N,Ndimetil-formamid (DMF), dimetil-szulfoxid (DMSO), Ν,Ν-dimetil-acetamid, tetrahidrofurán (THF), 1,4-dioxán stb.

Az (I) általános képlettel jellemezhető szililezőszerben Rj jelentései azonosan vagy különbözően hidrogénatom vagy halogénatom, R₂ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, például metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, szek-butil-, terc-butil-, pentil-, izopentil-, hexilcsoport stb., és R₃ jelentései azonosan vagy különbözően 1-6 szénatomos, fentiekben leírt alkilcsoport, fenilcsoport stb. vagy halogénatom, például klór-, fluoratom stb. Az (I) általános képletben az (R₃)₃Si csoport jelentése lehet trimetil-szilil-, trietil-szilil-, dimetilizopropil-szilil-, izopropil-dimetil-szilil-, metil-di(terc-butil)-szilil-, (terc-butil)-dimetil-szilil-, (terc-butil)-difenil-szilil- és triizopropil-szilil-csoport stb. A legelőnyösebb (I) általános képlettel jellemezhető szililezőszer az N-metil-N-(trimetil-szilil)-acetamid (MTMSA) vagy az N-metil-N-(trimetil-szilil)-trifluoracetamid (MTSTFA).

A reakció, melyet szobahőfok és 100 °C között végzünk, néhány perc és többször tíz óra közötti időtartam alatt válik teljessé. Szobahőfok alatti hőmérsékleten a reakció lefutása nem elég gyors, míg 100 °C-on vagy fölötte elhasadhat a szulfatált poliszacharid glikozidkötése. A reakciókörülmények, különösen a reakció hőfokának a változtatásával szabályozható a deszulfatálás foka. Például a reakciót 30 °C és 100 °C között, 30-180 percig, előnyösen 65 °C és 90 °C között, 0,5-2 óra hosszat végezve, véghez vihető a szulfátcsoportok részleges deszulfatálása, míg a 90 °C és 100 °C között 2-6 óra hosszat végzett reakció teljesebb deszulfatáláshoz vezet.

Az alkalmazandó szililezőszer mennyisége - a szulfatált poliszacharid minden szubsztituált és szubsztituálatlan hidroxilcsoportjának móljaira számítva 3-100-szoros, előnyösen 3-30-szoros mólnyi mennyiség. A deszulfatálás foka a szililezőszer mennyiségének változtatásával is szabályozható.

így olyan deszulfatált poliszacharid nyerhető, melyben részben vagy teljesen elimináltuk a primer hidroxilcsoporthoz kötött szulfátcsoportokat. A deszulfatálási reakció befejezése után az elreagálatlan szililezőszer hatástalanítására vagy a deszulfatált poliszacharid hidroxilcsoportjaihoz kötött szililcsoportok eltávolítására például vizet adhatunk a reakciókeverékhez és/vagy vízzel szemben dializálhatjuk a reakcióelegyet. Amennyiben szükséges, a szililcsoportok eltávolítását hagyományos módszerrel is végezhetjük. Ilyenkor a fenti módon kezelt oldatot lúgos (pH 9-9,5) körülmények között tartjuk vagy hevítjük.

Amikor a deszulfatált poliszacharid anionos funkciós csoportot tartalmaz, só képezhető az oldatba bevitt ellenion segítségével. Például a deszulfatált poliszacharid alkálifémsója úgy képezhető, hogy a szililcsoportok eltávolítása után a deszulfatált poliszacharid vizes oldatához alkálifém-hidroxidot (nátrium-hidroxid stb.) adunk, a keveréket - amennyiben szükséges - dializáljuk, majd a keverékből eltávolítjuk a vizet egy olyan lépésben, mely nem igényel hőbevitelt, például liofilizálással stb. Egyik speciális megvalósítási mód szerint, mikor a megmaradt szulfátcsoportokat nátriumsóvá kívánjuk átalakítani, nátrium-hidroxiddal pH 9-re állítjuk az oldat pH-ját, a keveréket dializáljuk, majd liofilizáljuk. így nyerjük a deszulfatált poliszacharid nátriumsóját.

A szelektíven deszulfatált poliszacharidok közül, melyek a találmány szerinti eljárással állíthatók elő, különösen előnyösen nyerhető a heparin. Ez a szelektíven deszulfatált heparin a következő tulajdonságokkal jellemezhető :

(1) egy telítetlen diszacharidkészítmény, amelyben - enzimatikus emésztéssel és nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (HPLC) mérve a ADiHS-tri(U,6,N)S-tartalom 10-40 mol% a ADiHS-di(U,N)S-tartalom 30-60 mol%, (2) az N-szulfát-csoportot tartalmazó diszacharidtartalom 75-95 mol%, (3) az átlagos molekulatömeg 4000-30 000 dalton, (4) az antitrombinaktivitás 20 E/mg-150 E/mg, és (5) az alap-fibroblastnövekedési faktor aktivitását fokozó hatása a sejtburjánzással szemben megmarad úgy, hogy az a nem deszulfatált heparinénak legalább 80%-a vagy több.

Itt az (1) pontban említett ADiHS-tri(U,6,N)S-tartalom a későbbiekben leírt „Diszacharidanalízis enzimatikus emésztéssel” tesztmódszerrel kapott érték, és a heparinbontó enzimekkel kezelt heparinból kapott különböző telítetlen diszacharidok közül azt a diszacharidtartalmat jelenti, amelyben az uronsav 2-es helyzete és a glükózamin aminocsoportja, valamint 6-os helyzete szulfátéivá van (2. ábra). Hasonló módon a ADiHS-di(U,N)S-tartalom azt a diszacharidtartalmat jelöli, mely4

HU 218 600 Β ben az uronsav 2-es helyzete és a glükózamin aminocsoportja szulfatálva van. Előnyösen a ADiHS-tri(U,6,N)S-tartalom 10-20 mol% és a ADiHS-di(U,N)Startalom 50-60 mol%.

A (2) pontban az N-szulfát-csoportokat tartalmazó diszacharidtartalom (mólszázalék) érték adja meg Nszubsztituált szulfátcsoportot tartalmazó diszacharidokat a deszulfatálásnak alávetett heparin összes cukorépítőegységre számolva.

A (3) pontban felsorolt átlag molekulatömeg a nagy felbontóképességű gélpermeációs kromatográfíával meghatározott molekulatömeg, ahol kontrollként standard molekulatömegű kondroitin-szulfátot használtunk, és amely előnyösen 10 000-20 000 dalton.

Deszulfatálás előtt a heparin gélpermeációs kromatográfiával meghatározott átlag-molekulatömege a 4000 és 30 000 dalton közötti tartományban van, és a találmány szerinti eljárással deszulfatált heparin átlagos molekulatömege majdnem változatlan marad.

A példákban deszulfatálás előtt és után a molekulatömegeket a következő körülmények között mértük: Gélpermeációs (GPC) HPLC.

Oszlop: TSK-gél G-4000+G-3000+G-2500 (Tosoh K. K.).

Oldószer: 0,2 mol/1 NaCl, 1,0 ml/perc.

Detektor: differenciális refraktométer (Rí), UV abszorpció (UV 230 nm).

Felvitt minta: 5 μΐ (10 mg/ml).

A (4) pontban leírt antitrombinaktivitás a következő példákban ismertetett módszenei mért érték. Ha a nem deszulfatált heparin antitrombinaktivitását ezzel a módszerrel mérjük, az 1200 E/mg és 1600 E/mg között van, de a találmány szerinti deszulfatált heparin antirombinaktivitása 20 E/mg és 150 E/mg között, előnyösen 30 E/mg és 100 E/mg között van, és csökken a bevérzést előidéző hatás.

Az alap-fibroblastnövekedési faktor sejtburjánzással szembeni aktivitását fokozó hatás (5. pont) érték a találmány szerinti deszulfatált heparin bFGF-aktivitást fenntartó hatása összehasonlítva azon heparin bFGF-aktivitást fenntartó hatásával, melyet még nem kezeltünk deszulfatálószerrel. Az aktivitást a következőkben a „bFGF- és aFGF-aktivitást fokozó hatás mérése” alatt ismertetett módszerrel határoztuk meg. A találmány szerinti deszulfatált heparin még deszulfatálás után is megtartja a nem deszulfatált heparin aktivitást fokozó hatásának 80-100%-át.

A találmány szerinti eljárással szelektíven deszulfatált heparin egy olyan szer, mely hatóanyagként fokozni tudja az alap-fibroblastnövekedési faktor aktivitását, és a deszulfatált heparint kombinálva az alap-fibroblastnövekedési faktorral olyan készítmény előállítása válik lehetővé, melyben fokozott az alap-fibroblastnövekedési faktor aktivitása sejtburjánzással szemben.

A találmány szerinti deszulfatált heparint beadva vagy az aktuális testrészre kívülről felvive, stabilizálódik a bFGF-akti vitás, mely jelentős szerepet játszik például a sebek kezelésében vagy a kisebesedés megelőzésében (decubitus stb.). A cukorbetegeknek csökkent a heparán-szulfát- vagy heparinszintje, ezért feltételezik, hogy a sebgyógyításra használt bFGF-aktivitás nem kielégítő heparán-szulfát vagy heparin jelenléte nélkül, így a találmány szerinti készítmény különösen hasznos a cukorbetegek felfekvésének (decubitus) kezelésében és megelőzésében. Még akkor is, mikor a betegeket vagy a beadás helyét olyan esetben kezeljük, mikor elegendő endogén bFGF termelődik és nincs szükség arra, hogy kívülről vigyünk be a bFGF-et, csak a találmány szerinti deszulfatált heparinnal tudunk kielégítően célt érni úgy, hogy a sebgyógyításra a fenti bFGF-aktivitást fokozó szert használjuk. A kiszerelési formát és a beadás módját tekintve, akár akkor, mikor a bFGF-aktivitást fokozó szert vagy a találmány szerinti készítményt beadjuk, akár mikor külsőleg visszük fel az érintett testfelületre, ezek biztonságosan beadhatók - mind parenterálisan, mind orálisan - bármely meleg vérű állatnak (ember, egér, patkány, hörcsög, nyúl, kutya, macska stb.), akár egyedül, akár gyógyászati célra alkalmas hordozóval, excipienssel vagy hígítószerrel stb. kombinálva, gyógyszerkészítmény formájában (injekció, tabletta, kapszula, oldat, kenőcs stb.).

Ezenkívül a találmány szerinti a bFGF-aktivitást fokozó szeméi és a fenti készítménynél csökkennek a mellékhatások, például a bevérzést okozó hatás, így azok gyógyszerként igen biztonságosan alkalmazhatók.

A találmányt - nem korlátozó jelleggel - a következő példán és tesztpéldán mutatjuk be.

A szulfátéit poliszacharid azonosítását a következő módszerekkel végeztük.

Tesztmódszerek

1) A diszacharid analízise enzimatikus emésztéssel

A glikózamino-glikán deszulfatálása után a szulfátcsoportok helyzetét az alábbiak szerint analizáltuk. A glikózamino-glikánokat a deszulfatálási reakció előtt és után enzimatikus emésztésnek vetettük alá, és a képződő telítetlen diszacharidokat nagy felbontóképességű folyadékkromatográfíával (HPLC) analizáltuk (lásd „2.8 Szerkezetmeghatározás kombinált glikózaminoglikán-bontó enzimes emésztéssel és HPLC-vel” [Structure analysis using glycosamino-glycan-decomposing enzymes and HPLC in combination], New Biochemical Experiment Lecture 3, Carbohydrates II, 49-62, 1991).

Emésztés heparint bontó enzimekkel

A „New Biochemical Experiment Lecture 3, Carbohydrates II, 54-59 (Tokyo Kagaku Dojin, 1991)”-ben leírt módszer szerint 0,1 mg heparint feloldottunk 220 μΐ 2 mmol kalcium-acetátot tartalmazó 20 mmol/1 nátrium-acetátban (pH 7,0), majd 20 mE heparinázt és 20 mE heparitináz I-et és ΙΙ-t adtunk az oldathoz. A keveréket 2 óra hosszat inkubáltuk 37 °C-on. Olyan esetben, mikor a deszulfatáló kezelés az aminocsoportokhoz kötődő szulfátcsoportokat is eltávolította, a heparinbontó enzimek már nem tudják elhasítani az ilyen deszulfatált heparint. Ilyenkor szükségessé válik, hogy az enzimatikus emésztés előtt acetilezzük az aminocsoportokat. Vizes, nátrium-karbonátot vagy Dowex-1 (HCO3-) ioncserélő gyantát tartalmazó oldatban az N-acetilezés kvantitatíve végbemegy ecetsavanhidrid jelenlétében („Sugár Chain Engineering”, 324,

HU 218 600 Β kiadó Sangyo Chosakai K. K., és Biotechnology Information Center).

HPLC-analízis

HPLC-vel (Irika, 852 modell) analizáltunk 50 μΐ oldatot, melyet előzőleg heparinbontó enzimekkel emésztettünk. Ioncserélő oszlopot használtunk (CarboPac PA-1, Dionex Co., 4,0 mm χ 250 mm) és az abszorbanciát 232 nm-nél mértük. Gradiens eluálást alkalmaztunk (50 mmol/1 —>2,5 mol/1 lítium-klorid), 1 ml/perc áramlási sebesség mellett (Kariya és munkatársai, Comp. Biochem. Physiol. 103B, 473-479,1992).

2) Gélpermeációs kromatográfia

HPLC-t alkalmazva, gélpermeációs kromatográfiával analizáltunk 10 pl 3 tömeg%-os szulfátéit poliszacharidoldatot. A méréshez TSK-gél (G4000+G3000+ +G2500)PW_XL-oszlopot (Tosoh, 7,8 mmx30 cm) és 0,2 mol/1 nátrium-klorid eluálószert alkalmaztunk 1,0 ml/perc áramlási sebesség mellett. A szulfátéit poliszacharidot differenciális refraktométerrel (Shimadzu, AID-2A) detektáltuk.

3) A bFGF-aktivitást és aFGF-aktivitást fokozó hatás mérése

A 10 tömeg% marhaszérumot tartalmazó DMEM táptalajon (Life Technologies Co.) fenntartott A31 sejteket (BALB/c 3T3) 96 lyukú biológiai tenyésztőlemezre szélesztettük 100 μΐ ITS+ (Collaborative Research Co.) segítségével, mely 1 μΐ/ml tesztmintát, 20 mmol/1 NaClO₃-at és SO₄ ²-mentes 2 ng/ml humán rekombináns bFGF-et (hrbFGF) (Seikagaku Kogyo K. K.) vagy 5 ng/ml humán rekombináns bFGF-et (hrbFGF) (Seikagaku Kogyo K. K.) tartalmazó DMEM-et tartalmazott. Háromnapos tenyésztés után 20 μΐ 96AQ sejttiterű, nem radioaktív sejtburjánzási mérőoldatot (Seikagaku Kogyo K. K.) adtunk a megfelelő lyukakba. Két óra hosszat 37 °C-on tenyésztettünk, majd mértük a megfelelő lyukak OD₄₉₀ értékét sejtbuijánzás kvantitatív meghatározására. A 2. táblázatban mind bFGF, mind aFGF esetében a sejtburjánzást 100-nak definiáltuk, ha 1 μΐ/ml nem deszulfatált heparint adtunk a keverékhez és 0-nak, ha nem adtunk ilyen a heparint az elegyhez.

4) Antitrombinaktivitás mérése

Hűtés mellett összekevertünk 150 mmol/1 sót, 10 mmol/1 kalcium-kloridot és 0,1 tömeg% marhaszérumalbumint tartalmazó 20 mmol/l-es Trispuffer (pH 7,4) 3x350 μΐ-es oldatát, 100 μΐ marhaantitrombin III oldatát (1 E/ml, ugyanebben a pufferben) és 100 μΐ többszörösen hígított heparin mintát, majd a keveréket 2 percig inkubáltuk 37 °C-on. Ehhez az oldathoz hozzáadtunk 50 μΐ marhatrombinoldatot (50 mE/ml desztillált vízben) és a keveréket 5 percig inkubáltuk 37 °C-on. Utána hozzáadtunk 100 μΐ szubsztrátoldatot (BOC-ValPro-Arg-MCA 70 μηιοΐ/l-es vizes oldata), megkevertük az elegyet és 3 percig inkubáltuk 37 °C-on, majd a reakció leállítására 300 μΐ 30%-os ecetsavat adagoltunk hozzá. A reakciókeverék fluoreszcens intenzitását 350 nm gerjesztési hullámhosszon és 444 nm fluoreszcens hullámhosszon mértük. Az 1. számú vakmintában desztillált vizet tettünk a fenti reakciókeverékbe a minta helyett és a 2. számú vakmintában a reakciókeverék csak a szubsztrátot és a puffért tartalmazta. A fentiekhez hasonló módon jártunk el és meghatároztuk a fluoreszcens intenzitást.

A trombinaktivitás gátlásának mértékét a következő egyenlettel számítottuk ki:

trombinaktivitás gátlása (%)= = 100-(AFs/AFb)x 100 ahol

AFs =a minta fluoreszcenciájának intenzitásából levonva az 1. számú vakminta fluoreszcenciájának intenzitása,

AFb =a 2. számú vakminta fluoreszcenciájának intenzitásából levonva az 1. számú vakminta fluoreszcenciájának intenzitása, és az 50%-os gátlási értékek meghatározására (IC₅₀) a megfelelő gátlási értékeket a minta koncentrációjának függvényében ábrázoltuk féllogaritmikus ábrán.

Az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze. Tesztpélda

Metil-a-galakto-piranozid-6-szulfát-ammónium-só vizes oldatához (2 mg/3 ml) 5 ml Amberlite IR-120 (H⁺) gyantát adtunk, hogy a sót szabad szulfátészterré alakítsuk. A gyanta eltávolítása után piridiniumsó-képzés céljából 2 ml piridint adtunk az oldathoz. A piridin feleslegét vákuumbepárlással eltávolítva, a maradékot liofilizáltuk, így jutottunk a száraz metila-galakto-piranozid-6-szulfát-piridinium-sóhoz. Ezt a mintát 0,2 mg-os részekre osztottuk és ehhez 0,05 ml száraz piridint és belső standardként metil-a-glikozidot adtunk különböző reakciórendszerek képzése céljából, melyekben az MTSTFA moláris mennyisége a metil-agalakto-piranozid-6-szulfát-piridinium-só összes hidroxilcsoportjainak ([-OH] + [-O-SO₃ ]) moláris menynyiségére számolva, 0-20-szoros volt. Miután az MTSTFA-t hozzáadtuk a megfelelő rendszerekhez, a keverékeket 2 óra hosszat 80 °C-ra hevítettük. Az O-trimetil-szililezés teljessé válása után a gázkromatográfiás analízishez (trimetil-szilil)-imidazolt adtunk a reakciókeverékhez és a keverékeket 20 percig 80 °C-on hevítettük. Gázkromatográfiásán mérve az adott rendszer trimetil-szililezett metil-a-galakto-piranozid-tartalmát kiszámítottuk a deszulfatált mennyiségeket, melyeket az

1. ábrán mutatunk be. Az 1. ábrából látható, hogy szulfátéit monoszacharid esetén, mikor a szacharid összes hidroxilcsoportjának moláris mennyiségére számítva 13-szoros moláris mennyiségű MTSTFA-t használtunk a fenti reakciókörülmények között, a primer hidroxilcsoportok szulfát-észterei csaknem teljesen deszulfatálhatók.

Példa

200 mg heparin-nátriumsót (átlag molekulatömeg 12 200 dalton) felvittünk egy Amberlite IR-120 (H⁺) oszlopra (1 χ 10 cm), az eluálószerhez piridinfelesleget adtunk, majd az oldatot pH 8-ra semlegesítve és liofilizálást alkalmazva nyertük a heparin-piridinium-sót. A heparin-piridinium-sót feloldjuk 20 ml vízmentes piridinben, hogy elkészítsük a reakciómintát, hozzáadtuk - a heparin cukorvázára számított - 20-szoros mennyiség (körülbelül 4 ml) MTSTFA-t, és a keveréket 2 óra

HU 218 600 Β hosszat kevertük 65, 75, 85, 90 és 95 °C-on. A reakció befejezése után a reakció leállítására és az elreagálatlan MTSTFA hatástalanítására 20 ml vizet adagoltunk a keverékhez. A reakciókeveréket Millipore ultraszűró membrán segítségével dializálva kaptuk a trimetil-szi- 5 lilezett heparin deszulfatálásával nyert terméket.

Ekkor a trimetil-szilil-csoportok hidrolitikus eltávolítására a dializált oldatot 0,5-1 óra hosszat 100 °C-ra hevítettük (míg az oldat átlátszó nem lett). A pH-t nátrium-hidroxiddal 9-9,5-re állítva az oldatot dializál- 10 tűk. A dializált oldatot liofilizálva 130 mg terméket nyertünk, mely a deszulfatáló eljárással kezelt heparin nátriumsójának felelt meg.

Összehasonlító példa

Egy ellenőrző kísérletben a példa szerint jártunk el, azzal a különbséggel, hogy a reakciót 90 °C-on végeztük és MTSTFA helyett N,O-bisz(trimetil-szilil)-acetamidot (BTSA) használtunk.

Az 1. táblázat mutatja az enzimatikus emésztéssel kapott diszacharid analízisének adatait a heparin szili- 20 lezőszerrel történő fenti kezelése előtt és után.

A megfelelő fenti, heparin deszulfatálással nyert termékeket vizes nátrium-karbonát-oldatban (pH 6,5) óra hosszat acetileztük ecetsavanhidriddel és metanollal, 4 °C-on. Ezeket a mintákat a fenti „ Tesztmódszerek ”-ben leírt analitikai módszerrel, heparinbontó enzimekkel emésztettük. A képződő telítetlen diszacharid különböző izomeijeit (1. ábra) HPLC-vel ffakcionáltuk. Az összetétel számszerű arányait az 1. táblázatban foglaltuk össze.

A fent említett (II) általános képletű diszacharidizomerek konkrét jelentései a következők (Ac jelentése pedig acilcsoport):

	R¹	R²	R³
ÁDiHS-OS	H	Ac	H
ADÍHS-6S	SO₃	Ac	H
ADiHS-NS	H	so₃-	H
ADiHS-US	H	Ac	so₃-
ADiHS-di(6,N)S	so₃-	so₃-	H
ADiHS-di(U,N)S	H	so₃	o o 1
ADiHS-di(U,6)S	so₃-	Ac	so₃-
ADiHS-tri(U,6,N)S	so₃-	so₃-	<Z> O d 1

1. táblázat

A heparin diszacharid-összetétele

Minta	Hőfok	ADiHS- [%]	Di- sza- cha- ridho- zam	6-os hely- zet szul- fatá- lási foka
°C	OS	NS	6S	US	di(6,N)S	di(U,N)S	di(U,6)S	tri(U,6,N)S	Összes	%	%
Kezelés előtt		4,3	3,8	0,7	1,3	8,1	24,8	0	52,6	95,6	91	0
BTSA-kezelés (összehasonlí- tás)	90	7,6	4,3	1,4	11,2	6,0	47,4	4,0	10,5	92,4	75	64,3
MTSTFA-kezelés (a találmány szerint)	65	5,5	2,9	1,1	2,8	7,9	34,7	1,7	36,7	93,3	86	24,4
u. a.	75	5,9	3,8	0,5	1,2	5,8	47,4	0,1	27,5	92,2	81	44,8
u. a.	85	6,9	3,8	0,9	8,0	6,1	51,7	1,3	14,9	93,6	79	62,2
u. a.	90	6,2	5,3	0,3	4,2	6,8	59,3	0,6	12,7	95,4	78	66,8
u. a.	95	6,3	9,4	0	2,4	5,3	67,6	0	1,6	92,6	65	88,8

A ADiHS jelentése: enzimatikus emésztés során képződő telítetlen diszacharid. A diszacharidhozamot a gélpcrmeációs HPLC görbe alatti területéből számítottuk.

Az 1. táblázat mutatja, hogy mind a BTSA-, mind az MTSTFA-kezelés után - a 6-os helyzetű szulfátcsoportok eliminálásával - a heparin fő alkotóelemét képző diszacharidból származó ADiHS-Tri(U,6,N) mennyisége jelentős mértékben csökkent, a ADiHS-di(U,N) mennyisége pedig megnövekedett. Azonban a BTSAkezelés az N-szulfát-csoportokat is eliminálta, ami együtt járt a ADiHS-Tri(U,6,N) és ADiHS-Di(U,N) együttes mennyiségének csökkenésével és a ADiHS-US mennyiségének növekedésével. Ebből látható, hogy az MTSTFA-kezelés ugyanolyan mértékben tudta eltávolítani a szulfátcsoportot a heparin primer hidroxilcsoport55 járói, mint a BTSA-kezelés, ugyanakkor azzal, hogy nem ment végbe a BTSA-kezeléssel okozott N-szulfátcsoport-eltávolítás, azaz szelektívebb volt a 6-os helyzetű szulfátcsoportra gyakorolt hatás.

Gélpermeációval vizsgálva a heparinok molekulatö60 megét MTSTFA-kezelés előtt és után, megállapítható,

HU 218 600 Β hogy a molekulatömegben gyakorlatilag nem következett be változás.

Az előzőekből következik, hogy az MTSTFA hatására végbemenő deszulfatálási reakció specifikusan a primer hidroxilcsoporthoz kötődő szulfátcsoportokat érinti és nem hat a más helyzetben levő szulfátcsoportokra, sem a glikozidkötésre.

Hasonló módon mértük a 65 °C-on, 75 °C-on, 85 °C-on, 90 °C-on és 95 °C-on fokozatosan deszulfatált heparin trombingátló aktivitását, valamint bFGFés aFGF-aktivitást fokozó hatását. Az eredményeket a

2. táblázatban foglaltuk össze.

2. táblázat

6-os helyzetben deszulfatált heparin	Trombinaktivitás gátlása (IC₅₀ ng/ml) (E/mg)	bFGF-aktivitás fokozása	aFGF-ak ti vitás fokozása
Natív	8,75 (1430 E/ml)	100	100
65 °C	1,31x102 (96 E/ml)	88	72
75 °C	1,42x102 (88 E/ml)	89	41
85 °C	1,67x102 (75 E/ml)	91	18
90 °C	2,98x102 (43 E/ml)	87	11
95 °C	8,84xl0³(1,4 E/ml)	26	12

A 2. táblázatból látható, hogy a 65 °C-on a 6-os helyzetben történő részleges deszulfatálás hatására hirtelen csökken a trombingátló hatás, ugyanakkor a bFGF-aktivitást fokozó hatás megmarad a 90 °C-on végzett deszulfatálásig. Az aFGF-aktivitást fokozó hatás ezzel szemben enyhén csökkent a 6-os helyzetű szulfátcsoport eltávolításával. Különösen, ha a 6-os helyzet deszulfatálását 85 °C és 90 °C között végezzük, olyan 6-os helyzetben szelektíven deszulfatált heparinhoz jutunk, melynek antikoaguláns aktivitása és aFGF-aktivitást fokozó hatása lecsökkent, ugyanakkor megmaradt a bFGF-aktivitást fokozó hatás.

Amikor a heparint, melynek átlagos molekulatömege 4000 és 30 000 között volt, a találmány szerinti eljárással, a fentiek szerint deszulfatáltuk, az 1. táblázatban leírt módon specifikusan a 6-os helyzet deszulfatálódott, a biológiai aktivitások a 2. táblázatban felsorolt tendenciát mutatták, és gyakorlatilag nem mutatkozott különbség a deszulfatálás előtt és után meghatározott molekulatömegben.

Ipari hasznosíthatóság

A találmány szerinti eljárásban a szulfátéit poliszacharid cukorvázához kötődő szulfátcsoportok közül, melyeknek különböző tulajdonságaik vannak, csak a primer hidroxilcsoporthoz kötődő szulfátcsoport eliminálódott specifikusan, vagyis az eljárás felismeri a különbséget a primer hidroxilcsoporthoz, a szekunder hidroxilcsoporthoz és az N-hez kötődő szulfátcsoportok között, ezáltal specifikus helyzetben szulfát-észtert tartalmazó szulfatált poliszacharidok állíthatók elő, ami eddig nem volt ismert a szakmai gyakorlatban.

Az előnyös megvalósításnál, a találmány szerinti eljárást a heparin deszulfatálására alkalmazva, kiküszöbölődik a heparin nemspecifikus kötődése a fehérjékhez és az alap-fibroblastnövekedési faktorral (bFGF) létrejövő kölcsönhatás révén specifikus fiziológiai aktivitás jön létre. Ez a termék gyógyszerként egyedül vagy bFGF-fel kombinálva, széles körben nyerhet felhasználást, például a seb-, égés- vagy bőrfekélykezelésben, az osteoporosis, csonttörés, emésztőszervi fekély gyógyításában vagy a szívinfarktus kilátásainak javításában stb.

Ezen túlmenően a találmány szerinti deszulfatálási eljárás széles körű alkalmazást nyerhet más fiziológiailag hatásos molekulák esetében is, mely más, mint a bFGF.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy a primer hidroxilcsoporthoz kötődő szulfátcsoport szelektív eltávolítása céljából egy szulfatált primer hidroxilcsoporttal rendelkező és cukoralkotóként szereplő szacharidegységeket tartalmazó szulfatált poliszacharidot egy (I) általános képletű szililezőszerrel reagáltatunk, ahol a képletben

Rj jelentései, azonosan vagy különbözően, hidrogénatom vagy halogénatom,

R₂ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, és R₃ jelentései, azonosan vagy különbözően, 1-6 szénatomos alkilcsoport, fenilcsoport vagy halogénatom.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy szulfatált poliszacharidként olyan vegyületet alkalmazunk, amelyben legalább egy olyan cukor-alkotóelem van, mint Nszubsztituált glikózamin, D-galaktóz-6-szulfát vagy L-galaktóz-6-szulfát.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy szulfatált poliszacharid cukor-alkotóelemként N-szulfatált glikózamint vagy N-acetilezett glikózamint alkalmazunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzaljellemezve, hogy szulfatált poliszacharidként heparint, heparán-szulfátot, kondroitin-szulfátot, dermatán-szulfátot, keratán-szulfátot, funoránt vagy porfiránt alkalmazunk.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy a szulfatált poliszacharid cukor-alkotóelemeként N-szubsztituált glikózamint alkalmazunk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy a szulfatált poliszacharid cukor-alkotóelemeként N-szubsztituált glikózamint alkalmazunk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy szulfatált

HU 218 600 Β poliszacharidként heparint vagy heparán-szulfátot alkalmazunk.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy a szulfátéit poliszacharidot szerves oldószerben oldódó sóvá alakítjuk át, és a reakciót szerves oldószerben végezzük.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy a szulfátéit poliszacharid szerves oldószerben oldódó sójaként a szulfátéit poliszacharid szerves bázissal alkotott sóját alkalmazzuk.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás deszulfatált poliszacharid előállítására, azzal jellemezve, hogy a deszulfatálási reakció után eltávolítjuk a szililcsoportot a szililezett hidroxilcsoportról.

11. Szelektíven deszulfatált heparin, mely a következő tulajdonságokkal jellemezhető:

(1) egy telítetlen diszacharidkészítmény enzimatikus emésztéssel és nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával (HPLC) végzett elemzése során mérve a ADiHS-tri(U,6,N)S-tartalom 10-40 mol% és a ADiHS-di(U,N)S-tartalom 30-60 mol%, (2) az N-szulfát-csoportot tartalmazó diszacharidtartalom 75-95 mol%, (3) az átlagos molekulatömeg 4000-30 000 dalton, (4) az antitrombinaktivitás 20 E/mg-50 E/mg és (5) az alap-fibroblastnövekedési faktor sejtburjánzással szembeni aktivitását fokozó hatás megmarad úgy, hogy az a nem deszulfatált heparinénak legalább 80%-a vagy több.

12. A 11. igénypont szerinti deszulfatált heparin, melyet az 1-10. igénypontok bármelyikében leírt eljárással állítunk elő.

13. Az alap-fibroblastnövekedési faktor aktivitását fokozó anyag, mely hatóanyagként 11. vagy 12. igénypont szerinti deszulfatált heparint tartalmaz.

14. Készítmény, melyben fokozott az alap-fibroblastnövekedési faktor sejtproliferatív aktivitása, amely all. vagy 12. igénypont szerinti deszulfatált heparint és egy alap-fibroblastnövekedési faktort tartalmaz.

15. Az (I) általános képletű deszulfatált heparin, amelyben a primer hidroxilcsoportokhoz kötődő szulfátcsoportok el vannak távolítva, és amely a következő tulajdonságokkal jellemezhető:

(1) egy telítetlen diszacharidkészítmény enzimatikus emésztéssel és nagy felbontóképességű folyadékkromatográfiával végzett elemzése során nem mutatható ki olyan összetevő, mely a (II) általános képlettel jellemezhető - ahol a képletben

R¹ jelentése SO₃H-,

R² jelentése acetilcsoport és

R³ jelentése hidrogénatom, vagy

R* és R³ jelentése SO₃H~ és

R² jelentése acetilcsoport -;
(2) az N-szulfát-csoportot tartalmazó diszacharidtartalom 75-95 mol%.

16. A 15. igénypont szerinti deszulfatált heparin alkalmazása meleg vérű élőlények sebeinek és fekélyeinek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására.